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Verfahren zur Herstellung des neuen L-6-Diazo-5-oxonorleucins
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer neuen Aminosäureverbindung, nämlich des neuen L-6-Diazo-5-oxonorleucins.
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zu entnehmen sind. Diese Verbindung enthält nur die Elemente Kohlenstoff, Wasserstoff, Sauerstoff und Stickstoff und hat die empirische Formel C6HN0 . Sie hat ein Molekulargewicht von 171 und besitzt folgende Strukturformel :
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L-6-Diazo-5-oxonorleucin ist verhältnismässig unbeständig gegen Hitze und zerfällt vor dem Schmelzen. Die Zersetzung tritt nicht bei einer bestimmten Temperatur ein, demzufolge variieren Zersetzungs- und Schmelzpunkte innerhalb eines grossen Bereiches in Abhängigkeit von der Bestimmung methode.
Im allgemeinen beginnt die Zersetzung bei etwa 1450 C und kann sich bis 1550 C erstrecken ;
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lL-6-Diazo-5-oxonorleucin ist sehr gut in Wasser löslich, aber unlöslich in gewöhnlichen unpolaren organischen Lösungsmitteln. Es ist in absolutem Äthylalkohol, absolutem Methylalkohol oder Aceton in der Kälte nur sehr wenig löslich, aber löslich in warmen, wässerigen Lösungen dieser Lösungsmittel.
L-6-Diazo-5-oxonorleucin gibt spezifische blau-violette Ninhydrin-Farbreaktionen. Durch Oxydation des L-6-Diazo-5-oxonorleucins mit Perjodsäure entsteht L-Glutaminsäure.
Das Produkt bildet mit Alkali-oder Erdalkalimetallhydroxyden, Carbonaten, Bicarbonaten, Oxyden, Alkoxyden, Amiden u. dgl. Metallsalze.
In wässerigem Phosphatpuffer bei PH 7 zeigt L-6-Diazo-5-oxonorleucin charakteristische UV-Ab-
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von 244 Millimikron.
L-6-Diazo-5-oxonorleucin hat ein charakteristisches Infrarot-Absorptionsspektrum. Wird die Bestimmung unter Verwendung einer Kaliumbromidscheibe durchgeführt, zeigt das Absorptionsspektrum bei
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g 3. 19, 3. 32, 3. 78, 4. 66, 6. 14, 6. 30, 6. 59, 6. 90, 7. 18, 7. 18,Mikron.'
Das Produkt besitzt ausgeprägte phytotoxische Eigenschaften und ist besonders als Herbicid, Unkrautvertilgungsmittel od. dgl. geeignet.
Die genannte Verbindung ist ausserdem von Bedeutung, da sie die Biosynthese essentieller Nucleinsäuren und Nucleinsäurevorläufern durch lebende Zellen hemmt und auch eine hemmende Wirkung auf das Wachstum von Neoplasma ausübt. L-6-Diazo-5-oxonorleucin kann daher für die Behandlung neoplastischer Krankheiten bei Tieren oder Menschen wertvoll sein. L-6-Diazo-5-oxonorleucin ist besonders
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wirksam gegen Hefen. Infolge dieses Charakteristikumskann es bei der Isolierung von Bakterien aus mikroben Gemischen, in denen eine oder mehrere Komponenten Hefe ist, verwendet werden.
Erfindungsgemäss wird das L- 6-Diazo- 5-oxonorleucin durch ein mikrobiologisches Verfahren hergestellt und umfasst das Kultivieren eines Mikroorganismus, der in dieser Beschreibung als Streptomyces C-2943 bezeichnet ist, unter künstlichen Bedingungen in einem geeigneten Nährmedium. Die Einzelheiten dieses Vorganges werden im folgenden beschrieben.
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nismus wurden den ständigen Sammlungen des Culture Bureau von Parke, Davis & Company, Detroit, Michigan, unter der Nr. 04997 und den Kultursammlungen der Fermentation Division, Northern Utilization Research Branch, U. S. Departement of Agriculture, Peoria, Illinois, angegliedert.
Es können Kulturen des Mikroorganismus dadurch erhalten werden, dass man eine Suspension einer Bodenprobe, die ihn enthält, in Wasser herstellt, die schwererenpartikeln absetzen lässt, die resultierende überstehende Bodensuspension in Verdünnungsreihen auf Nähragar verteilt, die Nährböden zur Herstellung von Mikroorganismenkolonien bei 24 - 280 C bebrütet und ausgesuchte einzelne Kolonien, die den Streptomyces C-2943 entsprechen, auf frische Agarnährböden überträgt. Durch wiederholtes Selektieren und Übertragen von reinen, charakteristischen Kolonien auf frische Agarnährböden werden Thalli erhalten, die reine Kulturen des erwünschten Mikroorganismus darstellen.
Streptomyces C-2943 ist ein aerober und aeralsporulierender Vertreter der Klasse Actinomycetales und gehört der Gattung Streptomyces an, wie in der sechsten Ausgabe von Bergey's Manual of Derterminative Bacteriology erwähnt ist. Der Organismus weist folgende Eigenschaften auf : wenn er auf GlocoseTrypton- oder auf Nähragar gezüchtet wird, ist das primäre Substratmycel grau bis schwarz ; auf Asparagin-Glycerin- oder Glucose-synthetischem Agar ist das Mycel weiss oder hellgrau, hellpurpur oder hellrot bis grau ; auf Czapeks- oder auf Calciummalat-Agarnährboden ist es weiss bis hellgelb bis grau. Auf die-
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wird, verbleibt die Farbe des Mediums im wesentlichen unverändert. Mikroskopisch gesehen sind die Lufthyphen lang und schwanken von 100 bis 500 Mikron in ihrer Länge. Primäre und manchmal sekundäre Verzweigung tritt auf.
Auch treten endständige Schlingen und Spiralen auf. Die Spiralen weisen verschiedene Längen auf und bestehen aus 2 bis 15 Windungen. Die Windungen sind oft lose und unregelmässig. Distale Teile dieser Lufthyphen unterteilen sich in Sporenketten.
Der Organismus verflüssigt allmählich Gelatine und bildet dabei eine dunkelbraunefarbe immedium.
Lackmusmilch wird von ihm gewöhnlich nicht peptonisiert. Im synthetischen Nährmedium (Pridham et
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resultierende Gemisch unter sterilen aeroben Bedingungen bei einer Temperatur von 20 bis 350 C bebrütet, den im Kulturgemisch vorhandenen Feststoff entfernt und das erwünschte L-6-Diazo-5-oxonor- leucin aus der wässerigen Kulturflüssigkeit isoliert.
Zur Impfung können sowohl Sporen oder Conidien des Streptomyces C-2943 als auch ihre wässerigen Suspensionen, welche eine geringe Menge Seife oder anderes Netzmittel enthalten, verwendet werden. Für grosse Gäransätze werden junge, lebhaft wachsende Kulturen des Streptomyces C-2943 den Sporen, Konidien oder ihren wässerigen Suspensionen vorgezogen.
Geeignete wässerige Nährmedien sind solche, die einen PH- Wert von zwischen 5 und nd 8,'1 aufweisen und sowohl Kohlenstoff-und Stickstoff-Quellen als auch anorganische Salze enthalten. Geeignete Kohlenstoff-und Stickstoffquellen sind unter anderen Sojabohnenölmehl, Weizenglutenmehl, Brauereihefe, salzextrahierter Schweinemagen, Fleischeiweisshydrolysat, lösliche Schlempe und Corn Steep Solids.
Es wurde gefunden, dass auch mehrere Kombinationen dieser Kohlenstoff- und Stickstoffquellen mit anderen Stickstoff-haltigen Materialien, wie ein Gemisch aus Sojabohnenölmehl, säurehydrolysiertem Kasein und entbitterter Hefe, ein Gemisch aus salzextrahiertem Schweinemagen und Sojabohnenpepton und ein Gemisch von Sojabohnenölmehl und säurehydrolysiertem Kasein besonders gute Resultate ergeben.
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Die optimale Konzentration dieser Zugaben schwankt von l, 5 bis 21o des Gesamtgewichtes des Mediums.
Die Kohlenstoffquelle kann zur Gänze aus den vorerwähnten Stoffen bestehen, es werden jedoch dann die besten Ergebnisse erzielt, wenn Glucose oder Galaktose dem Medium zugefügt werden. Die Konzentration der Glucose oder der Galaktose kann von 0 bis 2 % variieren. Konzentrationen vonüber 2loscheinen auf die Ausbeute des erwünschten Produktes eine nachteilige Wirkung auszuüben. Als anorganische Salze können Natriumchlorid, Ammonchlorid, Ammonnitrat, Kaliumchlorid, Calciumcarbonat u. dgl. ver- wendet werden. Ammonsalze wie Ammonchlorid und Ammonnitrat sind besonders geeignete Zusätze und führen zu hohen Ausbeuten des erwünschten Produktes. Die optimale Konzentration dieser Ammonsalze liegt zwischen 0, 1 und 0, 50/0 des. Nährmediums.
Das Kultivieren des Streptomyces C- 2943 im wässerigen Medium kann nach einer Anzahl verschie- dener Methoden durchgeführt werden. Es können beispielsweise Mikroorganismen unter aeroben Bedin-
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Vorteilhaft lässt sich die Herstellung von L-6-Diazo-5-oxonorleucin durch gross angelegte Gärung unter Verwendung von submersen Kulturen des Streptomyces C-2943 durchführen. Gemäss dieser Ausführungsform der Gärung wird ein steriles wässeriges Nährmedium mit Streptomyces C-2943 beimpft und
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der Kulturflüssigkeit gebildet hat. Die für die maximale Produktion von L-6-Diazo-5-oxonorleucin er- forderliche Zeit variiert mit der Grösse und Bauart der verwendeten Ausrüstung. Beispielsweise wird bei grossen kommerziellen Gärungsprozessen, wie sie in den tankartigen Gärbehältern durchgeführt werden, die maximale Produktion von L-6-Diazo-5-oxonorleucin in etwa 32 Stunden oder weniger erreicht.
Bei
Verwendung von Schüttelflaschen ist in der Regel ein längerer Zeitraum erforderlich als bei Verwendung von grossen Gärbottichen, er kann sich über 3 bis 8 Tage erstrecken. Unter submersen Kulturbedingungen entwickelt sich der Mikroorganismus in der Form mehr oder weniger voneinander gesonderter Partikel, die im ganzen Nährmedium verteilt sind, im Gegensatz zur mehr oder weniger kontinuierlichen Haut, die auf der Oberfläche des Mediums bei der Oberflächenkulturmethode vorhanden ist. Wegen dieser Verteilung des Organismus im Medium können grosse Volumina des beimpften Nährmediums auf einmal in den in der Gärungsindustrie üblicherweise verwendeten grossen Tanks oder Bottichen kultiviert wer- den.
Sowohl stationäre Gärbottiche, welche mit geeigneten Rühr-und/oder Belüftungseinrichtungen aus- gestattet sind, als auch horizontale Gärtrommeln haben sich in dieser Beziehung als besonders nützlich herausgestellt. Für die Erzeugung kleinerer Mengen des Antibiotikums oder von Kulturen des Mikroorganismus kann jedoch die submerse Kulturmethode in kleinen Flaschen oder Behältern ausgeführt werden, die mittels geeigneter mechanischer Einrichtungen entweder geschüttelt oder gerührt werden.
Das Rühren und die Durchlüftung des Kulturgemisches kann nach einer Anzahl verschiedener Wege geschehen, das Rühren kann mittels Turbinen, Schaufeln, Propeller oder anderer mechanischer Rührwerke geschehen oder kann durch Rotieren oder Schütteln des Gärbehälters selbst, duretT verschiedene Pumpvorrichtungen oder durch Führen von Luft oder anderer sauerstoffhältiger Gase durch das Medium bewerkstelligt werden. Die Belüftung kann durch Einpressen von Luft oder anderen sauerstoffhältigen Gasen in das Gärgemisch durch offene Rohre, gelochte Rohre, poröse Diffusionsmedien, wie Kohlenstäbe, Karborundum, Glasfritten od. dgl., oder durch Sprühen, Spritzen oder Giessen der Maische in oder durch eine sauerstoffhaltige Atmosphäre geschehen.
Die Oberflächenkulturmethode zur Erzeugung des L-6-Diazo-5-oxonorleucins umfasst das Beimpfen einer seichten Schichte, gewöhnlich weniger als 2 cm eines sterilen wässerigen Mediums, mit Streptomyces C-2943 und Bebrüten des Gemisches unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur zwischen etwa 20-350C, vorzugsweise in der Nähe von 23-290C. Zur Erzielung der Höchstproduktion von L-6Diazo-5-oxonorleucin ist meistens eine längere Bebrütungsdauer als nach der Tiefenkulturmethode erforderlich. Im allgemeinen ist eine Bebrütungsdauer von etwa 3 bis 8 Tagen notwendig.
Nach Beendigung der Gärungsphase des Verfahrens werden die Feststoffe von der Kulturflüssigkeit, beispielsweise durch Filtration, Zentrifugieren, usw., entfernt.
Die resultierende. Flüssigkeit, die das L-6-Diazo-5-oxonorleucin enthält, besitztdiegewünschten Eigenschaften in Bezug auf die Neoplasmahemmung. Am besten wird die Flüssigkeit jedoch weiterverarbeitet und das L-6-Diazo-5-oxonorleucin in konzentrierter oder kristalliner Form isoliert.
Nach einem zweckmässigen Verfahren zur Isolierung des Produktes wird die geklärte Kulturflüssigkeit auf ein kleines Volumen, beispielsweise auf 1/5 bis 1/20 des ursprünglichen Volumens eingeengt, etwa 3 bis 10 Volumina mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel, wie Methanol oder Äthanol, zugesetzt, die ausgefällten Verunreinigungen von der Lösung getrennt, die gereinigte Lösung der Adsorption und Elution unter Verwendung eines Adsorbens für das L-6-Diazo-5-oxonorleucin unter-
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worfen und das Produkt aus dem Eluat wiedergewonnen. Nach einer anderen vorteilhaften Methode wird die geklärte Kulturflüssigkeit zur Trockene eingedampft, der Rückstand mit einem mit
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unterworfen und das Produkt aus dem Eluat wiedergewonnen.
Die Adsorption wird durchgeführt, indem die gereinigte Lösung oder der erwähnte Extrakt durch eine Adsorptionssäule geführt wird, die ein neutrales Adsorbens enthält, dessen pH-Wert oder eingestellter PH-Wert 5-8, vorzugsweise 6-8, beträgt.
Einige Beispiele für geeignete Adsorbentien sind Aluminiumoxyd oder Brockmanns Aluminiumoxyd. Das Produkt wird aus dem Adsorbens mit Wasser oder mit einer wässerigen Lösung eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels eluiert ; das Eluat wird in Fraktionen aufgefangen und die Fraktionen, welche die stärkste Ultraviolettabsorption bei einer Wellenlänge von etwa 275 Millimikron zeigen, werden getrocknet. Wegen der instabilen Natur des Produktes bei erhöhter Temperatur ist es vorteilhaft, das zum Eluieren verwendete Lösungsmittel durch Gefriertrocknung unter Hochvakuum zu entfernen. Das Produkt kann durch Adsorption und Elution unter Verwendung von Aktivkohle weiter gereinigt werden.
Zu diesem Zwecke wird das trockene Produkt wie oben beschrieben dargestellt und in einer kleinen Menge Wasser aufgelöst, das einen geringen Anteil eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels enthält. Der PH-Wert der Lösung wird, falls es erforderlich sein sollte, auf 6-7 eingestellt und die Lösung durch eine Adsorptionssäule geführt, die Aktivkohle enthält. Die Säule wird mit Wasser eluiert, das einen geringen Anteil eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels, vorzugsweise Aceton, enthält. Zur Herstellung der Lösung für die Adsorptionsstufe kann Wasser verwendet werden, dem ein geringer Anteil eines organischen Lösungsmittels, wie Aceton, Methanol, Äthanol, Phenol, u. dgl. zugesetzt ist.
Vorzugsweise wird Wasser angewendet, welches 1% Aceton enthält, wobei soviel Lösungsmittel verwendet wird, dass eine Lösung entsteht, welche 2-10 mg L-6-Diazo-5-oxonorleucin im cm3 enthält. Die Menge Aktivkohle, die zur Adsorption des ganzen erwünschten Produktes aus der Lösung erforderlich ist, schwankt mit der Konzentration des L-6-Diazo-5-oxonorleucins im Trockenprodukt. Beispielsweise erfordert ein Material, das 5% L-6-Diazo-5-oxonorleucin enthält, gewöhnlich etwa 15 g Aktivkohle pro Gramm. Die besten Resultate werden dann erzielt, wenn die Aktivkohle vorher mitDiatomeenerde aufgeschlämmt wird, da dies dazu beiträgt, eine ausreichende Durchflussgeschwindigkeit aufrechtzuerhalten.
Nach der Adsorptionsstufe wird die Säule eluiert, indem sie mit einem geeigneten Lösungsmittel, wie Wasser, gewaschen wird, das weniger als 25% eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels enthält. Zur Erzielung
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Aceton in Wasser angewendet. Dasaufgearbeitet werden. Das Produkt ist in jeder Beziehung mit dem auf chemische Weise hergestellten synthetischen Produkt identisch.
Die folgenden Beispiele erläutern ausführlich die Herstellung des L-6-Diazo-5-oxonorleucins nach mikrobiologischen synthetischen Methoden.
Beispiel 1 : 300 cm3 Nährmedium mit der folgenden Zusammensetzung :
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<tb>
<tb> ufo <SEP> on <SEP>
<tb> Maltose <SEP> 1,0 <SEP> Calciumcarbonat <SEP> 0,1
<tb> Butanol-Aceton <SEP> Gärungsrückstand <SEP> 0,5 <SEP> Natriumchlorid <SEP> 0,5
<tb> säurehydrolysiertes <SEP> Kasein <SEP> 0,5 <SEP> Wasser <SEP> auf <SEP> 100,0
<tb>
wird in 2 Erlenmeyer Kolben gefüllt und der PH- Wert mit sechsnormaler Natriumhydroxydlösung auf 7,5 eingestellt. Darauf wird das Nährmedium durch 25 Minuten dauerndes Erhitzen der Kolben auf 1200C sterilisiert. Das Medium wird gekühlt und jeder Kolben mit 2 cm3 einer Suspension in 40 cm3 einer sterilen 0, Öligen Kastilseifenlösung oder mit Sporen von 4 auf Glukose-Trypton unter Zusatz von Mineralsalzen hergestellten Schrägagar-Kulturen des Streptomyces C-2943 beimpft.
Die Flaschen werden bei Zimmertemperatur (24-260C) 90 Stunden aufbewahrt und während dieser Zeit mit Hilfe von mechanischen Schüttelvorrichtungen durchmischt, wobei die Kolben mit 160 Umdr/min in einem Kreis von.
6 cm Durchmesser rotieren. Die Kulturflüssigkeit enthält etwa 1 mg L-6-Diazo-5-oxonorleucin (durch Diffusionsproben auf scheibenförmigen Agar Nährböden bestimmt, wobei das Ausmass der Wachstumshemmung auf die Hefe Torulopsis Albida NRRL Y1400 gemessen wurde). Die Kulturflüssigkeit wird filtriert und das erwünschte Produkt, das L-6-Diazo-5-oxonorleucin. wird durch Adsorptions- und Elutionsmethoden, wie sie weiter unten im Einzelnen beschrieben werden, aus dem Filtrat isoliert.
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2 :
12 l eines Mediums mit der folgenden Zusammensetzung :Sojabohnenölmehl 1,0 salzextrahierter Schweinemagen 0,5
Ammonchlorid 0,167
Natriumchlorid 0,5
Calciumcarbonat 0, 5
Wasser auf 100,0
Natriumhydroxyd (10 N) um den pH-Wert auf 7,5 einzustellen, werden in ein 30 l fassendes Glasgärgefäss gefüllt, das mit rostfreien Stahlarmaturen, einschliesslich Auf- gussapparat, Propeller, Prellbleche und Probeentnahmeleitung ausgerüstet ist, und das Medium durch zweistündiges Erhitzen auf 1210 C sterilisiert. Der pH-Wert des Mediums nach der Sterilisation beträgt
7, 8.
Das Medium wird abgekühlt und mit einer Suspension von Sporen einer auf Glucose-Trypton unter Zusatz von Mineralstoffen hergestellten Schrägagar-Kultur des Streptomyces C-2943 in 10 cm3 einer sterilen 0, zigen Natriumheptadecylsulfatlösung beimpft. Das beimpfte Medium wird 72 Stunden bei 25-260 C bebrütet und während dieser Zeit mit 225 Umdr/min gerührt, wobei 12 l sterile Luft pro Minute in das Medium geführt werden. Während des Bebrütens werden 98 cm3 eines Mono- und Diglyceride enthaltenden Gemisches von rohem Schmalz und Mineralölen als Schaumverhinderungsmittel nach Bedarf zugesetzt. Die so erhaltene bebrütete Kultur wird zur Beimpfung der weiter unten beschriebenen Hauptkultur verwendet.
Vier gläserne 30 l fassende Gärgefässe, welche je 16 l des oben beschriebenen Mediums enthalten, werden 2 Stunden bei 1210 C sterilisiert. Der PH- Wert nach der Sterilisation beträgt 7,6. Nachdem die das sterile Medium enthaltenden Gärgefässe auf Zimmertemperatur abgekühlt sind, werden 800 cm3 betragende aliquote Teile der oben. beschriebenen bebrüteten Kultur in jedes Gärgefäss gefüllt und das beimpfte Medium 40 Stunden bei 25- 26 C bebrütet. Während der ganzenBebrütungsdauer werden mittels eines Aufgussapparates 161 Luft pro Minute zugeführt und mittels eines Rührers, der mit 200 Umdr/min arbeitet, durchmischt. Während des Bebrütens werden nach Bedarf jedem Gärgefäss 30 cm3 des oben beschriebenen Gemisches aus Schmalz und Mineralölen zugesetzt, damit die Schaumbildung unter Kontrolle gehalten wird.
Die Konzentration des L-6-Diazo-5-0xonorleucins im Gärmedium beträgt nach der''ebrutung etwa
37 Mikrogramm pro cm3.
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Filtrates das Wachstum eingepflanzter Sarkom 180 Tumore in Mäusen beträchtlich.
Der Filterkuchen wird mit Wasser gewaschen und die kombinierten Filtrate und Waschflüssigkeiten (41,5 Liter) werden im Vakuum auf ein Volumen von 1920 cms eingeengt. Durch Zusatz von Äthanol wird das Volumen des Konzentrates auf 19,2 Liter gebracht, worauf der gebildete Niederschlag durch Filtration entfernt und der Filterkuchen mit Äthanol gewaschen wird. Das alkoholische Filtrat (pu = 6,5) wird durch eine Adsorptionssäule, wie weiter unten beschrieben, geführt.
2,3 kg Aluminiumoxyd werden mit verdünnter Salzsäure verrührt, so dass der PH-Wert bei 6,4 konstant bleibt. Das Aluminiumoxyd wird entfernt, mit Wasser gewaschen und durch vierstündiges Erhitzen auf 2000 C aktiviert. Das Aluminiumoxyd wird mit 90%obigem wässerigen Äthanol verrührt und in eine Säule gepresst, die einen Durchmesser von 10 cm aufweist (hold-up Volumen 2300 cm, Durchflussgeschwindigkeit unter dem Einfluss der Schwerkraft 5 1 pro Stunde).
Das wie oben bereitete alkoholische Filtrat wird in die Adsorptionssäule gefüllt und die Säule hintereinander mit 1, 9 1 zigen wässerigen Äthanol und 12, 11 750/oigem wässerigen Äthanol gewaschen. ' Das Perkolat wird verworfen. Die Säule wird darauf mit 18 1 250/obigem Äthanol eluiert und das Eluat in 1 Liter-Fraktionen aufgefangen. Die ersten 5 Fraktionen des Eluates werden im Vakuum eingeengt und das Konzentrat im Hochvakuum gefriergetrocknet. Das getrocknete Produkt besitzt die erwünschte biologische Aktivität. Beispielsweise zeigt eine 5 Tage lang und 2 mal täglich erfolgte intraperitonale Injektion von 0,, 5cm einer wässerigen Lösung des Produktes (300 ypro cnss) eine wesentliche Wachstumshemmung eingepflanzter Sarkom 180 Tumore bei Mäusen.
8, 5 g getrocknetes Material, das etwa 4% L-6-Diazo-5-oxonorleucin enthält, wird in 150 cm3 zuigen Aceton in Wasser (PH 6, 2) gelöst. Eine Adsorptionssäule wird vorbereitet, indem eine Auf-
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schlämmung von 125 g Aktivkohle und 125 g Diatomeenerde in einer Lösung vonligemAcetonin Wasser in eine Säule mit 6,5 cm Durchmesser gefüllt wird (hold-up Volumen 800 ctrss ; Durchflussgeschwindigkeit unter dem Einfluss der Schwerkraft 750 cm3 pro Stunde). Die das L-6-Diazo-5-oxonorleucin enthaltende wässerige Lösung wird durch die Säule geführt und die Säule mit 4, 811%iger Acetonlösung gewaschen. Das Eluat wird in 100 cm3-Fraktionen aufgefangen.
Die Fraktionen Nr. 15 bis 23 einschliesslich werden eingeengt und im Hochvakuum gefriergetrocknet. Das getrocknete Material wird in warmem 90% eigen wässerigen Methanol gelöst und bei 50 C mehrere Stunden aufbewahrt. Das sich in kristalliner Form abscheidende L-6-Diazo-5-oxonorleucin wird abgetrennt und im Vakuum getrocknet ;
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Beispiel 3 : a) 150 cm3 eines Nährmediums mit der folgenden Zusammensetzung :
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salzextrahierter Schweinemagen 0,5
Ammonchlorid 0,167
Natriumchlorid 0,5
Calciumcarbonat 0,5
Wasser auf 100, 0
Natriumhydroxyd (10 N) zur Einstellung des pH-Wertes auf 7,5 wird in einen 1-Liter Erlenmeyer Kolben gefüllt. Das Nährmedium wird darauf durch halbstündiges Erhitzen auf 1210 C sterilisiert und der Kolben mit 5 cm3 einer Suspension von Sporen aus einer Schrägagar- (Glukose-Trypton-Mineralsalze)-KuItur von Streptomyces C-2943 in 10 cm3 einer zijgen Na- triumheptadecyl-Sulfatlösung beimpft.
Der Kolben wird 72 Stunden bei 260 C bebrütet und während dieser Zeit mittels einer mechanischen Schüttelvorrichtung durchmischt, welche den Kolben auf einem Kreis mit 6,0 cm Durchmesser mit 160 Touren pro Minute rotieren lässt. Die bebrütete Kultur, die auf diese Weise erhalten wurde, wird zum Beimpfen des unterb) beschriebenen 56,8-Liter betragenden Mediums verwendet. b) 56,8 I Nährmedium mit der unter a) beschriebenen Zusammensetzung werden in ein 113 1 fassendes Gärgefäss aus rostfreiem Stahl gefüllt und durch einstündiges Erhitzen auf 1210 C sterilisiert. Der PH- Wert des Mediums nach der Sterilisation beträgt 6, 9. Das Medium wird abgekühlt und mit 90 cm3 der oben beschriebenen bebrüteten Kultur beimpft. Das beimpfte Medium wird bei 3S C 24 Stunden bebrütet.
Während der Bebrütungsdauer werden mittels eines Aufgussapparates 96 1 sterile Luft dem Medium zugeführt und das Gemisch mit einem mit 200 Touren laufenden Propeller gerührt. Die auf diese Weise erhaltene bebrütete Kultur von Streptomyces C-2943 wird zur Beimpfung des unten unter c) beschriebenen 5681 betragenden Mediums verwendet. c) 568 1 Nährmedium mit der unter a) beschriebenen Zusammensetzung werden in einen 7501 fassenden Gärbehälter aus rostfreiem Stahl gefüllt und durch einstündige Erhitzen auf 1210 C sterilisiert.
Der pH-Wert des Mediums nach der Sterilisation beträgt 6, 7. Das Medium wird abgekühlt und mit 56, 8 l der unter b) beschriebenen bebrüteten Kultur beimpft. Das Kulturgemisch wird 27 Stunden bei 270 C bebrütet und während dieser Zeit werden mittels eines Aufgussapparates 708 l sterile Luft pro Minute dem Gemisch zugeführt, wobei das Gemisch mittels eines Propellers mit 200 Touren pro Minute gerührt wird. Um die Schaumbildung unter Kontrolle zu halten, werden 2, 4l eines sterilen, Mono- und Diglyceride enthaltenden Gemisches von rohem Schmalz und Mineralölen zeitweise nach Bedarf zugesetzt.
Der im bebrüteten Gemisch vorhandene Feststoff wird durch Filtration in einer Rahmenpresse entfernt, die vorher mit einer Schichte Diatomeenerde versehen wurde. Das Filtrat wird unter vermindertem Druck auf ein Volumen von etwa 301 eingeengt. Das Konzentrat wird mit 2 : 75 1 Äthanol gemischt und und der sich bildende Niederschlag durch Filtration entfernt, und verworfen.
-d) Ein Anteil (180 l) des Äthanolfiltrates (Gesamtvolumen 290 1, pH 5, 9) wird durch eine Adsorptionssäule geführt, die auf folgende Weise zubereitet worden ist : 22,5 kg Aluminiumoxyd werden mit verdünnter Salzsäure verrührt, so dass der PH-Wert bei 6, 0 konstant bleibt. Das Aluminiumoxyd wird filtriert, mit von Ionen befreitem Wasser gewaschen und durch vierstündiges Erhitzen auf 2000 C aktiviert. Das Aluminiumoxyd wird mit 90%igem wässerigen Äthanol verrührt und in eine Säule gepresst, welche'l, 80 m lang ist und einen Durchmesser von 15,2 cm aufweist (hold-up Volumen 181, Durch- flussgeschwindigkeit 341 in der Stunde unter einem Druck von 0,85 Atmosphären).
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- 7-Nr. 200260
Das wie oben zubereitete alkoholische Filtrat wird unter einem positiven Druck von 0,85 Atü durch die Adsorptionssäule perkoliert und die Säule wird nacheinander mit 18 1 90"loigem wässerigen Äthanol und 120 1 2Moigem wässerigen Äthanol gewaschen. Die Säule wird darauf mit 108 1 ZSigem wässerigen Äthanol eluiert und das Eluat in Fraktionen von 9, 11 aufgefangen. Die vierte, die fünfte und die sechste Fraktion werden vereinigt, im Vakuum bei 350 C eingeengt und das Konzentrat im Hochvakuum gefriergetrocknet. e) Der verbleibende 1101 Anteil des Äthanolfiltrates aus c) wird auf 12,2 kg Aluminiumoxyd nach der oben unter d) beschriebenen Methode chromatographiert und das Eluat eingeengt und gefriergetrocknet.
Die trockenen Pulver nach d) und e) werden vereinigt. Das auf diese Weise erhaltene Produkt enthält 2, 16 g L-6-Diazo-5-oxonorleucin. Das Produkt wird auf folgende Weise durch Adsorption und Eluieren gereinigt : eine Aufschlämmung von 780 g Aktivkohle und 780 g Diatomeenerde in einer l% LgenLösung von Aceton in Wasser werden in eine Säule gefüllt, die 150 cm lang ist und einenDurchmesser von 10, 2 cm
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Das Produkt wird in 858 cm3 1'igem Aceton in Wasser gelöst und die Lösung durch die Säule perkoliert.
Die Säule wird mit 20 l einer zogen Lösung von Aceton in Wasser eluiert. Es werden Fraktionen von je 500 cm3 aufgefangen. Die 17. bis 20. Fraktion einschliesslich werden vereinigt und im Vakuum eingeengt. Das Konzentrat im Hochvakuum gefriergetrocknet. Das Produkt, das L-6-Diazo-5-oxonorleucin,
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kg) eine beträchtliche Wachstumshemmung eingepflanzter Sarkom-180 - Tumore beiMäusen. Die chemi- schen und anderen biologischen und physikalischen Eigenschaften des Produktes stimmen mit den eingangs erwähnten überein.
Die Erfindung ist nicht auf die angeführten Beispiele beschränkt. Es sind vielmehr im Rahmen des erfindungsgemässen Verfahrens weitgehende Abänderungen möglich.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Herstellung des neuen L-6-Diazo-5-oxonorleucins der Formel
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dadurch gekennzeichnet, dass ein steriles, wässeriges, geeignete Kohlenstoff-, Stickstoffquellen und Mineralsalze enthaltendes Nährmedium von einem PH- Wert zwischen 5,0 und 8,5 mit Streptomyces C-2943 beimpft und das. entstandene Gemisch unter aeroben, vorzugsweise submersen Bedingungen bei einer Temperatur von etwa 200 bis 350 C, vorzugsweise etwa 23 bis 290 C, bebrütet wird und aus dem Kulturfiltrat das L-6-Diazo-5-oxonorleucin nach an sich bekannten Methoden isoliert und, falls erwünscht, gereinigt wird.