DE1918153A1 - Neues proteinartiges Fermentationsprodukt - Google Patents

Description

Neues, proteinarfci^es Fermentationsprodukte

Di 3 vorliegende "Zrf induiia: betrifft ein neues j Mitomalcin ■-.-'Vinntes ?ernnntati3n3^roCukt, sowie dessen Herstellung: durch Periient^tio'i und Kathoden i-.ur laolierung und tjösä Heindarstel-Itui; -»us liohlÖGUii en ;-iie Gärbrühen. - C-e genstand, der Erfindung Kino sowohl verdünnte.Lösungen dieses Produkts, Rohkonzentrate soviIe c\c:f. reine ritorraljin_e

Das erf i-i^'un· ^r:?rer.U"L e neue Produkt"!st"--a-l-s-'-aatlleukämisches und anti'oioti.'sohes Lit bei- sowie als Korrnlextildner für mshr-'■•rorti;:'3 t'bergangsmetallio-ien wie Kupfer, Kobalt, Nickel, Mangan, "iirilf und Cadmium br:.uchbar. Es eignet sich daher zur Entfernung· -'viehrw.er.tiver Ionen aus biologischen Synthese-' und Analyseverfahrene nls Antibioticum inhibiert es sowohl gram-positive wie ?rai!i-nej;ative Bakterien und ist daher als Therc^peuticum, sowie in der Veterinärmedizin, Industrie und Landwirtschaft brauchbare Es kann ferner als Desinfektionsmittel eingesetzt werden sowie 2urn Trennen von Mkroorganismen für medizinische oder diagnostische Zwecke oder dgl.

BAD ORIGINAL

1919153

kitomaloin, ein proteinartiges antileukämisches, antibiobisches und komplexbildendes kit-tel, wird bei der Züchtung einer neuen Species eines Mikroorganismus, der mit Streptomyces malayensis bezeichnet.wurde, unter kontrollierten Bedingungen gebildet. Zu den erforderlichen Bedin-nr" on -ehören Kultivierung in wässrigem Nährmedium unter submers:-r. "cobe-i Bedingungen bei Temperaturen zwischen etwa 24 und 30° und einem ρH-Viert zwischen etwa 5t5 und etwa 8,5» während Zeiträumen, die zu einer wesent- ' liehen antimikrobiellen Aktivität im Medium fahren. Der Wirkstoff wird sodann durch Dialyse der C-ärbrühe oder durch Adsorption an Diäthylaminoäthylcellulose und anschließende EIuierung mit"wässriger Natriumchloridlösung und Dialyse des EIu-. ats gewonnen. Er wird chromatographisch an einem stark basischen AnionenaustauEcherharz gereinigt, des nit Wasser eluiert wird, worauf an Diathylaminoäthyl-Sephadex chromatographiert wird«

In den beiliegenden Zeichnungen (?ig. 1 und 2) werden die charakteristischen UV- und IR-AbsorptionsSpektren des erfin- . :'un;Tsgema.3en Produkts wiedergegeben.

Der zur Verwendung gelangende Fikroorcanismus,- der aus einer Bodenprobe aus I-ialaya isoliert wurde, besitzt die Eigenschaften der Streptomyceten. Er wurde auf "I-iedien gezüchtet, die üblicherweise zur Beschreibung und Identifizierung von Streptomyceten angewandt werden, wobei die bei der Züchtung auftreten-* den Charakteristica mit den von Waksman und Lechevalier, "in "Actinomycetes and Their Antibiotics", The Williams & Wilkins Company (Baltimore, 1953) beschriebenen verglichen wurden. Sine Kultur der neuen Species Streptomyces malayensis wurde bei der American Type Culture Collection, Washington, D.C. unter der Nr_β ATCC 21163 deponiert. - ' _t ■

Der S. malayensis^s ₁ P. nov. ATCC 21163 wird in der Sammlung der Chas. Pfizer & Co., Inc. als Isolate BA-6685 bezeich» · net.

Die Eigenschaften der neuen Species Streptomyces malayensis. werden in der folgenden Tabelle wiedergegeben^ in der die nach

ÖÖÖÖ88/i7g7 - ■ : ■ "'

IADGRiGlNAL

* ' -3 zweiwöchiger Züchtung gemachten Beobachtungen festgehalten sind.

Tabelle I. Streptomyces malayensis sp. nov. ATCC Ho. 21163,

Luftmyoel - sehr reich, nahezu mausgrau bis tief oliv^rau (Ridgway), falls gefärbt} Ränder der Kolonien häufig fransig und weiß.

Vegetatives Kycel - Blafdgelb bis gelblich-braun, jedoch dunkelgrau auf Tomatenpaste-Haferrnehr-Agar und manchmal mit ros*Färbung auf synthetischem und Calciummaletagar. - - .

Lösliches Pigment - Kein Melanin.. Schwachgelb bis gelb-braun in einigen Medien} in Milch zunächst lachsfarben, dann rosa-v/einfarbenj blaßjbräunlich-grau auf K"rtoffelkuchen.

Sporen - Rund bis breit elliptisch, meipt 1,3 χ 0,7/U, nit feinen Härchen bececkt, die etwas stachli ir sind (durch Elektronerirr.ikroskonie festgestellt), jedoch nicht so rauh wie bei S. viridochrorriogenesj in Ketten i.ieist 10-20 Sporen in Spiralen mit k-5 Windungen« Zweige bildende Sporen erheben sich wechselptändig oder gegenüberliegend und manchmal auirl-. förrrii·;, jedoch ergeben sich bei der Verzweigung häufig Büschel von Spiralen.

Gelatine - Schwache Verflüsr ir.uv-f, *?lt rate - Kitritbild um:·.

Stärke - Schwache Hydrolyse.

HiIch - Coagulierun^j la^.rsar.e und partielle Peptonisierun~.

Ca-malat - Wird \ier,iaut. _^ :........

HpS-Bildung - Ef*wird H₉S re'eildet (l'est mit Eleiacetatstreifen) aus Pepton i¹ iJi-·--\\-^gar-Schrägnährboden und Scir'itielkoll-e¹-. ::ϊχ -i^cr., rrote.osepenron, Trypton und ^'steir. durch Hydrochlorid und manchmal schwach aus

Cellulose - Kein Wachstum. Aerobiose - Aeroc.
50 C. - Kein Waclistum

Kohlenstofi*quellen - V.'äohst auf Arabinose, Dextrin, Fructose, Galactose," Glucose, Glycerin, Inosit, Inulin, Lac-^S» Iv"-"-2'it, Haffinose, Hharanose, Salicin,

BAD

- yr-

Sorbit, Stärke, Sucrose, Trehalose und Xylose. . Wuchs manchmal auf Natriumacetat, Äskulin, Sorbose (±) und manchmal, jedoch fraglich, auf DuI-cit.

Diese Kultur wurde verglichen mit verschiedenen Specicn mit haarigen Sporen und erschien zunächst dem S. calvus etwas ähnlich. Die beiden Kulturen wurden dann nebeneinander auf gleichen Medien gleichzeitig gezüchtet. Dabei wurde ein Stamm von S.calvus ATCC 13382 verwendet. Die danach auftretenden Unterschiede sind folgende:

S, malayensls, ATCC 21Z163

Vegetatives Kyeel, grau-braun

Pridham's Hefeextrakt-Agar

Synthetisches Agar Luftmycel bildet

sich. Vegetatives Myeel bräunlich-

Tomatenpaste

Sporen

Vegetatives Kycel dunkelgrau in der Kitte der Unterseite und grau-braun am Band

Rund bis breit ellir>tisch

S, calvusj ATCC 133*32

Vegetatives Mycel, nahezu schwarz

Kein Luftmyeel. Vegetatives Myeel blaß gelb.

Vegetativen Ilycel gelb bis dunkegrau

S tabellenförmig

Daneben bestehen Unterschiede bei Verwendung bestimmter Kedien,, r?.'- r"i;.-r 7or-;l<_;.'ei. \--.s '*?sch reibung von S, cflvus durch Wakeman . in "The Actinomyces", the Williams and Wilkins Company, Baltimore, Bd, II, 187 (1961) mit den Daten von EA-6685 zeigt:

Kartoffelkuchen
GoIntine

S. malayensls« ATCC 21163

S. calvus

Keine Piprnentbildung Pigmentbildung

kein Luftmycel

Hildung eines Luftrnycels

ja

nein

iAD ORIGINAL

. Es wurde gefunden, daß bei Züchtung einer Sporensuspen-• sion von Isolate BA-6685 auf Glucose {!%), Hefeextrakt {!%), KpHPOh (0,05$)-Agar bei 28⁰C mindestens 9 Varianten, davon jede mit deutlich unterschiedenen morphologischen Eigenschaften, gebildet wurden. Wiederholte Übertragung der Varianten auf dasselbe Medium zeigte, daß die Eigenschaften beibehalten werden. Das Stamm-Isolate BA-6685 und 6 der Varianten verlieren scheinbar ihre Fähigkeit zur Bildung von Mitomalcin nach wiederholter Übertragung, und sogar auch beim Stehen bei Raumtemperatur oder ' in der Kälte. Die beste Methode zur Beibehaltung dieser Varianten wie auch der Stammkultur, besteht darin, daß man eine Serie von Schrägnährböden aus einer vegetativen Kultur herstellt und diese während einer Periode von etwa 2 Monaten verwendet. Eine neue Serie von Schrägnährböden wird dann aus der so erhaltenen Variante hergestellt. Die 3 t weiteren Varianten behielten ihre Fähiü'keit zur Bildung von Mitomalcin nach 2wel Standard-Übertragungen bei. Sie wurden mit Isolat BA-6685B, BA-6685H und BA-6685I in der Sammlung der Ghas« Pfiser & Co₀₅ Ino_es bezeichnet» Kulturen dieser 3 Varianten wurden ebenfalls bei der /unei'ica*?. Type Culture CoIIeGtIOn₂ Washington«, D₀ Co unter den Hummern 2116^₉ 2II65 und 21166 feponierto Di© 3 Varianten srar&en als Streptomyees imlayensis Variants B₃ H 12M 1 bezeichnet»'

Das Stamm- Isolat BA-6685 und die 3 oben genannten Varianten wurden auf mehrere Schrägnährböden mit Pridham^fs Yeast-Extract Agar überführt, welches als Wuchsmaterial für die ve rgleichenden Untersuchungen verwendet wurde.

Als Medien wurden in den vergleichenden Untersuchungen folgende eingesetzt: Synthetisches (Czapek's) Agar ('Waksman, The Actinomycetes 1950» S. 193 - Medium No. l)j Tomatenpaste-Hafer-. mehl-Agar (Pridham et al. Antibiotics Annual, 1956-1957, S. 951) Iridhani's Hofeextrakt-Agar (Antibiotics Annual, 1956-1957,

S. 9^7-953) I Gelatine (Gordon & Milim, Jr. Bact. 73:15-27, 1957)', Glucoso-Asparagin-Agar (Waksman, The Actinomycetes, 1950} S. 193, Medium No. 2)| Glucose-Agar (10 «·., Pep ton 10 g_kl Fleischextrakt

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BAD

5 g., NaCl 5 g., Agar 15 g., dest. Wasser 1 liter)} Nähr-Agar (Waksman, The Actinomycetes, 1950, S. 193, Medium No. 5)\ Stärke** Agar (Kartoffelstärke 20 g., NH^Cl 0,5 g., Agar 15 ., .dest. Wasser 1 Liter)} Galcium-Malat-Agar (VJaksman, Bact. Rev. 221:l-29_r. 1957)| Tyrosin-Agar (Gordon k Smith J. Bact. 69:147-150, 1955)} Glucose-Hefeextrakt-Agar (Glucose (IJi)₁- Hefeextrakt (1%), (0,05$))} Kartoffelkuchen, entrahmte Milch} Cellulose (K (1 g.), MgNH₄PO^ (0,5 &), dest. Wasser 1 Liter, pH 7,0; 8 ml ^; pro Reagensglas, jedes Reageniglas enthaltend einen Streifen Filterpapier, der über die Gärbrühe hinaussteht)} Kohlenstoffquelle ("Carbon Utilization") (Pridft£^;.m & Göttlieb, Jr. Bact,· 56:107-114, 1948 - Grund-Agar)} Dextrqse-Nitrat-brühe (Waksman, The Actinomycetes, 1950, S. 193» No. I^-ir.it 30 g. Dextrose anstelle von Sucrose und ohne Agar)} Organische NitraWbrühe (Gordon & Mihm, Jr. Bact. ,73.Ί5-27, 1957)} HgS-Bildung (Difco Pepton-Eisen-Agar mit und ohne Hefeextrekt)} Kandier- und Kutz» ner-Medium} Glycerin (10g.), L-Asparagin (i g»)_s K_?HPO^ (1 g» K/ NaGl (2 g.), MgCl₂ (0,5 g.), CaCC₂ (0,2 g,)_p HgO (1 Liter) plus luster & Williams' (Applied Eicrot>lol_o 12j46-52* 1964) verschieäene' S»Quellen: Oysteia^HGl (O₅05 g_e/100 ffil_e)'_s Wa₉S₂Oo (Q₃Oi?-go/100 SIo)₂ Spypton (1^75 go/iOG IaIo)₉ Pepfcon {l_p6l'-g»/ _:'. IOD si,5-3 P?otsose«?epton Ci₉ 56 g_ö/10ö ml»), sämtliche bei .pH % ■.. ' getestet mit Bleiaeetatstreifeno . .' --

0,5 nil einer Sporensuspension der Kulturen wurden den ReagenzrÖhrchen mit Nitratbrühe, entrahmter Milch und Kolben mit Medien zum Testen der HgS-Produktion zugegeben. Auf die anderen Platten und Schrägnährböden wurde ein Tupfer der Sporensuspen«. sion gegeben. Mit Ausnahme der eigens bezeichneten Fälle wurden sämtliche Kulturen bei 28⁰C inkubiert. Die Inkubierung erfolgte während verschiedenen Zeiträumen von bis zu 2 Wochen. _x Die Ergebnisse sine! nachfolgend zusammengestellt: Starke-Hydrolyse - keine Hydrolyse, abgesehen von 2 mm durch BA-

6685B nach 14 Tai_;;en.

GeIatineverflussigung - 5 bis 8 mm-Zone durch sämtliche Kulturen ·" ■""'"'■^: . '-"" nach 7"Tagen, 10 bis 12 mm durch sämtliche

Kulturen nach 14 Tf.;,en. »

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-. - BAD OBiSINAL

yitratreduktion - nach drei Tagen hatten sämtliche Stämme, mit

Ausnahme von BA-6685B Nitrit produziert. Nach Ik Tagen i/urde auch bei BA-6685B eine sehr schwache Nitritbildunf beobachtet, während in dsn anderen Fällen die Reaktion auf Nitrit • stark war. Gleiche Ergebnisse wurden rr:it bei

den Medien zur Nitratreduktion gefunden«

Entrahmte Milch - BA-6685 verursachte nach 7 Tagen Koagulierung

und Feptonisierung und bildete ein rasafarbenes, lösliches Pigment*. Eei den anderen Kulturen waren Peptonisierunp· und Bildung an löslichem Pigment lar.nsarier. .Tacn lh Tagen war in allen Fällen Koagulation und Peptonisierung eingetreten, und ein lachsfarbenes lösliches Pigment hatte sich gebildet, E<,i BA-6685 und BA-6685B betru3 der pH- 7,2 bei den anderen Kulturen 6,8 (Vergleich 6,6), - Nach sletentü ;i;-sr Tvuhtunf bei 28°C in der Schüttelrnaschine wie aus Tabelle II ersichtlich.

Tabelle II

3A-6'.' ο 3 EA-6':65? PA- 6.-f:^'¹ ~\-h(b.*l

Gr u-id-A.-ar -

Cystein stärk ~^l.ark .-*' rY

Ka₀S,-CU scr. :;cn -

Pepton + + + f

Try pt on -.- st.^rk .h rk st, rk

Proteofic st.irk .:-L.\rk st--.rk st;irk

Fe-ptop + + + +

Auf Fepto.n-Eiser.-Agar ergaben sä^t'iione Kulturell sov^?o}ll mit wie auch ohne 0,1"· Hefeextrakt iinerhalt 3 Ti-^en Schwefelwas-

eeratoff.

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verbrauchte Cellulose - keine der Kulturen ^Cellulose «

Calcium-malat - Verdauung

Kohlenstoffquellen - sämtliche Kulturen wuchsen gleich gut oder nahezu gleich gut mit folgenden Kohlens toff quellen.: Arabinose, Dextrin,. Fructose, Galactose, Glucose, Glycerin, Inosit, Inulin, Lactose, Maltose, Mannit, Räffinose, Bhamnose, Salicin, Sorbit, Stärke, Sucrose, Trehalose, Xylose, Na-acetat, Aesculin, Sorbose, und Dulcit. Auf Sorbose ergaben alle +-Wachstum}, auf Dulcit war das Wachstum bei BA-6685 und BA-6685B fraglich, jedoch eindeutig negativ bei BA-6685H und BA-6685I.

Sauerstoffbedarf - alle Stämme waren sich in ihrem aeroben Verhalten gleich.

Wachstum bei 50 C - alle Stämme wuchsen nicht bei 50 C, jedoch Wachstum bei 28⁰C.

Kartoffelkuchen - gutes Wachstum; kein Luftmycelj vegetatives.

Mycel trüb gräulich-braun} braunes lösliches Pigment«

BA-6685B -.. wie BA-6685.mit der Abweichung, daß die Farbe des * vegetativen -ycels und des löslichen Pigments blaß war.»

BA-6685H - wie 3A-66S5

5A-6685I - wie BA-6685

Luftmycel - nach 3Λ-tägiger Inkubierung wurden die Kulturen auf verschiedenen Medien verglichen.

BA-6685 - gutes Wachstum auf allen Medien. Keine Sporen auf Glucose-Agar oder Ni^:hr-Agar. Sporenfarbe (Ridgway)i f Olivgrau bis dunkeloliv.-rau auf Glucose, Asparagin, synthetischer Agar, Pridham's Agar, Tomatenpaste-Hafermehl, Calciummalat und Tyrosin. Sporenfarbe hellmausgrau bis mausgrau auf Gelatine, -¹Starke und C-lucose-Hefeextrakt«

BA-6685B - Wachstum schlechter als tei BA-6685, so daß die Kolonie dünner und rai.t weniger Sporen versehen ist.' Sporenfärbung wie bei BA-6685, mit folgenden Ausnahmen: Kein Luftmycel auf Glucose-Asparagin-Agarj sehr geringe Sporentildun? auf synthetischem Agarj

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nackt auf Glucose-Agar; dünn, weiß auf Nähr-Agarj blaßolivgrau auf Tomatenpas te-Hafermehl-Agar; dünnes Wachstum mit wenig Luftmycel auf Tyrosin,

BA-6685H - sehr ähnlich BA-6685 mit folgenden Ausnahmen:

Auf synthetischem Agar ist das Luftmycel beschränkt auf die Ränder der Kolonie und liegt dort als weißer, fransiger Hand vor, während die Mitte der Kolonie zimtbraun ist; auf Tyrosin-Agar ist die Sporenfarbe etwa mausgrau.

SA-6685I - ähnlich BA-6685, mit folgenden Ausnahmen! auf

synthetischem Agar keine Sporenbildung, sondern weißes Luftmycelj auf Glucose-Agar ist die Kolonie nackt ; auf Calciunwnalat stärkere Sporenbildung.

Substratmyeel - BA-66851 blaßgelblich bis gelblich-braun bis

bräunlich-grau auf verschiedenen Medien (blaßgelb auf Gelatine-, N'rhr-, Calciummalat-Agar; gelb auf TJfyrosinj gelblich-braun auf synthetischem und Glucose-Agar; gelblich-braun mit grau auf Glucose-Asparagin-Agar, Glueose-Hefeextrakt-Agar und Pridham's Hefeextrakt-Agar; hellgrau auf Stärke).

BA-668^3 - wie BA-6685, mit folgenden Ausnahmen: Gelb-braun

auf Stärke, gelb-oliv auf Glficose-Asparagin-Agarj gelb-braun auf Glucose-Hefeextrakt-Agarj blaß durchscheinend gelb-braun auf synthetischem Agar| dunkelbraun auf Pridham's Hefeextrakt-Agarj blaßgelblich-oliv auf Tyrosin»

BA-6685H - wie BA-6685, mit folgenden Ausnahmen: Gelblichbraun auf Gelatine; hellorange-braun auf Glucose-Asparagin-Agar; hell bräunlich-orange auf synthetischem Agar; braun auf Pridham's Hefeextrakt-Aimr; gelblich-braun auf Tyrosin-Agar,

BA-6685I - identisch mit PA-6685H und daher von BA-6685

analog verschieden.

Lösliche .Pigmente - BA-6685J*, kein lösliches Pigment mit Ausnahme von blassem Gelb, auf synthetischem und gelb auf Glucose-Agar und Tyrosin-Agar, 909886/1787 .

-*+-. 19Τ8153

Ba-6685B - wie BA-6685, mit Ausnahme der folgenden Medien: Gelb ■ auf Glucose-Asparag-in-, synthetischem, Pridham's Heft*», extrakt-Agarj gelblich-braun auf Glucose-Pepfcon-und Tyrosin-Agar, hellbraun auf Glucose-Agar und Tomatenpaste-Hafermehl-Agar. - .

BA-6685H - wie BA-6685, jedoch hellbraun auf Glucoee-Pepton- und Tomatenpaste-Hafermehl-Agarj gelb auf Glucose-Agar und synthetischem Agarj hellgelblich-braun auf Tyro« ain-Agar.

BA-6685I - wie BA-6685, jedoch gelb auf Glucose-Asparagin-, synthetischem und Glucose-Pepton-Agari hellbraun auf · Tomatenpaste-Hafermehl-Agarι hellgelblich-braun auf Tyrosin-Agar.

Morphologie der Sporenkettea - alle Kulturen waren im Grund gleich, jedoch waren bei BA-6685B viele Windunsren offener, und es lagen weniger Ketten vor,

Sporenform - alle Stämme gleich: Sporen stabellenförmig, meistens 1,0 χ 0,7/ü.

Sporenoberfläche - alle Stämme mit dünnen, stachligen Erhebungen,

Selbstverständlich ist die vorliegende Erfindung nicht auf die Verwendung der oben beschriebenen Organismen oder auf Orga·* nismen, die obigen Beschreibraigem voll entsprechen, beschrärrt} ' vielmehr sollen diese nur zur Illustrierung der Erfindung dienen. Die Erfindung umfaßt daher auch die Verwendung natürlich vorkommender oder künstlich erzeugter Mutanten und/oder yarianten» wie sie aus dem beschriebenen Organismen in verschiedener Weise., 2»B. durch Böntgentestrahlung, UV-Bestrahlung, Behandlung mit Senfölen und dgl. erhalten werden.

Die vorliegende Erfindung umfaßt auch Verfahren zur Züchtung des Fiikroorganisinus S. malayensis ATCC 21163 und dessen... Varianten ATCC 21164, 21165 und 21166. Die Züchtung dieser Mikroorganismen erfolgt vorzugsweise in wässrigen Nährmedien.bei Ternperf-.turen zwischen etwa 24 Lind 3O⁰C und einem Ausgangs- pH--Wert sv.is.ihen ebvjH. 5,5 und 8,5 unter submersen, aeroben'Bedingungen und unter Rührung. Bevorzugt wird ein Ausganges-pH-Wert * zwischen etwa 5_t5 und 7ι da er zu» verbesserten Produktausbeuten.

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' führt. Geeignete Nährmeäien zur Durchführung derartiger Züchtungsverfahren enthalten ein Kohlehydrat, s.B. in Form von. . Zucker, Stärke, Glycerin, I-iaismehlj eine .Quelle für organischen Stickstoff wie z.B. Casein, Soyabohnenraehl, Erdnußmehl, Trypton, Weizenglut en, Baumwollsamenmehl, Lactalbumin, enzymatisch abgebautes Gasein, Ferner sind in den Hediuri zweckmäßig wachstumsfordernde Stoffe wie Distiller's Solubles, Hefeextrakt, Kolassenextraktrückstände, sowie Hineralsal-ze wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Ksliumphosphat, Marne?iumpulfat, und Spurenmineralien

handen. wie Kupfer, Zink und Eisen, vor·- Bis besonder? geeignetes und bevorzugtes Medium enthält Glucose, Sovatohrenmehl und Kaliumphosphat. Falls bei der Fermentation ein übermäßiges Schäumen auftritt, können Antischaummittel wie pflanzliche öle zugesetzt werden. Der pH-Wert bleibt im allgemeinen weitgehend konstant] wenn Veränderungen auftreten, kann me.n weiterhin einen Puffer wie Calciumcartonat zusetzen.

Ein Inoculum zur Herstellung von Mitomalcin kann erhalten werden, indem man da ε vor. Schrägnährböden der vorstehenden Kikroorganisraen erhaltene WachFtumsprodukt auf KeJien wie Emerson's Agar oder Fleischextrukt-Läctose verwendet. Kit dem Wachstumsprodukt können sowohl Schüttelkolben wie Inoculum-Behälfcer beimpft werden, oder die Inoculum-Eehälter können r-it dem Inhalt der Schüttelkolben beimpft werden. Dvε Wichs turn der l-iikroorganismen erreicht gewöhnlich nach etwa eir. 1-ir zwei Tagen sein Maximum. Durch Veränderungen an der Aiilage, der Eelüftung, der Hührgeschwindi^keit und dsl. "kann die Geschwindigkeit, rit der die maximale aktivität erreicht wird, nachteilig beeinflußt werden. Im allfemeinen wird, die C-ärung solange' fortgeführt, bis das Medium eine wesentliche, antinsikrocielle Aktivität aufweist. Im allgemeinen ;eiiügen dasu Zeiträume vor. etwa 16 bis 72 Stunden. Maximales Wachstum wird in Verlauf von 21 bis 28 Stunden erzielt. Zu diesem '"eitpunkt liegen optimale anti-leukämische und antimikrobielle Aktivität vor. Die Belüftung des Kediums in Behälters für sucmereses Wachstum, wird vorzugsweise bei etwa 1/2 bis 2 Volumenteilen freier Luft pro Volumenteil Gärbrühe pro

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gAD

Minute gehalten. Die Bewegung des Mediums kann mit den bei Fermentationen üblichen Kitteln erfolgen. Während der Überfüh-• rung des Mikroorganismus und des Wachstums in den einzelnen Stufen müssen selbstverständlich aseptische Bedingungen eingehalten werden.

Nach beendetem Wachstum des Mikroorganismus kann das Myeel durch- Filtration, Zentrifugieren oder dgl. von der Fermentationsbrühe getrennt vjerden. Danach kann das Mitomalcin nach verschiedenen Verfahren gewonnen werden« Dabei kann man direkt von der filtrierten Gärbrühe oder vom Trockenprodukt ausgehen. Vor«, zugsweise werden die Produkte wie nachstehend beschrieben gereinigt:

I-ütomalcin, das von S. malayensis ATCC 21163 und dessen Varianten produzierte, antileukämische Mittelmann nicht mit üblichen organischen Lösungsmitteln (Benzol, Toluol, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Methylenchlorid, Äthylenchlorid, Petro}.-äther, Diäthyläther, n-Butanol) oder Phenol aus seinen Gärbrühen extrahiert werden. Es erliegt nämlich in nicht-wässrigen Mecien wie auch in wässrigen Medien mit pH-Werten oberhalb 8 einer raschen Denaturierung. Es wird aus Gärbrühen und aus wässrigen Lösungen durch Adsorbenfcien wie Kohle und Puller(s. Erde (ein Kagnesiumaluminiumsilikat) nicht adsorbiert, und es ist mit Hilfe von Cellophanmembranen nicht dialysierbar. Die Denaturierung in Gegenwart von Lösungsmittel und die fehlende Dia- .· 1-ysierbarkeit weisen auf eine proteinartige Natur des Produkts hin. Mitomalcin wird hingegen an Diäthylaminoäthylcellulose (DEAE-Cellulose.) adsorbiert, von welcher es leicht mit wässriger Natriumchloridlösuns, eluiert werden kann.

Verschiedene Methoden können zur Gewinnung des 'Mitomalcins P-v.k wässrigen Lösungen, z.B. Gärbrühen, eingesetzt werden» Na,ch einem Verfahren wird eine solche Brühe unter Verwendung von 1 .bis 2% Diatoir.eenerde filtriert. Das Filtrat wird bei vermindertem Druck (unterhalb 35°C) auf etwa 10% des Ausgangsvolumens _ eingeengt, das Konzentrat wird geklärt und dann gegen Leitungswasser 2k Stunden lang bei 5°C dialyciert. Der Inhalt des Dia-

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, lysiersacks wird sodann gefriergetrocknet. Der "bei der Gefrier-•trocknung anfallende Peststoff ist wirksam gegen Leukämie L-1210,

Nach einem zweiten Verfahren wird die eingeengte Gärbrühe mit genügend Ammoniumsulfat verrührt, so daß man eine 67#-ige gesättigte Lösung (ca· k2 g pro 100 ml) bei 5°C erhält. Dann werden dem Gemisch 2 bis % Diatomeenerde zugegeben, danach .wird filtriert. Der Filterkuchen wird mit 6?#-iger gesättigter Ammoniumsulfatlösung gewaschen und dann mit 1 Volumenprozent der Ausgangsbrühe einer 2#-igen Natriumchloridlösung verrührt»

■ Das Gemisch wird filtriert und der Filterkuchen wird nochmals mit dem gleichen Volumen 2$-iger wässriger Natriumchloridlö-. sung extrahiert. Die vereinigten Salzlösungen werden gegen Leitungswasser 2 Tage lang dialysiert, dann wird gefrierge«. trocknet. "

Nach einem weiteren Verfahren wird die konzentrierte und dialysierte Brühe durch eine Säule geführt, die Diäthylominoäthylcellulose in 0,01-molarer Phosphat-Pufferlösung (pH 7$0) enthalt. Die Menge an Diäthylaminoäthyleellulose entspricht etwa 1 bis 3 g pro Liter Atisgangsbrühe, Sobald die Pr öbe die Säule passiert hat, wird sie mit dem dreifachen Volumen der Füllkörperschicht an 0,01-molarer Phosphatpufferlösung (pH 7) gewaschen. Die Eluierung erfolgt mit %i-iger Natriumchloridlösung in 0,01-molarer Phosphat-Pufferlösung mit einem Volumen, das 1 bis 2$ des Volumens der Ausgangsbrühe entspricht. Das Eluat wird gegen Leitungswasser dialysiert und dann gefriergetrocknet.

Die .drei obigen Verfahren können auf Gärbrühen angewandt werden, die mit beliebigen Medien erhalten wurden. Die beiden folgenden Verfahren sind nur dann anxvendbar, wenn Medien mit minimalsm Salzgehalt (unterhalb 3fo), verwendet wurden; dabei wird Einengung und Dialyse der filtrierten Brühe umgangen. Nach dem ersten Verfahren wird die filtrierte Brühe direkt durch eine· Säule mit DEAE-cellulose (1-3 g. pro Liter) in 0,01-molarer Phosphatpufferlösung geleitet. Waschen und Eluieren der Säule

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erfolgt dann wie oben beschrieben. Das Eluat wird dialysiertf und das Produkt durch Gefriertrocknung gewonnen* <

Das zweite und bevorzugte Aufarbeitungsverfahren wird wie folgt durchgeführt: Die filtrierte Gärbrühe wird, mit DEAE-CeIIu-. lose (ca. 14 g./l) 30 Minuten lang gerührt, dann wird filtriert;» Das Filtrat kann nochmals mit der Hälfte DEAE*Cellulose verrührt und dann filtriert werden, um die aktiven Bestandteile vollständiger zu adsorbieren. Die DEAE-Celluloge wird dann zwei* mal mit 4#-iger wässriger NatriumchloridlÖsüng in einer YoIu** menmenge von 1-2$ der Ausgangsbr-ühe eluiert. Das Eluat wird 24 Stunden läng gegen Leitungswasser-dialysiert und falls gefriergetrocknet, wobei man das rohe feste Produkt Zur weiteren Reinigung wird das Sluat oder eine wässrige Lösung des auf obige Weise erhaltenen Rohprodukts an der Chlorid-, PhQSw phat- oder Acetatform eines starken Anionenaustauscherharzes wie Dowex-1, Amberlite IRA-^OO, De-Acidite PP (sämtliche sind stark basische Anionenaustauscher aus Polystyrol, das -NMe„ - ^y Gruppen enthMltj Hersteller Dov? Chemipal Co,, Rohm & Haas Co,\ S The Permutiti Co*, Ltd.) ch'romatographiert. Mit der Pho@phatfori|F dieser Harzej scheint man etwas bessere Ergebnisse als mit άϋη | anderen Salfcforffien zu erzielen. Eine wässrige ^ Lösung des Roh4 Produkts wird durch die mit Harz gefüllte Säufce geführt,die a^* schließend mit Wasser, gewaschen wird* Das aktive" Ma.terial. liegf in der aus der Säule austretenden Lösung und der Waschflüssig-s keit vor, während 70-90$ der optischen Dichte bei 280. ψχ und die Hauptmenge an Farbstoff adsor-biert wird. Austretende Lösung und Waschlösung werden dialysiert und dann gefriergetrocknet.

Das Produkt der Gefriertrocknung wird sodann an schwach . basischem Ionenaustauseherhar-z DEAE-Sephadex (Diäthylaminpäthylderivat von Sephadex, einem verjnetsten Dextran enthaltend Di- . äthylaminoäthylgruppeii als funktioneile Gruppen, Hersteller Pharmacia, Uppsala, Schweden) mit 3-6 g Har-z pro g Probe chro- " matographiert, .

Das Sephadex wird in 0,01-molarer Phosphatpufferlösung .>-.

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(pH 7) gequollen, mit Pufferlösung gewaschen und mit der Wirk-Stoffprobe, die in einem minimalen Volumen Wassers gelöst ist, versetzt. Die Säule wird mit linear ansteigende Mengen Natriumchlorid (0-1$) enthaltendem, 0,01-molarem Phosphatpuffer (pH 7) eluiert. Die wirkstoffhaltigen Fraktionen (bestimmt durch ihre Wirksamkeit gegen B. subtilis und optische Dichte bei 250 und 280 mu)werden vereinigt, dialysiert'und gefriergetrocknet, wobei man einen cremfarbigen Feststoff erhält.

Die weitere Reinigung erfolgt.unter Wiederholung der Säulenchromatographie oder, vorzugsweise durch Chromatographieren an Sephadex G-100 (schwach saures,* vernetstes Dextran mit Carboxymethylgruppen, Herrteller Pharmacia, Tipps Ii, Schweden)·

Hierbei wird die Säule, die in 0,1-molarer Aranoniumcarbonatlösung, welche mit Ameisensäure? auf pH ⁿ,5 gepuffert ist, gequollenem Sephadex gefüllt ist, mit einer Probe des Wirkstoffs beschickt, welcher in ·=»ϊη?:π minimalen Volumen der Pufferlösung gelöst ist. Die Säule"mit derselben Pufferlösung eluiert, die linear ansteigend 0-1$ Natriumchlorid enthält.' Anstelle der natriumchlor idhalt igen Pufferlösung kann auch Wasser oder 0,0025-molare Essigsäure als Eluierungcmittel dienen;

Das so erhaltene Produkt ist i: cK-?ereich zwischen 1 und beständig. Es stellt ein weißes, terniisch unbeständiges, amorphes Pulver dar, das keinen bestimmten Schmelzpunkt aufweist, sondern allmählich zwischen 250 ur.r? 270° zersetzt wiri. Das UV-Absorptionssoektrun (s, Fi^. 1) in V!a?5ar zeigt breite Banden bei 325 bis 330 nju und ein klares Kixi::ar: cei 276 ipu, Et⁷' =

/ / ' 1 cm

15-18. In .'ilkalischcr Lösung; -.riri die 3-i:-?de hei niedriger WeI-

1 ^
lenlänr;e nach 250 niu, E7^/J-_ = 36 verschoben. Das IH-Süektrum

/ 1 CIi

(2 Gew.-55 in KBr-Pellet) zeigt starke $ Bander, bei 3,05, 6,0$, 6,55, 7,20, 8,05 und 9,30 (Fiu. 2). Eine Ausfällung 5?.it Ammoniumsulfat erfolgt bei 50 bis 75^-iger Sätti^unr unter Erhaltung der Aktivität. Die Aktivität ist beständig in wässrigen ■ Lösungen mit niedrigem pH-Wert (1-3)» jedoch nicht bei hohen pH-Werten (6-11)* Das Produkt ist ar. gewöhnlichen Oellophen-

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membranen praktisch nicht dialysierbar. Die Verbindung zeigt antibakterielle Wirkung, insbesondere gegen gram-positive Bakterien·

Die im Mitomalcin enthaltenen Aminosäuren, bestimmt am sauren Hydrolysat mit Hilfe eines Technieon-Aminosäure-Anal/« sators ( Technicon Corp., Ardeley, New York) Bind in Tabelle III aufgeführt. Die, Zahlenwerte beziehen sich auf reines Produkt·

	Tabelle III	i
Aminosäure	/U Kol/mK.	10,28
Asparaginsäure	0,663	10,99
Threonin	0,709	8,11
Serin	0,523	5,36
Glutaminsäure	0,346	5,74
Prolin	0,370	14,42
Glycin	0,930	15,69
Alanin	1,012	10,87
Valin	0,701	1,35
Cystin	0,087	1,55
Isoleucin	0,100	5,66
Leucin	0,365	0,85
Tyrocain	0,055	4,25
Phenylalanin	0,274	1,61
Lys in	0,104	0,39
Histidin	0,025	2,81
Arginin	0,181	17,59)
(Ammoniak	1,135

Ferner wurden folgende Aminosäuren gefunden:

Allo-3-h;.-droxyprolin n-Hydroxyprolin Allo-hydroxyprclin •^-Ar.ir oisobuttersäure 3-1 c-thylhistidin Cc- mos a m in

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BAD- ORIölN'Ay

. Das Chromatographieoh. am schwach sauren Ionenaustauscher ''-Sephadex 5-100 (Determann et al, J. Chromatog. 2^, 303-313, 1966) . Uestimmte Molekulargewicht beträgt etwa 1? A-OO.

Die"Wirksamkeit des .Mitomalcins bleibt in wässriger Lösung bei Kühlung mindestens 6-I'onate lang unverändert, während der gefriergetrocknete Peststoff seine Wirksamkeit,¹ falls er unter 'Kühlung aufbewahrt wird, mindestens 2 Jahre lang beibehält.

Mtoraalcin zeigt sich bei Mäusen wirksam gegen lymphoide Leukämie L-1210 und akute lymphozytische Leukämie P-388. Es ist etwas wirksam gegen das Carcinosarcom Walker 25.6,

Durch Injektion von 0,1 mg/kg Mitomalcin wurde bei Fäusen keine Anaphylaxe hervorgerufen,

Mitomalcin kann parenteral sowohl in wässriger Lösung oder in physiologischer Kochsalzlösung zur Behandlung ve» verschiedener Infektionskrankheiten bei Tieren und Menschen eingesetzt, werdenj es kann ferner in verschiedenen pharmazeutischen Zubereitungen verwendet werden. Derartige Zubereitungen können flüssige Verdünnungsmittel, die sich zur Herstellungvon Lösungen direkt vor der"Verabreichung eignen, enthalten. Als Beispiele solcher Lösungsmittel seien genannt: Propylenglycol, Diäthylcarbonat, Glycerin, Sorbit uM dgl. Obgleich die Verabreichung, auch auf anderem Wege erfolgen kann, wird der parenterale Weg im allgemeinen bevorzugt. Die jeweiligen Dosierun-sformen können Puffer, Lokalanesthetica und anorganische Salze enthalten.

Feste Mitomalcin-Präparate sollten d.ie Verbindung im allgemeinen in einer Menge von min ei es tens 0,05 mcg/mg des Präparats enthalten,- Flüssige Präparate werden entweder direkt gespritzt oder, vorzugsweise, durch Infusion zugeführt. Zur direkten Verabreichung eignet sich eine wässrige Lösung mit bis zu 0,5 mg Wirkstoff pro ml der Lösung, Zur Infusion wird der Wirkstoff zweckmäßig verdünnt,.beispielsweise mit isotonischer Glucoselösung auf ein 1, und allmählich im Verlauf von 6-8 Stunden verab·*

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»eiefewag reicht. Flüssige Formulierungen wie z.B. wässrige.Lösungen sind insbesondere dann von Vorteil, wenn der Wirkstoff ..'■: in einer Menge von etwa 0,1 bis 2,5 mg/ml Lösung oderSuspension verwendet wird. Selbstverständlich kann auch reines Mit omalcin zugeführt werden. Die wirksamste Dosis, scheint bei 0,9 bis 1,0 rag/kg Körpergewicht zu liegen. Ausgezeichnete antibakterielle und tumorhemmende Wirkung wird bei 0,5 biß l»0 mg/kg beobachtet. Als Antibioticum kann der Wirkstoff auch örtlich angewandt werden unter Verwendung der üblichen Verdünnungsmittel zur Herstellung entsprechender Formulierungen, .

Witomalcin wird auch mit Vorteil in Kombination mit anderen pharmazeutisch zulässigen Verbindungen angewandt, wie z.B. mit Antibiotica vom Typus der Tetracycline, mit Carbomycin, Neomycin, Bacitracin, Tylosin, Sulfomethiazin, Penicillinen und mit anderen carcinostatischen Verbindungen wie den N-Lostverbindungen, mit 6-I-iercaptopurin, 8-Äzaguanin, Urethan, Azanerin, Triäthylamin, 6-Diazo-5-oxo-l-norleucin, Triäthylen-phosphoramid, 1,^-Dimethylsulfonyloxybutan, den carcinostatischen FoI-säure-Antagonisten und dgl. ·

Wie bereits erwähnt, ist Tiitomalein ein aktives Antibioticum. Das antibakterielle Spektrum wurde in vitro unter standardisie rten Bedingungen mit einer Nährbrühe bestimmt, Vielehe die TestVerbindung in verschiedenen Konzentrationen enthielt und rnit dem jeweiligen Organismus "beimpft wurde. Die. niedrigste Konzentration (MIC), bei welcher der jeweilige Organismus nicht mehr wuchs, wurde bestimmt, die Ergebnisse sind in Tabelle IV zusammengefaßt:

Tabelle IV

Antibacterielles Spektrum in Vitro j

Organismus I-ilG (me^/ml.)

Staphylococcus aureus 5 3,12

Staphylococcus aureus 400 1,56

Streptococcus pyogenes 8668 0,78 Streptococcus pyogenes C203 0,39 Streptococcus faecalis . 3,12 »

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- 19 -	Orcani.au«	JV	KIjC (mefr./ml.)	«	UOO
	OiplocoocuB pneumoniae	0,39	3,12
Irysipelothrlx rhusiopathias	0,39	12,5
Aerob*eter aerogtnee	>100	1,56
lsoheriohia ooli	>100	6,25
Froftaus Tulparis	>100	3,12
Pseu&omonas aaruginosa	>100	50
Saluonella typhosa
Klebalella pneuraoniae
Vibrio comma
Pasteurella multocida
Sarcina Iutea
Bacillus subtilie
Staphylococcus aureus 2O9P
Shigella sonnei
Beispiel 1

Ein Nährmedium wur<?e hereectellt, vrobei folgende Stoffe in der angegebenen Fenge pro Liter War-tar ein. yssstzt wurden:

Dextrose	3.0
Glycerin	3,0
Lactose	3,0
repton	0,5
Apparapin	0,5
NaNO,	0,5
Hirnstoff	0,5
Corn steep liquor	0,5
Fleischextr-kt	C, 5
Distillers soluMes	0,5
Kefeextrnkt	0,5
Weizenkeime	0,5

Dann wurde mit Leituiiccv.'npser auf das ^eviur.schte Voiunen aufcefüllt, IC Kinuten lang gekocht, homogenisiert, filtriert, auf pK 7,0 einseEtellt und tei 1,05 atr. eine halbe Stunde lan-"sterilisiert.

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Die sterile, abgekühlte Brühe (250 ml/Erlenmeyer Kolben mit 1 Liter Inhalt) wurde mit einer 10-tägigen Schräffnährboden-Züchtung von S. malayensis ATCC 21163 inokuliert und für 70 Stunden ' bei 28⁰C auf eine Schüttelmaschine gebracht. Dann wurde über ■ ; Glaswolle filtriert, um größere Anteile des V/achsturns zu ent- ' fernen, und das Filtrat wurde über sterile Seitz-Ultrafilter der Porosität s-1 'geführt. Das sterile Ultrafiltrat wurde zu. Versuchen gegen Sarcoma 180, Adenocarcinema 755 und lymphoide Leukämie 1210 eingesetzt, wobei "die Versuchsführung nach dem CCNBC-Protokoll erfolgte (Cancer Chemotherapy Reports 2£, 1-3 (1962)j Protocols I.3OI-I.3O3). ■ ' ·

Die Versuche reigten, daß die Gärbrühe gegen lymphoide**' Leukämie L-1210 bei Hausen äußerst wirksam ist»

Ähnliche Ergebnisse wurden ersielt, wenn man anstelle von S. malayensis ATCC 21163 S. malayensis ATCC 21164, 21165 Ode-r 21166 einsetzte.

Beispiel 2

Das Verfahren von Beispiel 1 wurde wiederholt unter Verwendung von S. malayensis ATCC 21163 auf folgendern Medium:

Glucose	1.
Soysbohnenmehl
Dike11 iumph 0 s pha t	0,2
Distiller's So#lubles	0,25
CaIc iumcarh onat	0,2
Natriumchlorid	0,2

Auffüllen mit Leitungswasser

Die Gärbrühe wird unter Verwendung von 1-2$ Hyflo-Supercel· (speziell behandelte Diatomeenerde, Hersteller Johns-llanville Co., N.Y.), filtriert. Das Filtrat wird bei vermindertem Druck ' und unterhalt 35°C auf etwa 10$ des Ausgangsvolumens eingeengt·

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"Das Konzentrat wird dann zwei Tage lang gegen Leitungswasser • bei-5⁰O dialysiert, und der Inhalt des Dialysierbeutels wird •gefriergetrocknet. Der Hückstand an rohem Mitomalcin ist wirksam gegen Leukämie L-1210 in Dosen von 30 bis 100 mg/kg.

Wiederholt man das Verfahren mit S. malayensis ATCG 21164, 21165 oder 21166, so werden ähnliche- Ergebnisse erzielt,

Beispiel 3

Das Verfahren von Beispiel 1 wird unter-Verwendung des folgenden Mediums wiederholt:

A.

Glucose	o,3
Glycerin	0,3
Lactose	0,3
Pepton	0,05
Natriumnitrat	0,05
51IeIS chextrakt	0,01
Hefeextrakt	0,03
Harnstoff	0,05
Distiller's Solubles	0,05
Corn steep Liquor	0,05

Auffüllen mit Leitungswasser

Die Brühe wird über Hyflo Supercel (1-2$) filtriert und das FiItrat wird bei vermindertem Druck unterhalb 35°C auf ein Zehntel des Ausgangsvolumens eingeengt. Das Konzentrat wird sodann mit genügend Ammoniumsulfat zur Erzielung einer 67^-igen gesättigten Lösung (ca. kZ g/100 ml) bei 5°C verrührt. Dann wird Supercel (2-5$, Diatomeenerde, Hersteller Johns-Manville Co., N.Y.) dem Gemisch· unter Rühren zugegeben, danach wird filtriert. Der Filterkuchen wird mit 67#-iger gesättigter Ammoniumsulfatlösung gewaschen und dann mit einer Volumenjfienge von 1% der Ausgangsbrühe an 2%-lgev Natriumchloridlösung verrührt. Das Gemisch wird filtriert Und der Kuchen wird nochmals mit der gleichen Volumenmenge an 2#-iger wässriger Natriumchloridlösung ex*.

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trahiert» Die vereinigten Extrakte in Form von Salzlösungen werden zwei Tage lang gegen Leitungswasser dialysiert, danr wird gefriergetrocknet. Das so erhaltene Produkt ist -egen Leukämie L-I210 in Dosen von 20 bis 50 mg/kg wirksam. .·

Beispiel k

Das Verfahren von Beispiel 1 wird mit S. malayensis ATCC 21163 wiederholt, jedoch wird die Gärbrühe wie folgt aufgearbeitet:

Das durch Filtrieren der Gärbrühe über Hyflo-Supercel erhaltene Filtrat wird mit ca, 1 bis 2 g pro Liter DEAE-Cellulose 30 Minuten lang verrührt, denn wird filtriert. (Zur besseren Adsorption kann das so erhaltene Filtrat nochr.£ls mit der ftaTS-benmVnge DSAli-Cellulose verrührt und wiederum filtrie rt werden). Fast der ges£>mte Wirkatoff wird an der DEAE-Cellulose adsorbiert,.die anschließend zweimal mit einer Volumenmenge von 1-2$ der Ausgangsbrühe an ty$-iger wässriger Natriumchloridlösung eluiert wird. Das 31uat wird 2k Stunden lang gegen Leitungswasser dialysiert, dann wird gefriergetrocknet.-Das rohe Hitomalcin ist in dieser Stufe bereits wirksam gegen Leukämie L-I210 in Dosen von 15-50 mg/kg.

Beispiel 5

Das nach dem Verfahren von Beispiel k- erhaltene Produkt wird gereinigt, indem man es in Wasser unter Bildung einer 5,^-igen Lösung löst, die dann an Dowex-1-Harz in der Fhosphatf.orm chroma tographiert wird. Das Harz wird vorbereitet, indem man die Säule mit Harz in der Chloridform mit 0,2-molarer Phosphat-Pufferlösung (pH 7) wäscht, bis die Waschlösung nur einen geringen Chloridgehalt aufweist» Die Säule wird dann nit-Wasser gewaschen, bis sie frei von Phosphationen ist. Pro g des gefrigrgetrockneten, rohen Kitomalcins werden etwa 10 g Harz verwendet«.

Nach dem Durchgang der Hitonalcinlösung wird C¹Ie Säule mit · Wasser gewaschen, und austretende Lösung und die Wasohlösungen werden vereinigt und gefriergetrocknet, wobei man Mtomalcin mit einer Aktivität von 5-15 mg/kg gegen Leukämie L-I210 erhält,

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Die weitere Reinigung erfolgt durch Chromatogivphieren dieses Produkts an einsr Säule π it DEAE-Se^he.dex. In der Säule liegt das Sephadex-Harz in einer Menge -von 3-6 g pro g Kitomalcin in 0,01-molarer Phosphat-Pufferlösung (pH 7) vor. Die Probe besteht aus einer 5£-ig^e*i Lösung im gleichen Puffer, erhalten durch Dialyse gegen den Puffer während 3-6 Stunden. Nachdem die Probe auf <?ie Säule aufgegeben wurde, wird mit 0,01-molarer FhQsphatlösung (pK 7), 1^-iger, 2^-iger und ^-iger Natriumchloridlösun- ic gleichen Puffer eluiert. Dap Eluierunr.:;--mittel wird gewechselt, sobald die pptisohe Dichte bei 280 nm anschließend an einen Pe;-!: niedrige Werte erreicht. '!ewo'hnlich. wäscht die Pufferlösunf etwa 1-2$ der optischen Dichte aus. Die l.is-ige Ifctriumchloriclostm^ liefert etwa 2-3 Banden der optischen Dichte. Werden diese Fraktionen bei 25C und 280 rau abgelesen, und berechnet ;λ-;-. das Verhältnis der beiden Werte, so seigi" sich, daß für iie az-rten beiden Pesics das Verhältnis 250/280 box 0,7 bis 0,9 liegt, beim dritten Feak hingegen bei 0,^5 bis 0,65» Die dritte B-nöe wird langsam mit lfj-iger Natriumchlöridlösung, jecach rasch beim tber:;r.ii:;· zu 2 ;s-irer NatriuinchloridlÖsuiu^r eluiert» Da.- let?te Eluierun -r:nittol, die 4-j-ige iretriumchloi'idlösxir -, er ibt 2iur 5 V-i:; 10-1 der ~<:^:5--ai::ten optischen Dichte. Die drei Banf^;::, die :..lt 1- bier 2^-i^er Kitrlu-iiohloridlösunf auftreten, machen 50-70,€ der jenamter. op-Dichte au£".

Beispiel 6

Subkulturen von S. malayensis ATCC 21164 werden auf Agar-Schrägnährböden nit folgender 2usamnensetzung gehalten:

Medium A	%	Kediur. E	1	•
Glucose	C, 3	Glucose	1
Glycerin	C,3	HJf©extrakt	0,05
Lactose	0,3	K2ITO4
Fleischextrakt	0,05
Hefeextrakt	0,05
Pepton	0,05
NaNO-	o, 05
Harnstoff	0.05

Distiller's Solubles 6.05

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Corn steep liquor 0,05 Weic-enkei.uo 0, C5 .■..r;:£rr^.;;in ..C₁C5

pH 6,9-7,0

. Den, jeweiligen Ke el ium werden 1,5/» Agar zugesetzt, dann vrird c?x,.E Gemisch eruärn-t, um Lo sun j su bewirken, und sterilisiert.

Die UbertrGgarif, von der Subkultur erfolgt entweder iurch den Pfropfen oder r.it einer Sporensuspension in 1 Liter-InokulierkolV.en. Die Holten werden :cach der Inokulierun.?; bei 27 bis 29⁰C auf einer Sehrttelnaschine (150 U.p.II.) inkubiert, wobei die D-.uer be ir; Hediur:: C 20 bis 24, beim Medium A U-O tis 60". Stunden beträgt.

Kediura C -	%
Maisstärke	2
Soyabohnenmehl	2
Hefeextrakt	0,5
KnCl2	0,005
CuSC^	0,005
ZnSO^	0,005
CaCO^	0,2
Na Cl"	0,25

Das Medium D vrird in einen Gärbehälter von 11Λ0 1 Inhalt ir- 530 bis 76O 1 Vieccerja' eingeführt.

KediuiT D % ■

Glycerin · 0,9

Pepton 0,05

Fl e i ε c hex t re.k t 0,05

Harnstoff 0,05

N3i:C-₃ · . C, 05

Hjfeeztrakt 0,05

Corn steep liquor 0,05

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'· . Distiller's Solubles 0,05 Asparagin 0,05

Weizenkeime . 0,05

In den vorbereiteten Tank wird Wasr:erdampf von 125°C/1,4-1 ,-55" at 25 Mr 35 Minuten lang eingeblasan, dann vrirö die Vorform zubegeben, bis eine Endkonzentration von etwa 1% erhalten ist. Das Fermentationsgemisch wird bei 27 bis 28⁰C unter 300 oder 1100 ü.p.M, gerührt. Die Luftzufuhr erfolgt konstant mit'0,0037 c"bm pro Liter, und starkes Schäumen wird durch Zugabe von sterilisiertem SoyabohnenÖl gesteuert. Die Fermentation ist nach 24 Stunden beendet.

Bei der Aufarbeitung wird das Mycel entfernt, indem man die G-ärbrühe mit 1,4-2,11 at durch eine Filterpresse führt. Dann wird das Filtrat 30-40 Minuten lang mit 1-2 g pro Liter DEAE-Cellulose verrührt und wiederum durch die Filterpresse gegeben* Das Filtrat wird nochmals mit DEAE-Cellulose behandelt· Beide Filterkuchen werden· mit Wasser gewaschen" und trocken geblasen,' Auf diese Weise ifird das aktive Prinzip quantitativ aus der Gärbrühe gewonnen. Das Raffinat wird verworfen, die Cellulosekuchen werden in 4$-iger Natriumchloridlösung verrührt, dann wird filtriert. Der Vorgang wird wiederholt/ die vereinigten Eluate werden bei 5-10⁰C dialysiert (kontinuierlicher Strom). Mt der sazfroien braunen Lösung erhält man gewöhnlich-auf synthetischen Böden wit B. subtilis Zonen von 20 bis 25 mm,

10 g frisches Doxiex-l(X-4) phosphat"*"werden-in.das. Eluat aus der DEAE-Cellulose in einer !!enge entsprechend der Gramm-

Dowex-1-phosphat wird wie folgt hergestellt: Dowex-1-chlorid wird zunächst mit In-Phosphorsäure, dann mit Wasser gewaschen, bis der pH des Eluats 4,5-5.0. Durch Eluieren mit 0,1-molarer Phosphat-Pufferlösung (pH 7; wird der pH-Wert dann auf 6,5-7,0 gesteigert· Überschüssiger Puffer viird durch Waschen mit Wasser entfernt. . <

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Menge an zu erwartendem festem Produkt eingerührt, (570 1 Gärbrühe ergeben nach der Behandlung mit DEAE-Cellulose etw^ 50-75 g an '_-efriergetrocknetQm Feststoff). Dies entspricht etwa. 30 mg/ml. Die Suspension wird filtriert und die dabei erhaltene hellgelbe Lösung wird gefriergetrocknet. Durch eine .zweite Dialyse wird das Produkt v/eiter gereinigt.

Man erhält einen cremfarbigen Peststoff (15-30 g pro I50 g Fermentation), der auf synthetischen Boden mit B, eubtilis Zonen von 25-30 mm ergibt und deutlich x^irksam ist gegen Leukämie L-1210,

Beispiel 7 · ■-...;

Das Verfahren von Beispiel 6 wird unter Verwendung des folgenden Permentationsmediuins anstelle von Medium D wiederholt. Dabei werden im vree ent liehen dieselben Ergebnisse erzielt,

Medium % , ■

Cerelose (Dextrose	0,5.
hydrat)	0,k
Glycerin	0,1
•NZ-Amine-ΪΤΤ	0,05
Pepton	0,1
Fleischextrakt	- 0,1
KCl	0,05
CaCOo

Beispiel 8

Das Verfahren des Beispiels 6. viird nochmals wiederholt, jedoch wird das Eluat aus der Säule mit DEÄE-Cellulose nach der Dialyse durch Durchleiten durch Dowex-1-phosphat entfärbt. In dieser und allen folgenden Stufen wird pyrogenfreies Wasser verwendet. Säe

Die weitere Reinigung erfolgt durch Chromatographieren an. einer Säule mit DEAE-Sephadex (A-50).

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Pro g der Probe v:ird ei:'· lVooke:i>iov'iL''"!t ν ο.· 3 C DKtvS-Seph'vdex A -50/ (vernetste-r,. Echvi-ch basischer kui-t ■■ uz eher) verwer— , det. Das Sephadex-Hars wira ir. 0, Ol-riol^rer Phosphat—Pufferlösung (pH 7) gequollen, wobei eine ?.0-f.-iche Volurr.e:a::unahme erfolgt. Die Säule wird sor^/f^ltig r.it'dei¹ i-uf farlosung ;ie*i' scher. _f dann wird die Probe, in einer mininälen Kas3ermenge gelöst, aufgegeben. Die Säule wird nit 0,-01-r-iolarer F^osphat-PufferlöBunc; (pH 7) mit allmählich auf 1> steinendem I;' triurchloridgehalt eluiert. Die Trennunr d(?r Fr-«.kt-ionen e rf ο Irrt in Abhän igkeit von der -optischen Dichte bei 250 und ?H-0 τμυ wie p.uch von oer Wirksamkeit Fegen B. pubtilis, der :uif synthetischem I^Teöiun gezüchtet '%'ird. Ein Kittelschni t^j wir5 ■re.'.ziiP der höchsten Antibiotica-Konzentratior abgenonren. An r?iecer Stelle tritt auch eine gut wiiirnehmbare Yerdnaerim äet: UV-Soektri;:-~ ei?- (s, Tabelle 7).

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co

O
(O
OO
00

OO

Tabelle V

Für das aus DIZAE-Seoh; dex erhaltene, wirksame Prinzip charakteristische Eipenschoften

Biolog. Wirksamkeit

Fri.'ki;lcr." ' . Zone

Nr. ' UV-φυ mm P.D. Verhältnis

85 88

Qli.

97 100 103 106

lOP 115

?nO (min.), 280 (max.), 305 (r.lr..)_f 325 (max.) 18

ZfO (Tin.), ??6 (^_x,), 2?0 (infl.), 325 (br.Schi)26 260 (mim.), 276 (rar.χ.), 290 (infl.,), 325 (br.Sch,)27 (min.), 276 (max.), 290 (infl.), 325 (br.Sch,)27

260 (rain.), 280 (max.), 305 (min.),

Br. Sch. = breite Schulter NZ ' = keine Zone Infl, = Inflektion

325/280-C9

325/276=0,75 325/276=0,65 325/276-0,65

325/280=0,8

. Die Messungen der optischen Dichte legen nahe, daß ein zweites Antibioticum vorliegt. Jedoch zeigt außer der vorstehend beschriebenen keine f. Fraktion antileukämische Wirksamkeit. Die Fraktionen 90-105 werden vereinigt, dialysiert und gefriergetrocknet, wobei man in etwa 6,5#-iger Ausbeute einen eremfarbigen Festetoff erhält, der turbidimetrisch gegen Staphylococcus aureue 5 angesetzt wird. Dabei wurde eine Aktivität Im Bereich von 5-10 γ festgestellt. Die antileukämische Wirksamkeit (gegen L-1210) wird im Bereich von 0,1-1,0 mg/kg beobachtet«

Bei der letzten Reinigungsstufe erfolgt chromatographische Trennung des aus der Säule mit DSAE-Sephadex erhaltenen Materials an Sephadex G-100. 'Zur Erzielung bester Ergebnisse beträgt das Verhältnis Substrat zu Probe etwa 50il, besogen*auf das Trockengewicht. Das Sephadex G-100 wird in 0,1-molarer Ammoniumcarbonat lösung, die !Pit Ameisensäure auf ph 7,5 gepuffert ist, gequollen. Dann wird der Säule die Probe, in einem Minimum dieser Pufferlösung gelöst, aufgegeben. Wie bereits vorher beschrieben erfolgt die Trennung in Abhängigkeit von der optischen Dichte bei „250 u/id 2oO rau wie auch der Wirksamkeit gegenüber B. subtilis. Der Fittelschnitt, d.h. die Fraktionen mit höchster Wirksamkeit, wird gefriergetrocknet, wobei man in 70$«- iger Ausbeute einen weißen, flockigen, wasserlöslichen Peststoff erhält. Die Eigenschaften des Produkts sind in Tatelle VI zu-

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Tabelle VI

Pur aas aus Sephadex G-IOO erhaltene, wirksame Prinzip charakteristische Eigen schafte nitFPis^ches BeisT>iel) · ■ .

	Fraktion Nr.
	20
	21
co	23
O	pil
co
00	25
co σ>	26
S* :	27
CO

ITV -

P.D. Verhältnis

260(min.), 276(max,), 290(infl.), .325(br. Sch.)

26Q(min.j, 276(max.), 290(infl.), 325(br. Sch.)

200(min.), 276(max.), 2?0(infl,), 325(br. Sch·)

260(min.), 276(max.),· 290(lnfl·), 325tbr. Sch·)

260(min.), 276(mas.), 290(infl.), 325(br. Sch.)

280(Sch.)

330(br. Sch.)

nur Endabsorütion 260/276-0,93i 325/276-0,^3 26o/27Ä*0,9Ö; 325/2?6-O,33 260/276-0*88} 325/2 76-0,32 260/276-0,90j 325/276-0,33 260/276-0,971 325/276-0,38 330/280-0,59

Das ·ο erhaltene Produkt ist bei der Elektrophorese bei pH 8,8 homogen, wird durch organische Lösungsmittel denaturiert, let bei sauren pH-Werten beständig, unbeständig unter alkalischen Bedingungen, thermisch unbeständig, leicht löslich in Wasser, unlöslich in üblichen organischen Lösungsmitteln, nicht dialysierbar mit Standard-Cöllophanmembranen, hochaktiv gegen zahlreiche gram-poeitlve und gram-negative Bakterien, nichtjqrrogen und turbidimetrisch aktiv (gegen S, aureüs 5) im Bereich von 1-5 γ .

Nachstehend wire* die Wirksamkeit von Kitomalcin gegen Leukämia L-1210 demonstriert. I it einer Serie von 5 Ansätzen, hergestellt nach den erfincunc;3£emäi3en Ve-rfahren, wurden mit Standard-Leukämiä L-1210 ("Hevised Protocols for Screening Chemical Agents and Natural Products Against Animal "Tumours and Other Biological Systens", CGUSC, Bethesda, Md., Nov. 6, 1962) die in Tabelle VII zusammenzefaiSten Ergebnisse erzielt. Der Wirkstoff wurde intraperitoneal an den Tafen 1 bis 15 nach der Infizierung verabreicht. Tabelle VIII gibt die Werte an, die bei einer Behandlung an den Tagen 1 bis 9 n&ch Infisierunr erzielt wurden» (Mit den Syn;bol * > * vird lannes Überleben der Mause angegeben, d.h. mindestens k von 6 überleben noch nach Tapen).

	Vero	Tabelle	VII	Überlebens· Hate	- fi des Ver-	ζentraten L-1210	Dös n>·/	ν oil-	Uc er lebe:": ε Hate	c- ieS - 7er*-« -v.
	Dosi r:./k	uohe nit 5 Ansätzen von Kc r Kito:n„lcin ;re;-en Leuk^-.i-;	3/r	Ui ('oxisch	An aatz	0	is k^		153
Ansatz	h	C ■■""- .	t/6	Sl	) E	C	,5	6/6	166
A			'6/6	^?		0	,4	5/6	171
A	2		ο/6	139	p	0	,3	6/6	162
A	χ		' ' 6/6	223	B	• c	,2	6/6	139
A	■-"t		6/6	2CC	. E	0	»2	6/6	11*2
.i	o,	α	5/6	182	P	0	,1	6/6	141
A	o,	8	*- f '	221	B	C	.05	6/6-	126.
A	c,	7	909886/1	787			, 05
A		ό						BAD	ORIGINAL

Ansatz	Dosis rag./kg.	1	1	Über lebens- rate	% des Ver- gleichsv, Ansatz	B	Dosis mg./kg.	J	Λ	Über- % des lebens- Ver rate glei- chsy.
A	0*5	0,9	6/6	304	B	0,05		108-
A	0,5	0,9	6/6	275		0,03		6/6 111
A	0,1	0,8	5/6	188
A	0,05	0,8	6/6	162	(toxisch) G
B	2	0,8	6/6	81	C	1,5	88
B		0,7	6/6	122	C	1,0	208
B	1,5	0,7	6/6	>234	C	0,9	>250
B	1	0,6		>229	C	0,8	191
B	0,6	6/6	150	σ	0,8	>225
B	0,6	6/6	37^	C	0,7	>244
B	0,5	6/6	233	σ	0,6	Λ265.
B	1,5		>212	C	0,5	221
E	1,0	6/6	283	D "	0,5	147
ρ	0,9		163	D	1,5	>206
B	0,8	6/6	164	D	1,0	>239
P	0,7 .	6/6	214	D	0,9	220
E	0,6		157	D	0,8	• >227
E	0,5	6/6	220	D	0,7	>218
B	0,3		153	D	0,6	141
B	0,1 ■	6/6	207	D	0,5	I54
B	0,05	6/6	213	D	0,3	I54
S	0,03		225	. D	0,1	136
S		258	D	0,05	120
E		177		0,03	115
E		152
E		211
E		209
E		245
E		177
E		132
E		U5		*"- ,---■ -"""
		112

909886/1787

Tabelle VIII

■An satz	Dosis m,s:./kg.
D	1,5
D	1,0
D	0,9
D	0,8
• D	0,7
D	0,5
E	1,5
E	1,0
E	0,9
Ξ	0,8
Ξ	0,7
E	0,5

Über-

lebens-

rate

% des Vergleichs ν.

161

163

130 >262 >2^6 >39O

168 >331

An satz	Dosis	Über- % des lebens- Ver rate gleichsv.
P	2,0	119
P	1,5	168-
P	1,0	>369
P	0,9	>257
P	0,8	, 163
F	0,7	212
F	0,6	188
P	0,5	. ^212
F	0,3 ■	196
F	0,1	193
P	0,05	122
F	0,03	12*l·

Zeichnet man den Prozentwert gegenüber dem Vergleich (T/G) gegen die Dosis (mg/kg) bei den Daten der Tabelle VII auf,:so zeigt sich eine maximale Wirksamkeit von etwa 280$ Überlebenszeit gegenüber dem Vergleich bei einer Dosis von 0,8 mg/kg pro Tag, Dsr Bereich der maximalen Wirksamkeit liegt zwischen 0,5 und 1 mg/kg. Eine analoge Aufzeichnung der Werte aus Tabelle VIII gegfen die Dosis zeigt eine maximale Wirksamkeit von 280 bis 300$ des Vergleichs bei 1 mg/kg/fag.

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BAD ORI&M

Claims (1)

1. Patentansprüche

   IJ Proteinartige Verbindung Mitomalcin, mit folgenden Ei- *. genWlaften: ^eicht löslich in Wasser, unlöslich in üblichen organischen Lösungsmitteln und Phenol, von-denen sie denaturiert, wir.I, nicht dialysierbar, /beständig bei sauren pH-¥ei¹%eB_T~zersetzt sich allmählich bei 250 bis 270⁰C, zeigt in wässriger Lösung ein üV-Absorptionsmaximum bei 276 rau, 3/* 15-18} zeigt in Kaliumbromid-Pellet IR-Absorptionsmaxima bei 3,05, 6,05, 6_f55t 7,20, 8,05 und 9,30/u; besitzt ein MolekulargVieht von etwa 17 400} ergibt bei Hydrolyse Ammoniak und Asparaginsäure, Threonin, Glutaminsäure, Serin, Prolin, Glycin, Alanin, Valin, Gystin,Isoleucin, Leucin, Tyrosin, Phenylalanin, Lysin, Histidin, Arginin, Allo-3-hydroxyprolin, n- und allo-Hydroxyprolin, OC-Aminoisobuttersäure, 3-Methylhistidin und Carnosamin.

   2. Verfahren zur Herstellung der Verbindung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces malayensis in > einem wässrigen Nährmedium unter submersen aeroben Bedingungen ι züchtet, bis das Medium eine wesentliche, antimikrobielle Wirk'H samkeit besitzt. .; .'

   3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man den Streptomyces malayensis bei einer Tempera.tür zwischen ] etwa 2^ und ^0⁰C und einem pH-Wert zwischen etwa 5i5 und §,5 i während etwa; 18 bis 72 Stunden züchtet und den Wirkstoff aus der Gärbrühe gewinnt.... ■

   ' k* Verfahren nach Anspruch 3,\dadurch gekennzeichnet, daß man die Gärbrühe filtriert, das Piltrat einengt, das aktive Prinzip an Diäthylaminoäthy!cellulose adsorbiert, die Diäthylaminoäthylcellulose mit wässriger NatriumöhloridlÖsung eluiert| das.so erhaltene Eluat dialysiert und dann mit einem stark basischen Aniojaaustauscherharz in der Acetat-, Chlorid- oder 1?hoι-U phatform behandelt, das Harz mit Wasser _ eluiert und das Eluat *■ gefriergetrocknet. . ν «, * f

   909886/178f

   5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Eluat mit einem schwach basischen vernetzten Dextran-Aus·- tauscherharz mit Diäthylaminoäthylgruppen behandelt, das Harz mit Natriumchlorid-haltiger Phosphatpufferlösung (pK 7) eluiert und das Eluat dialysiert und gefriergetrocknet wird.

   6. Verfahren nach Anspruch 5» dadurch gekennzeichnet, daß das gefriergetrocknete Produkt in wässriger, mit Ameisensäure auf pH 7 gepufferter Ammoniumcarbonatlösung gelöst, die Lösung mit schwach saurem, vernetzten! Dextran-Aus tauscher harz behandelt, dieses Harz mit wässriger Ammoniumcarbonatlösung. Wasser oder Essigsäure eluiert und das Eluat gefriergetrocknet wird.

   Pur Chas.. Pfizer & Go., Ine, New York, N.Y., V.St.A.

   Rechtsanwalt

   909886/1787

   BAD ORIGINAL