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Verfahren zur Herstellung von Einzellprotein Die vorliegende Erfindung
betrifft ein Verfahren zur Her-Stellung von Sinzellprotein (single cell protein")
aus Kohlehydraten oder Kohlenwasserstoffen, und insbesondere ein 7erfahren zur Herstellung
von Einzellprotein durch Züchtung eines neu isolierten Mikroorganismus, der als
Pseudomonas ilr. 5742 bezeichnet WirfÄ, toter submersen Fermentationsbedingungen
in einem Kulturmedium eines Kohlehydrates wie Molasse, einem Stärkehydrolisat oder
irgendeinem zuckerhaltigen Material, oder ein Kohlenwasserstoffs, wie eine Petroleumfraktion
von Kerosin, Gasöl, Heizöl, gewöhnliches eines Paraffin oder irgendeine Art eines
üblichen Kohlenwasserstoffe enthaltenden Paraffins, bis die Zellen-Konzentration
im Medium einen gewissen Stand erreicht hat, und qie anachließende Abtrennung des
Einzellproteins aus dem Kulturmedium.
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Die hauptsächliche der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende Aufgabenstellung
liegt darin, eine neue Proteinquelle durch Kultivierung eines Mikroorganismus zu
liefern, der zu einer neuen Art von Pseudomonas gehört. Dadurch soll das Problem
des Proteinmangels in der Welt mit gelöst werden.
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Das gemäß diesem Verfahren hergestellte Einzellprotein enthält einen
Proteingehalt von 60 bis 80 %. Dieses besteht aus 17 Arten von Aminosäuren einschließlich
der 8 wesentlichen Aminosäuren. Diese Proteinart besitzt einen hohen Nährwert, und
es wird angenommen, daß sie nicht nur zu Wahrungszwecken für Tiere, sondern auch
möglicherweise für den Menschen geeignet ist. Anstelle der Produktion von Proteinen
durch den üblichen Pflanzenwuchs und die landwirtschaftlichen Tierzuchtmethoden
liefert das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung eine Möglichkeit, Proteine
in industriellem Maßstab auf begrenzten Flächen innerhalb kurzer Zeit herzustellen.
Deshalb ist das Verfahren gemäß der Erfindung von großem Wert für die Menschheit.
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Der für das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung am stärksten
bevorzugt verwendbare Mikroorganismus ist gemäß der vorliegenden Erfindung isoliert,
untersucht und entwikkelt worden. Er wurde bei der American ype Culture Collection
hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer ATCC 21174. Nachfolgend wird dieser
Mikroorganismus der Einfachheit halber kurz mit ATCC 21174 bezeichnet.
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Es sind verschiedene Verfahren zur Herstellung von Einzel; protein
aus Kohlehydraten und/oder Kohlenwasserstoffen durch Bermentation bekannt. Gegenüber
diesem Stand der Technik stellt das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung ein
technisch vorteilhaftes Verfahren zur Herstellung von: Einzellprotein dar, und zwar
unter Berücksichtigung der folgenden Tatsachen: 1. Die vorliegende Erfindung betrifft
ein Verfahren zur Herstellung von Einzellprotein unter Verwendung einer neu isolierten
Art von Pseudomonas, die eine Vielzahl von Rohmaterialien verwerten kann, insbesondere
als einzige
Kohlenstoffquelle Kohlenwasserstoffe, die aus dem in
großen Mengen und leicht zugänglichen Erdöl stammen.
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2. Das Einzellprotein konnte in einer 24stündigen chargenweisen Fermentation
unter Einimpfung eines Stammes von ATCC 21174 in einem medium erhalten werden, das
Kohlenwasserotoff als einzige Kohlenstoffquelle enthält. Die durchschnittliche Fermentationszeit
konnte durch kontinuierliche Durchftihrung der Fermentation weiter herabgesetzt
werden. Die Produktionsgeschwindigkeit pro Gewichteinheit Protein ist viel höher
gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung als bei pflanzlicher oder tierischer
Proteinproduktion innerhalb begrenzter Fläche und Zeit. Die Produktion gemäß dem
Verfahren der vorliegenden Erfindung wird durch klimatische und/oder natürliche
Bedingungen nicht beeinflußt. Sie kann in technischem maßstab überall durchgeführt
werden.
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3. Das gemäß dem Verfahren der Erfindung erhaltene Einzellprotein
enthalt 60 bis 50 % protein. Dies sind 50 % mehr als bei handelsüblicher efe und
100 yö mehr als bei Sojabohnen.
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4. Das durch ATOO 21174 erzeugte Einzellprotein besteht aus acht wesentlichen
und neun nicht wesentlichen Aminosäuren und ist als tierische Nahrung und möglicherweise
auch als Nahrung für den Menschen geeignet. Die Zusammensetzung hinsichtlich der
Aminosäuren ist in der beigefügten Tabelle angegeben.
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5. Die Ausbeute an Einzellprotein aus ATOC 21174 ist, bezogen auf
das verbrauchte Rohmaterial, hoch. Beispielsweise bei Verwendung einer Petroleumfraktion
als einziges Rohmaterial können 1 t bis 1 1/2 t Einzellprotein (65 ffi Proteingehalt
)
aus 1 t verbrauchter Petroleumfraktion erhalten werden. Die prozentuale Ausbeute
ist höher als bei irgendeinem Verfahren zur Herstellung von Einzellprotein.
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6. Die Stickstoffverwertung von ATCC 21174 zur Einzellprotein-Produktion
ist hoch. Über 90 % des Stickstoffgehaltes von zur Kulturflüssigkeit zugesetztem
Ammoniumsalz und/ oder Ammoniak wird zu Protein-Stickstoff in den Zellen verarbeitet.
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7. Das gemäß dem Verfahren der Erfindung erhaltene Einzellprotein
ist ein geruchloses, geschmackloses, schwach gelb gefärbtes Pulver, das mit Weizenmehl
oder Reismehl vermischt werden kann, um den Proteingehalt der erwähnten Nahrungsmittel
für Ernährungszwecke des Menschens anzuheben, um damit den Nährwert zu erhöhen.
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8. Die Fermentationstemperatur gemäß dem Verfahren der vorliegenden
Erfindung liegt bei 36 bis 420 C. Sie ist deshalb besonders geeignet zur Herstellung
von Einzellprotein in tropischen und subtropischen Bezirken. Selbst während des
Sommers ist es nicht nötig, Kühlwasser abzukühlen.
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9. ATCC 21174 wächst schnell auf einer Kohlenwasßerstoff-Brühe. Verunreinigungen
sind kein Problem für das Verfahren der Erfindung. Deshalb müssen die Brühe sowie
die für das Verfahren der Erfindung verwendete liuft nicht sterilisiert werden.
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10. Bemäß dem Verfahren der vorlieganden Erfindung scheidet ATCC 21174
ein Enzymart zum Emulgieren des Kohlenwasserstoffs und der wäßrigen Lösung aus.
Deshalb sind die t0-guten und der Zusatz von Mitteln zum Emulgieren des
Kohlenwasserstoffs
bzw. der wäßrigen Lösung nicht erforderlich.
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Der Mikroorganismus ATCC 21174 hat die folgenden mikrobiologischen
Eigenschaften: I. Morphologische Characterisica: Die einzelnen Zellen von ATCC 21174
sind stabförmig, 0.7 bis 0.88 zu 1.2 bis 1.75 Micron. Sie kommen einzeln oder in
Gruppen vor. Sie sind beweglich, aerobisch, gramnegativ.
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II. Kulturmerkmale: 1. Nährstoff-Agar-Platte Nach 48 stündiger Züchtung
bei 380 0 nicht transparente grünliche Farbe, dann nach bräunlich sich verfärbend.
Kreisförmig, glatte Oberfläche.
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2. Nähr-Bouillon: Wachstum auf der Oberflächeß Trübung mit Sediment.
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Gründlich.
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3. Kartoffel-Brühe: Wachstum auf der Oberfläche. Trübung mit Sediment.
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Bläulich-grün.
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III. Physiologische Eigenschaften: 1. Temperatur-Verhalten: Wachstum
bei 33 bis 420 a, optimal bei etwa 36 bis 380 a.
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2. pH-3eziehungens Gutes Wachstum bei pH 6.0 bis 7.4.
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3. Nitrat-Reduktion: positiv.
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4. Lackmus-Milch: alkalisch 5. Sauerstoff-3eziehung: aerobisch 6.
Gelatine: Verflüssigung 7. Stärkeassimilation: negativ 9. Kohlehydrat-Permentation:
Keine Säure und kein Gas aus Arabinose, Dulcit, Fructose, Galactose, Glucose, Glycerin,
Inulin, Lactose, Maltose, Mannit, Sucrose, Stärke.
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9. Kohlenwasserstoff-Fermentation: Keine Säure und kein Gas aus Kerosin,
Gasöl, Heizöl, Rohöl und normalem Paraffin.
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10. Emulgierende Wirkung in Kohlenwasserstoff-Fermentation: ATCC 21174
scheidet ein Enzym aus, das während der Permentation eine Emulgierung des Kohlenwasserstoffs
und der wäßrigen Nährlösung bewirkt.
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Die biologische Klassifikation von AlCC 21174 wird dadurch untersucht,
daß die oben beschriebenen Eigenschaften mit den Eigenschaften der bekannten Mikroorganismen
verglichen werden, die in "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology", 7. Aus
gabe, 1957, beschrieben sind. Er wird danach als Mikroorganismus beurteilt, der
zur Gattung Pseudomonas gehört. ATCC 21174 unterscheidet sich jedoch von allen bekannten
Arten von Pseudomonas dadurch, daß er aktiv in einem Kohlenwasserstoffmedium wachsen
kann und eine Emulgier-Wirkung auf Kohlenwasserstoff
in wäßriger
Lösung ergibt. Es kann daraus geschlossen werden, daß der Stamm ATOO 21174 eine
neue Art ist. Sie wurde sls-pseudomonas Nr. 5742 bezeichnet.
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Für die DurchfAhrung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung wird
in einer ersten Stufe der Mikroorganismus (ATCC 21174) in einem Kulturmedium gezüchtet,
das Kohlenwasserstoffe, hauptsächlich bestehend aus n-Paraffinen mit 9 bis 23 Kohlenwasserstoffatomen,
eine Stickstoffquele und andere Nährstoffe enthält, die für das Wachstum nötig sind,
bis eine ausreichende Menge an Zellen sich in der Kulturbrühe entwickelt hat.
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Gemäß der vorliegenden Erfindung können als Eohlenstoffquelle Kohlenwasserstoffe
einer Petroleumfraktion wie Kerosin, Gasöl, Heizöl verwendet werden, die hauptsächlich
und zu nicht weniger als etwa 10 Vol. s aus normalem Paraffin mit 9 bis 23 Kohlenstoffatomen
bestehen sollten. Es kann auch normales Paraffin mit der genannten Zahl an Kohlenstoffatomen
verwendet werden. Stärker bevorzugt sind die höheren Zahlen von 18 bis 22 Kohlenstoffatomen.
Je höher der Gehalt an solchen normalen Paraffinen ist, desto bessere Ergebnisse
werden erzielt.
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Als Kohlenwasserstoff, der gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet
werden kann, kann normales Paraffin allein verwendet werden, welches eine Mischung
von verschiedenen Arten normaler Paraffine mit 9 bis 23 Kohlenstoffatomen sein kann.
Es kann auch andere Kohlenwasserstoffe wie verzweigte Paraffine, Olefine, zyklische
Paraffine, aromatische tohlenwasserstoffe enthalten, sofern deren Menge nicht über
90 % liegt.
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Gemäß der vorliegenden Erfindung ist es nicht erforderlioh, irgendein
ulgiermitte1 zur Kulturflüssigkeit Zu geben.
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Auch ein besonders starkes Rühren ist nicht erforderlich, um den Kohlenwasserstoff
und die wäßrige Lösung zu emulgieren, da ATCO 21174 selbst ein Emulgier-Enzym entwickeln
kann, das die Emulgierung bewirkt.
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Ein Wachstums-Faktor oder ein Wachstum-Anregungsmittel braucht gemäß
dem Verfahren der vorliegenden Erfindung nicht zugefügt zu werden, da der Mikroorganismus
von sich aus in einem Kohlenwasserstoffmedium rasch wächst.
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Irgendwelche Vitamine sind zur Durchführung des Verfahrens gemäß der
Erfindung nicht erforderlich.
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Als Stickstoffquelle können im Verfahren gemäß der Erfindung irgendwelche
anorganische Verbindungen der Gruppe der Ammoniumsalze wie Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat,
Ammoniumchlorid, Harnstoff oder eine wäßrige Animoniaklösung verwendet werden.
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Es ist nicht erforderlich, irgendeine organische Stickstoffverbindung
wie Maisquellwasser oder Hefeextrakt zuzusetzen.
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Es können jedoch geringe Mengen anorganische Verbindungen wie Salze
des Kaliums, Phosphors, Mgnesiums und/oder Mangans zum Medium zugesetzt werden.
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Praktisch wird die Züchtung in einem flüssigen Medium als submerse
Fermentation mit Belüftung durchgeführt. Die Belüftung erfolgt zweckmäßig mit einer
Geschwindigkeit von etwa 1 Vol. Luft pro Vol. Brühe pro Minute.
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Die Fermentationstemperatur liegt im allgemeinen bei etwa 33 bis 420
a und vorzugsweise bei 36 bis 380 C. Der pH-Wert des Mediums liegt im allgemeinen
etwa bei 6.0 bis 7o4 und vorzugsweise bei etwa 7.0. Bei chargenweiser Fermentation
kann die Konzentration der Zellen in 24 Stunden etwa 12 bis 18 g (bezogen auf Trockensubstanz)
pro Liter Brühe erreichen.
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Bei kontinuierlicher Durchführung kann die Konzentration der Zellen
10 g (bezogen auf ro¢kensubstanz) pro Liter bei einer Durchflußgeschwindigkeit von
1/6 Vol. Brühe/Stunde erreichen.
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Nach Beendigung der Fermentation werden die Zellen zunächst von der
Brühe abgetrennt, dann mit Lösungsmittel extrahiert, um irgendwelche restliche Kohlenwasserstoffe
zu entfernen, und schließlich als trockenes Produkt gewonnen.
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Gemäß der vorliegenden Erfindung können als einzige Kohlenstoffquelle
Kohlehydrate wie Molasse, Stärkehydrolisate, Glukose oder irgendwelche zuckerhaltigen
Stoffe verwendet werden.
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Das gemäß der Erfindung erhaltene Einzellprotein besitzt einen Proteingehalt
von 60 bis 80 f>. Es ist durch das Taiwan Olive stock Research Institut festgestellt
worden, daß es bei Verfütterung an Mäuse, Hühner und Schweine als Futtermittel nahrhaft
ist.
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Beispiel 1 Aus 550 g technischer Glucose (Zuckergehalt 70 %), 10 g
Harnstoff, 4 g E2HP04, 0.7 g MgSO4 und Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 10
Litern wird ein Nährmedium hergestellt.
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Der pH-Wert des Mediums wird auf 7.0 eingestellt. Dann wird zu dem
Medium eine vorher hergestellte Kultur von ATCO 21174 gegeben.
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Das Kulturmedium wird bei 350 C gerührt und belüftet. Nach 2Ostündiger
Züchtung wird die Fermentationsbrühe entnommen und zentrifugiert, um die Zellen
abzutrennen. Nach dem rooknen werden 146 g trockene Zellen erhalten. Die Ausbeute
beträgt etwa 26.5 %, bezogen auf das eingesetzte Rohmaterial.
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Beispiel 2 Aus 600 g Molasse (Zuckergehalt 50 bis 54 %), 10 8 Harnstoff,
2 g Superphosphat, 2 g (NH4)3PO4 und Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 10 Liter
wird ein Kulturmedium hergestellt.
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Dieses Medium wird auf pH-Wert 7.0 eingestellt. Dann wird ATCC 21174
eingeimpft. Nach 20stündiger Durchführung der submersen Fermentation bei 350 C wird
die i?ermentationsbrühe, wie im Beispiel 1 beschrieben, behandelt. Das erhaltene
trockene Produkt wiegt 157 g. Die Ausbeute beträgt 26.2 , bezogen auf das eingesetzte
Rohprodukt.
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Beispiel 3 Es wird - wie in Beispiel 1 beschrieben - ein Kulturmedium
hergestellt, wobei anstelle der technischen Glucose 492 g Stärke hydrolisiert werden.
Nachdem der pH-Wert auf 7.0 eingestellt wurde, wird eine Kultur von ATOC 21174 eingeimpft.
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Es wird 20 Stunden lang bei 350 C gezüchtet. Anschließend wird - wie
in Beispiel 1 beschrieben - behandelt. Das erhaltene Produkt wiegt 172 g (Trockensubstanz).
Die Ausbeute beträgt etwa 34.9 %, bezogen auf das eingesetzte Rohmateriale Beispiel
4 Es werden 2 1 eines Kulturmediums aus 2 g (NE4)2S04, 0,2 g KH2PO4, 0.004 g FeSO4#7H2O,
0.0001 g MnSO4#2H2O und Wasser hergestellt. Eine Kultur von ATCC 21174 wird eingeimpft.
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Das Medium wird bei 350 o submers fermentiert, wobei kontinuierlich
ein Strom aus Naturgas (96 % Methan) und Luft eingeleitet wird. Nach 48 stündiger
Fermentation wird 1 g an trockenen Zellen erhalten.
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Beispiel 5 Bs werden 5 1 eines Kulturmediums, enthaltend 60 g Kerosin,
10 g (NH4)2SO4, 2 g K2HP04, 0,1 g MgSO4#7H2O, 0.001 g FeSO4#7H2O und Wasser hergestellt.
Der pH-Wert des Mediums wird auf 9,0 eingestellt. Dann wird mit einer Kultur von
ATCC
21174 geimpft. Es wird 24 Stunden lang bei 33 bis 350 C submers termentiert. Die
Zellen werden abgetrennt und getrocknet. Das getrocknete Produkt wird anschlieDend
mit Lösungsmittel (Aceton oder n-Hexan) extrahiert, um irgendwelches verbliebene
Kerosin zu entfernen. Schließlich wird ein ölfreies Produkt in einer Menge von 45
g erhalten.
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Beispiel 6 In einem 6000 l-Fermentations-Apparat werden 3500 1 eines
Kulturmediums, enthaltend 100 1 Gasöl, 7.5 kg (NH4)2S04, 0.6 kg K2S04, 0,06 kg MnSO4,
3,5 kg Superphosphat und Wasser hergestellt. Das Superphosphat wird zugefügt, nachdem
es in 200 1 Wasser gelöst worden war und die unlöslichen Stoffe zurückgelassen wurden.
Dann wird eine aus ATCO 21174 hergestellte Kultur eingeimpft. Die Ferjnentation
wird bei 35° C durchgeführt, und der pH-Wert wird kontinuierlich auf 6.8 bis 7.0
eingestellt. Nach 24 Stunden wird die Brühe entnommen, und die Zellen werden gewonnen.
Die nassen Zellen werden zunächst getrocknet und dann mit dem Lösungsmittel extrahiert
Nach Entfernung des Lösungsmittel werden 53.66 kg Binzellprotein erhalten. Aus dem
Lösungsmittel werden 59.46 1 Gasöl wiedergewonnen. Die tatsächlich verbrauchte Menge
an Gasöl beträgt 40.52 l oder 32.55 kg. Die Ausbeute beträgt etwa 165 Xo, bezoger
auf das verbrauchte Gasöl.
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Beispiel 7 In einem 10 l-Fermentierungs-hpparat werden 5 1 eines Kulturmediums,
enthaltend 60 g Heizöl, 10 g (NH4)2S04, 2 g KOl, 0.1 g MnSO4, 1 g MgSO4, 18 g K2HP04
und Wasser hergestellt.
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das Medium wird auf pH 7.0 eingestellt, und eine Kultur von ATCC 21174
wird eingeimpft. Nach 32stündiger Fermentation bei 34 bis 350 C wird die Brühe -
wie in Beispiel 5 beschrieben - behandelt. Als Endprodukt werden 61.7 g erhalten.
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Beispiel 8 In einem 50 000 l-Fermentierungs-Apparat werden 22 000
1 eines Kulturmediums, enthaltend 400 1 Heizöl, 10 kg KCl, 4 kg MgS04, 0.5 kg MnS04
und Wasser hergestellt. 20 kg Superphosphat werden in Wasser gelöst. Die klare Lösung
wird um Kulturmedium gegeben. Das Kulturmedium wird 28 Stunden lang bei 36° C gezüchtet,
nachdem es mit ATCC 21174 geimpf worden war. Während der Ziichtung wird der pH-Wert
der Brühe kontinuierlich auf 6.8 bis 7.0 eingestellt. Nach Beendigung der Fermentation
wird - wie in Beispiel 6 beschrieben - gearbeitet. Das erhaltene Einzellprotein
wiegt 182.5 kg. Das wiedergewonnene Öl wiegt 160 kg. Die Ausbeute des Proteins,
bezogen auf das verbrauchte Öl, beträgt 114 Vo.
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Beispiel 9 Wie im Beispiel 5 beschrieben, werden 5 1 eines Kulturmediums
hergestellt, wobei jedoch anstelle von Kerosin Gasöl verwendet wird. Nach Impfen
mit ATCC 21174 wird 12 Stunden lang gezüchtet. Dann wird die Brühe in einer Menge
von 5 1 innerhalb von 8 Sturden entnommen, und gleichzeitig wird kontinuierlich
mit gleicher Geschwindigkeit ein frisch hergestelltes Kulturmedium in den Permentierungs-Apparat
gegeben. Die kontinuierliche Fermentierung wird 7 Tage lang durchgeführt. Die entnommene
Brühe enthält durchschnittlich 1.0148 g (Trockensubstanz) Zellen pro 100 ml Brühe
Beispiel 10 Es wird - wie im Beispiel 9 beschrieben - gearbeitet, wobei jedoch die
Durchflußmenge der Brühe 5 1 pro 6 Stunden beträgt. Nach 7tägiger kontinuierlicher
VerfahrensdurchfiUlrung besitzt die entnommene Brühe durchschnittlich einen Feststoff
gehalt von 0.9651 g (Trockensubstanz) pro 100 ml Brühe.
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Beispiel 11 Es wird - wie im Beispiel 9 beschrieben - gearbeitet,
wobei jedoch die Durchflußgeschwindigkeit der Brühe 5 1 pro 4 Std.
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beträgt. 1aeh 7tägiger kontinuierlicher Verfahrensdurchführung enthält
die Brühe durchschnittlich 0.8759 g Festkörper pro 100 ml Brühe.
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Tabelle Aminosäuren-Zusammensetzung des Einzellproteins ("Single
Cell Protein") von Pseudomonas Nr. 5742 (ATCC 21174) Aminosäure Gew. so Tryptophan
0.57 Lysin 5.03 Histidin 1.32 Argingin 3.74 Aspaginsäure 7.56 Threonin 3.26 Serin
2.81 Glutaminsäure 8.42 Prolin 2.25 Glycin 3.63 Alanin 5.80 Valin 3.35 Methionin
0.76 Isoleucin 3050 Leucin 5.35 Tyrosin 1 o69 Phenylalanin 2.64 5.00 mg des Proteins
(61.68 %) werden 24 Stunden lang mit 6N-HCl bei 1100 G hydrolisiert und dann auf
2.5 ml verdünnt.
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Davon wird 1 ml fär die Analyse entnommen. Patentansprüche: