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Verfahren zur Herstellung von Substanzen, die das Wachstum pathogener
Mikroorganismen hemmen Die Erfindung betrifft biochemische Verbindungen, insbesondere
ein neues Antibioticum und dessen Herstellungsverfahren.
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Die Erfindung bezieht sich auch auf das Herstellungsverfahren und
die Isolierung von Substanzen, die das Wachstum pathogener Microorganismen inklusive
Mycobacterius tuberculosis hemmen. Besagte Verbindungen bestehen a) aus einer Substanz
mit saurem Charakter, die von Säuren gefällt wird und sich in wäßrigem Alkali löst.
Diese Substanz zeigt so gut wie gar kein Diffusionsvermögen und hat ein Molgewicht
von nahezu 1o ooo. Im UV-Absorptionsspektrum hat sie bei etwa 26o nu eine Spitze;
sie kann weiterhin durch E I`,m von etwa 7o charakterisiert werden. Im Ultrarotgebiet
zeigt sie im folgenden Frequenzbereich (aus gedrückt in cm')
| 100s 1282 |
| 1100 1739 |
| 1121 3390 |
charakteristische Absorptionsbanden; b) aus dem Alkalisalz besagter Substanz.
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Die Erfindung bezieht sich weiterhin darauf, in ein wäßriges Nährmedium
eine Kultur von Streptomyces arenae einzuführen, das Medium anschließend zu belüften
und zu bewegen.
Es ist schon seit längerer Zeit bekannt, daß bestimmte
Mikroorganismen beim Wachstum auf verschiedenen Nährbodentypen Antibiotica bilden.
So entsteht zum Beispiel bei der Kultivierung oder Fermentierung von Penicillium
notatum Penicillin, aus einer Art von Streptomyces griseus Streptomycin und aus
einer Art des Streptomyces aureofaciens Aureomycin.
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Der Organismus, der das Antibioticum der. vorliegenden Erfindung produziert,
wurde aus einer Bodenprobe aus dem sandigen Gebiet des Illinois State Beach in der
Nähe von Zion, Illinois, USA. isoliert. Er gehört zur Gattung der Streptomyces und
wurde Streptomyces arenae genannt. Je nachdem., auf welchem Nährboden er gewachsen
ist, hat er folgende charakteristische Eigenschaften: Trypton, Rindfleischextrakt,
Hefeextrakt, Glucoseagar Gemäßigtes Wachstum, dunkelbraunes Substratmycel, weißes
Mycel an der Luft, das grau wird, mit Sporen.
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Pepton, Rindfleischextrakt, Glucose, Na Cl-Agar . Gemäßigtes Wachstum,
goldbraunes Substratmycel, grauweißes Mycel an der Luft, das dunkel wird, mit Sporen,
hellbraunes, wasserlösliches Pigment.
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Hafermehlagar Üppiges Wachstum, gelbbraunes Substratmycel, das. beim
Altern in ein dunkles Orangebraun übergeht, dunkelgraue Sporen, Tropfenbildung an
der Oberfläche, braunes, wasserlösliches Pigment.
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Gewöhnliches Agar Spärliches Wachstum, cremefarbiges Substratmycel,
flaumiges, dünnes, lockeres Mycel, kein wasserlösliches Pigment.
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Agar mit apfelsaurem Ca Reiches Wachstum, cremefarbiges Substratmycel,
das beim Altern in ein helles Rotbraun übergeht, flaumiges, cremefarbiges Mycel
an der Luft von grauer Farbe mit rosa Schimmer, hellrosa, lösliches Pigment. Das
apfelsaure Ca löst sich vollständig auf.
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Dextrose, Asparaginagar Spärliches Wachstum, goldbraunes Substratmycel,
das einige Büschel mit weißem, luftigem Mycel und einige erhabene Kolonien mit dunkelgelbem
Mycel bildet, gelbes, wasserlösliches Pigment.
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Lakmusmilch Starkes Häutchen, das in 7 Tagen Lakmus reduziert, innerhalb
von 25 bis 28 Tagen die Milch vollkommen verdaut, wobei sich kurz vor der vollständigen
Verdauung Quark bildet; dunkelbraunes, lösliches Pigment, das innerhalb von 3o Tagen
schwarz wird.
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Stärkeagar Stärke hydrolysiert langsam, wobei die hydrolysierte Zone
keine scharfe Grenze bildet. Nährgelatine Starkes Häutchen von grauem Mycel auf
der Oberfläche, dunkles, rotbraunes, wasserlösliches Pigment, das sich mit der verflüssigten
Nährgelatine mischt. Innerhalb von 22 Tagen ist die Hälfte der Nährgelatine verflüssigt.
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Kartoffeloberflächen Reiches, ausgedehntes Wachstum, goldbraunes Substratmycel,
das dunkelbraun wird, starke, dunkelgraue Sporen, flaumiges, lockeres Mycel; die
Kartoffel wird dunkelgrau bis schwarz.
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Nitratagar Test auf Nitratanhäufung verläuft negativ. Kliglers Eisenagar
Mäßiges Wachstum von dunkelgrauem Mycel, Bildung von H2 S.
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Czapeks synthetisches Agar Üppiges Wachstum, sehr runzliges, rissiges
Agär, gelbes Substratmycel, das beim Altern eine dunkle, orangebraune Färbung annimmt,
grauweißes Mycel an der Luft, helles, gelbbraunes, lösliches Pigment. Beschreibung
der Kolonie (gewachsen auf dem erstgenannten Medium) Kolonien mittlerer Größe, braunes
Substratmycel, hellgraues Mycel an der Luft, bernsteinfarbige Tröpfchen auf der
Oberfläche der Kolonie, dunkelbraunes, lösliches Pigment. Bei dem Wachstum der Kolonie
bildet sich zunächst im Mittelpunkt der Kolonie eine kleine Vertiefung mit vier
vertieften, radial ausstrahlenden Linien, die die. Kolonie in vier Teile teilen.
Bei fortschreitendem Wachstum wird die Kolonie durch die gleichen vertieften Linien
in acht Sektoren geteilt, wobei der Mittelpunkt eine kleine Erhöhung bildet.
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Folgende Kohlenstofflieferanten unterhalten gutes Wachstum: Xylose,
Glucose, Mannose, Galactose, Lactose, Maltose, Saccharose, Stärke, Mannit, Glycerin,
Natriumacetat, Natriumcitrat und Seignettesalz. Sorbit und Calciumlactat werden
nicht als Kohlenstofflieferanten benutzt. Außerdem unterstützen folgende Stickstofflieferanten
das Wachstum: NaN03, (N H4)2HP04, Harnstoff, Asparagin, Tryptophan und Arginin.
Tyrosin fördert dagegen das Wachstum von Streptomyces arenae nicht.
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Die Kulturen bilden auf einer großen Anzahl von Nährmedien Sporen.
Die stärkste Sporenbildung wurde auf Hafermehlagar, Kartoffeloberflächen und Agar
mit apfelsaurem Calcium beobachtet. Das sporenbildende Mycel ist grau gefärbt. Die
Sporen, die in reichem Maße bei der Teilung des Mycels an der Luft entstehen, sind
rund bis oval und werden in langen Ketten in dichten Spiralen gebildet. Das Mycel
ist durch monopodiale Verzweigungen charakterisiert, deren sporenbildende Spitzen
in dichten Spiralen endigen. Das luftige Mycel, das keine Sporen bildet, ist zwar
auch verzweigt, bildet aber keine Spiralen.
Wird der Organismus
in einem flüssigen Nährmedium, das sich bei 24 bis 26° C auf einer Rotationsschüttelapparatur
befindet, bebrütet, so wächst es in Form von sehr kleinen Kügelchen oder unregelmäßigem
Granulat und produziert ein dunkles, orangebraunes, wasserlösliches Pigment. Das
auf diesem Wege entstandene Antibioticum löst sich in Wasser und hemmt Mikroorganismen
in der gleichen Weise wie die Kulturen von Agarplatten.
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Da das Antibioticum so gut wie gar kein Diffusionsvermögen besitzt,
wurde eine nephelometrische Bestimmungsmethode entwickelt. Als Standardsubstanz
diente eine partiell gereinigte und getrocknete Probe des Antibioticums, der ein
bestimmter Wert in Agarverdünnungseinheiten zugeteilt wurde.
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Es wurden Ausbeuten bis zu 320 Verdünnungseinheiten nach der
Agarverdünnungsmethode erhalten, wobei Mycobacterium tuberculosis A.T.C.C.
607
als Testorganismus verwendet wurde.
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In folgendem Beispiel werden die Bedingungen beschrieben, unter denen
der Mikroorganismus unter Schütteln in einer Kultur wächst und das Antibioticum
bildet.
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Beispiel I 5oo ccm Erlenmeyer werden mit je 15o ccm eines Nährmediums
folgender Zusammensetzung beschickt: Sojabohnenmehl .................. 15 g NaCl
............................ 59
Glucose ......................... 15 g CaC03
.......................... I g Destilliertes Wasser ... ... . .. . ... . . looo
ccm.
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Die Erlenmeyer werden mit Baumwolle zugestopft, in einem Autoklav
bei IM' C 30 Minuten sterilisiert, auf Raumtemperatur abgekühlt und mit 1
ccm einer Sporensuspension von Streptomyces arenae beimpft. Dazu verwendet man Sporen
von Agarflächen, die in 2 bis 5 ccm sterilen Wassers suspendiert sind. Danach setzt
man die Erlenmeyer bei 24 bis 26° C auf eine Rotationsschüttelapparatur mit 22o
bis 240 Umdr./Min. und 5,7 mm Hub. Nach 48 Stunden werden 6 ccm dieser Kultur in
Erlenmeyer mit frischem Nährmedium der gleichen Zusammensetzung übertragen und dieser
Erlenmeyer während 48 Stunden in der gleichen Weise bebrütet.
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5oo ccm Erlenmeyer werden mit je 125 ccm eines Nährmediums folgender
Zusammensetzung beschickt: Hefe ........................... 2 g Maiseinweichwasser
(feucht) ...... 1o g Glucose ........................ 25 g Sojabohnenmehl
................. 159 NaCI ........................... 39
NH,N 03 .......................
I g CaC03 ......................... 2 g Leitungswasser . . . . . . .. . . .. . .
. . . . looo ccm.
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30 Minuten im Autoklav bei I21° C sterilisiert, abgekühlt und
mit je 5 ccm der zweiten 48-Stunden-Kultur (vgl. oben) aasgeimpft. Die Erlenmeyer
werden auf eine Rotationsschüttelapparatur gestellt und bei z4 bis 26° C bebrütet.
Vom dritten Tage an werden täglich Proben entnommen und auf antibiotische Wirksamkeit
geprüft. Die antibiotische Wirksamkeit wird mit Mycobacterium tuberculosis A. T.
C. C. 607 als Testorganismus und in Agarverdünnungseinheiten gemessen. Die Ergebnisse
gehen aus der folgenden Tabelle hervor:
| Bebrütungszeit Antibiotische Wirksamkeit |
| in Tagen in Einheiten,'ccm |
| 3 715 |
| 4 40 |
| 5 140 |
| 6 240 |
| 7 320 |
Die Fermentierungen wurden in I,5-cbm-Tanks nach dem oben beschriebenen allgemeinen
Verfahren ausgeführt. Sie ergaben Ausbauten von 5oo bis über looo Einheiten je Kubikzentimeter.
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Beispiel II Isolierung des Antibioticums Die Fermentierungsflüssigkeit
aus den großen Fermentern (vgl. oben) wird zunächst filtriert und das feuchte, unlösliche
Mycel bei neutralem pH mit Äthanol extrahiert. Die erste Extraktion kann auch in
einem PH-Bereich von 4 bis 1o mit anderen organischen Lösungsmitteln, wie Methanol,
Aceton, Butanol und tert.-Butanol, vorgenommen werden. In früheren Untersuchungen
verblieb die aktive Substanz nach Abtrennen des Mycels im Filtrat, aus dem sie mit
einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel extrahiert werden konnte. Jetzt
sind jedoch go bis 95°/p der aktiven Substanz in irgendeiner Form an das Mycel gebunden;
daher filtriert man vorteilhafterweise das Mycel vor der Extraktion ab. Man kann
jedoch auch die gesamte Fermentierungsflüssigkeit mitsamt dem Mycel mit einem mit
Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, wie z. B. Butanol, extrahieren und den Extrakt,
wie unten beschrieben, auf das Antibioticum aufarbeiten.
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Dieser Extrakt aus einem wasserhaltigen, organischen Lösungsmittel
wird zu einer wäßrigen Lösung eingeengt, die ihrerseits in dem PH-Bereich von 2
bis 1o mit C H C13 extrahiert wird.
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Dieser C H C13 Extrakt wird dann an wasserfreiem Kieselsäuregel als
Adsorber chromatographiert. Dabei genügen 4,5 kg Kieselsäuregel, um 2 kg Wirksubstanz
in 41 CHC13 gelöst, mit einer Aktivität von 5oo Einheiten je Milligramm zu adsorbieren.
Anschließend fraktioniert man das Kieselsäuregel mit CHC13, das einen steigenden
Prozentsatz an Methanol enthält, wobei der größte Teil der unerwünschten Nebenprodukte
am Kieselsäuregel haftenbleibt und nur einige vor dem Antibioticum in die C H C13
Methanol-Fraktionen gehen. Diese C H Cl,-Methanol-Fraktionen werden dann zur Trockne
eingedampft, wobei man einen antibiotisch wirksamen Rückstand mit 2ooo bis 5ooo
Einheiten je Milligramm erhält. Die Einheiten werden nach der Agarverdünnungsmethode
mit Mycobacterium tuberculosis 607 als Testorganismus bestimmt. Bei Wiederholen
dieser chromatographischen BehandlungmiteinemAdsorptionsmittel,wieMg-Silicat,
kann
ein Präparat erhalten werden, das eine Aktivität von 5ooo bis ioooo Agarverdünnungseinheiten
je Kubikzentimeter besitzt.
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An Stelle von Kieselsäuregel kann man auch Aktivkohle zur Adsorption
des Antibioticums aus dem C H C13 Ektrakt benutzen. In diesem Falle wird das Antibioticum
durch Elution mit einer Methanol-(8o°/o)-CHC13(zo°/a)-Mischung, die o,i n-HCl enthält,
aus der Aktivkohle gewonnen. Handelsübliches Kieselsäuregel ist dafür ungeeignet.
Durch orientierende Untersuchungen kann man jedoch schnell feststellen, welche Gele
sich für die gewünschte selektive Adsorption eignen.
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Gegenwärtig wird folgende Extraktionsmethode bevorzugt: Das Mycel
wird mit einem 5o- bis 8o°/oigen, niederen, aliphatischen Alkohol, wie z. B. Äthanol,
extrahiert, der Extrakt so weit eingeengt, daß eine wäßrige Lösung verbleibt, die
anschließend bei pH 2 bis 4 mit Butanol extrahiert wird. Das aktive Material wird
danach bei pH Zo in Wasser reextrahiert. Zur weiteren Reinigung kann die aktive
Substanz bei niederem pH in Butanol und bei hohem pH in Wasser reextrahiert werden.
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Bei dieser gegenläufigen Verteilung zwischen Wasser und Butanol hat
es sich gezeigt, daß die antibiotische Mischung zwei verschiedene Komponenten enthält.
Davon ist die eine bei neutralem pH mehr in Butanol, die andere mehr in Wasser löslich.
Diese beiden Komponenten können durch Extraktion mit Lösungsmitteln voneinander
getrennt werden. Tests zeigen, daß beide Fraktionen sowohl gegenüber dem Mycobacterium
tuberculosis wie auch gegenüber dem Staphylococcus aureus wirksam sind.
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Die nach dem oben beschriebenen Verfahren erhaltene -antibiotische
Substanz ist nicht ganz rein und scheint aus einer Mischung der beiden Komponenten
zu bestehen. Das Antibioticum besitzt eine Aktivität von etwa 5ooo bis zu io ooo
Agarverdünnungseinheiten j e Milligramm, d. h. im Agar müssen etwa o,i y/ccm vorhanden
sein, um das Wachstum von Mycobacterium tuberculosis, wie oben beschrieben, zu hemmen.
Sie kann in unreiner Form verwendet werden. Sie ist in rohem Zustand bei gleichem
Gewicht zwei- bis fünfmal so wirksam wie Streptomycin, wenn der Test nach der Agar-
oder Nährmedium-(broth)-verdünnungsmethode ausgeführt wird.
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Die neue antibiotische Substanz hat saure Eigenschaften; sie löst
sich in verdünntem Alkali, bildet zum Beispiel mit wäßrigem Alkalihydroxyd Alkalimetallsalze,
wie das Na-Salz, und wird beimAnsäuern ausgefällt. Die Alkalimetallsalze sind löslich.
Andere Salze, wie das Cu-, Ca-, lVIg- und Pb-Salz, sind unlöslich und können zur
Reinigung des Antibioticums verwendet werden. Es gibt nicht die für die Proteine
charakteristische Biuret=Reaktion. Das Antibioticum diffundiert nicht durch eine
Membran von regenerierter Cellulose und hat nach osmotischen Messungen ein Molgewicht
in der Größenordnung von ioooo. Es gehört zu den Antibiotica, die keine Inhibitionszone
geben, wenn sie nach der Plättchenmethode getestet werden, die bei Substanzen mit
niederem Molgewicht, wie Streptomycin, Penicillin u. a., angewandt wird. Folgende
Tabelle zeigt sein antibacterielles Wirkungsspektrum
| Einheiten des |
| Antibioticums |
| Organismus ccm von Agar, |
| die zur Hemmung |
| erforderlich |
| Staphylococcus albus ......... 20 |
| Staphylococcus aureus ........ 20 . |
| Escherichia coli .............. > 640 |
| Bacillus subtilis .... . ...... . . 40 |
| Pseudomonas fluorescens ...... > 640 |
| Serratia maroescens ... . ...... > 640 |
| Aerobacter aerogens .......... > 640 |
| Proteus vulgaris ............. > 640 |
| Bacillus mycoides .... . ... ... . 2,5 |
| Streptococcus fecalis ......... 40 |
| Monila albicans . . . . . . . . . . . . . . > 640 |
| Eberthella typhosa . . . . . . . . . . . > 640 |
| Salmonella paratyphi . . . . . . . . . > 640 |
| Salmonella schottmuelleri ..... > 64o |
| Shigella dysenteriae . . . . . . . . . . > 640 |
| Klebsiella pneumoniae . . . . . . . . > 640 |
| Neisseria catarrhalis . . . . . . . . . . > 640 |
| Streptococcus pyogenes ....... 40 |
| Brucella äbortus ............. 640 |
| Corynebacterium diphtheriae... 10 |
| Hemophilus pertussis . . . . . . . . . > 640 |
| Brucella bronchiseptica ....... > 640 |
| Mycobacterium tuberculosis ... o,63 |
| Mycobacterium phlei ......... o,63 |
| Bacillus bodenheimer . . . . . . . . . > 640 |
| Staphylococcus aureus, Strepto- |
| mycin resistent . . .. . . . . . . . . 10 |
| Staphylococcus aureus, Strepto- |
| thricin resistent . . . . . .. . . . . . 20 |
Das Ultraviolettspektrum zeigt bei etwa 26o mit eine charakteristische Spitze, die
mit der antibiotischen Wirksamkeit gekoppelt zu sein scheint, da sie in allen nach
der obigen Vorschrift hergestellten Verbindungen vorhanden ist. Die antibiotischen
Verbindungen mit hoher Wirksamkeit zeigen auch ein E jI,m von etwa 7o. .
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Das Ultrarotabsorptionsspektrum des Antibioticums der vorliegenden
Erfindung ist beiliegender Tabelle zu entnehmen. Die charakteristischen Absorptionsbanden
der in einem Kohlenwasserstofföl suspendierten Substanz liegen im Ultrarotgebiet
bei folgenden Frequenzen (in cm-'): ioo8 ............. 1282 1100 ............. 1739
1121 - ............ 3390 Infolge seines hohen Molgewichts zeigt das Antibioticum
keinen definierten Schmelzpunkt. Es wird bei etwa 17o° C dunkler und verkohlt etwas
über 2oo° C. Auf Grund seiner sauren Natur wird es von Anionenaustauschern adsorbiert
und kann von ihnen wieder eluiert werden. -Untersuchungen haben ergeben, daß
die
Substanzen C, H, etwas N, weniger als i°/, S und gar kein P enthalten.
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Elektrophoretische Untersuchungen haben ergeben, daß das Antibioticum
der vorliegenden Erfindung negativ geladen ist. Nach dem Anthrontest enthält es
im gegenwärtigen Reinheitsstadium beträchtliche Mengen an Kohlehydraten. Fügt man
wäßriges Pb-Acetat zu der wäßrigen Lösung des Antibioticums mit 30000 Einheiten
je Kubikzentimeter, so bildet sich ein Niederschlag mit etwa 99,6°;r, Aktivität.
Die restliche Flüssigkeit zeigt nur 15 Einheiten je Kubikzentimeter. Die Aktivität
kann durch Zugabe von H. S oder H, S 04 in einem Lösungsmittel, wie
Aceton, Methanol, n-Butanol, tert.-Butanol, denaturiertem Äthanol usw., wiedergewonnen
werden.
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Man kann die Erfindung unter veränderten Bedingungen leicht in der
Praxis anwenden, wobei man die eine oder andere neu entdeckte Methode oder eine
gleichwertige übernimmt,