DE2038693B2

DE2038693B2 - Verfahren zum Züchten von Hefe

Info

Publication number: DE2038693B2
Application number: DE2038693A
Authority: DE
Inventors: Hajime Kawaharada; Yoshio Shimada; Kenji Suzuki; Fumio Kobe Tanaka; Kiyoshi Takasago Watanabe
Original assignee: Kanegafuchi Kagaku Kogyo Kk Osaka (japan)
Current assignee: Kanegafuchi Kagaku Kogyo Kk Osaka (japan)
Priority date: 1970-03-03
Filing date: 1970-07-30
Publication date: 1973-11-22
Also published as: DK126695B; BE753753A; JPS4843877B1; FR2083777A5; US3725200A; DE2038693A1; GB1307434A; NL7010338A; DE2038693C3

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Züchten von Hefe unter aeroben Bedingungen und üblichen pH- und Temperaturverhältnissen in einem iihiidien Nährmedium, das η-Paraffine als Hauptkohlenwasserstoffe enthält.

Eine große Anzahl von Mikroorganismen, die Kohlenwasserstoffe assimilieren, sind seit langem bekannt, und in den letzten Jahren sind zahlreiche Vorschläge zur Produktion von Mikroorganismenzellen unter Verwendung von Erdöl als Rohmaterial gemacht worden. Die bekannten Hefestämme waren jedoch vom Standpunkt der Ausbeute, des Proteingehaltes und der Wachstumsgeschwindigkeit der Hefezellen nicht zufricdjnsteliend, wodurch Schwierigkeiten hei der kommerziellen Herstellung von Hefezellen entstanden sind.

Aus der britischen Patentschrift 1 168 835 sind die Hefen Candida pulcherrima CBS 610, Candida utilis variati major CBS 841 und Candida tropicalis CBS 2317 bekannt. Es wurde festgestellt, daß bei 48stündiger Schüttelkultivierung Candida puicherrima CBS 610 und Candida utilis variati major CBS 814 in n-Paraffinen kein Wachstum zeigten. Candida tropicalis CBS 2317 vermag η-Paraffine zu assimilieren, doch sind beim Züchten dieses Hefestammes in n-Paraffine enthaltenden Nährmedien die erzielte Ausbeute an Hefezellen, der Rohproteingehalt und die Wachstumsgeschwindigkeit noch nicht befriedigend.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zum Züchten von Hefe unter aeroben Bedingungen und üblichen pH- und Temperaturverhältnissen in einem üblichen Nährmedium, das n-Paraffine als Hauptkohlenwasserstoffe enthält, zur Verfügung zu stellen, durch das die Ausbeute an Hefezellen, der Rohproteingehalt der Zellen und die Wachstumsgeschwindigkeit der Hefezellen gegenüber bekannten Hefen wesentlich erhöht werden

Diese Aufgabe wird nach der Erfindung dadurch gelöst, daß man als Hefe Candida novellus ATCC 20275 einsetzt.

Der neue Hefestamm Candida novellus ATCC20275 wurde bei der Entnahme von Bodenproben von verschiedenen Orten gefunden. Dieser Stamm vermag in ausgezeichneter Weise n-Paraffine zu assimilieren, mit hoher Geschwindigkeit zu wachsen und Zellen mit hohem Proteingehalt zu ergeben. An Hand von taxonomischen Untersuchungen wurde festgestellt, daß es sich bei diesem Stamm um eine neue Art handelt.

Candida novellus ATCC 20275 weist die folgenden mikrobiologischen Eigenschaften auf:

1. Vegetative Zellen.

Nach 3 Tagen in Malzextrakt von 25 C besaßen die Zellen runde bis ovale Form und eine Größe von 3 bis 6 - 4 bis S μ. Vegetative Vermehrung durch multilaterale Sprossung,
ίο 2. Ascosporen.

Gebildet weder auf Gipsblock. Gorodkowa-Agar noch auf Karottenstopfen, V-S-Agar oder Natriumacetatagar.

3. Mycel ⁿseudomycel), Blastosporen, usw.

Pseud, iycel entwickelt sich gut auf einer Kartoffelagarscheibe, ebenso werden Blastosporen und Blastokonidien reichlich gebildet.

4. Kolonienbildung.

Nach einem Monat bei 17" C ist die Ausstrichkultur erhöht, cremefarben, glatt und glänzend mit ganzer Kante.

II. Physiologische Eigenschaften

Optimale Wachstumsbedingungen:
pH 5,0, Temperatur 30° C, aerob.
Wachstumsbedinguneen:
pH 2,5 bis 9,0, Temperatur 2 bis 39⁰C.
Assimilation von Nitrat:
Fehlt.

Reaktion in Lakmusmilch:
Keine Koagulation; Farbveränderung nach Blau. Beständigkeit gegen osmotischen Druck (auf 10°/₀igem Natriumchloridmedium):
Nicht vorhanden.
Verflüssigung von Gelatine:
Positiv.

Vitaminbedürftigkeit:
Benötigt Biotin.

Bildung von Karotinoid-Pismenten:
Fehlt.

Ausnutzung von Äthanol:
Positiv.

Spaltung von Arbutin:
Positiv.
Esterbildung:
Nicht vorhanden.

Bildung von stärkeartiger Substanz:
Fehlt.

Säurebildung:
Nicht vorhanden.
Ausnutzung von Stickstoff quellen:
Pepton, Ammoniumsulfat, Harnstoff und Asparagin werden ausgenutzt.
Pellikelbildung:

Nach einem Monat in Malzextrakt bei 17⁰C wird ein Ring gebildet.
Fermentation:
Glukose (-)-), Galaktose (schwach), Saccharose (+), Maltose (sehr schwach), Laktose (—), Raffinose (—).

17. Ausnutzung von Kohlenstoffquellen:

Glukose (+), Mannose (+), Galaktose (+), Fruktose (+), Laktose (—), Saccharose (+), Maltose (+), Trehalose (+), Raffinose (-), Aesculin (+), a-Methylglukosid (+), Dextrin (—),

25	1
	2 3
30	4
	5
35	6
	7
40	8
	9 10
45	Ii
	12
50	13
	14
55	15
	16
60

Stärke! ·-). Inulin( —"), Melibiose( ). Xylose( · ). Arabinose (—), Salicin ( -).

Eine vergleichende Untersuchung der obieen niorpholosischen und physiologischen Eigenschaften wurde auf der Grundlage des Verfahrens nach L ο d d e r e: al. in »The Yeasts. A Taxonomic Study. 1952. durchgeführt. Es wurde gefunden, daß drei Stämme*, nämlich Candida tropicalis, Candida guilliermondii und Candida parapsilosis. der erfindürTgsgemäß verwendeten neuen Art ähnlich sind. Es isfjedoch deutlich, daß sich die neue Art von Candida trnnicalis hinsichtlich der Fähigkeit, Maltose zu vergären und Stärke zu assimilieren, unterscheidet; von Candida guilliermondii unterscheidet sie sich hinsichtlich der"Fähigkeit, Raffinose zu vergären und zu assimilieren, hinsichtlich de. Fähigkeit, Arabinose zu assimilieren sowie hinsichtlich einer Reaktion in Lakmusmilch: und von Candida parapsilosis unterscheidet sie sich hinsichtlich der Fähigkeit, Saccharose zu vergären, und hinsichtlich der Fähigkeit, Arabinose und Salicin zu assimilieren.

Da e nige Zweifel hinsichtlich der Stabilität der vergärenden Eigenschaften bestanden, wurde eine Antigenanalyse der Stämme zur genaueren Identifikation gemäß dem serologischen Verfahren, das in »The Japan Journal of Medical Mycology«, S. 179 bis 190, Bd. 10, Nr. 3, November 1969, beschrieben ist, durchgeführt. Ak Ergebnis wurdt gefunden, dai3 die Antigenstruktur des erfindjngsgemäß verwendeten neuen Stammes hitzebeständiges Am gen 1, 2, 3_; 4, 13 ist.

Ein Vergleich mit den Antigenstrukturen der biologisch verwandten Arten zeigte die folgenden Ergebnisse:

Candida novellus 1, 2, 3, 4, 13,

Candida tropicalis 1, 2, 3, 4, 5, 6,

Candida guilliermondii 1, 2, 3, 4, 9,

Candida parapsilosis 1, 2, 3, 5, 13, 14, 15.

35

40

Diese Ergebnisse zeigen, daß Candida novellus sich in der Antigenstruktur von den drei nahe verwandten Arten klar unterscheidet.

Das Verfahren der Erfindung kann entweder ansatzweise oder kontinuierlich durchgeführt werden, wobei jedoch für eine Großproduktion der Hefezellen normalerweise ein kontinuierliches Züchtungsverfahren angewendet wird.

Das Ausgangsmaferial ist eine Kohlenstoffquelle, die sich hauptsächlich aus η-Paraffinen oder n-Paraffine enthaltenden Kohlenwasserstoffen zusammensetzt. Die verwendeten η-Paraffine enthalten 9 bis 30 Kohlenstoffatome pro Molekül und werden mittels der Molekularsiebmethode, über die Harnstoffeinschlußverbindung oder durch ähnliche Verfahren erhalten. Als η-Paraffine kommen z. B. Kerosin, Gasöl, oder rohe η-Paraffine, welche bei einem Verfahren zur Gewinnung von Erdölfraktionen gereinigt werden und mehr als 50% η-Paraffine enthalten, in Frage. Die Konzentrationen der η-Paraffine bei der kontinuierlichen Züchtung beträgt im allgemeinen 0,01 bis 1 %. Die Züchtungstemperatur liegt im Bereich von 25 bis 4O⁰C, vorzugsweise 27 bis 35°C. Der pH-Wert des Kulturmediums beträgt 3,5 bis 6,0, vorzugsweise 4,0 bis 5,0.

Dem Züchtungsmedium müssen außer der Kohlen- >toffquelle eine wachstumsfördernde Sub-tanz sowie anorganische Substanzen zugesetzt werden. Fs ist erforderlich, als wachstumsfördernde Substanz einj Spur an Biotin oder einem Homologen mit derselben Art der philologischen Aktivität wie Biotin, z. B. Desthiobiotin. oder 0.02 bis 0.5 "₀ eines Biotin enthaltenden Materials, z. B. Melassen. Hefeextrakte oder Maisquellwasser, zuzusetzen, da der erfindungsgemäße Stamm Biotin benötigt. Als weitere Ausgangsinaterialien werden Kalium-. Magnesium-. Zink- oder Eisenquellen verwendet, z. B. Kaliumchlorid. Magnesiumsulfat. Zinksu'iat. Eisensulfat oder Eisen(IlI)-sulfat: ferner werden wie hei jeder üblichen Züchtung von Hefe eine Stickstoffquelle, z. B. Ammoniak. Ammoniurr.sulfat oder Harnstoff, sowie eine Phosphorsäurequelle, wie Phosphorsäure. Mononatriumphosphat, Dinatriumphosphat, Monokaliumphosphat oder Dikaliumphosphat, zugesetzt. In Abhängigkeit von den Züchtungsbedingungen kann ein geeignetes Antischaummittel hinzugegeben werden, z. B. Sojabohnenöl, ein Silikonharz oder ein Fettsäurederivat. Während der Züchtung wird das Kulturmedium mit einem freien Sauerstoff enthaltenden Gas belüftet.

Obgleich die Züchtungsbedingungen für Candida novellus nicht spezialisiert sind, wird eine Züchtungsvorrichtung mit hohem Koeffizienten der Sauerstoffabsorptionsgeschwindigkeit bevorzugt, um die Ausbeute, den Proteingehalt und die Zellproduktivität der Hefezellen zu erhöhen.

In Vergleichsversuchen wurde festgestellt, daß Candida novellus ATCC 20275 den Stämmen Candida pulcherrima CBS 610, Candida utilis variati ATCC major CBS 841 und Candida tropicalis CBS 2317 überlegen ist.

Die Vergleichsversuche wurden folgendermaßen durchgeführt:

Die Kulturzusammensetzurig und die Kultivierungstemperatur waren die gleichen wie in dem nachfolgenden Beispiel 1. Ein Teil der Malzextraktschrägkultur wurde in einen Kolben eingeimpft, und das Gewicht der Trockenzellen wurde nach 48stündiger Schüttelkultivierung gemessen. Das Versuchsergebnis wird in der nachfolgenden Tabelle 1 wiedergegeben.

Candida pulcherrima CBS 610 und Candida utilis variati major CBS 841 zeigten keinerlei Wachstum, obwohl sie 2 Wochen gezüchtet wurden. Der Beurteilung nach hatten daher diese beiden Stämme nicht die Fähigkeit, η-Paraffine in Protein umzuwandeln.

Tabelle 1

Organismus

Candida novellus ATCC 20273 ....

Candida tropicalis CBS 2317

Candida pulcherrima CBS 610

Candida utilis variati major CBS 841

Trockenzellen (g/100 ml)

2,05
1,14
0
0

Die Tabelle 1 zeigt den Wachstumsgrad bei einem Zeitpunkt von 48 Stunden vom Beginn der Kultivierung an. Weil es zunächst nicht sicher war, ob der Unterschied zwischen den mit den beiden ersten Stämmen in der Tabelle 1 erzielten Ergebnissen auf eine

unterschiedliche Wachstumsgeschwindigkeit oder eine Stammausbeute, bezogen auf η-Paraffine, zurückzuführen ist, wurde die Änderung hinsichtlich des Gewichts der Trockenzellen innerhalb der Kukivierungszeit im Vergleichsversuch gemessen. Die erhaltenen Ergebnisse werden in der Tabelle 2 wiedergegeben.

Wie der Tabelle 2 zu entnehmen ist, i«t Candida novellus ATCC 20275 dem Candida tropicalis CBS 2317 hinsichtlich der Wachstumsgeschwindigkeit weit überlegen und auch hinsichtlich der Ausbeute merklich besser als der letztere.

Die Ergebnisse der Kultivierung in Jar-Fermentern werden in der Tabelle 3 wiedergegeben. Die Versuchsbedingungen waren die L'jichen wie in dem nachfolgenden Beispiel 1. Tabelle 2
Trockenzellen (g'100 ml)

Kulti\ierungszeit	Organismus	Can	diiia tropicals
	Candida novellus		CBS 2317
(Stunden)	ATCC 20275		0
12	0,35		0.11
24	1.63		0,57
36	2,07		1.16
48	2,10		1.43
60	2,04		1.52
72	2.00		1.46
S4	1.95		1.38
96	1.88

Tabelle

Organismus	Ausbeute an Zellen, bezogen auf n-Paraffin	Rohproteingehalt (°/„)	Wachstums geschwindigkeit
Candida novellus ATCC 20275 Candida tropicalis CBS 2317	107,2 90,2	58,3 51,6	0,30 0,18

Wie der Tabelle 3 zu entnehmen ist, ist Candida tropicalis CBS 2317 dem Stamm Candida novellus ATCC 20275 hinsichtlich der Zellenausbeute. des Rohproteingehalts und der Wachstumsgeschwindigkeit weit unterlegen.

Beispiel 1

200 ml eines Züchtungsmediums, das aus 2⁰I₀ η-Paraffinen (Reinheit 98%, C₁₀ bis C₂₁), 0,2% Phosphorsäure, 0,2% KCl, 0,06% Ammoniumsulfat, 0,2% Harnstoff, 0,06% MgSO₄ · 7H₂O, 30 ppm ZnSC₄-7H₂O, 50 ppm FeSO₄ ■ 7H₂O, 100 ppm CaU₂ · /H₂O, 0,1 % Melassen und Leitungswasser (mit NaOH auf pH 6,0 neutralisiert) bestand, wurde jeweils in 2-1-Schüttelkolben eingegossen und dann im Autoklav sterilisiert; das Medium wurde dann auf pH = 6,0 eingestellt. Candida novellus ATCC 20275, Candida tropicalis, Candida lipolytica bzw. Pichia miso mogii wurden in die Züchtungsmedien eingeimpft. Jeder der Stämme wurde 24 Stunden lang der Schüttelkultur unterworfen, um eine Einsaatkultur zu erhalten.

20 Liter einer Nährfiüssigkeit mit derselben Zusammensetzung wie das obige Züchtungsmedium, die jedoch keinen Harnstoff enthielt, wurden jeweils in einen Jar-Fermenter von 30 Liter Inhalt eingegossen und 15 Minuten lang bei 120^cC sterilisiert. NaiJiucm der pH-Wert auf 6,0 eingestellt worden war, wurden 600 ml von jeder der Einsaatkultu/en in die jeweilige Nährflüssigkeit eingeimpft. 5%iger wäßriger Ammoniak wurde hinzugegeben, um den pH-Wert der Nährflüssigkeit bei 4,5 zu halten. Die Züchtung wurde bei

4c 3O⁰C unter Rühren mit 700 UpM durchgeführt, während mit einer Geschwindigkeit von 30 Litern pro Minute belüftet wurde. N'pchdem der Ammoniakverbrauch abgebrochen worden war, wurden die erhaltenen Zellen abgetrennt und mit Wasser gewaschen.

Die Ausbeute der Zellen, der Gehalt an Rohprotein und die Wachstumsgeschwindigkeiten wurden ermittelt. Die Ergebnisse zeigt die folgende Tabelle.

Art	Ausbeute an Zellen, bezogen auf n-Paraffin(%)	Rohproteingehalt (%)	Wachstums geschwindigkeit
Candida novellus ATCC 2O?75 Candida tropicalis Candida lipolytica Pichia miso mogii	105,6 98,2 101,5 105,3	57,8 54,8 45,6 43,2	0,29 0,26 0,23 0,24

_R . . . Auch hier wurde jede der Einsaatkulturen in einen

e 1 s ρ 1 e l l Jar-Fermenter übertragen. An der logarithmischen

Es wurden die gleichen Einsaatkulturen, Nähr- 65 Wachstumsphase wurde die Züchtung in eine konti-

flüssigkeiten für die Hauptzüchtung (mit der Abwand- nuierliche Züchtung umgewandelt. Während der kon-

lung, daß an Stelle von Melasse Hefeextrakte verwen- tinuierlichen Züchtung wurde eine Nährflüssigkeit mit

det wurden) und Stämme wie im Beispiel 1 verwendet. der gleichen Zusammensetzung, wie sie die im Bei-

spiel 1 angegebene Nährflüssigkeit aufweist, die jedoch kein η-Paraffin enthielt, kontinuierlich zugesetzt, wobei eine getrennte kontinuierliche Zuführung von η-Paraffinen (Reinheit 99°/₀, C₁₅ bis C₂₃) erfolgte, während die Konzentration der Zellen bei 1,7 bis 1,9% und die Konzentration des n-Paraffinsubstrates bei 0,1 bis 0,3% gehalten wurden. Die Züchtung wurde

bei 33°C unter Rühren mit 1000 UpM durchgeführt, während mit einer Geschwindigkeit von 30 Litern pro Minute belüftet und der pH-Wert bei 4,5 gehalten wurde. pH-Wert und Temperatur wurden automatisch geregelt. Die Züchtung wurde nach einem Zeitraum von 200 Stunden abgebrochen. Die erhaltenen Ergebnisse sind unten aufgeführt.

Art	Ausbeute an Zellen, bezogen auf n-Paraffin (%)	Rohproteingehalt (%)	Zellproduktivität (g/l/h)
Candida novellus ATCC 20275 Candida tropicalis Candida lipolytica Pichia miso mogii	106,5 99,1 100,1 103,9	58,1 52,5 46,5 44,5	4,2 3,4 2,8 3,5

Beispiel 3

Eine Einsaatkultur und eine kontinuierliche Züchtung wurden unter den gleichen Bedingungen wie im as Beispiel 2 unter Verwendung von Candida novellus ATCC 20275 durchgeführt. Als Grundflüssigkeit für die kontinuierliche Züchtung wurde jedoch ein Medium verwendet, das die gleiche Zusammensetzung wie im Beispiel 2 hatte, mit der Abwandlung, daß die Hefeextrakte fortgelassen wurden. Statt dessen wurden Biotin, Maisquellwasser, Hefeextrakt bzw. Melassen hinzugegeben. Die Züchtung wurde 120 Stunden lang kontinuierlich durchgeführt. Folgende Ergebnisse wurden erhalten:

Zusatz zum Grundmedium

	Ausbeute an Zellen,	Rohprotein	57,0	Zell
Evonzcn*	bezogen auf	gehalt	57,9	produktivität
t ration	n-Paraffin (%)	(%)	58,2	(g/l/h)
—	keine Vermehrung*)	57,0
	105,5	56,8	4,0
10 μ^	103,0	4,3
0,2%	101,5	4,7
0,05%	106,0	4,1
0,1%	103,0	4,5

Kein Zusatz

Biotin

Maisquellwasser
Hefeextrakte ...
Melassen

*) Die kontinuierliche Züchtung wurde nach 32 Stunden abgebrochen.

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zum Züchten von Hefe unter aeroben Bedingungen und üblichen pH- und Femperaturverhältnissen in einem üblichen Nährmedium, das n-Paraffine als Hauptkohlenv.asserstoffe enthält, dadurch gekennzeichnet, daß man als Hefe Candida novellus ATCC 20 275 einsetzt.

I. Morphologische Eigenschaften