DE2461189A1

DE2461189A1 - Verfahren zur erzeugung von mikrobenzellen

Info

Publication number: DE2461189A1
Application number: DE19742461189
Authority: DE
Inventors: Yoshio Hirose; Yasushi Morinaga; Shigeru Yamanaka
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1973-12-26
Filing date: 1974-12-23
Publication date: 1975-07-10
Also published as: FR2256242B1; SU673185A3; GB1472008A; FR2256242A1; JPS5095490A; JPS5221591B2; US3930947A; IT1034078B

Description

Priorität: 26. Dezember 1973, Nr. 12O1/1Q;74, Japan Verfahren zur Erzeugung von Mikrobenzellen

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Erzeugen von Mikrobenzellen unter Verwendung von Methan als Hauptkohlenstoffquelle.

Methan ist eine der am besten zugänglichen und wirtschaftlichsten Kohlenstoffquellen für das Mikrobenwachsturn. Es ist bekannt, daß zahlreiche Mikroorganismen befähigt sind, auf einem Kulturmedium in Gegenwart von Methan als Hauptkohlenstoffquelle zu wachsen. Das Wachstum der meisten bekannten Stämme ist jedoch sehr gering und unbefriedigend. Bei Verwendung von Mischkulturen sind bereits Stämme mit besserem Wachstum bekannt. Wenn jedoch die Stämme isoliert werden, geht diese überlegene Eigenschaft des ursprünglichen Gemisches von Stämmen in gewissem Maß verloren (Applied Microbiology, 15, 1473-1478 (1967) und, 21, 511-515 (1971)). Bei Verwendung von Reinkulturen sind keine Stämme mit überlegenen Eigenschaften bekannt, die die Fähigkeit zur einem guten Wachstum zeigen. Da es schwierig ist, stabile Mischkulturen während einer grossen Anzahl von Wachstumszyklen aufrecht zu erhalten, ist die industrielle Herstellung von Einzellerprotein aus Methan noch problematisch.

Es wurde nun gefunden, daß ein neuer Stamm des Genus Methylomonas, der aus Bodenproben isoliert wurde, gutes Wachstum als Reinkultur auf einem Medium in Gegenwart von Methan als Hauptkohlenstoff-

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quelle zeigt. Die so erhaltenen Mikrobenzellen sind als Putter-' mittel geeignet.

Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zum Erzeugen von Mikrobenzellen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Methylomonas sp. PERM P-2400 in einem wässrigen Kulturmedium, das eine assi milierbare Stickstoffquelle und anorganische Salze enthält, in Gegenwart von Methan als Hauptkohlenstoffquelle züchtet, bis die Zellen des Stammes sich in dem Kulturmedium vermehrt haben, und die durch Vermehrung gebildeten Zellen aus dem Medium gewinnt.

Der neue Stamm Methylomonas Species AJ-3670 (PERM P-2400) wurde bei dem Permentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry for Industrial Trade and Industry, Chibe, Japan hinterlegt und ist bei dieser Hinterlegungsstelle frei erhältlich.

Der neue Stamm hat folgende kennzeichnende Eigenschaften: Mor^hologische^Eigenschaften^ (Züchtung durch Schüttelkultur in Gegenwart von Methan als einzigerKohlenstoffquelle während 18 Stunden in einem anorganischen flüssigen Medium bei 30° C): einzellige Stäbchen, Grosse 1,0 bis 1,2 χ 2,0 bis 3,5 /i, beweglich durch polare Geißeln, gram negativ, die Zellen werden jedoch in der frühen Wachstumsphase manchmal partiell positiv angefärbt. Manchmal tritt Rosettenbildung auf. Es werden keine Sporen oder Zysten gebildet.

(Züchtung auf anorganischem Schrägagar in einer Atmosphäre, die aus Methan als Hauptkohlenstoffquelle besteht, während 24 Stunden): Stäbchen, die manchmal Pleomorphismus zeigen, Grosse 1,0 bis 1,2 χ 3 bis 6 u. Die Zellen sind durch schleimartige Substanzen miteinander verklebt und manchmal sind Gestalten mit verzweigtem Aussehen zu erkennen. In den Zellen sind körnige Substanzen festzustellen, die leicht mit Sudanschwarz angefärbt werden, es werden keine Sporen oder Zysten gebildet.

Typ der Agarkolonien: (Gezüchtet auf anorganischem Plattenagar

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in Gegenwart von Methan während 16 Tagen ): Durchmesser 1,0 mm, kreisförmig, flach, glatt, zusammenhängend, tmtterartig (butyrous), weiß bis chamoisfarbig, opak. Bilden kein lösliches Pigment. (Nähragarplatten): Kein Wachstum

Katalase: Positiv. Oxydase:Positiv in junger Kultur, die Oxydaseaktivität geht jedoch in älteren Kulturen leicht verloren. Nitrat wird zu Nitrit reduziert. Optimale Wachstumstemperatur: 35 bis 37° 0, kein Wachstum bei 40° C.
Optimaler Wachstums-pH-Wert:6,0 bis 7»5. Aerob.

Ausnutzung von organischen Verbindungen als einzige Kohlenstoffquelle:

Unter den verschiedenen organischen Verbindungen, die geprüft wurden, ist Methan die einzige ausnutzbare organische Kohlenstoffquelle. Alkohole, wie Methanol· oder Äthanol, Aldehyde, wie Formaldehyd oder Acetaldehyd, Alkylamine, wie Methylamin oder Äthylamin, organische Säuren (in Form der Salze), wie Formiate, Acetate, Citrate, Succinate, Pyruvate, Oxalate oder Gluconate, Kohlenhydrate, wie D-Glucöse, Fructose, Saccharose, D-Ribose, D-Xylose, Lactose, D-Galactose, L-Rhamnose, D-Arabinose, D-Maltose oder D-Mannose und natürliche organische Nährstoffe, wie lösliche Stärke, Hefeextrakt, Peptone, Casaminosäuren, Maisquellwaseer oder Sojabohnenhydrolysate werden nicht ausgenutzt. Verschiedene organische Verbindungen haben auf das Wachstum des Stammes FERM-P 2400 in Gegenwart von Methan folgende Wirkungen: Methanol, Äthanol, Formaldehyd, Acetaldehyd, Methylamin, Athylamin, Formiat, Gitrat, Pyruvat und Nucleotide haben inhibierende Wirkungen. D-Glucase₍ Fructose, D-Xylose, lactose, D-Galactose, D-Arabinose' und D-Mannose zeigen keine Wirkung. D-Ribose stimuliert das Wachstum* Casaminosäuren, Maisquellwasser und Sojabohnenhydrolysat haben keine Wirkung auf das Wachstum, jedoch Hefeextrakt und Peptton stimulieren das Wachstum. Die vorstehend erläuterten Ergebnisse wurden durch nachstehende Versuchsmethoden erhalten. Die verschiedenen zu prüfenden Substanzen wie Alkohole ₉ Kohlenhydrate, orga-

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nische Säuren und natürliche organische Nährstoffe, wie Hefeextrakt, wurden in einer Menge von 0,1 $> dem anorganischen flüssigen Medium zugesetzt. Die Testkulturen wurden nach dem Animpfen mit den Bakterien zwei "bis.vier Tage bei 30 C geschüttelt. Die wachsenden Kulturen wurden durch Tests auf die Kohlenstoffassimilation und auf die Wirkungen von organischen Verbindungen auf das Wachstum unter Methanatmosphäre geprüft. Bei Verwendung von Aldehyden und Alkylaminen wurde in den vorstehend genannten Versuchen eine Konzentration von 0,05 % eingehalten. Das Medium, das für die morphologischen Beobachtungen, die Versuche zur Ausnutzung von organischen Verbindungen und andere vorstehend beschriebene Tests verwendet wurde, hatte folgende Zusammensetzung:

KH₂PO₄	•	12 HgO
Na₂HPO₄	7	HgO
MgSO₄ ·	7	HgO
PeSO₄ ·	5	HgO
CuSO₄ · -

Medium (NH₄)gSO₄ 0,5 g/1

0,3 "

1,8 »

0,2 »

10 mg/1

1,0 mg/1 pH-Wert · 7,2

Die Züchtung in Gegenwart von Methan wurde in einer aus 20 $> Methan und 80 $ luft bestehenden Atmosphäre durchgeführt. Die üblichen physiologischen Tests, die zur Identifizierung von üblichen Bakterien angewendet wurden, beispielsweise der Methylrot-Test, sowie die Tests auf Bildung von Schwefelwasserstoff oder auf Säurebildung aus Kohlehydraten, wurden nach üblichen Methoden vorgenommen. und ausgewertet. Es wurde jedoch kein Wachstum bei dem Methan oxydierenden Bakterium gemäß der Erfindung beobachtet und die erwarteten Ergebnisse wurden nicht erzielt.

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Pur Methan oxydierende Bakterien existiert ein offizielles Klassifizierungssystem. Am verbreitetsten angewendet wird jedoch das von R. Whittenbury et al (Journal of General Microbiology, 61, 205 - 218 (1970) vorgeschlagene Klassifizierungssystem. In diesem System sind Methan oxydierende Bakterien aufgrund ihrer morphologischen Eigenschaften in fünf Gruppen eingeteilt. Es handelt sich um die Gruppen Methylosinus, Methylocystis, Methylomonas, Methylobacter und Methylococcus.

Die Eigenschaften des erfindungsgemäßen Stammes wurden mit den in der Veröffentlichung von R. Whittenbury angegebenen Eigenschaften verglichen, wobei festgestellt wurde, daß der erfindungsgemäß verwendete Stamm dem Genus Methylomonas angehört. Der Stamm unterscheidet sich von dem Genus Methylosinus dadurch, daß er keine Exosporen bildet. Er gehört auch dem Genus Methylocystis nicht an, aufgrund seiner Motilitatseigenschaften. Da die Zellen, stäbchenförmig sind, kann der Stamm nicht dem Genus Methylococcus angehören.

Die verbleibenden zwei Genera werden aufgrund der Zystenformen unterteilt und was die anderen morphologischen Eigenschaften betrifft, sind in dieser Veröffentlichung nur die von Methylomonas methanica und Methylobacter chromococcum angegeben. Entsprechend dieser Veröffentlichung bestehen die Schlüsseleigenschaften des Genus Methylobacter darin, daß Zysten des Azotobacter-Typs gebildet werden und daß Ähnlichkeit mit den große Zellen bildenden Spezies von Azotobacter besteht. Andererseits bilden einige Stämme des Genus Methylomonas keine Zysten und zeigen keinen Pleomorphismus. Diese Eigenschaften sind in Tabelle 1 aufgeführt. Ob-,wohl der erfindungsgemäße Stamm gewissen Pleomorphismus auf anorganischem Schrägagar zeigt, zeigt er in einem flüssigen KuI tur^· medium keinen Pleomorphismus und bildet keine Zysten. Darüber hinaus wird bei fortgesetzter Subkultur die Zellform nicht verändert. Diese Tatsachen zeigen ebenfalls an, daß der Stamm dem Genus Methylomonas angehört. Die Eigenschaften des Stammes wurden mit den Eigenschaften sämtlicher Arten des Genus Methylomonas, die in der Veröffentlichung beschrieben sind, verglichen. Da

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sich zeigte, daß die Eigenschaften des Stammes verschieden von denen des bekannten Stammes sind, wird der erfindungsgemäß verwendete Stamm als neuer Stamm angesehen, der als Methylomonas sp. PERM P-2400 bezeichnet wird. Wie aus Tabelle 2 ersichtlich ist, sind die bekannten Stämme Methylomonas albus und Methylomonas agile befähigt, bei einer Temperatur von 37 C zu wachsen. Der erfindungsgemäße Stamm ist ebenfalls zum Wachstum bei dieser Temperatur befähigt. Die bekannten Stämme unterscheiden sich jedoch von dem erfindungsgemäßen Stamm durch die Assimilation von Methanol. Die Assimilation von Methanol wird als wichtiger Faktor für die Klassifizierung von Methan oxydierenden Bakterien angesehen. Der erfindungsgemäße Stamm assimiliert nicht nur Methanol nicht, sondern sein Wachstum wird sogar durch Methanol in Konzentrationen von 0,1 % stark gehemmt. Beim Vergleich mit den Eigenschaften der in Tabelle 2 beschriebenen Eigenschaften sämtlicher Stämme des Genus Methylobacter ist klar ersichtlich, daß kein Stamm des Genus Methylobacter existiert, der dem erfindungsgemäßen Stamm entspricht.

In der Veröffentlichung von R. Whittenbury ist Methanomonas methanooxidans nicht erwähnt. In den Veröffentlichungen von L. R. Brown et al (Canadian Journal of Microbiology, 10, 791-799 (1964)) und P. K. Stocks et al (Journal of Bacteriology, 88, 1071-1077 (1964)) wird jedoch ausgeführt, daß Methanomonas methanooxidans Methanol assimilieren kann. Dadurch ist sichergestellt, daß der erfindungsgemäße Stamm auch verschieden ist von Methanomonas methanooxidans.

Das für das Wachstum von Zellen dieses Bakteriums verwendete Kulturmedium enthält mindestens eine assimilierbare Stickstoffquelle und anorganische Salze. Das Vorliegen einer geeigneten Menge organischer Nährstoffe, wie von Peptonen und Hefeextrakt, kann das Mikrobenwachstum fördern. Das Kulturmedium wird in ein Kulturgefäß gegeben, das dicht verschlossen, sterilisiert und mit einer Impfkultur des erfindungsgemäßen Stammes inokuliert werden kann. Gasförmiges Methan und gasförmiger Sauerstoff werden in üblicher Weise in das Gefäß eingeleitet. Gemeinsam mit den beiden vorstehend erwähnten Gasen werden vorzugsweise 1 bis 5 Gew.-96 gasförmiges Kohlendioxid zugesetzt, weil eine geeignete Menge des Gases

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die lag-Phase des Wachstums (Anlaufphase) verkürzen kann.

Der Ursprung des verwendeten Methans unterliegt keinerlei Beschränkung. So kann Naturgas, das durch Methangärung unter anaeroben Bedingungen gebildete Gas oder Methan aus anderen üblichen Quellen verwendet werden. Als gasförmiger Sauerstoff kann das reine Gas oder Luft verwendet werden.

Die erforderliche Menge jedes Gases kann zunächst in das Gefäß eingeschlossen werden und während der Fermentation in nicht kontinuierlicher Verfahrensweise durch frisches Gas ersetzt werden. Gemäß einer anderen Ausführungsform kann auch jedes Gas in Form einer üblichen Belüftung kontinuierlich eingeleitet werden, wobei die Gase gesondert oder in Form eines; Gemisches zugeführt werden können.

Zu typischen geeigneten Stickstoffquellen gehören Ammoniumsalze, wie Ammoniumsulfat und Ammoniumchlorid, Nitrate, wie Kaliumnitrat und Ammoniumnitrat, wässriges Ammoniak \md gasförmiges Ammoniak. Während der Fermentation wird die Konzentration der Ammoniumsalze vorzugsweise bei einem Wert von 0,03 bis 0,2 $ gehalten.

Als anorganische Salze werden Verbindungen verwendet, wie sie bei üblichen Verfahren eingesetzt werden. Dazu gehören beispielsweise Kaliumphosphate, Magnesiumsulfat, lerrosulfat und Kupfersulfat.

Die Züchtung wird 1 bis 7 Tage durchgeführt, wobei die Temperatur bei 20 bis 38° C gehalten wird. Der pH-¥ert des Mediums wird im allgemeinen bei 5 bis 8 gehalten. Wenn Ammoniumsalze als Stick stoffquelle verwendet werden, wird das in dem Kulturmedium vorliegende Ammoniak während der Züchtung verbraucht, wobei der pH- Wert des Mediums vermindert wird. In diesem Fall ist es erforderlich, alkalische Verbindungen, wie Ammoniak, dem Medium während der Züchtung zuzusetzen.

Die Bakterienζeilen können mit Hilfe üblicher Methoden, wie durch

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Zentrifugieren oder Filtration, aus der Fermentationsbrühe gewonnen werden.

Da die erfindungsgemäß gebildeten Bakterienzellen wesentliche Mengen an Eiweiß enthalten, sind sie als Futtermittel, Nahrungsmittel und dergleichen geeignet. Das Eiweiß oder Protein kann mit Hilfe üblicher Verfahren aus den Zellen gewonnen oder extrahiert werden.

Die Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele verdeutlicht. Beispiel 1

Es wurden 20 ml eines wässrigen Kulturmediums folgender Zusammensetzung verwendet:

(WH₄)₂S0₄ 0,5 g/l

KH₂PO₄ 0,3 "

Na₂H PO₄ . 12 Η_£0 1,8 "

MgSO₄ . 7 H₂O 0,2 «

PeSO₄ · 7 H₂O 10 mg/1

CuSO₄ · 5H₂O 1,0 » pH 7,2

.Das Medium wurde in einen 500 ml-Schüttelkolben gegeben und sterilisiert. Das Medium wurde mit Methylomonas Stamm PERM P-2400 angeimpft. Die' Luft in dem Kolben wurde durch ein aus 20 % Methan und 80 % Luft bestehendes Misch^as ersetzt und danach wurde der Kolben fest verschlossen. Das inokulierte Medium wurde 25 Stunden unter Schütteln bei 36,5° C gehalten. Während der ersten 20 Stunden wuchs der Stamm'logarithmisch mit einer spezifischen Wachstumsrate von 0,17 h~ . ■

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Nach der Züchtung wurden die Bakterienzellen durch Zentrifugieren gewonnen, gewaschen und getrocknet. Das trockene Zellmaterial wurde in einer Menge von 0,6 g/l erhalten. Der Stickstoffgehalt der trockenen Zellen betrug 10,4 $ und der Gehalt an Rohprotein "betrug etwa 65 $.

Beispiel-2

400 ml eines wässrigen Kulturmediums, das die gleichen Bestandteile wie in Beispiel 1 enthielt, und Hefeextrakt in einer Konzentration von 0,5 g/l wurden in einen 1 1 -Permenter (jarfermenter) gegeben und sterilisiert. Das Medium wurde mit 20 ml einer Impfkultür von Methylomonas Stamm PERM P-2400, die wie in Beispiel 1 hergestellt worden war, angeimpft und 48 Stunden unter Rühren (1200 Upm) bei 36,5° C gezüchtet, während gasförmiges Methan in einer Rate von 30 ml/min, und Luft in einer Rate von 170 ml/min, in das Medium eingeleitet wurden. Während des Züchtens wurde der pH-Wert des Mediums mit Hilfe von gasförmigem Ammoniak bei 6,6 gehalten, Während 36 Stunden wuchs der Stamm logarithmisch mit einer spezifischen Wachstumsrate von 0,2 h" * Die Konzentration der Bakterienzellen betrug nach 36 Stunden 8,2 g/l.

Nach der Züchtung wurden die Bakterienzellen gewonnen, wobei 16,8 g/l trockenes Zellmaterial erhalten wurden.

Beispiel 3

Die Herstellung des Kulturmediums und die Züchtung des Bakteriums erfolgte in gleicher Weise wie in Beispiel 2. Nach 30 Stunden (4,8 g/l als trockenes Zellgewicht) wurde die KuItürbrühe in einer Verdünnungsrate von 0,15 h~ allmählich durch Zugabe von frischem Medium verdünnt. Nach 18 Stunden von Beginn des Verdünnens erreichte die Kulturbrühe den stationären Zustand, und enthielt Bakterienzellen in einer Menge von 4,3 g/l (als trockenes Zellgewicht). Die Ausbeute, bezogen auf das verbrauchte Methan,

betrug 66 #.

Tabelle

Genus Ruhezustand Zellform Morphologische Veränderung

Unreife Zyste* stab- Zeigt keinen ausgeprägten Methylo- + ⁰^ Azotobac- förmig Pleomorphismus

monas

Methylo- Zyste vom Azo- Stabbacter tobacter-Iyp förmig Ähnlichkeit mit der grosse Zellen bildenden Spezies von Azotobacter

Erfin- Nicht aufge- Stabdungsge- funden förmig mäßer
Stamm

Keine morphologische Änderung in flüssigem Medium, aber Pleomorphismus auf Agarmedium zu erkennen

Nicht alle Stämme bilden identifizierbare Ruheform

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Tabelle 2

Stamm Wachstum bei 37 C

Assimilation von 0,1 i» Methanol

Stimulierung des Wachstums durch Hefe· extrakt

Motilität

Parbe der Kolonie

Bildung von löslichem Pigment

erfindungsgemäßer Stamm Weiß bis Chamois

Methylomonas metha-

M. albus

M. streptobacterium

M. agile

M rubrum M. rosaceus Ocker bis Rosa

Weiß

Weiß
Weiß

Rot
Blaßrosa

Grün

Methylobacter« chromococcum

M. bovis

M. capsulatus

M. vinelandii Blaßrosa

Weiß bis Braun Weiß bis Braun Weiß bis Braun

Gelb

ΓΌ

oo

Claims

Patentansprüche

(l) Verfahren zum Erzeugen von Mikrobenzellen durch Züchtung eines Methan abbauenden Bakteriums in Gegenwart von Methan und Gewinnung der durch Vermehrung gebildeten Zellen aus dem Medium, dadurch gekennzeichnet , daß man Methylomonas Stamm PERM P-2400 in einem wässrigen Kulturmedium, das eine assimilierbare Stickstoffquelle und anorganische Salze enthält, in Gegenwart von Methan als Hauptkohlenstoffquelle züchtet.
2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung in einem Medium durchführt, das Methan als praktisch einzige assimilierbare Kohlenstoffquelle enthält.
3) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeiehn et , daß man die Züchtung in einer Atmosphäre vornimmt, die zusätzlich 1 bis 5 Gew,-$ Kohlendioxid enthält.
4) Verfahren nach Anspruch 1 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als zusätzliche Kohlenstoffquellen Hefeextrakte oder Peptone verwendet.

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