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Verfahren zur Herstellung von 6-Aminopenicillansäure
Die Erfindungbezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Substanzen mit antibiotischer Wirk- samkeit.
6-Aminopenicillansäure hat folgende Strukturformel :
EMI1.1
6-Aminopenicillansäure und ihre Salze können durch Züchtung eines Penicillin produzierenden Stammes in einem Nährmedium und darauffolgendes Isolieren der 6-Aminopenicillansäure oder deren Salze aus der Fermentationsflüssigkeit erhalten werden.
6-Aminopenicillansäure ist insoferne wichtig, da sie mit verschiedenen Verbindungen zur Herstellung von neuen Substanzen mit antibiotische Wirksamkeit umgesetzt werden kann.
Gegenstand der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung von 6-Aminopenicillansäure durch enzymatischen Abbau verschiedener Penicillinarten vorzusehen.
Es wurde nämlich gefunden, dass verschiedene Penicillinarten mit Hilfe eines Enzyms, der Penicillinamidase, zu 6-Aminopenicillansäure abgebaut werden können.
Gemäss der Erfindung wird daher ein Verfahren zur Herstellung von 6-Aminopenicillansäure vorgesehen, bei welchem ein Penicillin der allgemeinen Formel :
EMI1.2
in welcher Formel Reine Alkyl- oder Alkenylgruppe oder die Gruppe RIXCH2 bedeutet, wobei Rl eine Alkyl-, Alkenyl-, Allyl- oder Arylgruppe und X Sauerstoff oder Schwefel darstellt oder eine Fermentationsflüssigkeit, welche eine oder mehrere derartige Penicillinarten enthält, mit einem Enzympräparat umgesetzt wird, welches aus einem penicill inamidase produzierenden Mikroorganismus erhalten wurde.
Beispiele von Penicillinarten, welche erfindungsgemäss als Substrate verwendet werden können, sind folgende :
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EMI2.1
<tb>
<tb> Formel <SEP> (II)
<tb> Phenoxymethyl-penicillin
<tb> (Penicillin <SEP> V) <SEP> R <SEP> = <SEP> RXCH., <SEP> wobei <SEP> R <SEP> = <SEP> C <SEP> H, <SEP> X <SEP> = <SEP> 0
<tb> Butylthiomethyl-penicillin <SEP> R <SEP> = <SEP> R1XCH2, <SEP> wobei <SEP> Rl <SEP> = <SEP> C <SEP> H, <SEP> X <SEP> = <SEP> S
<tb> n-Heptyl-penicillin
<tb> (penicillin <SEP> K) <SEP> R <SEP> = <SEP> CH3.CH2.(CH2)4.CH2-
<tb> 2-pentenyl-penicillin
<tb> (Penicillin <SEP> F) <SEP> R <SEP> = <SEP> CH3.CH2.CH <SEP> = <SEP> CH. <SEP> CH <SEP> n-Amyl-penicillin
<tb> (Dihydro-penicillin <SEP> F) <SEP> R <SEP> = <SEP> CH3.CH2.CH2.CH2.CH2n-Butyl-penicillin <SEP> R <SEP> = <SEP> CHUS. <SEP> CH. <SEP> CH.
<SEP> CH- <SEP>
<tb>
Es kann auch als Substrat eine Mischung der natürlichen Penicillinarten verwendet werden, wie sie durch ein typisches Fermentationsverfahren, bei welchem kein Precursor verwendet wird, erhalten wird.
In einer derartigen natürlichen Mischung können beispielsweise enthalten sein : Penicillin K, F, Dihydro F und 3-Pentenylpenicillin (Flavicin) sowie etwas Benzylpenicillin (penicillin G) und p-Hydroxybenzyl- -penicillin (Penicillin X). Es kann somit das erfindungsgemässeverfahren auf die Fermentationsflüssigkeit in einem Verfahren zur Herstellung von 6-Aminopenicillansäure angewendet werden, um deren Ausbeute zu erhöhen.
Jede der der Formel (II) entsprechenden Penicillinarten kann in Form ihrer Salze verwendet werden, u. zw. mit einem Kation, welches die enzymatische Hydrolyse nicht stört. Die gebräuchlichsten derartigen Salze sind die Erdalkali- und Alkalimetallsalze, wie die Natrium-, Kalium- und Kalziumsalze.
Im folgenden werden einige Beispiele von Mikroorganismen angeführt, welche Penicillinamidase produzieren :
EMI2.2
<tb>
<tb> Pilze
<tb> Alternaria <SEP> sp. <SEP> B. <SEP> R. <SEP> L. <SEP> Nr. <SEP> 32
<tb> Aspergillus <SEP> sp. <SEP> B. <SEP> R. <SEP> L. <SEP> Nr. <SEP> 78
<tb> Botrytis <SEP> cinerea. <SEP> B. <SEP> R. <SEP> L. <SEP> Nr. <SEP> 20 <SEP> und <SEP> 36
<tb> Epicoccum <SEP> sp. <SEP> B. <SEP> R. <SEP> L. <SEP> Nr. <SEP> 64
<tb> Fusarium <SEP> sp. <SEP> B. <SEP> R. <SEP> L. <SEP> Nr. <SEP> 46, <SEP> 116,205, <SEP> 221,226 <SEP> und <SEP> 236
<tb> Mucor <SEP> sp. <SEP> B. <SEP> R. <SEP> L. <SEP> Nr. <SEP> 52,63, <SEP> 84 <SEP> und <SEP> 85
<tb> Penicillium <SEP> chrysogenum <SEP> B. <SEP> R. <SEP> L. <SEP> Nr. <SEP> 51-20C <SEP>
<tb> Penicillium <SEP> sp. <SEP> B. <SEP> R. <SEP> L. <SEP> Nr. <SEP> 11, <SEP> 92,93 <SEP> und <SEP> 129
<tb> Phoma <SEP> sp. <SEP> B.
<SEP> R. <SEP> L. <SEP> Nr. <SEP> 65
<tb> Trichoderma <SEP> sp. <SEP> B. <SEP> R. <SEP> L. <SEP> Nr. <SEP> 82
<tb> Hefen
<tb> Cryptococcus <SEP> albidus <SEP> N. <SEP> C. <SEP> Y. <SEP> C. <SEP> Nr. <SEP> 445
<tb> Trichosporon <SEP> sp. <SEP> N. <SEP> C. <SEP> Y. <SEP> C. <SEP> Nr. <SEP> 384
<tb> Actinomyceten
<tb> Streptomyces <SEP> sp. <SEP> B. <SEP> R. <SEP> L. <SEP> Nr. <SEP> 157,188, <SEP> 190,192, <SEP> 194,198,
<tb> 200,206, <SEP> 290,314 <SEP> und <SEP> 316
<tb>
Wenn als Mikroorganismus, welcher penicillinamidase produziert, ein Stamm von Streptomyces verwendet wird, kann ein geeignetes Enzympräparat für das erfindungsgemässeverfahren erhalten werden, wenn man ein geeignetes Medium in einem Fermentationskessel mit einer Kultur des Organismus anLmpft. Dieses wird dann eine Zeit lang zur Produktion des Enzyms bebrütet.
Hierauf wird der Organismus entfernt und es hinterbleibt eine klare Flüssigkeit, diedas Enzym enthält, das dann, wenn gewünscht, iurch Zusatz von Ammonsulfat oder Aceton ausgefällt werden kann.
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Die Reaktion zwischen dem Penicillin und dem Enzympräparat kann durch Zusatz des Penicillins zur Brühe, durch Zusatz einer Lösung des Penicillins zum dialysierten Enzym oder vorzugsweise durch Zusatz des Penicillins zu einer Lösung eines mit Aceton ausgefällten Enzympräparates durchgeführt werden. Das dialysierte Enzym wird hergestellt, indem die Flüssigkeit, die das Enzym enthält, mit Ammonsulfat behandelt wird, worauf der gebildete Niederschlag abgetrennt, wieder in Wasser gelöst und schliesslich gegen strömendes Leitungswasser dialysiert wird.
Das mit Aceton ausgefällte Enzympräparat wird hergestellt, indem ein gleiches Volumen Aceton zu einem Volumsteil der geklärten Flüssigkeit, die das Enzym enthält, zugesetzt und der gebildete Nieder- schlag abgetrennt wird. Dieser Niederschlag kann entweder unmittelbar durch Wiederauflösung in Wasser verwendet werden ; anderseits kann er nach Waschen mit weiterem trockenem Aceton und Trocknen im
Vakuum unbegrenzt lange als Pulver gelagert werden.
Das Enzym zeigt ein PH-Optimum in der Gegend von 9 ; unter einem pH-Wert von 7 ist das Enzym fast inaktiv. Die Enzymreaktion wird vorzugsweise bei einer Temperatur zwischen 25 und 600C durchgeführt.
Bei verschiedenen andern der oben angegebenen Mikroorganismen kann ein geeignetes Enzympräparat erhalten werden, wenn mit einer Kultur des Organismus ein Zuchtkessel, der ein geeignetes Zuchtmedium enthält, angeimpft wird. Beim Animpfen wird unter aseptischen Bedingungen eine penicillin art dem Zuchtmedium zugesetzt. Das Ganze wird 24 - 48 h lang wachsen gelassen, wonach die ganze Brühe reif zum Animpfen für die Endfermentierung wird. Ein Teil hievon wird einer grösseren Menge von Zuchtmedium zugesetzt. Eine Penicillinart wird bei der Animpfung unter aseptischen Bedingungen dem Zuchtmedium zugesetzt. Diese penicillinzusätzewerden vorgenommel1, um die Bildung des Enzyms Penicillinamidase einzuleiten.
Nach einigerzeit wird nun zu diesem Endfermentierungsansatz eine bestimmte Menge des Penicillins zum Umsatz in 6-Aminopenicillansäure zugesetzt. Der pH-Wert, bei welchem die Reaktion durchgeführt wird, hängt von dem besonderen verwendeten Organismus ab. Am Ende der Reaktionszeit wird die Flüssigkeit vom Organismus abgetrennt und irgendwelche feste Rückstände des Kulturmediums und der 6-Amino- penicillansäure können aus der wässerigen Lösung gewonnen werden.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung erläutern, ohne dass diese jedoch hierauf beschränkt werden soll.
Beispiel I : Herstellung des Enzyms.
Eine Kultur von Streptomyces B. R. L. Nr. 198 (A. T. C. C. Nr. 13664) wurde in Schüttelflaschen sowie Fermentiergefässen von 10 und 90 1 Inhalt gezüchtet, wobei als Zuchtmedium eine Brühe mit einer Konzentration von 20 g/l und einem pH-Wert von 7,3 bis 7, 4 verwendet wurde.
Die Brühe hatte folgende Zusammensetzung :
EMI3.1
<tb>
<tb> Flüssige <SEP> Glukose <SEP> 3, <SEP> 010 <SEP>
<tb> Sojabohnenmehl <SEP> 2, <SEP> 5gO
<tb> Difco <SEP> Hefeextrakt <SEP> 0,5je
<tb> Natriumchlorid <SEP> 0,5go
<tb> Kalziumkarbonat <SEP> 0, <SEP> 2go <SEP>
<tb>
Zunächst wurden die ersten vier Bestandteile zusammengemischt, der pH-Wert wurde auf 6, 8 eingestellt und hierauf wurde das Kalziumkarbonat zugesetzt. Durch 30stündige Züchtung der Mikroorganismen in diesem Medium wurde eine Impfkultur erhalten und ungefähr 7 Vol. -% dieser Kultur wurden zum Animpfen des endgültigen Fermentationsansatzes verwendet.
Dieser endgültige Fermentationsansatz wurde 96 h lang bei 26 - 280C unter Rühren und Luftdurchleitung behandelt, hierauf wurde das Mycel entweder abfiltriert oder abzentrifugiert und schliesslich die klare Flüssigkeit, welche das Enzym enthielt, mit Ammonsulfat bis zu 901o der Sättigung (650 g/l) versetzt. Der Niederschlag wurde hierauf abzentrifugiert, in wenig Wasser wieder aufgelöst und 2 Tage lang gegen fliessendes Leitungswasser dialysiert.
Das Enzympräparat wurde schliesslich gefriergetrocknet.
Es kann entweder das wässerige Enzympräparat bei -200C gelagert werden oder es kann durch das folgende Verfahren ein Pulver erhalten werden, das unbegrenzt lagerfähig ist. Die klare Flüssigkeit wird hiezu mit einem gleichen Volumen Aceton behandelt und der Niederschlag wird abzentrifugiert und wieder in einem geringen Volumen trockenem Aceton suspendiert. Daraus wird der Niederschlag wieder abzentrifugiert und im Vakuum getrocknet.
Herstellung von kristalliner 6-Aminopenicillansäure.
Zu 700 ml des wie oben hergestellten dialysierten Enzyms wurden 15 g Phenoxymethylpenicillin,
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EMI4.1
EMI4.2
<tb>
<tb> werden,Penicillin <SEP> V <SEP> n-Butylthiomethylpenicillin <SEP> Penicillin <SEP> G
<tb> 10 <SEP> 1 <SEP> Brühe <SEP> 380 <SEP> 370 <SEP> 10
<tb> Schüttelflaschenbrühe <SEP> 110 <SEP> 150 <SEP> 5
<tb>
Tabelle 2
EMI4.3
<tb>
<tb> Penicillin <SEP> K <SEP> Penicillin <SEP> V <SEP> Penicillin <SEP> G
<tb> 50 <SEP> 30 <SEP> < 1 <SEP>
<tb>
<Desc/Clms Page number 5>
Tabelle 3
EMI5.1
<tb>
<tb> Mischung <SEP> von <SEP> natürlichen <SEP> Penicillinarten <SEP> n-Butylpenicillin <SEP> Penicillin <SEP> V <SEP> Penicillin <SEP> G
<tb> 163 <SEP> 53 <SEP> 180 <SEP> < 10
<tb>
Beispiel 2 :
Herstellung des Enzyms.
EMI5.2
Zusammensetzung in Schüttelflaschel1 gezüchtet.
EMI5.3
<tb>
<tb> Maismehl <SEP> 50 <SEP> g
<tb> Ammoniumsulfat <SEP> 1 <SEP> g
<tb> Leitungswasser <SEP> 11
<tb>
Der pH-Wert wurde vor dem Sterilisieren auf 6, 8 eingestellt.
Durch 30 h langes Züchten des Organismus bei 260C in einem Kulturmedium folgender Zusammensetzung wurde eine Impfkultur erhalten :
EMI5.4
<tb>
<tb> Getreideweiche <SEP> 80 <SEP> ml
<tb> handelsübliche <SEP> Glukose
<tb> ("Dextrosol") <SEP> 40 <SEP> g <SEP>
<tb> Leitungswasser <SEP> 1 <SEP> l
<tb>
Der pH-Wert wurde vor dem Sterilisieren auf 6, 4 eingestellt.
Beim Animpfen sowohl der Impfkultur als auch des endgültigen Fermentationsansatzes wurde das Penicillin bis zu einer Menge von 250 bis 2500 E/ml zugesetzt.
Nach 5-bis 6tätiger Fermentierung hatte der Enzymgehalt ungefähr sein Maximum erreicht und es wurde das Penicillin zum Umsatz in 6-Aminopenicillansäure zugesetzt.
Um die Aktivität des Enzyms unter Verwendung der erfindungsgemässen Substrate im Vergleich mit Penicillin G zu illustrieren, wurden die Penicillinarten jeweils in sterilen Lösungen aseptisch zu einer 120 - 144 h alten Zucht von Botrytis cinerea zugesetzt. Die Endkonzentration von Penicillin in der Brühe betrug vorteilhaft 5000 E/ml. Nach weiterer 24stündiger Fermentierung wurden Teilmengen von jeder Brühe von ihrem Mycel abgetrennt und Feststoffgehalt und abgemessene Volumina von jeder Probe auf Chromatographiepapier zum Vergleich, wie in Beispiel 1 beschrieben, aufgebracht.
Die Resultate sind unten in Tabelle IV als Einheiten/ml von 6-Aminopenicillansäure, gebildet in der Mischung von Enzym und Substrat, angegeben.
Tabelle 4
EMI5.5
<tb>
<tb> Penicillin <SEP> K <SEP> n-Butylthiomethylpenicillin <SEP> Mischung <SEP> von <SEP> natürlichem <SEP> Penicillin <SEP> Penicillin <SEP> G
<tb> 470 <SEP> IM <SEP> 250 <SEP> 48
<tb>
Beispiel 3: Die Mengen an 6-Aminopenicillansäure, gebildet aus einer Mischung von natürlichen Penicillinarten während 24 h bei 250C unter Verwendung von andern Arten von Mikroorganismen gemäss der Erfindung, sind im folgenden angegeben. Die Resultate sind angegeben als E/ml an 6-Amino- penicillansäure in der Mischung von Enzym und Substrat, bestimmt durch Umsatz zu Benzylpenicillin.
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EMI6.1
<tb>
<tb>
Mikroorganismen <SEP> 6-Aminopenicillansäure <SEP>
<tb> Hyphomyceten <SEP> und <SEP> Phycomyceten
<tb> Alternaria <SEP> tenuis <SEP> BRL. <SEP> 32 <SEP> 25
<tb> Aspergillus <SEP> versicolor <SEP> BRL. <SEP> 78 <SEP> 30
<tb> Epicoccum <SEP> nigrum <SEP> BRL. <SEP> 64 <SEP> 10
<tb> Fusarium <SEP> roseum <SEP> BRL. <SEP> 46 <SEP> 20
<tb> Fusarium <SEP> oxysporum <SEP> BRL. <SEP> 116 <SEP> 30
<tb> Fusarium <SEP> sp. <SEP> BRL. <SEP> 205 <SEP> 10
<tb> BRL. <SEP> 221 <SEP> 40
<tb> BRL. <SEP> 226 <SEP> 30
<tb> BRL. <SEP> 236 <SEP> 25
<tb> Mucor <SEP> hiemalis <SEP> BRL. <SEP> 52 <SEP> 10
<tb> Mucor <SEP> sp. <SEP> BRL. <SEP> 63 <SEP> 20
<tb> Mucor <SEP> sylvaticus <SEP> BRL. <SEP> 84 <SEP> 10
<tb> Mucor <SEP> sp. <SEP> BRL. <SEP> 85 <SEP> 20
<tb> Pénicillium <SEP> chrysogenum <SEP> 51. <SEP> 20c <SEP> 10
<tb> Penicillium <SEP> sp. <SEP> BRL. <SEP> 11 <SEP> 5
<tb> BRL.
<SEP> 92 <SEP> 5
<tb> BRL. <SEP> 93 <SEP> 15
<tb> BRL. <SEP> 129 <SEP> 30
<tb> Phoma <SEP> sp. <SEP> BRL. <SEP> 65 <SEP> 20
<tb> Trichoderma <SEP> viride <SEP> BRL. <SEP> 82 <SEP> 10
<tb> Hefearten
<tb> Cryptococcus <SEP> albidus <SEP> N. <SEP> C. <SEP> Y. <SEP> C. <SEP> 445 <SEP> 15
<tb> Trichosporon <SEP> sp. <SEP> N. <SEP> C. <SEP> Y. <SEP> C. <SEP> 384 <SEP> 10
<tb> Actinomyceten
<tb> Streptomyces <SEP> sp. <SEP> BRL. <SEP> 157 <SEP> 20
<tb> BRL. <SEP> 188 <SEP> 100
<tb> BRL. <SEP> 190 <SEP> 30
<tb> BRL. <SEP> 192 <SEP> 20
<tb> BRL. <SEP> 194 <SEP> 100
<tb> BRL. <SEP> 200 <SEP> 20
<tb> BRL. <SEP> 206 <SEP> 40
<tb> BRL. <SEP> 290 <SEP> 5
<tb> BRL. <SEP> 314 <SEP> 60
<tb> Streptomyces <SEP> lavendulae <SEP> A. <SEP> T. <SEP> C. <SEP> C. <SEP> 13665 <SEP> 80
<tb>
PATENTANSPRÜCHE :
1.
Verfahren zur Herstellung von 6-Aminopenicillansäure, dadurch gekennzeichnet, dass ein Penicillin der allgemeinen Formel
EMI6.2
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