DE2460672A1 - Verfahren zum zuechten von mikroorganismen - Google Patents
Verfahren zum zuechten von mikroorganismenInfo
- Publication number
- DE2460672A1 DE2460672A1 DE19742460672 DE2460672A DE2460672A1 DE 2460672 A1 DE2460672 A1 DE 2460672A1 DE 19742460672 DE19742460672 DE 19742460672 DE 2460672 A DE2460672 A DE 2460672A DE 2460672 A1 DE2460672 A1 DE 2460672A1
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- microorganism
- consuming
- ncib
- methane
- methanol
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/26—Processes using, or culture media containing, hydrocarbons
- C12N1/28—Processes using, or culture media containing, hydrocarbons aliphatic
- C12N1/30—Processes using, or culture media containing, hydrocarbons aliphatic having five or less carbon atoms
-
- F—MECHANICAL ENGINEERING; LIGHTING; HEATING; WEAPONS; BLASTING
- F16—ENGINEERING ELEMENTS AND UNITS; GENERAL MEASURES FOR PRODUCING AND MAINTAINING EFFECTIVE FUNCTIONING OF MACHINES OR INSTALLATIONS; THERMAL INSULATION IN GENERAL
- F16L—PIPES; JOINTS OR FITTINGS FOR PIPES; SUPPORTS FOR PIPES, CABLES OR PROTECTIVE TUBING; MEANS FOR THERMAL INSULATION IN GENERAL
- F16L55/00—Devices or appurtenances for use in, or in connection with, pipes or pipe systems
- F16L55/24—Preventing accumulation of dirt or other matter in the pipes, e.g. by traps, by strainers
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/804—Single cell protein
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/858—Methylomonas
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/863—Mycobacterium
- Y10S435/866—Mycobacterium smegmatis
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/874—Pseudomonas
Description
PATENTANWÄLTE ^ 4 D U Ö / I
p^ctpTtent München
1A-45 759
Beschreibung; zu der Patentanmeldung
,.SHELL INTERETATIOUALE RESEARCH MAATSCHAPPIJ B.V«
Carel van Bylandtlaan ZO1 Don Haag
Hiederiaade
betreffend Verfahren zum Züchten von Mikroorganismen
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Züchten von Mikroorganismen·
Es sind viele Mikroorganismen bekannt, die Kohlenwasserstoffe oder bestimmte oxidierte oder sonstige Derivate
davon als Kohlenstoff-und/oder Energiequelle verwenden
können· Die getrocknete Biomasse, die durch Züchtung solcher Mikroorganismen erhalten werden kann und oft als Einzelzellprotein
bezeichnet wird, ist reich! ' an Protein und kann als löslicher ETährstoff oder Nährstoffzusatz für Menschen
und Tiere angewandt werden. Von besonderem Interesse in diesem Zusammenhang sind Mikroorganismen, die imstande sind, gasförmige
organische Verbindungen, die ein oder mehrere Kohlenstoffatome im Molekül enthalten, wie zum Beispiel Methan zu verbrauchen·
Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein verbessertes Verfahren zur Züchtung von Methan verbrauchenden Mikroorganismen
zu entwickeln· '
♦) bzw, MiMrftteXfhalU«·
— O -
509828/0822
246Ü672
- 2 - 1A-45 759
Die Erfindung betrifft daher ein Verfahren aur Züchtung von Mikroorganismen, bei dem ein Methan-verbrauchender Mikroorganismus,
der ein Methylomonas-Stamm ist, unter aeroben Bedingungen in einem flüssigen Wachstumsmedium gezüchtet wird,
umfassend assimilierbare Quellen für Stickstoff und essentielle Mineralsalze in Gegenwart von Methangas und in Gegenwart von
a) einem oder mehreren Methanol-verbrauchenden Mikroorganismen, die imstande sind, das durch das Wachstum des Methan-verbrauchenden
Mikroorganismus gebildete Methanol zu metabolisieren und To) einem oder mehreren nicht-methylotropen Mikroorganismen,
die imstande sind, die organischen Substanzen zu metabolisieren, die von den M;ethan«-und/oder Methanol-verbrauchenden
Mikroorganismen gebildet worden sind.
Der Ausdruck "Mikroorganismus" wird hier in einem breiten Sinn verwendet und umfaßt nicht nur Bakterien, sondern auch
Hefen, Fadenpilze, Aetinomyceten und Protozoa!.
Es hat sich gezeigt, daß bei der oben erwähnten gemischten Kultur von Mikroorganismen eine synergistische Wirkung auftritt,
die zu einer höheren Wachstumsgeschwindigkeit und Ausbeute der Mikroorganismen führt, als wenn der Methan-verbrauchende
Mikroorganismus allein gezüchtet wird oder wenn Methan- und Methanol-verbrauchende Mikroorganismen zusammen gezüchtet
werdeno Durch Verfahren, bei denen gemischte Kulturen angewandt
werden, werden auch verschiedene andere Vorteile erreicht, z.B. eine erhöhte Widerstandsfähigkeit gegen Infektion
und verminderte Schaumbildung, verglichen mit Verfahren, bei denen nur eine Mikroorganismusart angewandt wird.
Es ist bekannt, daß Methanol ein Zwischenmetabolit beim mikrobiologischen Methanverbrauch ist' und als solcher in einem
Kulturmedium während des Wachstums von Methan-verbrauchenden Bakterien vorhanden sein kann. So kann das Vorhandensein von
Methanol-verbrauchenden Mikroorganismen neben dem Methan-verbrauchenden
Bakerium vermutlich die Ausbeute an Mikroorganismen bei einem bestimmten Gewicht an Methan erhöhen, indem es zu
509828/0822
-3-
- 5 - 1A-45 759
einer vollständigeren "Umwandlung des Ke.thans in Biomasse
führt. Diese Tatsache konnte bestätigt werden» Die Ausbeute wurde weiter erhöht durch das Vorhandensein einer 3· Gruppe
(nicht-methylotropher) Mikroorganismen· Diese latsache kann
folgendermaßen erklärt werden: Der nieht-methylotrophe Organismus
verbraucht organische Substanzen, die während des Metabolismus von Methan und Methanol gebildet werden,und erhöht
dadurch die Ausbeute an Biomasse, entfernt störende Metaboliten und bildet wachstumsfördernde Moleküle* Die bei
dem erfindungsgemäßen Verfahren angewandten Kulturen können auf eine von zwei Arten erhalten werden:
a) Gemischte Kulturen, umfassend einen Methan-verbrauchenden Mikroorganismus zusammen mit einer Anzahl Methanol-verbrauchen-'
der Mikroorganismen und einer kleineren Anzahl nicht-methylotropher
Mikroorganismen kann aus natürlichen Quellen isoliert werden. Eine besonders bevorzugte gemischte Kultur, die in den
Beispielen als 303 bezeichnet wird (und die NCIB-Eingangsnummer
11085 besitzt) wurde isoliert und es zeigte sich, daß sie einen
Methan-verbrauchenden Mikroorganismus, der durch geschichtete +) Membranen gekennzeichnet ist un& §M3 (FCIB 11084) bezeichnet
wird, einen Methanol-verbrauchenden Organismus einer neuen Art, der als OML (ICIB 11112) bezeichnet wird,und 4 nicht-methylotrophe
Mikroorganismen, die in den Beispielen als M^, M2, M~
und M. bezeichnet werden, umfaßt. Der Organismus M.. ist eine
Art von Pseudomonas (NCIB 11062), der Organismus Mp eine Art
von Mycobakterium (NCIB 11061), der Organismus M,.eine Art von
Pseudomonas (NCIB 11063) und der Organismus M. eine Art von
Pseudomonas (NCIB 11065).
b) Geeignete gemischte Kulturen können auch erhalten werden, indem man einen oder mehrere Stämme von Methylomonas mit einem
oder mehreren Stämmen von Methanol-verbrauchenden Mikroorganismen
und einem oder mehreren Stämmen von nicht-methylotrophen Mikroorganismen zusammenbringt.
■+) (stacked membranes) 509828/0822 .
- 4 - · 1A-45 759
Beispiele für geeignete Methanol-verbrauchende Mikroorganismen sind Stämme von Hyphomicrobium (z.B. HCIB Nr.11040),
Pseudomonas extorquens imd Pseudomoaas metbylotropha (z.B.
NCIB Nr. 10508 - 10515 und 10592 - 10596). BeisplgJ^ für
geeignete nieht-methylotrophe Mikroorganismen sindKstämme von
Pseudomonas (z.B.NGIB Nr.11019 und 11022), Acinetobacter (z.B.NCIB Nr.11020), Curtobacterium (z.B.NCIB Nr.11021),
Mycobaoteriaceae and Aehromobacteriaceaeo
Die-oben erwähnte gemischte Kultur Ϊ3 (NCIB 11085) und die
Stämme SM3 (NCIB 11084), OMI (NCIB....), M1(NCIB 11062),
M2(NCIB 11061), M5(UCIB 11063) und M4 (NCIB IIO65) sind alle
neu und die Erfindung bezieht sich auch auf diese neuen Stämme sowie ein Verfahren zur Züchtung bzw« Erzeugung von Mikroorganismen
in einem flüssigen Wachstumsmedium, bei dem einer oder mehrere dieser Mikroorganismen angewandt werden.
Das flüssige Wachstumsmedium umfaßt auch eine stickstoffhaltige Verbindung, ö.ie Ammoniak, Harnstoff, ein Ammoniumsalz,
wie das Sulfat, Chlorid oder Nitrat sein kann, z.Bo ein
Alkalinitrat· Die Verbindung ist günstigerweise in einer Konzentration von 3-50 g/l vorhanden.
Andere Elemente die in dem Medium vorhanden sein können sind Phosphor, Schwefel, Magnesium und Eisen. Die Phosphorquelle
ist vorzugsweise eines oder mehrere Phosphate, z.B. K2HPO4, KH2PO4,Na2HPO. oder (NH4^HPO4 oder Phosphorsäure,
vorzugsweise in einer Konzentration von 3-20 g/l. Die Schwefelquelle kann Schwefelsäure oder ein Sulfat wie (NH4)2S04
sein, günstigerweise in einer Konzentration von 0,5-5,0 g/1. Die beiden Metalle werden in Form des einen oder anderen
ihrer Salze zur Verfügung gestellt, z.B. in Eorm von MgSO4*
7H2O in einer Konzentration von 0,2-2,0 g/l und EeCl5-OH2O
in einer Konzentration von 0,01-0,1 g/l.
Das Medium kann auch Spuren anderer Elemente in Eorm geeigneter
Salze enthalten, z.B. Calcium, Mangan, Zink, Kobalt, Molybdän und Bor. Beispiele für geeignete Medien sind in den
Beispielen angegeben.
509 828/0822 ~3~
- 5 - 1A-45 759
Das erfindungsgemäße Verfahren kann ansatzweise? halbkontinuierlich
aber vorzugsweise kontinuierlich durchgeführt werden« Um ein Wachstum zu erreichen wird das Medium mit
den Mikroorganismen beimpft und mit einem Gasgemisch enthaltend Methan und Sauerstoff zusammengebracht. Methan kann
in Form von natürlichem Gas zur Verfugung gestellt werden··
3?ür die kontinuierliche Kultur können die Mikroorganismen in irgendeinem entsprechend angepaßten Permentationsgefaß
gezüchtet werden,z.B. in einem gerührten Fermentationsgefäß mit Ablenkblechen oder einem Fermentationsgefäß in Form
eines Sprühturms, das entweder mit einer inneren Kühlung oder einer äußeren Umlaufkühlschleife versehen ist. Frisches Medium
wird kontinuierlich zu der Kultur gepumpt,mit Geschwindigkeiten
entsprechend 0,02 bis 1,0 Volumina der Kultur pro* Stunde und die Kultur wird mit einer solchen Geschwindigkeit
abgezogen, daß das Volumen der Kultur konstant bleibt. Ein
Gasgemisch, enthaltend Methan und Sauerstoff und gegebenenfalls Kohlendioxid oder andere Gase wird mit dem Medium in
Kontakt gebracht, vorzugsweise in dem es kontinuierlich durch eine Verteilerplatte am Boden des Gefäßes eingeblasen wird»
Die Sauerstoffquelle für die Kultur kann luft, Sauerstoff
oder mit Sauerstoff angereicherte Luft sein. Das verbrauchte Gas wird vom Kopf des Gefäßes abgezogen· Das verbrauchte Gas
kann entweder über eine äußere Schleife oder innen mit Hilfe
einer Gasumwälzpumpe zurückgeführt werden. Der Gasfluß und
die Gasrückführung sollten so geleitet werden, daß man ein maximales Wachstum der Organismen und eine maximale Ausnutzung
des Mathans erreicht.
Die Temperatur der Kultur wird im allgemeinen bei .30
bis 5O0O, vorzugsweise bei 38 bis 450C gehalten· Der pH-Wert
der Kultur wird auf einen Wert von 6,0 bis 8,0, vorzugsweise
6,4 bis 7»4 eingestellt durch entsprechende Zugabe von
Alkali, z.B. NaOH, KOH, M»0H und/oder einer Säure, z.B.
H2SO^ oder Η,ΡΟ*.
Die Mikroorganismuszellen können von dem Wachstumsmedium nach irgendeinem üblicherweise angewandten Standard-Verfahren gewonnen
werden, z.B. durch Ausflocken, Sedimentation und/oder
509828/0822
(continuous flow culture) ~δ~
(continuous flow culture) ~δ~
- 6 - 1A-45 759
Ausfällung und anschließende Zentrifugierung und/oder .
Filtration. Die Biomasse wird dann getrocknet, z.B. durch Gefrieren oder Sprühtrocknen und kann in dieser Form als Proteinnährstoff
oder Nahrungszusatz für Menschen oder Tiere verwendet
werden·
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert:
Eine gemischte Kultur von Bakterien die auf Methan wächst . .wurde aus einer Schlammprobe gewonnen, die aus einer tropischen
Entenfarm stammte. 2 g der Probe wurden in einen 250 ml Schüttelkolben, enthaltend 25 ml 1SM Medium (in Beispiel 3. beschrieben)
gegeben und zweimal täglich mit einem Gasgemisch, bestehend aus 25 i>
Methan und 75 $> luft belüftet. Der Kolben wurde auf
einer Rotations-Schüttelvorrichtung mit einem Orbital-Radius
von 2,5 cm mit 200 TJpM 1 Woche geschüttelt. Aus der Kultur,
in der sich eine Trübung gebildet hatte, wurden Unterkulturen
gebildet, indem 2 ml Inokulum in ähnliche Schüttelkolben gegeben wurde, wobei aseptische Bedingungen eingehalten wurden.
Dieses Verfahren wurde einige Male wiederholt und wenn ein reproduzierbares gutes Wachstum erhalten worden war, wurden die
Kulturen in dem Schüttelkolben angewandt, um einen Fermenter der in Beispiel 5 beschriebenen Art zu beimpfen. Die Cbarakteristika
der als T3 bezeichneten Kultur sind im einzelnen in Beispiel 2 beschrieben*
(1) Die Kultur besteht aus einem obligaten Methan-verbrauchenden
Bakteriraa, das als SM3· (NCIB 11084) bezeichnet wird und
das zusammen mit einem Methanol-verbrauchenden Bakterium und Arten von dicht-methylotrophen Bakterien wächst. Der Methanyerbrauehettde
Organismus . SM3 (ITCIB 11084) besitzt eine etwas variable Morphologie und erscheint als kurze Stäbchen oder
-Stäbcben und besitzt eine innere Membranstrukturϊ die
509828/08T2
- 7 - 1A-45 759 - "
in parallelen Schichten in. der Zelle angeordnet ist. Dieser
Organismus wächst nur schwach wenn er allein auf Methan ist. Aufgrund dieser Beschreibung scheint der Organismus eine bisher
noch nicht beschriebene Art von Methylomonas zu sein (HOIB 11084)·
(2) Der als OMIi (UCIB 1-1112) bezeichnete Methanol-verbrauchende
Organismus ist charakterisiert durch seine Fähigkeit nur
auf Agärplatten, die Methanol als einzige Kohlenstoffquelle
enthalten, zu wachsen und Kolonien zu bilden» In Gegenwart von Glucose, Lactose, Saccharose, Mannit, Inosit, öitrat oder
Nährstoffagar tritt kein Wachstum ein. Der Organismus ist ungefähr
2 yum lang und 1 /um breit mit einer einzigen jcLaren
Geißel. Kolonien auf Agar sind glatt und grau mit einem vollständigen Rand und treten auf Methanol/Mineralsalz-Agarplatten
nach zweitägiger Inkubation bei 420O auf. Aufgrund dieser Beschreibung
scheint der Organismus eine bisher noch nicht beschriebene Art eines Pseudomonas-Stamms (N0IB11112) zu sein.
(3) Andere Arten von Organismen wurden aus dem Gemisch isoliert, die weder auf Methan noch Methanol als einziger Kohlenstoff
quelle wachsen konnten. Diese wurden als üLj-, M2, HL
und Μ* bezeichnet. Sie wurden Standard-Tests unterworfen, um
zu bestimmen zu welcher allgemeinen Art von Mikroorganismen
sie gehörten.
Die angewandten Versuche wurden bereits in Standard-Werken
beschrieben wie in
(a) "Manual for the Identification of Medical Bacteria",
S.T. Cowan und K.J.Steel, Cambridge University £ress(1966)
(b) "Bergey^ Manual of Determinative Bacteriology", 7.Auflage
Williams und Wilkins (1959)
(c) "A.Guide to the Identification of the General of Bacteria",
Y.B.D.Skerman, 2.Au-Ji.Williams und Wilkins (1967).
5U9828/0822
- 8 - ' 1A-45 759
Für einige dieser Versuche stehen Alternativ-Verfahren zur Verfugung und weitere lcurze Einzelheiten sind unten angegeben,
um das tatsächlich in diesen Fällen angewandte Testverfahren zu beschreiben.
Oxidase-Test - Kovaos, 1956
Indol-Bildung - Koyacs-Heagens, 1928
Voges-Proskauer-Iest - Barritt, 1936 Urease-Bildung <?- Gxoid-Medien, Christensen-Medium, 1946
Citrat-Verbraueh, Wachstum auf Simons-Citrat-Schrägen
bestätigt in Koserfs-Brühe.
Die Ergebnisse dieser Versuche sind in Tabellen 1 und 2 angegeben·
Aus den Ergebnissen dieser Versuche können die folgenden Polgerungen
gezogen werden bezüglich der Identität der Organismen· Organismus M1 ist eine Art von Pseudomonas (ITCIB 11062)·
Organismus M£ ist eine Art von Mycobacterium (NCTB 11061),
Organismus M» ist eine Art von Pseudomonas (HCIB 11063) und
Organismus M* ist eine Art von Pseudomonas (HCIB 11065).
509828/0822
1A-45 759
Identifizierung von kein-Methan-verbrauchenden Bakterien
in der gemischten Kultur T3 - 1. Tersuchsstufe
Test
GRAM-Pärbung 3?orm
Sporen-Bildung beweglich
Katalase-Bildung Oxidase-Aktivität
Glue ose-Terbra uch (Säure)
O - F Test (Hugh & Leifspn) Säure-resistent
Stäbchen
+ mit Hilfe polarer Geißeln
Stäbchen
nicht
Säureresistent
Säureresistent
Stäbchen Stäbchen
+.mit HiI- +mit Hilfe polarer fe polarer
Geißeln Geißeln
Oxidativ
Oxidativ
-10-
609828/08
- 10 - 1A-45 759
Identifizierung*der kein-Methan-verbrauchenden Bakterien
in der gemischten Kultur T3 - 2. Yersuchsstufe
Test M^ Mo M-* Ka
1 23 A4
| Urease- - Aktivität |
+ | — | + |
| Citrat-Verbrauch + | - | + | + |
| Gelatine- Hydrolyse + |
- | * | |
| Indol-Bildung | - | - | - |
| MR (Methyl-rot) & VP (Voges-Pros- kauer) Reaktionen |
- | - | |
| Glucose (Säure-Bildung) |
- | - | - |
| Lactose (Säure) |
- | - | - |
| Saccharose - (Säure) |
mm | - | mm |
| Mannit (Säure) |
- | - | - - |
| Maltose - (Säure) |
- | - | - |
| Wachstum auf + Mährstoff-Agar |
+ | + | + |
| Eatalase + Aktivität |
+ | + | + ■ |
| Reduktion von - Nitrat |
schwach. | schwach |
-11-509828/0822
- 11 - 1A-45 759
Es wurden. Kulturen aus Gemischen der folgenden Bakterien
gezüchtet: . ®
SM3 (wächst nur auf Methan)
OML (wächst nur auf Methanol)
M.J (ein nicht-methylotrophes Bakterium)
Es wurde ein Ausgangsmedium auf der Grundlage des von Sheehan & Johnson beschriebenen (im folgenden als ISM-Medium
bezeichnet) hergestellt, das die folgenden Bestandteile enthielt·.
5
MgSO4O7H2O
MgSO4O7H2O
| 1,6.. | • | g/l |
| 1,16 | η | |
| 1,18 | ||
| 0,08 | η | |
| 0,014 | o-6 | It |
| 0,025 | 10~7 | Il |
| 8 χ 1 | 10""7 | Il |
| 6,8 χ | 10-7 | Il |
| 6,0 χ | η | |
| 4,8 χ | it | |
522 CuSO4.5H2O
ZnSO4·7H2O MnSO4·4H2O
Ha2MoO4* 2H2O
Die Kulturen wurden in sterilen Glasgefäßen mit einem Volumen von 500 ml gezüchtet, durch das ein kontinuierlicher Strom
eines Methan/Luft-Gemisches geleitet wurde·
Die Vorrichtung bestand aus einer Reihe von Gefäßen durch die ein Gemisch von 25 i° Methan und 75 "fa Luft über ein
Sintersol-Filter geleitet wurde. Die Öffnungen der Vorrichtung
erlaubten ein Beimpfen und eine Probenentnahme,
-12-
509828/0822
- 12:- 1Δ-45 759
Die Kolben wurden mit 1,5 ml einer frischen Kultur (24 h alt)
von jedem der vier als M1, M2, M* und M, bezeichneten Organismen
beimpft. 4 ml sowohl der Methan-verbrauehendeη
(SM3) und der Methanol-verbrauchenden (OMI) Bakterien wurden von 2 bis 3 Tage alten Kulturen zugegeben, die in Schüttelkolben
auf ISM-Medium gewachsen waren.
Das Medium in den Gefäßen war 400 ml ISM-Mediumywie oben
beschrieben,und.das Wachstum wurde bestimmt durch Messung der
optischen Dichte (OD) bei einer Wellenlänge von 625 nm.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 angegeben. Diese Ergebnisse
zeigen, daß eine gemischte Kultur für das beste Wachstum auf Methan erforderlich ist. Eine gewisse Verbesserung erreicht
man durch das Vorhandensein des Methanol-verbrauchenden Organismus,
aber für das beste Wachstum sind alle Organismen erforderlieh.
Auf Methan nach 3 Tagen erhaltenes Wachstum bei Verwendung
verschiedener Kombinationen von Bakterien, die in der Kultur T3 vorhanden sind.
In dem Inokulum vorhan- Wachstum (Einheiten>-:der
dener Organismus optischen Dichte nach
3 Tagen)
| SM3 | OMI | M2, M, | 0,14 |
| SM3, | M1, | 3Ul' l | 0,25 |
| SM3, | OML | 0,27 | |
| SM3, | 0,59 | ||
| V M4 | |||
Diese Ergebnisse sind der Mittelwert von 3 Versuchen die jeweils aus zwei oder drei Replicationen . bestanden.
-13-
509828/0822
-13 - U-45 759 Beispiel 4
Die folgenden Versuche waren dazu bestimmt festzustellen,
ob die Komponenten der Kultur Ϊ3 durch andere Mikroorganismen
mit· ähnlichen Eigenschaften ersetzt werden können· Es wurden Kulturen in G-lasgefäßen mit durchgeleitetem Gas wie in Bei- .
spiel 3 angesetzt, aber in einigen Fällen wurde der Methanolverbrauchende
Organismus aus der Kultur T3 ersetzt durch den Methanol-verbrauchenden Organismus NOIB 11040· Ähnlich wurden
die nicht-methylotrophen Komponenten von Ϊ3 ersetzt durch
die nicht-methylotrophen Organismen NGIB Nrn. 11019,11020,
11021 und 11022, Die Ergebnisse dieser Versuche sind in
Tabelle 4 angegeben·
Zunahme der optischen Dichte (bei 625 om) von verschiedenen
gemischten Kulturen die auf Methan wachsen, (Mittelwerte von 2 Versuchen mit jeweils 4 Replicationen
pro Kultur)·
Kultur OD bei 625nr
Methan- Methanol- Methanol nicht- nicht- «»oh 1 Teverbrauchen-
verbrauchen-verbrauehen-methyl- methyl- 3 s<
der Organis- der Organis-der Organis-otrophe otrophe mus (SM3) mus (OML) mus (NCIB Organis-Organis-
11040) men men
M1,M2,M3(NCIB und M4 Kr.11019-11022)
+ =s in der Kultur vorhanden - = in der Kultur nicht vorhanden
-14-509828/0822
- 14 - 1A-45 759
Die Unterschiede in den senkrechten Spalten der Tabelle 6 sind nicht wesentlich» Es kann darausgeschlossen werden, daß
der Methanol-verbrauehende Organismus HCIB 11040 anstelle von
OML verwendet werden kann· Ähnlich sind die nicht-methylotrophen
Bestandteile austauschbar·
Fermentationen unter Anwendung der Kultur S3
Die Kultur wurde kontinuierlich auf einem mineralische^ Medium,
Methan und Luft gezüchtet. Ein Biot-Jc-Fermentationsgefäß mit
einem Arbeitsvolumeη von 2,5 1 wurde angewandt. Methan und
Luft wurden durch Verteilerplatten in die Flüssigkeit mit einer Geschwindigkeit von 150 ml/min bzw. 450 ml/min geleitet· Die
Temperatur des Mediums wurde auf 420C gehalten und der pH-Wert
auf 7,4 durch automatische Zugabe von 2 η NaOH· Das Medium wurde mit einer Geschwindigkeit von 1000 UpM gerührt und der
Druck in dem Fermentationsgefäß war nur leicht über Atmosphärendruck·
Das für die kontinuierliche Kultur angewandte als SJ4 bezeichnete
Medium besaß die folgende Zusammensetzung:
| KH2PO4 | 1,6 | g/l |
| Na2HPO4' | 1,16 | Il |
| NaNO3- | 3,18 | Il |
| MgSO4*7H2O | 0,107 | Il |
| FeSO4*7H2O | 0,009 | H |
| Ca(NO3)2·4Η20 | 0,06 | Il |
| Spurenelemente-Lösung | 1 ml/1 | |
| Konz· Schwefelsäure | 0,33 ml/1 |
4«»t. VMMr auf 1 1
-15- ·
509828/0822
- 15 - 1A-45 759
Die zur Herstellung des Mediums angewandte Spürenelemente-Lösung
besaß die folgende Zusammensetzung:
CuSO4.5H2O 3 g/l
0 . 0,336 "
20 . 0,5 . "
42H2O 0,213 »
CoCl2-6H20 0,015 "
Diese Ausgangslösung wurde zu dem Rest des Mediums in einer
Konzentration von 1 ml/1 - wie oben erwähnt - zugegeben.
Das fermentationsgefäß wurde zunächst mit 2 1 ISM-Medium
(siehe Beispiel 1) gefüllt, gerührt, belüftet und -wie oben
angegeben - Methan eingeleitet. Es wurde mit 100 ml im Sehüt%elkolben vollständig gezüchteter Kultur T3 beimpft.
Nachdem das Wachstum in dem- Permentationsgefäß begonnen hatte,
wurde Medium SJ4 mit einer Verdünnungsgesebwindigkeit von 0,08 h~" eingeleitet. Die Geschwindigkeit wurde in Stufen
von 0,02 h~1 in zweitägigen Intervallen auf 0,22 h*"1 erhöht,
ohne daß die Kultur ausgewaschen wurde. Es wurden Gleichgewichtszustände .erreicht, bei denen die Konzentration-der Biomasse
2,5 bis 6 g/l betrug. Das stellt keineswegs die höchste Biomassen-Konzentration dar, die bei kontinuierlichen Kulturen
erhalten wurde. Die Kultur wurde mehr als 3000 h kontinuierlich fortgesetzt«, Die Organismen wurden gewonnen und der Analyse
unterworfen. Die Ergebnisse dieser Analyse sind in den. folgenden Beispielen angegeben.
Bei irgendeinem Gleichgewichtszustand bei der kontinuierlichen
Kultur änderte sich der Anteil einer einzelnen Bakterienart an der Gesamtbakterieurnenge nicht. Die Kultur war auch sehr
beständig gegen Infektion durch fremde Mikroorganismen, so daß keine Verunreinigung (Contamination) nachgewiesen werden
konnte, selbst wenn die Kultur vorsätzlich mit fremden Organismen infiziert wurde·
x) eines bestimmten Verdünnungsgrads
-16-
509828/0822
- -|6 - ' 1A-45 759
Es wurde eine gemischte Eultur von Methan-verbraucbenden
Bakterien in einer kontinuierlichen Kultur in einem 300 1 Fermentationsgefäß unter Bedingungen gezüchtet, die im wesentlichen
den für die Fermentation im kleinen Maßstab angegebenen entsprachen (Die Zellen wurden durch Zentrifugieren
gewonnen und sprühgetrocknet» Es wurde ein freifließendes farbloses geruchloses Pulver (SOP) erhalten, das aus trocknen
Bakterienzellen bestand· Es besaß einen Proteingehalt von e· 78 io (berechnet als N χ 6,25)· Die Nährst of fqualität des
Pulvers wurde wie folgt in Fütterungsversuchen bei Ratten untersucht·
SOP wurde eben abgesetzten Ratten in 10 Tage langen Versuchen verabreicht, wobei das SOP die einzige Proteinquelle der Nahrung
bildete· Bei jedem Versuch wurde eine Vergleichsnahrung, die Casein als einzige Proteinquelle enthielt, verabreicht·
Heringsmehl, eine der reichsten Formen von tierischem Nahrungszusatz wurde ebenfalls zum Vergleich an Ratten verfüttert· Der
rohe Proteingehalt (N χ 6,25) in jeder Nahrung betrug 10 ^,
aber alle anderen Nährstoffe wurden in Mengen,wie sie für das optimale Wachstum erforderlich sind, verabreicht· Die Ergebnisse
der Fütterungsversuche sind in Tabelle 5 angegeben·
Nahrungsbestandteil Wirksame Nahrungsum- Wirksames Prowandlung
teinverhältnis
Casein 0,243 (2,50)
SCP 0,256 2,59
Heringsmehl 0,233 2,2
Aus Tabelle 5 geht hervor, daß SCP das aus einer gemischten Bakterienkultur gebildet worden ist, die auf Methan gewachsen
ist, eine gute Form von Protein darstellt· Es ist sogar besser als Fischmehl als Nahrungsbestandteil für Tiernahrung·
-17-509828/0822
1A-45 759
Das Aminosäurespektrum des SCP wurde analysiert und die
Ergebnisse sind in Tabelle 6 angegeben. Diese Ergebnisse zeigen, daß das Aminosäuregleichgewicht so ist, daß SCP
sehr geeignet ist als Protein zur Tiernahrung.
| Tabelle 6 | % rohes Protein | |
| Aminosäure | (g/16g U) | |
| 8,48 , | ||
| Aspartinsäure | 4,00 | |
| Threonin | 3,30 | |
| Serin | 9,96 | |
| Glutaminsäure | - | 4,18 |
| Prolin | 4,63 | |
| Glycin | 6,16 | |
| Alanin | 5,91 | |
| Valin | 0,31 | |
| Cystin (1/2) | 2,78 | |
| Methionin | 4,50 | |
| Isoleucin | 7,02 | |
| Leucin | 3,51 | |
| Tyrosin | 4,37 | |
| Phenylalanin | 2,09. | |
| Ammoniak | 0,16 | |
| Ornithin | 5,43 | |
| Lysin | 2,00 | |
| Histidin | 5,84 | |
| Arginin | 11,4 | |
| Έ fo m/m | 71,25 | |
| Rohes Protein ( | fo Trockengew.) | |
509828/0822
Claims (13)
1. Verfahren zur Züchtung von Mikroorganismen, dadurch
gekennzeichnet, daß ein Methan-verbrauchender Mikroorganismus, der ein Stamm von Methylomonas ist, unter
aeroben Bedingungen in einem flüssigen Wachstumsmedium, enthaltend assimilierbare Quellen für Stickstoff und wesentliche
Mineralsalze in Gegenwart von Methangas und in Gegenwart von a) einem oder mehreren Methanol-verbrauchenden Mikroorganismen,
die imstande sind,das durch das Wachstum des
Methan -verbrauchenden Mikroorganismus gebildete Methanol zu metabolisieren und b) einem oder mehreren nicht-methylotrophen
Mikroorganismen, die imstande sind; die durch die Methan-und/οder
Methanol-verbrauchenden Organismen gebildeten organischen Substanzen zu metabolisieren, gezüchtet wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Methan-verbrauchenden Stamm
von Methylomonas den Organismus mit der IiCIB Nr. 11084 verwendet,
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Methanol-verbrauchenden Mikroorganismus
den Organismus NCIB Nr. 11112 verwendet.
4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Methanol-verbrauchenden Mikroorganismus
einen Stamm von Hyphomicrobium, Pseudomonas extorquens oder Pseudomonas methylotropha verwendet.
5· Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als nicht-methylotrophen Mikroorganismus·
einen Stamm dezrTseudomonas NCIB Nr.11062,11063
und/oder 11065 verwendet.
509828/0822
-19-
- 19 - 1A-45
6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als nicbt-methylotrophen Mikro- ,.
Organismus einen Stamm der Art Mycobacterium IiGIB Nr.11061
verwendet,
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den Methan-verbrauchenden Mikroorganismus
den Methanol-verbrauchenden Mikroorganismus und die nicht-methylotrophen Mikroorganismen itf^ner als 0J3 bezeichneten
Kultur mit der UGIB Nr.11085 verwendet*
8. Verfahren nach Anspruch 1 bis 7, dadurch g e k e η η ze
ichnet , daß man die Temperatur im Bereich von
38 bis 450G hält.
9· Verfahren nach Anspruch 1 bis 8, dadurch g e k e η η ζ
e i ch net , daß man den pH-Wert im Bereich von 6,4 bis
7,4 hält·
10. Mikroorganismus mit der NCIB Nr, 11084.
11. Mikroorganismus mit der NCIB Nr. 11112.
12. Mikroorganismus mit der NCIB Nr. 11062.
13. Mikroorganismus mit der NCIB Nr. 11063..
14« Mikroorganismus mit der NCIB Nr. 11065.
15· Mikroorganismus mit der NCIB Nr, 11061. 16. gemischte Kulturmit der NCIB Nr. 11085.
509828/0822
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB67874A GB1467022A (en) | 1974-01-07 | 1974-01-07 | Cultivating of methane-utilising micro-organisms |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE2460672A1 true DE2460672A1 (de) | 1975-07-10 |
| DE2460672C2 DE2460672C2 (de) | 1983-04-28 |
Family
ID=9708622
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE2460672A Expired DE2460672C2 (de) | 1974-01-07 | 1974-12-20 | Verfahren zum Züchten von Mikroorganismen |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US3996105A (de) |
| JP (1) | JPS50116680A (de) |
| BE (1) | BE823623A (de) |
| CA (1) | CA1037398A (de) |
| CH (1) | CH614234A5 (de) |
| DE (1) | DE2460672C2 (de) |
| DK (1) | DK140903B (de) |
| ES (1) | ES433184A1 (de) |
| FI (1) | FI53224C (de) |
| FR (1) | FR2256957B1 (de) |
| GB (1) | GB1467022A (de) |
| HU (1) | HU169929B (de) |
| IT (1) | IT1030943B (de) |
| NL (1) | NL7416644A (de) |
| NO (1) | NO140800C (de) |
| SU (1) | SU615870A3 (de) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1514485A (en) * | 1974-08-12 | 1978-06-14 | Shell Int Research | Regulation of assimilable nitrogen in microbiological processes |
| US4302542A (en) | 1976-06-21 | 1981-11-24 | Phillips Petroleum Co. | Fermentation with thermophilic mixed cultures |
| US4268630A (en) * | 1978-04-14 | 1981-05-19 | Exxon Research & Engineering Co. | Microbiological production of ketones from C3 -C6 alkanes |
| HU188954B (en) * | 1983-09-16 | 1986-05-28 | Richter Gedeon Vegyeszeti Gyar,Hu | Process for production of new inoculum suitable for anaerobic fermentation of b under 12 coensime |
| JP2603182B2 (ja) * | 1993-02-25 | 1997-04-23 | 環境庁国立環境研究所長 | 有機塩素化合物分解菌の培養方法 |
| US6835560B2 (en) * | 2001-10-18 | 2004-12-28 | Clemson University | Process for ozonating and converting organic materials into useful products |
| US6747066B2 (en) * | 2002-01-31 | 2004-06-08 | Conocophillips Company | Selective removal of oxygen from syngas |
| US7045554B2 (en) * | 2003-09-03 | 2006-05-16 | Conocophillips Company | Method for improved Fischer-Tropsch catalyst stability and higher stable syngas conversion |
| US7651615B2 (en) * | 2005-12-23 | 2010-01-26 | Clemson University Research Foundation | Process for reducing waste volume |
| EP3589727A1 (de) | 2017-03-01 | 2020-01-08 | Unibio A/S | Neues fermentationsmedium zum wachstum von methanotrophen bakterien und verfahren zur herstellung des mediums |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5328512B1 (de) * | 1970-10-26 | 1978-08-15 | ||
| GB1366711A (en) * | 1971-02-19 | 1974-09-11 | Shell Int Research | Microbiological process |
-
1974
- 1974-01-07 GB GB67874A patent/GB1467022A/en not_active Expired
- 1974-11-21 CA CA214,308A patent/CA1037398A/en not_active Expired
- 1974-12-20 HU HUSE1757A patent/HU169929B/hu unknown
- 1974-12-20 CH CH1713074A patent/CH614234A5/xx not_active IP Right Cessation
- 1974-12-20 DE DE2460672A patent/DE2460672C2/de not_active Expired
- 1974-12-20 NO NO744645A patent/NO140800C/no unknown
- 1974-12-20 DK DK674574AA patent/DK140903B/da unknown
- 1974-12-20 IT IT30904/74A patent/IT1030943B/it active
- 1974-12-20 FI FI3708/74A patent/FI53224C/fi active
- 1974-12-20 FR FR7442265A patent/FR2256957B1/fr not_active Expired
- 1974-12-20 SU SU742090249A patent/SU615870A3/ru active
- 1974-12-20 BE BE1006347A patent/BE823623A/xx unknown
- 1974-12-20 NL NL7416644A patent/NL7416644A/xx not_active Application Discontinuation
- 1974-12-20 ES ES433184A patent/ES433184A1/es not_active Expired
- 1974-12-20 JP JP49146689A patent/JPS50116680A/ja active Pending
-
1975
- 1975-01-06 US US05/539,202 patent/US3996105A/en not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| NICHTS-ERMITTELT * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FI53224C (de) | 1978-03-10 |
| FR2256957B1 (de) | 1977-11-10 |
| ES433184A1 (es) | 1976-12-01 |
| IT1030943B (it) | 1979-04-10 |
| BE823623A (nl) | 1975-06-20 |
| DE2460672C2 (de) | 1983-04-28 |
| GB1467022A (en) | 1977-03-16 |
| SU615870A3 (ru) | 1978-07-15 |
| FI370874A (de) | 1975-07-08 |
| FR2256957A1 (de) | 1975-08-01 |
| HU169929B (de) | 1977-02-28 |
| CH614234A5 (de) | 1979-11-15 |
| NO744645L (de) | 1975-08-04 |
| NL7416644A (nl) | 1975-07-09 |
| JPS50116680A (de) | 1975-09-12 |
| CA1037398A (en) | 1978-08-29 |
| DK140903B (da) | 1979-12-03 |
| US3996105A (en) | 1976-12-07 |
| NO140800C (no) | 1979-11-14 |
| NO140800B (no) | 1979-08-06 |
| DK674574A (de) | 1975-09-01 |
| DK140903C (de) | 1980-05-19 |
| FI53224B (de) | 1977-11-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DE2922284C2 (de) | ||
| DE2122294B2 (de) | Verfahren zur Gewinnung von Creatininamidohydrolase | |
| DE3343551A1 (de) | Verfahren zur biotechnologischen herstellung von poly-d(-)-3-hydroxybuttersaeure | |
| DE2460672A1 (de) | Verfahren zum zuechten von mikroorganismen | |
| DE1442230C3 (de) | Verfahren zum aeroben Züchten von Mikroorganismen | |
| DE1932981A1 (de) | Verfahren zur Herstellung eines Enzyms Lipase | |
| DE2931082C2 (de) | ||
| DE2633451C3 (de) | Herstellung von Bakterienzellmasse | |
| DE2402217B2 (de) | Verfahren zur Herstellung von Proteinmaterial | |
| DE2610478C2 (de) | Verfahren zum Züchten von Mikroorganismen | |
| DE2407740C2 (de) | Herstellung einer als Protein-Nahrungsmittel oder Nahrungsmittelzusatz geeigneten Biomasse | |
| DE2344006C3 (de) | Verfahren zur biotechnischen behandlung von epsilon-caprolactam enthaltenden abwaessern | |
| DE2535782A1 (de) | Verfahren zur zuechtung von mikroorganismen | |
| DE3248420C2 (de) | ||
| DE933846C (de) | Verfahren zur Herstellung von fuer die Aufbesserung von tiereiweissarmem Futter geeigneten Vitaminsubstanzen | |
| DE1903162A1 (de) | Gaerungsverfahren zur Herstellung von Aminosaeuren | |
| DE2708112C3 (de) | Verfahren zur mikrobiologischen Erzeugung von Protein | |
| DE2508914A1 (de) | Neue gegen kokzidien wirksame substanz und deren herstellung durch kultur eines streptomyces | |
| DE2167120C2 (de) | Verfahren zur Gewinnung von löslicher Creatin-amidinohydrolase | |
| DE2311006A1 (de) | Verfahren zur proteinherstellung | |
| DE2509653A1 (de) | Neue gegen kokzidien wirksame substanz und deren herstellung durch kultur eines streptomyces | |
| AT200260B (de) | Verfahren zur Herstellung des neuen L-6-Diazo-5-oxonorleucins | |
| DE2757877C3 (de) | Herstellung von Biomassen | |
| DE1918705A1 (de) | Verfahren zur Herstellung von Einzellprotein | |
| DE2059387A1 (de) | Mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung von Konzentraten,die Karotinoide enthalten |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 8110 | Request for examination paragraph 44 | ||
| 8126 | Change of the secondary classification |
Free format text: C12N 1/30 C12N 1/32 C12N 1/20 |
|
| 8125 | Change of the main classification |
Ipc: C12N 1/30 |
|
| 8181 | Inventor (new situation) |
Free format text: HARRISON, DAVID ERNEST FORESTER, SHELDWICH LEES, FAVERSHAM, KENT, GB HARWOOD, JOHN HARRY, TEYNHAM, SITTINGBOURNE, KENT, GB HERBERT, BARRY NEIL, MURSTON, SITTINBOURNE, KENT, GB |
|
| D2 | Grant after examination | ||
| 8364 | No opposition during term of opposition | ||
| 8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |