DE1957980C3 - Verfahren zur Herstellung von Daunorubicin durch Züchtung eines Streptomyces - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von Daunorubicin durch Züchtung eines Streptomyces

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DE1957980C3
DE1957980C3 DE1957980A DE1957980A DE1957980C3 DE 1957980 C3 DE1957980 C3 DE 1957980C3 DE 1957980 A DE1957980 A DE 1957980A DE 1957980 A DE1957980 A DE 1957980A DE 1957980 C3 DE1957980 C3 DE 1957980C3
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    • C07H15/20—Carbocyclic rings
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Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Gewinnung des mit der Nummer 13 057 R.P. bezeichneten Antibioticums, das den Namen Daunorubicin (früher: Rubidomycin) erhalten hat.
In der französischen Patentschrift 15 33 151 sind das mit der Nummer 9 865 R.P. bezeichnete Antibioticum, seine drei Hauptbestandteile, die mit den Nummern 13 213 R.P., 13 057 R.P. (oder Daunorubicin) und 13 330 R.P. bezeichnet werden, die Herstellung des Antibioticums 9 865 R.P. durch Züchtung von Streptomyces 8 899 oder Streptomyces 31 723 in geeignetem Medium und die Fraktionierung des Antibioticums 9 865 R.P. in seine drei Bestandteile beschrieben.
In der französischen Patentschrift 15 51195 ist ebenfalls die Herstellung des Antibioticums 13 057 R.P. oder Daunorubicins durch Züchtung eines neuen Streptomyces-Stammes beschrieben, der mit Streptomyces griseus, Varietal Rubidofaciens, Stamm DS32041 (NRRL 3383) bezeichnet wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Herstellung von Daunorubicin durch Züchtung eines im folgenden näher identifizierten Mikroorganismus, der dem Genus Streptomyces angehört und mit »Streptomyces bifurcus, DS 23 219 (NRRL 3539) bezeichnet wird, unter aeroben Bedingungen. Dieser neue Mikroorganismus wurde aus einer in Frankreich im Departement Val-de-Marne, entnommenen Erdprobe erhalten.
Die Isolierung dieses Stammes wurde unter Anwendung der folgenden üblichen Methode vorgenommen: Die Erdprobe wird in sterilem destilliertem Wasser suspendiert, die Suspension wird dann auf verschiedene Konzentrationen verdünnt, und kleine Volumina jeder Verdünnung werden auf die Oberfläche von Petrischalen verteilt, die ein geeignetes Agarnährmedium enthalten. Nach einer Inkubation von 15 Tagen bei 26'C werden die Kolonien von Mikroorganismen, die man isolieren will, auf Schrägagar versetzt, um reichlichere Kulturen zu erhalten.
Aus den im iolgenden dargelegten Gründen muß der Stamm Streptomyces DS 23 219 als Repräsentant einer neuen Species angesehen werden, die mit Streptomyces bifurcus aufgrund der Tatsache bezeichnet wird, daß man in seinen Kulturen sehr häufig eine recht besondere Form von Sporophoren antrifft, die am Ende eine Dichotomic aufweisen und dann zwei längliche Äste aufweisen, die am Ende eines Hauptfadens sitzen.
Streptomyces bifurcus, Stamm DS 23 219, bildet zylindrische Sporen mit Abmessungen von 0,4 bis 0,5/1.0 bis 1,2 μ. Seine geraden oder schwach gebogenen Sporenfäden sind auf Luft-ausgesetzten Fäden angeordnet, die sie isoliert oder als Trauben tragen, die eine beschränkte Anzahl von Elementen umfassen, lläullg bildet der Hauptl'aden an seinem linde nur zwei längliche Fäden, was den Sporophoren ein ganz besonderes gespaltenes Aussehen gibt.
Allgemein entwickelt Streptomyces bifurcus. Stamm DS 23 219, auf synthetischen Nährmedien ein gelbliches bis hellrosa, bräunlichrosa oder rötlichbraunes vegetatives: Mycel und produziert lösliche Pigmente von oiangerosa bis violettrosa Färbung. Auf den organischen Medien ist sein vegetatives Mycel gelbbraun bis orangebraun, und die löslichen Pigmente, die er erzeugt, färben den Agar orangebraun bis rötlichbraun. Er erzeugt kein Melaninpigment auf organischen Medien und kein H2S. Er bildet aus Nitraten sowohl auf organischen Medien als auch auf synthetischen Medien Nitrile, verflüssigt Gelatine, peptonisiert Milch langsam und verwertet Cellulose.
In der nachfolgenden Tabelle! sind die Züchtungsis Charakteristiken und die biochemischen Eigenschaften, die Streptomyces bifurcus. Stamm DS 23 219, auf einer gewissen Anzahl von üblicherweise zur Prüfung des Aussehens von Streptomyces-Stämmen verwendeten Nähragarmedicn und Nährbouillons aufweist, angcgeben. Ohne genauere Angaben sind diese Eigenschaften diejenigen, die Kulturen von etwa 2 bis 3 Wochen bei 25 C, die ein gutes Entwicklungsstadium erreicht haben, aufweisen. Eine gewisse Anzahl der verwendeten Züchtungsmcdien wurde nach den Rezepturen hergestellt, die in »The Actinomycetes« (S. A. Waksman, Chronica Botanica Company, Waltham, Mass., USA, 1950, Seite 193-197) angegeben sind. In diesem Falle sind die Medien durch den Buchstaben W, dem die Nummer folgt, die ihnen in »The Actinomycetes« gegeben wurde, bezeichnet.
Die Literaturstellen für die anderen Züchtungsmcdien oder die Zusammensetzungen derselben sind die folgenden:
Anm. A: »Hickey and Trcsner's Agar«, T. G. Pridham u. Mitarb., Antibiotics Annual, 1956-1957, Seite 950,
Anm. B: K. L. Jones, Journal of Bacteriology, 57, 142, 1949,
Anm. C: Rezeptur W-23, versetzt mit 2% Agar, Anm. D: »Yeast Extract Agar«, T. G. Pridham
u. Mitarb., Antibiotics Annual, 1956-1957, Seite 950,
Anm. E: »Tomato Paste Oatmeal Agar«, T. G. Pridham u. Mitarb., Antibiotics Annual, 1956-1957, Seite 950,
Anm. F: W. E. G rundy u. Mitarb., Antibiotics and Chem., 2, 401, 1952,
Anm. G: »Inorganic Salts - Starch Agar«, T. G. Pridham u. Mitarb., Antibiotics Annual, 1956-1957, Seite 951,
so Anm. H: entspricht der Rezeptur W-I, wobei 30g Saccharose durch 15 g Glucose ersetzt sind,
\nm. I: entspricht der Rezeptur W-I, wobei 30g Saccharose durch 15 g Glycerin ersetzt sind,
Anm. J: »Plain gelatin«, hergestellt nach den Angaben des »Manual of Methods for Pure Culture Study of Bacteria« der Society of American Bacteriologists, Geneva, N.Y., II.sn.u,
Anm. K: »Manual of Methods for Pure Culture Study of Bacteria« der Society of American Bacterio-(10 logists, Geneva, N.Y., Il-o-m,
Anm. L: »Manual of Methods lor Pure Culture Study of Bacteria« der Society of American Bacteriologists, Geneva. N.Y., Il.-,,.,.,,
Anm. M: entspricht dor Re/eplur W-If, wobei 30 g (>s Saccharose durch 15 g Glucose ersel/t sind,
Anm. N: entspricht der Re/eplur W-18, wobei die .Saccharose weggelassen und durch kleine Filterpapierstreifen ersct/1 ist. die teilweise in die Flüssigkeit
3 19 57 980 4 Entwick Vegetatives Anm. Q: H. D. Tresner und F. Danga, Journal Bacteriology, 76, 239-244, 195S. keines
. 42, S. A. Waksman, The Williams and Wilkins lungsgrad Mycel oder Seite 333, of
ir eintauchen. Nr % Anm. O: Handelsübliches Magermilchpulver, nach Company, Baltimore, 1961, Unterseite Lösliches Beobachtungen
& den Angaben < der Kultur Luftausgesetzter Pigment und biochemische
Jes Herstellers zubereitet. Teil (umfaßt Eigenschaften
-ti Anm. P: The Actinomycetes, Band 2, Gesamtheit von schwach-
Tabelle I (2) (3) luftausgesetztem rosabraun
,/_ Kulturmedium gut hellgelb Mycel und
braunes vege Spekulation) (5) (ό)
tatives Mycel; (4) sehr schwach- zylindrische Sporen mit Ab-
gut entwickelt hellgrau; sehr rosabräunlich messungen von 0,4 bis hellrötlich-
mäßig 0,5/1,0 bis 1,2 μ; gerade oder orangebraun
entwickelt schwach gebogene Sporen
(D ziemlich gelbliches bis faden; häufig Sporophoren von
-;' Agar nach gut hellgelblich- zweigeteilter Form
ΐ Hickey und braunes orangebraun
V Tresner vegetatives keiner
v (Anm. A) Mycel
ziemlich gelbliches bis
gut hellgelblich-
: Agar nach braunes schwach rosa-
.;■■ Bennett vegetafives keiner orangebraun
(Anm. B) Mycel
gut hellorange-
braunes keines
Agar nach vegetatives
Emerson Mycel hellblaugrau;
(Anm. C) mäßig
gut hellorange- entwickelt hellgräulich- gute Löslichmachung von
braunes rosa Calciummalat
Agar mit vegetatives
Hefeextrakt Mycel blaugrau;
nach ziemlich gut
Pridham ziemlich bräunlich entwickelt keines
(Anm. D) gut oranges
Agar mit vegetatives
Hafer und Mycel keiner
Tomate nach sehr hellbräunlich- hcllrü'lich-
Pridham mäßig gelbes orange
(Anm. E) vegetatives
Glucose- Mycel keiner
Pepton-Agar mäßig farbloses bis
(W-6) hellbräunlich-
rosa
Nähragar vegetatives keiner
(W-5) Mycel
schlecht farbloses bis
hellrosa
Agar mit vegetatives
Calcium- M.u-el keiner
malat nach /icmlich hellorange-
K rai nsky gut brauncs bis
(Anm. F) hcllrotbrauncs
Agar mit vegetatives blaugrau;
Ovalhumin Mvcel sehr mäßig
(W-12) entwickelt
Glueose-
Asparagin-
A gar
(W-2)
Entwick 5 Vegetatives 19 57 980 Lösliches 6
lungsgrad Mycel oder Pigment
Fortsetzung Unterseite Beobachtungen
Kulturmedium der Kultur !■unausgesetzter und biochemische
Teil (umfaßt Eigenschaften
Gesamtheit von
(2) (3) luftausgeset/tem (5)
ziemlich rosa braungelb Mycel und orangerosa
gut bis rot Sporulationl bis rot (6)
(I) (4)
Glycerin- rosagrau bis
Asparagin- mäßig rötlichrosa bis blaugrau; ziem hellviolett-
Agar hellrosabraunes lich spärlich rosabraun
(W-3) vegetatives entwickelt Hydrolyse \on Stärke:
Stärke- Mycel hellgräulich; positiv
Nitrat-Agar ziemlich rötlichorange- spärlich hellrötlich-
'W-IO) gut braune entwickelt braun
Unterseite zylindrische Sporen mit Ab
Agar mit iiellbläulichgrau messungen von 0,4 bis
Stärke nach bis hell- 0,5/1,0 bis 1,2 μ; gerade oder
Pridham rosagrau; schwach gebogene Sporen-
(Anm. G) mäßig fäden; häufig Sporophoren von
gut hellgelbliches entwickelt violcttrosa zweigeteilter Form; Hydrolyse
bis rötlichrosa \on Stärke: positiv
vegetatives
Synthetischer Mycel keiner
Agar nach
Czapek mit gut hellgelbliches blaßrosa bis
Saccharose bis hcllrosa- blaßorange
(W-I) brauncs
Synthetischer vegetatives keiner
Agar nach Mycel
Czapek gut violettroles intensiv
mit Glucose vegetatives purpurviolett;
(Anm. H) Mycel reichlich
Synthetischer rosagrau bis
Agar nach violcttgrau:
Czapek gut sehr gut ent mäßig rötlichbraun
mit Glycerin wickeltes, sehr entwickelt
(Anm. I) dickes und stark
Kultur gefaltetes vege keiner
auf tatives Mycel:
Kartoffeln hellbräunlich
(W-27) bis hell-
rötlichbraun
mäßig weißliches keines
vegetatives
Mycel Verflüssigung: positiv
Reine keiner
Gelatine ziemlich gelblicher keines
mit 12% gut Ring
(Anm. J) Reduktion von Nitraten zu
Nitrat- mäßig kleine gräu keiner keines Nitriten: Stark positiv
Nähragar liche Kolonien,
(Anm. K) die sich an der Reduktion von Nitraten zu
Glucose- Oberfl !»ehe keiner Mitriten: positiv
Nitrat- agglomerieren
Houillon nach mittel rosa Schleier, keines
1) im m ic k dick, gut
(Anm. 1.) entwickelt Reduktion von Nitraten zu
Ik)UiII(In nach keiner Nitriten: positiv
C ζ a ρ c k
mit Saccharose
l-'orlsci/unu
Kullurmeilium Entwick Vegetatives Luftausgcsclzter Lösliches Beobachtungen
lungsgrad Myccl oder Teil (umfallt Pigment und biochemische
Unterseite üesamtheit von lügenschal'tcn
der Kultur luftausgcset/tcm
Mycel und
Sporulation)
(I) (2) O) (4) (M (h)
Bouillon nach Czapek mit Glucose (Anm. M) Bouillon nach Czapek mit Cellulose (Anm. N)
Magermilch (Anm. O)
Tyrosin-Hefeextrakt- Agar zur Bildung von Melanin (Anm. P) Agar nach Trcsner und Danga (Anm. Q)
mittel
mittel
gut
mäßig
gut
rosaviolett
keiner
kleine rosaweiße Kolonien auf dem aus der Bouillon herausragenden Papier gelblicher Ring
rosa wc iß keines
keines
keiner
hellbräunlichrosa
rosaweiß bis rosagrau; mäßig entwickelt
hellbräunlich- keiner gelb hellbräunlichrosa
hellbräunlichgelb
Reduktion von Nitraten zu Nitriten: positiv
Reduktion von Nitraten zu Nitriten: positiv; Verwertung von Cellulose: positiv
keine Koagulation; langsame Peptonisation, erst nach 1 Monat Züchtung beginnend; pH unverändert in 1 Monat Bildung von Melanin: negativ
Produktion von H2S: negativ
Die Fähigkeit von Streptomyces bifurcus, Stamm DS 23 219, verschiedene Kohlenstoffquellen und Stickstoffquellen zur Gewährleistung seiner Entwicklung zu verwerten, wurde nach dem Prinzip der Methode von Pridham und Gott lieb (J. of Bact. 56, 107-114. 1948) bestimmt. Der Entwicklungsgrad wurde auf dem von diesen Autoren angegebenen Grund-Tabelle Ί medium beobachtet, wobei die Glucose durch die verschiedenen jeweilig untersuchten Kohlenstoff-4° quellen oder das (NH4J2SO4 durch die verschiedenen jeweils untersuchten Stickstoffquellen ersetzt wurde. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle II angegeben.
Geprüfte Kohlenstoffquellen
Verwertung Geprüfte Stickstoffquellen
Verwertung
D-Xylose L-Arabinose L-Rhamnose D-GIucose D-Galactose D-Fructose D-Mannose L-Sorbose Lactose Maltose Saccharose Trehalose Cellobiose Raffinose
+ aber langsam NaNO3 NaNO2 (NH4J2SO4 (NH4J2HPO4 Adenin Adenosin Uracil Harnstoff L-Asparagin Glykokoll Sarcosin DL-Alanin DL-Valin DL-Asparaginsäure
ίο
rortscl/iini!
Geprüfte Kohlenstol'f- Verwertung - + Iicprüfte S tickstol !quellen Verwertung - P 1957980.742
u,uellen - + -
Dextrin + - + L-Glutaminsäure + + aber langsam S. bifurcus
Inulin + + L-Arginin + +
Stärke + L-Lysin + + NRRL 3539
Glykogen + DT 12 15863 DL-Serin + +
Glycerin + DL-Threonin + +
Erythrit S. coeruleorubidus DL-Methionin
Adonit Taurin
Dulcit NRRL 3045 NRRL 3046 DL-Phenylalanin
D-Mannit L-Tyrosin
D-Sorbit DL-Prolin
Inosit L-Hydroxyprolin
Salicin ! ι Betain
Vergleichstabelle III
Verwertung von BE-PS 639897 DT18G9187
(FARMITALIA)
S. peucetius S. griseus,
var. rubido
IM 3868 (Rutgers faciens -
Institute) NRRL 3383
Stärke
L-Arabinose L-Rhamnose Lactose Saccharose Trehalose
Raffinose Inulin Adonit D-Sorbit Inosit Uracil Sarcosin Betain
Produktion v. Daunorubicin
a) berechnet auf die Brühe
b) an kristallisiertem Produkt (Hydrochlorid)
positiv positiv langsam und positiv positiv
schwach
positiv positiv negativ negativ positiv
positiv positiv negativ negativ positiv
positiv positiv negativ positiv positiv
+ ± positiv negativ positiv
positiv negativ positiv
jedoch langsam
positiv positiv positiv negativ positiv
negativ ± negativ positiv
positiv positiv negativ negativ negativ
positiv positiv negativ negativ positiv
± positiv negativ positiv
negativ positiv
negativ positiv
negativ positiv
34 μg/cm3 22,5
0,240 g/hl 0,051 g/hl 1,25 g/hl 1,89 g/hl 0,775 g/hl
(Beispiel 3-7) (Beispiel 9-10) (Beispiel 8 und 9) (Beispiel 2-5)
Die Gesamtheit der Charakteristiken, die Streptomyces bifurcus, Stamm DS 23 219, aufweist, hat nicht ermöglicht, ihn als eine der bereits beschriebenen Species zu identifizieren. Er muß daher als Repräsentant einer neuen Species angesehen werden.
Nach der in Bergeys Manual of Determinative Bacteriology (7. Auflage, The Williams and Wilkins Company, Baltimore, 1957) angegebenen Klassifikation von Streptomyces machen ihn seine Eigenschaften, auf organischen Medien kein Melaninpigment zu bilden, auf Kartoffeln ein lösliches rötlichbraunes Pigment zu entwickeln und auch auf Kartoffeln ein hellrötlichbraunes vegetatives Mycel zu entwickeln, dem Streptomyces noursei ähnlich. Er steht jedoch mit diesem
letzteren in keinem Verhältnis, der spiralige Sporophoren bildet und dessen sporuliertes luftausgesetztes Mycel eine rosa Farbe annimmt, während er nur nichtspiralige Sporenfaden bildet und ein hellblaugraues sporuliertes luftausgesetztes Mycel aufweist.
In The Actinomycetes (Band 2, S. A. Waksman, The Williams and Wilkins Company, Baltimore, 1961, Seite 158) befindet sich eine Beschreibung von drei anderen Species, die mit Streptomyces noursei die Eigenschaft teilen, auf organischen Medien kein Melaninpigment zu bilden, auf Kartoffeln ein rötliches lösliches Pigment freizusetzen und auf Kartoffeln ein rosa bis rötliches vegetatives Mycel zu bilden, nämlLch Streptomyces albogriseolus, Streptomyces spiralis und Streptomyces fragil is. Diese drei Species weisen jedoch gegenüber dem Stamm Streptomyces bifurcus. Stamm DS 23 219, wesentliche Unterschiede auf, die zeigen, daß sie unbestreitbar Species sind, die ihm nicht entsprechen können: Streptomyces albogriseolus und Streptomyces spiralis bilden spiralige Sporophoren und gehören daher in die Sektion Spira der Klassifikation von Pridham, während Streptomyces bifurcus, Stamm DS 23 219, der nur gerade oder schwach gebogene Sporenfaden bildet, in die Sektion Rectus-Flexibilis dieser gleichen Klassifikation gehört. Was Streptomyces fragilis anbetrifft, so zeigt die rosa Farbe, die sein luftausgesetztes Mycel bei Erreichung der Sporulation annimmt, daß er in keiner Beziehung zu Streptomyces bifurcus, Stamm DS 23 219, steht, dessen luftausgesetztes Mycel, wie bereits ausgeführt wurde, sich hellblaugrau färbt, wenn er sporuliert ist.
Streptomyces bifurcus, Stamm DS 23 219, kann daher nicht als einer der am nächsten kommenden Stämme identifiziert werden.
Das neue Verfahren zur Gewinnung von Daunorubicin besteht im wesentlichen darin, Streptomyces bifuicus, Stamm DS 23 219, oder seine Mutanten in einem geeigneten Medium und unter geeigneten Bedingungen zu züchten und das im Verlaufe der Züchtung gebildete Antibioticum abzutrennen.
Die Züchtung durch Fermentation von Streptomyces bifurcus, Stamm DS 23 219, ergibt im wesentlichen Daunorubicin, jedoch auch die anderen Bestandteile des Antibioticums 9 865 R.P., die von dem Daunorubicin im Verlaufe von Extraktions- und Reinigungsarbeitsgängen abgetrennt werden und gegebenenfalls isoliert werden können. Das Hauptziel der vorliegenden Erfindung ist jedoch die Herstellung von Daunorubicin.
Die Züchtung von Streptomyces bifurcus, Stamm DS 23 219, kann nach jeder beliebigen aeroben Oberflächenzüchtungsmethode oder Submerszüchtungsmethode erfolgen, doch ist diese letztere aus Gründen der Bequemlichkeit zu bevorzugen. Man verwendet zu diesem Zweck die verschiedenen Apparaturtypen, die jetzt üblicherweise in der Fermentationsindustrie verwendet werden.
Man kann insbesondere den folgenden Weg für die Durchführung der Arbeitsgänge einschlagen:
Stamm DS 23 219 - Stammansatz
I
Kultur auf Agar
I
Kultur im Kolben unter Bewegung
Impfkultur im Fermenter
ί
Produktionskultur im Fermenter
Das Fermentationsmedium soll im wesentlichen eine assimilierbare Kohlenstoffquelle und eine assimilierbare Stickstoffquelle, Mineralstoffe und gegebenenfalls Wachstumsfaktoren enthalten, wobei alle diese Bestandteile in Form von gut definierten Produkten oder von komplexen Gemischen, wie man sie in biologischen Produkten verschiedenen Ursprungs antrifft, zugeführt werden können.
Als assimilierbare Kohlenstoffquellen kann man Kohlehydrate, wie beispielsweise Glucose, Maitose, Dextrine, Stärke, oder andere Kohlehydratsubstanzen, wie beispielsweise Zuckeralkohole, z. B. Mannit und dgl., oder gewisse organische Säuren, wie beispielsweise Milchsäure oder Citronensäure, verwenden. Gewisse tierische oder pflanzliche Öle, wie beispielsweise Schmalzöl oder Sojaöl, können diese verschiedenen Kohlehydratquellen mit Vorteil ersetzen oder ihnen beigefügt werden.
Die geeigneten assimilierbaren Stickstoffquellen sind außerordentlich verschiedenartig. Sie können sehr einfache chemische Substanzen, wie beispielsweise Nitrate, anorganische oder organische Ammoniumsalze, Harnstoff oder Aminosäuren, sein. Sie können auch in Form von komplexen Substanzen, die den Stickstoff hauptsächlich in protidischer Form enthalten, zugeführt werden, wie beispielsweise in Form von Casein, Lactalbumin, Gluten oder deren Hydrolysaten, Sojamehl, Arachismehl, Fischmehl, Fleischextrakten, Hefeextrakten, Distillers' Solubles und Maisquellwasser.
.Unter den zugefügten mineralischen Stoffen können gewisse eine Pufferwirkung oder eine neutralisierende Wirkung besitzen, wie beispielsweise die Alkali- oder Erdalkaliphosphate oder Calcium- und Magnesiumcarbonat. '
Andere führen zu dem zur Entwicklung des Streptomyces bifurcus, Stamm DS 23 219, und zur Erzeugung des Antibioticums erforderlichen Ionengleichgewicht, wie beispielsweise die Alkali- und Erdalkalichloride und -sulfate. Schließlich wirken gewisse in speziellerer Weise als Aktivatoren der Stoffwechselreaktionen des Streptomyces DS 23 219. Es sind dies die Zink-, Kobalt-, Eisen-, Kupfer- und Mangansalze.
Der pH-Wert des Fermentationsmediums soll zu Beginn der Züchtung zwischen 6,0 und 7,8, vorzugsweise zwischen 6,5 und 7,5, liegen. Die zur Fermentation optimale Temperatur beträgt 25 bis 300C, doch wird auch bei Temperaturen zwischen 23 und 33°C eine zufriedenstellende Produktion erhalten. Die Belüftung der Züchtung kann in ziemlich weiten Grenzen variieren. Es wurde jedoch gefunden, daß Belüftungen von 0,3 bis 31 Luft je 1 Bouillon und je Minute besonders gut geeignet sind. Die maximale Ausbeute an Antibioticum wird nach 2- bis 8tägiger Züchtung erhalten, wobei diese Zeitspanne hauptsächlich von dem verwendeten Medium abhängt
Aus den vorstehenden Ausführungen ist ersichtlich, daß die zur Produktion von Daunorubicin angewendeten allgemeinen Bedingungen der Züchtung von Streptomyces bifurcus, Stamm DS 23 219, in ziemlich weitem Maße variieren und jedem besonderen Erfordernis angepaßt werden können.
Das Daunorubicin kann aus den Fcrmentalionsmaischen nach verschiedenen Methoden isoliert werden.
Man kann die Kulturmaische bei einem pH-Wert zwischen 1,5 und 9 filtrieren. Unter diesen Bedingungen geht der Hauptteil der Aktivität in das Filtrat. Nach Waschen mit Wasser enthält der Filterkuchen praktisch keine Aktivität mehr. Es ist vorteilhaft, diesen Arbeitsgang in saurem Medium und insbesondere unter Ansäuern mit Oxalsäure auf einen pH-Wert zwischen 1,5 und 2 durchzuführen. Es ist auch möglich die Filtration bei einem pH-Wert zwischen 2 und 7, vorzugsweise bei einem pH-Wert in der Nähe von 2, in Anwesenheit eines aliphatischen Alkohols mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen vorzunehmen.
Bei den obengenannten Extraktionsarbeitsgängen wird das Daunorubicin in wäßriger oder wäßrig-alkoholischer Lösung erhalten, und man führt es anschließend durch Extraktion mit einem mit Wasser nichtmischbaren organischen Lösungsmittel, wie beispielsweise Butanol, Methylisobutylketon, Äthylacetat oder Chloroform, bei einem pH-Wert zwischen 5,5 und 9, vorzugsweise bei einem pH-Wert in der Nähe von 7,5, in eine organische Lösung über. Gegebenenfalls nimmt man vor dieser Extraktion eine Behandlung mit einem Ionenaustauscherharz vor. In diesem Falle wird die wäßrige Lösung auf einen pH-Wert in der Nähe von 4 eingestellt und das Antibioticum dann an ein Kationenaustauscherharz gebunden. Das Daunorubicin wird vorzugsweise mit Methanol, das 10% Wasser und 1 % Natriumchlorid enthält, eluiert. Das Eluat wird dann eingeengt, um den Alkohol zu entfernen, und dann wie oben angegeben extrahiert.
Man kann die Fermentationsmaische auch einer Extraktion mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel, wie beispielsweise Butanol, Äthylacetat oder Chloroform, bei einem pH-Wert zwischen 5,5 und 9, vorzugsweise bei <-inem pH-Wert in der Nähe von 7,5, unterziehen. Ii diesem Falle geht die gesamte Aktivität in die organ;sche Phase, die von der wäßrigen Phase nach üblichen Verfahren abgetrennt wird.
Gleichgültig, welche Extraktionsweise gewählt wird, wird das Daunorubicin schließlich in organischer Lösung erhalten. Es kann zu diesem Zeitpunkt vorteilhaft sein, eine Reinigung durch aufeinanderfolgende Überführung des Antibioticums in wäßrige Lösung und dann in organische Lösung durch Änderung des pH-Werts vorzunehmen. Das rohe Antibioticum kann anschließend aus der zuletzt erhaltenen organischen Lösung durch Einengen oder durch Ausfällen mit einem schlechten Lösungsmittel, wie beispielsweise Hexan, isoliert worden.
Zur Herstellung von reinerem Daunorubicin kann man die üblicherweise angewendeten Methoden, wie beispielsweise Chromatographie an verschiedene Adsorbentien, Gegenstromverteilung oder Verteilung zwischen verschiedenen Lösungsmitteln, anwenden.
Das Daunorubicin kann auch in Additionssalze mit Säuren, wie beispielsweise Chlorwasserstoffsäure, übergeführt werden. Diese Salze können durch Anwendung üblicher Methoden gereinigt werden.
Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Daunorubicin und dessen Salze weisen Eigenschaften auf, die mit denjenigen des Antibioticums 13 057 R.P. und seiner Salze, die in der französischen Patentschrift 15 33151 beschrieben sind, identisch
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschränken.
Beispiel 1
In einen 170-l-Fermenter bringt man die folgenden Bestandteile ein:
Pepton 1200 g
Fleischextrakt 600 g
Hydratisierte Glucose 1200 g
Agar 240 g
Leitungswasser, ad
Der pH-Wert wird mit 120 cm' 10 η-Natronlauge auf 7,20 eingestellt. Man sterilisiert das Medium durch 40rninütiges Durchleiter! von Dampf von 122X. Nach Abkühlen beträgt das Volumen der Bouillon 120 1 und der pH-Wert 6,65. Man beimpft dann mit 200 cm1 einer gerührten bzw. geschüttelten Erlenmeyer-Kultur von Streptomyces bifurcus, Stamm DS 23 219. Die Kultur wird bei 27 C während 30 Stunden unter Bewegen und unter Belüftung mit steriler Luft entwickelt. Sie ist dann zur Beimpfung der Produktionskultur geeignet.
Die Produktionskultur wild in einem 800-l-Fermenter durchgeführt, der mit den folgenden Substanzen beschickt ist:
Distillers' Solubles 4 kg
Gekörnte Bohnen 12 kg
Sojaöl 8 1
Natriumchlorid 2 kg
Kobaltchlorid-Hexahydrat 8 g
Leitungswasser, ad 330 I
Nach Einstellen des pH-Werts mit 400 cm' 10 n-Natronlauge auf 7,70 wird das Medium bei 122 1C während 4ü Minuten sterilisiert. Nach Abkühlen beträgt das Volumen der Bouillon 3601. Es wird durch Zugabe von 401 einer sterilen wäßrigen Lösung, die 6 kg hydratisierte Glucose enthalt, auf 4001 aufgefüllt. Der pH-Wert beträgt dann 6,80.
Man beimpft mii 40 J der Impfkultur aus dem oben beschriebenen 170-l-Fermenter. Die Züchtung wird bei 27CC 170Stundr". unter Bewegen mittels eines Turbinenrührers, der mit 260 U/min betrieben wird und unter Belüftung mit steriler Luft in einer Menge von 30 mVStunde durchgeführt. Der pH-Wert des Züchtungsmediums beträgt dann 7,30 und das Volumen der Maische 305 1. Die vorhandene Menge an
so Daunorubicin (13 057 R.P.) beträgt 22,5 μg/cm\
Beispiel 2
2001 der während der in Beispiel I beschriebenen Fermentation erhaltenen Züchtungsmaische werden in einen mit einem Rührer und einer Heizschlange mit Dampf ausgestatteten Bottich eingebracht Man setzt 6 kg Oxalsäure zu und erhitzt die Masse auf 500C. Man rührt bei dieser Temperatur I1Z2 Stunden weiter. Nach dieser Zeitspanne wird die Suspension auf einer Filterpresse nach Zugabe von 30 kg Filterhilfe filtriert. Der Filterkuchen wird auf dem Filter mit 1001 Wasser gewaschen. Das Filtrat, dessen Volumen 2601 beträgt, wird auf +150C abgekühlt, und der pH-Wert wird mit 10%iger Natronlauge auf 4,5 eingestellt.
Das Filtrat wird in eine Säule, die 61 Amberlite IRC-50 im Säurezvklus enthält so eeleitet, daß das
Harzbett von oben nach unten mit einer Rate von 15 l/Stunde durchströmt wird. Die Säule wird anschließend mit 301 Wasser, das in der gleichen Richtung wie das Filtrat und mit der gleichen Rate durchgeleitet wird, und dann mit 30 1 Methanol mit einem Gehalt von 50% Wasser in einer Rate von 15 I/Stunde von unten nach oben und dann weiterhin mit der gleichen Rate und von unten nach oben mit 501 Methanol mit einem Gehalt von 10% Wasser gewaschen.
Der Abfluß und die Waschflüssigkeiten werden verworfen, und die Säule wird mit einer von oben nach unten durch das Harz geleiteten Lösung der folgenden Zusammensetzung eluiert:
Natriumchlorid
Wasser
Methanol, ad
10 g
100 cm'
1000 cm'
Das Eluat wird ab dem Auftreten einer orangeroten Färbung und bis zum Verschwinden dieser Färbung gesammelt Man erhält so ein Volumen von 501, die den Hauptteil des Antibioticums enthalten.
Das Eluat wird unter vermindertem Druck (2 mm Hg) bei 35°C auf ein Volumen von 101 eingeengt.
Das Konzentrat wird bei pH 8,5 nacheinander dreimal mit je 51 Chloroform extrahiert. Der Chloroformextrakt wird bei 30DC unter vermindertem Druck (5 mm Hg) auf ein Volumen von 50 cm3 eingeengt. Das Antibioticum wird in Form der Base mit 500 cm3 Hexan ausgefällt, abgesaugt, gewaschen und getrocknet. Man erhält schließlich 4,9 g rohe Base mit einem Gehalt von 64% Daunorubicin.
Beispiel 3
6,8 g des wie in Beispiel 2 erhaltenen Produkts mit einem Gehalt von 64 % Daunorubicin werden in 40 cm3 Wasser suspendisrt und durch fortschreitende Zugabvon 7 cm3 1 η-Salzsäure gelöst. Die Lösung wird durcl Filtrieren geklärt, und Daunorubicin-hydrochlorid win durch langsame Zugabe von 11 Aceton kristallisiert Die so erhaltenen Kristalle werden abfiltriert, mi 50 cm' Aceton gewaschen und bei 50cC unter vermin dertem Druck (5 mm Hg) 15 Stunden getrocknet. Mai erhält 3,3 g kristalliertes Hydrochlorid mit einerr Gehalt von 90% Daunorubicin in einer Ausbeute vor 68%.
Beispiel 4
3 g des gemäß Beispiel 3 erhaltenen Produkts werdei in 10 cm3 Methanol gelöst. Dann werden 100 cm Chloroform nach und nach zugegeben, was die Kristal lisation von Daunorubicin-hydrochlorid bewirkt. Di< so erhaltenen Kristalle werden abfiltriert, mit 20 cm Chloroform gewaschen und unter vermindertem Drucl (5 mm Hg) 15Stunden bei 50C getrocknet. Mar
:o erhält 1,8 g umkristallisiertes Hydrochlorid mit einerr Gehalt von 90% Daunorubicin. Die Ausfällung dei Kristallisationsmutterlaugen mit 200cm3 Hexan er möglicht, eine zv jite Fraktion Daunorubicin zu erhal ten. Nach Filtrieren, Waschen mit 50cm3 Hexan unc Trocknen bei 50'C unter vermindertem Druck (5 mrr Hg) erhält man 1 g Daunorubicin, das in den Arbeits gang von Beispiel 3 zurückgeführt werden kann.
Beispiel 5
2,4 g des wie in Beispiel 4 beschrieben erhaltenen Daunorubicin-hydrochlorids werden in 40 cm3 Butanol suspendiert. Nach '/2stündigem Rühren werden die Kristalle abfiltnert, mit 10cm3 Butanol gewascher und bei 60 C unter vermindertem Druck (0,5 mm Hg) während 8 Stunden getrocknet. Man erhält 2,1 g reines Daunorubicin-hydrochlorid mit einer Ausbeute von 88%.
809 622/118

Claims (1)

  1. Patentanspruch:
    Verfahren zur Herstellung des Daunorubicin genannten Antibioticum: 13 057 R.P. durch Fermentation, dadurch gekennzeichnet, daß man einen neuen »Streptomyces bifurcus. Stamm DS 23 219 (NRRL 3539)« genannten Stamm verwendet.
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Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3998699A (en) * 1972-06-08 1976-12-21 Sankyo Company Limited Antibiotic substances B-41, their production and their use as insecticides and acaricides
FR2315941A2 (fr) * 1975-07-01 1977-01-28 Rhone Poulenc Ind Nouveau derive du naphtagene, sa preparation et les compositions qui le contiennent
US4039736A (en) * 1976-04-15 1977-08-02 Bristol-Myers Company Antibiotic compounds marcellomycin and musettamycin
JPS52148064A (en) 1976-05-31 1977-12-08 Microbial Chem Res Found Antitumors
US4192915A (en) 1976-08-16 1980-03-11 Bristol-Myers Company Anthracycline glycosides from streptomyces
NL176004C (nl) 1976-10-05 1985-02-01 Microbial Chem Res Found Werkwijze ter bereiding van geneesmiddelen met antitumorwerking op basis van anthracycline glycosiden en werkwijze ter bereiding van daartoe dienende anthracycline glycosiden.
US4209588A (en) 1976-10-05 1980-06-24 Zaidan Hojin Biseibutsu Kagaku Kenkyu Kai Process for producing new antitumor anthracycline antibiotics
US4248970A (en) 1978-05-30 1981-02-03 Bristol-Myers Company Antibiotic complex producing bacterial culture
JPS5648893A (en) * 1979-09-07 1981-05-02 Sanraku Inc Preparation of anthracycline glycoside
DE3120655C2 (de) * 1981-05-23 1983-12-29 INA Wälzlager Schaeffler KG, 8522 Herzogenaurach Geschlitzter Kolbenring und Verfahren zu seiner Herstellung
IT1155446B (it) * 1982-12-23 1987-01-28 Erba Farmitalia Procedimento per la purificazione di glucosidi antraciclinonici mediante adsobimento selettivo su resine
CN101798328B (zh) * 2010-03-20 2012-05-23 山东新时代药业有限公司 一种柔红霉素发酵液提取纯化工艺改进方法
CN103641868B (zh) * 2013-11-18 2015-12-09 宁夏泰瑞制药股份有限公司 一种利用柔红霉素发酵液生产盐酸柔红霉素的方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR1533151A (fr) * 1962-05-18 1968-07-19 Rhone Poulenc Sa Nouvel antibiotique et sa préparation

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Nichts Ermittelt. *

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Publication number Publication date
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IL33371A (en) 1972-12-29
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JPS5218279B1 (de) 1977-05-20
BR6914251D0 (pt) 1973-02-22
FI46079B (de) 1972-08-31
NO128618B (de) 1973-12-17
FI46079C (fi) 1972-12-11
US3875010A (en) 1975-04-01

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