DE2757877C3 - Herstellung von Biomassen - Google Patents
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Description
Erfindungsgegenstand ist das im Patentanspruch angegebene Verfahren.
Für die Herstellung von Biomassen werden seit langem Abfall-Kohlenhydrate, wie Melassen aus Zukkerraffinerien
oder Sulfitablaugen aus der Zellstoff-Gewinnung, verwendet. In jüngerer Zeit wurden wegen der
leichten Verfügbarkeit und des günstigen Preises von Erdöl auch Herstellungsverfahren für Biomassen
entwickelt, bei denen als Substrate entweder Rohölfraktionen oder hochgereinigte Gemische von normalen
Paraffinen eingesetzt werden. Bei der Verwendung derartiger Substrate auf Erdölbasis treten aber technologische
Schwierigkeiten bzw. Nachteile auf, die auf der Unlöslichkeii der Erdölprodukte in Wasser, der für die
Assimilation durch die Mikroorganismen benötigten großen Sauerstoffmenge und der großen Warmeentw-.rklung
während der Fermentation beruhen. Außerdem werden die laufenden Herstellungskosten von
Biomassen noch dadurch erhöht, daß das Substrat gründlich gereinigt und/oder die produzierte Biomasse
sorgfältig gewaschen werden muß, um potentiell schädliche Erdölkomponenten zu entfernen.
Diese Schwierigkeiten treten nicht auf. wenn als Substrat bei der Erzeugung von Biomassen niedere
Alkohole, wie Methanol oder Äthanol, eingesetzt werden, die mit Wasser beliebig mischbar und leicht
flüchtig sind und sehr rein zur Verfügung stehen. Es gibt daher keine Mischproblcme wie bei den Erdölfraktioneu:
außerdem wird, da diese niederen Alkohole bereits Sauerstoff in ihrem Molekül enthalten, der Sauerstoffbedarf
für ihre Assimilation entsprechend reduziert: Hieraus ergibt sich als weiterer Vorteil, daß die
Erzeugung der Biomasse von einer geringeren Warniecntwickliing
begleite! ist. so daß die Kosten für die
notwendige Kühlung entsprechend gesenkt werden können.
Allianol wird von zahlreichen Mikroorganismen
genutzt und wäre das ideale Substrat für die I lerslellung von Biomassen, ist aber vergleichsweise teuer. Methanol
ningegen kann billig und mil hohem Reinheitsgrad hergestellt werden. Diese Tatsache erklärt die Bemühungen,
die darauf verwendet wurden, Mikroorganismen aufzufinden, die in der Lage sind. Methanol
wirkviiii ;iin/uniit/t'ii. In der technischen sowie
Pateniliieratur werden zahlreiche Mikroorganismen genannt, die diese Forderung erfüllen, aber die bisher
beschriebene Wirksamkeit von liefen ist ziemlich gering.
In der GB-PS 11 Vt Kb1S werden verschiedene
Bakterien und Hefen, darunter Candida alcomigas als Methanol verbrauchende Mikroorganismen beschrieben.
Allerdings muß bei diesen Verfahren entweder durchgehend bei einer Methanolkonzentration unter
0,02% oder mehrstufig in mehreren Tanks und in der Endstufe bei einer Endkonzentration an Methanol unter
0,02% gearbeitet werden, damit nicht Formaldehyd entsteht, die die erzeugte Zellmasse für menschliche
oder tierische Ernährung ungeeignet macht. Für die großtechnische Erzeugung von Biomassen ist dieses
Verfahren nicht wirtschaftlich genug. Erfindungsgemäß wurde nun ein neuer Hefestamm, Candida NRRL-Y
11062, aufgefunden, der in sehr wirtschaftlicher Weise
die Herstellung von Biomassen, ausgehend von Methanol als einziger Quelle für Kohlenstoff und
Energie ermöglicht.
Aufgrund der hohen Geschwindigkeit der Reproduktion dieses Hefestammes und seines Proteingehaltes
kann mit seiner Hilfe außerordentlich schnell Protein erzeugt werden.
Gegenstand der Erfindung ist das im Patentanspruch näher bezeichnete Verfahren zur Herstellung von
Biomassen unter Verwendung des neuen Hefestammes NRRL-Y 11062.
Der Stamm Candida NRRL-Y 11062 wird durch
multipolare Keimung oder Sprossung reproduziert und bildet einzelne eiförmige Zellen oder Büschel, die aus
einer Anzahl von länglichen Zellen bestehen (Pseudomycelium).
In einem flüssigen Nährmedium bildet der Stamm ein Sediment, auf festem Nährboden hingegen entweder
glatte und glänzende Kolonien oder opake und faltige bzw. runzelige Kolonien. Durch Nachzüchten des
Stammes auf einem festen Nährboden nimmt der Stamm mehr und mehr ein glattes und glänzendes
Aussehen an. das in einem flüssigen Medium den einzelnen Zellen entspricht, während beim Züchten des
Stammes in einem flüssigen Nährmedium unter bestimmten Bedingungen die psuedomycclare Form
überwiegt, die den runzeligen und opaken Zellen entspricht. Keinerlei Sporen irgendeiner Art wurden
bisher beobachtet. Auf der Basis dieser morphologischen Eigenschaften wird angenommen, daß der Stamm
zur Gattung Candida gehört, entsprechend der Klassifizierung von |. Lodder, Herausgeber: »The Yeasts, a
taxonomic Study« 1970.
Die physiologischen Merkmale des Stammes Candida NRRL-Y I 1062 sind folgende:
1. Fermentative Nutzung cinigerC-Qiiellen
D-Glucosc +
D-Galaelose -
Saccharose -
Maltose
Trehalosc
Lactose
2. Wuchs
D-Glucosc f
D-Galactosc
I -Sorbose -
Saccharose -
Maltose
Cellobiose ι
Trehalose
I actosc
Melibiose
RaffiiKise
Meleeitose
Inulin
Stärke
D-XylQse +
1-Arabinosc +
D-Arabinosc —
D-Ribose + (schwach)
1-Rhamnose -
Äthanol +
Glycerin -
Erythrit -
Ribitol +
Galacticol
(vgl. Merck-Index, 8. Auflage) -
D-Mannit +
D-Glucitol +
Milchsäure -
Bernsteinsäure -
Citronensäure —
Inosit —
Nitrai —
kein Vitamin —
bei37"C +(schwach)
Der Vergleich der physiologischen Eigenschaften des Stammes Candida NRRL-Y 11062 mit den Eigenschaften,
wie sie in der Untersuchung von Lodder a.a.O. und in dem Buch »A new Key to the Yeasts« von J. A.
Barrett und R. J. Pankhurst. 1974, angegeben
sind, zeigt, daß der Stamm Candida N RRL-Y 11062 sich
von allen in diesen Druckschriften beschriebenen Hefearten unterscheidet.
In der technischen sowie in der Patentliteratur sind
bisher zahlreiche H Jen beschrieben worden, die in der
Lage sind. Methanol nutzbar zu fachen (vgl. C. L.
Cooncy und D. W. Le νi η c in »Single-Cell Protein
II« — MIT Press, 1975), aber aie Eigenschaften des
Stammes Candida NRRL-Y 11062 unterscheiden sich von den Eigenschaften aller anderen bisher bekannt
gewordenen Stämme.
Ein Merkmal sui generis des Stammes Candida NRRLY 11062 ist seine Fähigkeit, Methanol wirksamer
zu assimilieren als Äthanol. Der Stamm kann sowohl in diskontinuierlichen wie in kontinuierlichen Kulturen
gezüchtet werden, seine Eigenschaften werden aber in kontinuierlichen Kulturen besser ausgenützt.
Weiterhin kann aufgrund der Fähigkeit, ein Pscudomyceliiim
zu bilden, eine Kultur erhalten werden, die sich sehr leicht absetzt; dieses Merkmal oder diese
Eigenschaft kann bei der Ausführung der kontinuierlichen Kultur mit partieller Rückspeisung der Biomasse
genutzt werden, eine Tatsache, die einen höheren stündlichen Ausstoß ermöglicht. Das leichte Absetzen
erleichtert darüberhinaus das Sammeln oder Isolieren der Biomasse.
In der Praxis besteht das Verfahren darin, daß man
mit dem Stamm Candida NRRL-Y 11062 ein Kulturmedium bzw. einen Nährboden beimpft, der die wesentlichen
Elemente (N, P, K, Mg, Fe. Ca), die Wuchsfaktoren {Hcfccxlraktc und Biotin), mineralische Spurenelemente
sowie Methanol als Quelle für Kohlenstoff und
Energie enthält. Der Nährboden wird unter Rühren bei einer Temperatur im Itereieh von 20 bis 3.5'3C, am besten
j() bis JJ"C, und bei einem pH von 2,5 bis 6,5. am
günstigsten 4 bis 4,5, inkubiert. wobei kontinuierlich mit
einem sauerstoffhaltigen Gasgemisch, beispielsweise I.uft.belüftet wird.
Die llefe/.ellen. die sich zu Lasten der zur Verfügung
gestellten Nährstoffe vermehren, werden mittels Sedimentation
und Filtration gesammelt, mit Wasser gewaschen und unter Erwärmen getrocknet. Die
erhaltene Biomasse kann unmittelbar als solche als Protein-Integrator für Nahrungsmittel und Tierfutter
verwendet werden, oder es können wertvolle Stoffe daraus extrahiert werden, beispielsweise Proteine,
Aminosäuren und Nucleinsäuren.
Die folgenden Beispiele dienen zur näheren Erläuterung
der Erfindung:
Es wurden 500 ml Erlenmeyer-Kolben bereitgestellt, die jeweils 50 ml des folgenden Nährbodens enthielten:
KH2PO4
NaHjPO4 · H2O
NaHjPO4 · H2O
FeSO4 · 7 HoO
CaCI2
ZnSO4 · 7 H2O
Hefe-Extrakt
Biotin
Spurenelemente (Lösung)
2.0 g/l
2,0 g/l
5,0 g/l
2,0 mg/1
2,0 mg/1
2,0 mg/1
200,0 mg/1
25,0 μg/l
1 ml/l
2,0 g/l
5,0 g/l
2,0 mg/1
2,0 mg/1
2,0 mg/1
200,0 mg/1
25,0 μg/l
1 ml/l
Die Lösung der Spurenelemente, hergestellt in verdünnter HCI (1 ml konz. HCI in I I Wasser) hatte
folgende Zusammensetzung:
CuSO4 ■ 5 H2O
HjBO3
MnSO4 · H,O
Kl
CoCl. ■ 6 H2O
MoOj
200 mg/1
500 mg/1
500 mg/1
10 mg/1
10 mg/1
IO mg/1
500 mg/1
500 mg/1
10 mg/1
10 mg/1
IO mg/1
Der pH-Wert des Nährbodens wurde auf 5.0 gebracht, die Kolben wurden dann 20 Minuten bei
116'1C sterilisiert. Zu 2 Kolben wurden jeweils 0.75 ml
(1,9 Volumen-%, bezogen auf das Volumen) Methanol gegeben und die Kolben dann mit dem Stamm Candida
NRRL-Y 11062 in Schrägkultur beimpft. Die Kolben wurden 72 Stunden auf einer rotierenden Rührvorrichtung
inkubiert (220 UpM, Durchmesser der Verschiebung 3,5 cm), wobei die Temperatur von 32,5 C
thermostatisch gesteuert bzw. überwacht wurde.
Andere Kolben, die den gleichen Nährboden mit Zusatz von 1 Vol.-% Methanol, 2 Vol.-% Äthanol und
2% Gew./Vol. Glucose enthielten, wurden mit jeweils 5 ml der obigen Vorkultur beimpft. Nach 24stündiger
Inkubation wurden zu jedem Kolben weitere 1 Vol.-°/o
Methanol gegeben. Nach insgesamt 2Sstündigcr Inkubation wurde der Inhalt an Biomasse der einzelnen Kolben
gemessen und folgende Ergebnisse erhalten:
Substrat Optische Dichte Trockene Hioniiissi·
(I : lOJbeibbOnm l'n.icni
g/l %
Glucose | 0.340 | J.49 | 54.5 |
Methanol | 0.270 | 3.68 | 51.0 |
Äthanol | 0.095 | 1.18 | 54.1 |
ho Der Proteingehalt war mit Hilfe der Biuret-Methode
bestimmt worden,
h·, E-"in Fermenter mit Niitzvolumcn etwa 8 I. der den
Nährboden gemäß Beispiel I enthielt, wurde mit einer Suspension des Stammes Candida NRKI. Y 11062
beimpft. Die Temperatur des Fermenters wurde
thermostatisch bei 32,5°C gehalten; auüerdem wurde
Methanol zugegeben, um sicherzustellen, daß die Restkonzentration in der Bouillon zu keinem Zeitpunkt
1 Vol.-% überstieg. Nachdem die Kultur zufriedenstellend
gewachsen war, wurde mit der kontinuierlichen Zuspeisung des sterilen Nährboibns in den Fermenter
begonnen; der sterile Nährboden enthielt 29,6 g/l Methanol; gleichzeitig wurde eine Menge Nährboden-Kultur
abgezogen, die gleich war der zugesetzten Menge Nährboden. Die Einspeisungsmewge und AbzugsmengL·
wurden zunehmend erhöht, bis eine Verdünnungsgeschwindigkeit (D = Strömungsgeschwindigkeit
bei der Hinspeisung zu Volumen der Kultur) von 0,166 h ' erreicht worden war. Unter diesen
Bedingungen enthielt der abgezogene Strom 10,28 g/l trockene Biomasse sowie 146 ppm Rest-Methanol, mit
einer Ausbeute von 35% und einer stündlichen Erzeugung von 1,72 g/l Biomasse. Die so erhaltene
Biomasse enthielt 55,6% Proteine (Biuret-Tcst).
Ein Fermenter, wie in Beispiel I beschrieben, wurde mit einem Absetztank für den abgezogenen Strom ι >
verbunden, ein Teil des Nährboden-Kultur-Gemisches, angereichert mit Biomasse, wurde regelmäßig in den
Fermenter zurückgespeisl. Durch Zugabe von frischem Nährboden zu dem Fermenter, der 24 g Methanol/l
enthielt, mit einer solchen Strömungsgeschwindigkeit, ^n
daß eine Verdünnungsgeschwindigkeit von 0.267 h ' erreicht wurde, erzielte man in dem nicht zurückgeführten
Teil, der aus dem Absetztank abgezogen wurde, eine Mährboden-Kultur, die 7,80 g/l Biomasse und 120 ppm
Restmethano! enthielt, mit einer Ausbeute von 32,5% und einem stündlichen Ausstoß von 2,08 g/l. Die auf
diese Weise erhaltene Biomasse enthielt 53.0% Proteine (Biuret-Test).
Claims (1)
- Patentanspruch:Verfahren zur Herstellung von Biomassen mit hohem Proteingehalt durch Züchten eines Stammes der Gattung Candida bei einer Temperatur im Bereich von 20—3/5°C und einem pH-Wert von 23—6,5 auf einem Nährboden, der aus einer Salzlösung besteht, welche als einzige Kohlenstoff- und Energiequelle Methanol enthält, und Isolieren der erhaltenen Hefezellen, dadurch gekennzeichnet, daß man als Hefestamm Candida NRRL-Y 11062 einsetzt.
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