DE2209067A1

DE2209067A1 - Neue Antibiotika, ihre Herstellung und die medizinischen Zusammensetzungen, die sie enthalten

Info

Publication number: DE2209067A1
Application number: DE19722209067
Authority: DE
Inventors: Denise Charenton Val-de-Marne; Florent Jean; Lunel Jean; Paris; Mancy geb. Courtillet (Frankreich)
Original assignee: Rhone Poulenc SA
Current assignee: Rhone Poulenc SA
Priority date: 1971-02-25
Filing date: 1972-02-25
Publication date: 1972-09-07
Also published as: DK130225C; US3857937A; BE779813A; CH532120A; FR2126108B1; HU164311B; FR2126108A1; DK130225B; CA976494A; NL7202021A; GB1314657A

Description

Neue Antibiotika, ihre Herstellung und die medizinischen Zusammensetzungen, die sie enthalten

Die vorliegende Erfindung betrifft zwei neue Antibiotika, die im folgenden mit den Nummern 23 671 RP und 23 672 RP bezeichnet werden, ihre Herstellung durch Züchtung eines im folgenden vollständiger identifizierten Streptomyces, der Streptomyces chryseus, DS 12 370 (NRRL 3892) genannt wird.

Die Antibiotika 23 671 RP und 23 672 RP besitzen eine oedeutende antimikrobiell Wirksamkeit, hauptsächlich gegen die Gram-positiven Keime, insbesondere gegen Staphylokokken, sowie gegen Mycobakterien, insbesondere gegen den Stamm von Tuberkelbazillus H 37 Rv. Außerdem besitzen sie den Vorteil, nur eine geringe Toxizität aufzuweisen.

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Physikalisch-chemische Eigenschaften:

Das Antibiotikum 23 671 RP ist durch die folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften gekennzeichnet:

Aussehen: weißes kristallines Pulver Elementaranalyse: Das Antibiotikum 23 671 RP besteht aus Kohlenstoff, Wasserstoff und Sauerstoff in den folgenden Mengenanteilen:

C = 58,45 - 58,6 %, H =8,6 - 8,7 %, 0 = 31,35 - 31,55 %

Löslichkeit: Das Antibiotikum 23 671 RP ist in Wasser bei 20⁰C praktisch unlöslich. Es ist in Alkoholen, Aceton, Äther, Dimethylformamid und chlorierten Lösungsmitteln löslich.

Schmelzpunkt (<ofler-Bank): I30 - 132°C

Drehyermögen:

[αJ_D = -71,5° + 1,5° (c = 1 % in Methanol)

UV-Spektrum: In methanolischer Lösung weist das Antibiotikum

23 07I RP ein Absorptionsmaximum bei 285 nm

(e] *_m = 1,04) und ein Minimum bei 252 nm (e] ^ « 0,67)

In Flg. 1 ist das UV-Spektrum von 23 67I RP in Lösung in Methanol bei einer Konzentration von 2 110/Ug/cm gezeigt.

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IR-Spektrum (die Bestimmung wurde an mit Kaliumbromid verpreßt em Produkt vorgenommen);

Dieses Spektrum ist in Fig. 2 gezeigt, in der als Abszisse einerseits die Wellenlängen in Mikron (oberer Maßstab) und andererseits die Wellenzahlen in em (unterer Maßstab) und als Ordinate die optischen Dichten aufgetragen sind«.

In der nachfolgenden Tabelle I sind die Hauptinfrarotabsorptionsbanden von 2j5 671 RP, ausgedrückt in Wellenzahlen (cm~ ), angegeben.

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Tabelle

	st	1325	Sch	905	m	SSt	= sehr stark
2980	st	1295	m	870	sch	St	= stark
2940	st	1260	Sch	Ö35	m	m	= mittel
2920	Sch	1235	m	805	sch	sch	= schwach
2890	m	1215	ssch	780	m	ssch	= sehr schwach
2840	sch	1162	SSt	745	ssch	Sch	= Schulter
1735	SSt	1115	st	725	ssch
1710	Sch	1095	Sch	700	sch
1630	m	IO8O	SSt	660	Sch
1455	st	1060	st	645	Sch
1412	m	1035	Sch	600	sch
1375	st	1000	st	500	sch
1350	m	985	Sch	455	m
13^5	Sch	965	m	420	sch
1330	m	920	m	395	sch

Chromatographische Wanderungen

DUnnschichtchromatographie eines Gemische von Kieselgel H und Aluminiumoxyd H (75 ·* 25 %) unter den folgenden Bedingungen:

Auftrag 100/Ug

Entwicklung mit reinem Äthylacetat in gesättigter Kammer (bei 22°C)

Nachweis durch Aufsprühen von konzentrierter Schwefelsäure,

Das 23 671 RP besitzt einen Rf-Wert von 0,26.

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Dünnschichtchromatographie mit Silioagel Merck P 25^ und Entwicklung mit dem System A'thy lace tat, Chloroform und Aceton (1:1:1 Volumina) und Nachweis unter den vorstehenden Bedingungen:

Das 23 671 RP weist einen Rf-Wert von 0,62 auf.

Das Antibiotikum 23 672 RP ist durch die folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften gekennzeichnet;

Aussehen: weißes kristallines Pulver.

Elementaranalyse: Das Antibiotikum 23 672 RP besteht aus Kohlenstoff, Wasserstoff und Sauerstoff in den folgenden

Mengenanteilen:

C =58,6 - 58,7 % H= 8,4 - 8,5 % Q = 32,6 - 32,8 %

Löslichkeit: Das Antibiotikum 23 672 RP ist in Wasser bei 20⁰C praktisch unlöslich, Es ist in. Alkoholen, Aceton, Äther, Dimethylformamid und den chlorierten Lösungsmitteln löslich.

Schmelzpunkt (Kofier-Bank)? 15J» - 155

⁰C

Drehvermögen;

[a]^⁴'⁵ =-71* + 1,5° (e = 1 % in Methanol)

UV-Spektrum; In methaneliseher¹ "/igung weist- das 23 672 RP ein Absorptionsmaximum bei 285 nm. (ßl ^ - 0,67) und ein Minimum bei. 254 bxü (El ^ = Ο,ϊο) auf_o In Fig. 3 ist das UV-Spektrun: von 2J> 6?£ KF In Lösung in

Methanol bei Konzentrationen, von 'tO_;6,, 106 und "i 155yUg/cm"

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IR-Spektrum (die Bestimmung wurde an mit Kaliumbromid verpreStern Produkt vorgenommen): Dieses Spektrum ist in Flg. gezeigt, in der als Abszisse einerseits die Wellenlängen in Mikron (oberer Maßstab) und andererseits die Wellenzahlen in cm~ (unterer Maßstab) und als Ordinate die optischen Dichten aufgetragen sind.

In der nachfolgenden Tabelle II sind die Hauptinfrarotabsorptionsbanden von 23 672 RP, ausgedrückt in Wellenzahlen (cm~ ), angegeben.

Tabelle II

3450	SSt	1240	m	895	sch	sst = sehr stark
3210	Sch	1210	sch	860	sch	st . = stark
2965	St	1185	Sch	83O	m	m = mittel
2921	St	1155	SSt	8OO	sch	sch = schwach
2890	Sch	1135	sch	in	m	ssch = sehr schwach
2870	sch	1-108	St	740	ssch	Sch = Schulter
2830	Sch	1090	Sch	715	ssch
2040	ssch	1075	m	692	sch
1740	SSt	1070	sch	655	Sch
1625	m	1055	SSt	635	Sch
1450	St	1025	Sch	595	m
1405	m	995	St	545	m
1375	St	975	Sch	490	m
1347	m	•955	m	450	m
1325	m	922	Sch	415	Sch
1255	sch	912	m

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Chromatographische Wänderungen:

Dünnschichtchromatographie mit einem Gemisch von Kieselgel H und Aluminiurnoxyd H (75 : 25 $) unter den gleichen Bedingungen wie bei dem Antibiotikum 23 67I RP: Das 23 672 RP weist einen Rf-Wert von 0,17 auf.

Dünnschichtchromatographie mit Silicagel Merck P 25^· und Entwicklung mit Äthylacetat: Das 23 072 RP besitzt einen Rf-Wert von 0,38. Bei Entwicklung mit dem System Äthylacetat, Chloroform und Aceton (1:1:1 Volumina) besitzt es einen Rf-Wert von 0,50.

Antibiotlsche Aktivität und Toxizität A - Bakteriostatische Aktivität in vitro Die bakteriostatische Wirksamkeit der Produkte 23 67I RP und 23 672 RP gegen eine bestimmte Anzahl von Keimen wurde nach einer der üblicherweise für diesen Zweck verwendeten Verdünnungsmethoden bestimmt. Für jeden Keim wurde die kleinste Konzentration an Substanz bestimmt, die unter definierten Bedingungen jede sichtbare Entwicklung in einer geeigneten Nährbouillcn verhindert. Die Ergebnisse der verschiedenen Bestimmungen sind in der nachfolgenden Tabelle zusammengestellt, in der die minimalen bakteriostatischen Konzentrationen in Mikrogramm Substanz je cnr Versuchsmedium ausgedrückt sind.

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Tabelle III·

Geprüfte Bakterienorganismen	Minimale bakteriostatische Konzentrationen ,ug/cm	23 672 RP
Staphylococcus aureus, Stamm Smith	23 671 RP	0,67
Staphylococcus aureus, Stamm 133 (Institut Pasteur)	0,70	1,2
Staphylococcus aureus, Stamm 209 P ■ ATCC 6538 P	0,90	0,54
Staphylococcus aureus, Stamm 209 P - ATCC 6538 P gegen Carbomycin resistent gemacht	0,38	>200
Staphylococcus aureus, Stamm 209 P - ATCC 6538 P gegen Erythromycin resistent ge macht	> 200	170
Staphylococcus aureus, Stamm 209 P - ATCC 6538 P gegen Spiramycin resistent gemacht	110	0,86
Staphylococcus aureus, Stamm 209 P - ATCC 6538 P gegen Pyostacin resistent gemacht	0,56	55
Sarcina lutea - ATCC 9341	48	0,07
Streptococcus faecalis - ATCC 9790	0,05	1,5
Streptococcus viridans (Institut Pasteur)	1,7	6,7
Streptococcus pyogenes haemolyticus (Stamm Dig 7, Institut Pasteur)	8,3	0,24
Diplococcus pneumoniae (Stamm TiI, Institut Pasteur)	0,19	1,1
Bacillus Subtilis - ATCC 6633	2,3	0,35
Bacillus cereus - ATCC 6030	0,15	0,10
Mycobacterium species - ATCC 6O7	0,05	0,42
Mycobacterium parasmegmatis (1 75 - Lausanne)	0,52	0,35
1,2

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Geprüfte Bakterienorganismen	B)	Minimale bakteriostatische Konzentrationen /Ug/cra^	RP	23 672 RP j
		23 671		>200
Escherichia coli - ATCC 96J7		>200		>200
Shigella dysenteriae - Shiga L (Institut Pasteur)		>200		>200
Salmonella paratyphi A (Lacasse, Institut Pasteur)		>200		>200
Salmonella schottmuelleri (paratyphi Pougenc (Institut Pasteur)		>200		>200
Proteus vulgaris	>200		>200 >200
Klebsiella pneumoniae - ATCC 10.031 Pseudomonas aeruginosa (Stamm Bass - Institut Pasteur)	>200 >200		>200
Brucella bronchiseptica (CN 38? - Wellcome Institut)	>200		>200
Pasteurella multocida (A 125 - Institut Pasteur)	>200		>30
Mycoplasma gallisepticum

Diese verschiedenen Bestimmungen zeigen., daß die Aktivität der Produkte 23 671 RP und 23 672 RF hauptsächlich bei Keimen auftritt, die die Färbung nach Gram annehmen. Außerdem ist ersichtlich, daß das 23 671 RP und das 23 672 RP in vitro eine gekreuzte Resistenz mit Carbomycin, Erythromycin, Pyostaein, jedoch nicht mit Spiramycin aufweisen.

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- ίο -

B - Antituberkulöse Wirksamkeit In vitro :

Die Aktivität von 23 t>71 RP und 23 672 RP gegen Mycobacterium tuberculosis H 37 Rv wurde in flüssigem Medium nach Dubos nach der Technik der aufeinanderfolgenden Verdünnungen bestimmt. Das Ei^gebnis dieser Bestimmung ist in der nachfolgenden Tabelle IV gezeigt.

Tabelle

I V

Produkt	ö71 672	RP RP	Hemm konzentra t i on	gegenüber H	37	Rv	(x)	/Ug/ml
23 23	0, 1,	6 (1,25) 25 (5 )

(x) Die erste Zahl gibt die Konzentration an, bei der die Hauptinhibierung der Kultur erhalten wird; die zweite Zahl (zwischen Klammern) gibt die Konzentration an, bei der die vollständige Inhibierung auftritt.

Das 23 671 RP ist doppelt so wirksam als das 23 672 RP.

Die Aktivität des 23 671 RP in vitro wurde gegenüber gegen verschiedene Antibiotika resistente Mycobakterien bestimmt, um eine eventuelle gekreuzte Resistenz zu zeigen. Trotz sehr geringer Unterschiede in der Aktivität von einem Stamm zum andern behält das 23 071 RP seine Aktivität gegen Stämme, die gegen Rifampicin, Streptomycin, Neomycin und Kanamycin hochgradig resistent sind, und gegenüber Stämmen, die gegen Viomycin und Griselimycin mäßig resistent sind, bei.

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C - Toxizität

Das 2j5 671 RP weist eine mäßige Toxizität auf, und das 23 672 RP ist praktisch atoxisch, wie die folgenden Ergebnisse zeigen. Die akute Toxizität wurde bei der Maus bei Verabreichung auf oralem Wege und auf subcutanem Wege bestimmt.

23 671 RP: DL_C

750 mg/kg s.o. 585 mg/kg p.o.

23 672 RP: DL₅₀ = atoxisch bei 25OO mg/kg s.c.

= atoxisch bei 25OO mg/kg p.o,

D - Antimikrobielle Wirksamkeit in vivo \ Die Aktivität der beiden Produkte bei der experimentellen

Infektion (auf intraperitonealern Weg) mit Staphylococcus ' der Maus wurde bei Verabreichung auf oralem Wege und auf

subcutanem Wege bestimmt.

Die DCp-₀ bei der Behandlung von Staphylokokkeninfektion sind in der nachfolgenden Tabelle V in mg/kg Körpergewicht angegeben.

Tabelle V

23 071 RP	p.o.	s.c.	235 672 RP	p.o.	s.c.
40	25	85	35

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E - Aktivität gegen Tuberkulose in vivo

Die Aktivität von 23 671 RP und 23 ü?2 RP in vivo wurde bei mit einem virulenten menschlichen Stamm infizierten Mäusen bestimmt.

Bei Dosen zwischen 100 und 200 mg/kg s.c. und zwischen 100
und 250 mg/kg p.o. verlängern die Antibiotika 23 67I RP und 2^ 672 RP das Leben der behandelten Tiere gegenüber demjenigen von Vergleichstieren signifikant.

Erzeugerorganismus

Der die Antibiotika 23 671 RP und 23 672 RP erzeugende Organismus ist ein Stamm von Streptomyces, der aus einer in Indien entnommenen Erdprobe isoliert wurde und der die Nummer DS 12 370 erhalten hat. Dieser Stamm wurde im Northern Regional Research Laboratory unter der Nummer NRRL 3892 hinterlegt und ist frei zugänglich. Dieser Organismus weist Charakteristiken auf, die nicht ermöglichen, ihn als eine bereits beschriebene Species zu identifizieren, und muß als eine neue Species angesehen werden, die die Bezeichnung Streptomyces chryseus erhalten hat.

Streptomyces chryseus, Stamm DS 12 370 bildet zylindrische Sporen mit Abmessungen von 0,3 bis 0,4 /u/0,8 bis 1,4 ,u. Die Sporenfäden sind gerade oder schwach gebogen und zumeist isoliert auf den Fäden, die sie tragen, angeordnet. Sie sind manchmal verhältnismäßig kurz, doch können sie eine beträchtlichere Länge haben, und bis zu mehreren zehn Sporen aufweisen. Durch seine Sporulationsart läßt sich dieser Stamm in die Sektion Rectus-Flexibilis der Klassifikation nach Pridham einordnen .

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Streptomyces chryseus, Stamm DS 12 370 entwickelt sich gut bei 25⁰C₁ ziemlich gut bei 37⁰C, weniger gut bei 45⁰C und nicht bei 50⁰C. Er erzeugt kein Meianinpigment auf organischen Medien. Die Färbung seines vegetativen Mycels ist ein beständiges Gelb, im allgemeinen in den heilehromgelben bis dunkeIchromgelben Tönen. Er bildet ein weißes, im allgemeinen ziemlich spärliches Luft-ausgesetztes Myeel. Dieses Luftausgesetzte Mycel bleibt während des Auftretens der Sporulation weiß, die sich nur langsam und schwierig auf den Medien entwickelt, auf denen sie auftritt.

Die Züchtungscharakteristiken und die biochemischen Eigenschaften von Streptomyces chryseus, Stamm DS 12 370 sind in der nachfolgenden Tabelle VI zusammengestellt. Es sind dies diejenigen von Kulturen, die ein gutes Entwicklungsstadium erreicht haben, das heißt Kulturen von 3 Wochen bis zu 1 Monat bei 25⁰C, falls es nicht anders angegeben ist. Diese Eigenschaften wurden auf Nähragar und Bouillons beobachtet, die üblicherweise zur Bestimmung der morphologischen Eigenschaften von Stämmen von Streptoaiyoes verwendet werden, wobei die Kulturen auf Agarmedien auf Schrägagar durchgeführt wurden. Eine gewisse Anzahl der verwendeten Züchtungsmedien wurden nach den Rezepturen hergestellt, die in "The Actinomyeetes", S.A. Waksman. Chronica Botanica Company, Waltham, Mass., USA, 1950, Seite 193 ~ 197* angegeben sind. In diesem Falle sind die Medien durch den Buchstaben W, dem die Nummer folgt, die ihnen in "The Actinomycetes" gegeben wurden, bezeichnet. Die Literaturstellen oder die Zusammensetzungen der anderen Züchtungsmedien sind die folgenden:

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Anm. A: "Hickey and Tresner's Agar", T.G. Prldham u. Mitarb., Antibiotics Annual, 1956 - 1957, S. 950

Anm. B: K.L. Jones, Journal of Bacteriology, 57, 142, 1949 Anm. C: Rezeptur W-23, versetzt mit 2 % Agar

Anm. D: "Yeast Extract Agar", T.G. Pridham u. Mitarb.,
Antibiotics Annual, 1956 - 1957, S. 950

Anm. E: "Tomato Paste Oatmeal Agar", T.G. Pridham u. Mitarb., Antibiotics Annual, 1956 - 1957, S. 950

Anm. P: "Melanin formation medium", The Actinomycetes, Bd. 2, S. yy$, No. 42, S.A. Waksman, The Williams and Wilkins Company, Baltimore, I96I

Anm. G: W.E. Grundy u. Mitarb. ,Antibiotics and Chem. 2_, 401, 1952

Anm. H: "inorganic Salts - Starch Agar", T.G. Pridham u. Mitarb., Antibiotics Annual, 1956 - 1957, S. 951

Anm. I: entspricht der Rezeptur W-1, wobei 3 % Saccharose durch 1,5 % Glucose ersetzt sind

Anm. J: entspricht der Rezeptur W-1, wobei 3 % Saccharose durch 1,5 % Glycerin ersetzt sind

Anm. K: entspricht der Rezeptur W-I8, wobei 3 % Saccharose durch 1,5 % Glucose ersetzt sind

Anm. L: entspricht der Rezeptur W-I8, wobei die Saccharose weggelassen und durch kleine Filterpapierstreifen
ersetzt ist, die teilweise in die Flüssigkeit eintauchen

Anm. M: "Manual of Methods for Pure Culture Study of Bacteria" der Society of American Bacteriologists, Geneva, N.Y.,

H₅₀ - 18.

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Anm. N: "Plain Gelatin", hergestellt nach den Angaben in "Manual of Methods for Pure Culture" Study of Bacteria" der Society of American Bacteriologists, Geneva, N.Y., H₅₀ - 18

Anm. P: Handelsübliches Magermilchpulver, nach den Angaben des Herstellers zubereitet

Anm. Q₁: Für die Untersuchung der Produktion von H₃S von H.D. Tresner und P. Danga, Journal of Bacteriology, 76, 239 - 244, 1958, angegebenes Medium.

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Tabelle VI

ro CD CD OO CO

Kulturmedium	Entwicklungs grad	vegetatives Mycel (v.M.) oder Unter seite der Kultur	Luft-ausgesetzter Teil (umfaßt Gesamt heit von Luft- ausgesetztem Mycel und Sporulation)	Lösliches Pigment	Beobachtungen und biochemi sche Eigen schaften
(D	(2)	O)	(²O	(5)	(6)
Agar nach Hickey und Tresner (Anm. A)	gut	dickes und ge faltetes v.M., dunkelchromgelb	weiß; sehr spärlich entwickelt	keines
Agar nach Bennett (Anm. B)	gut	dickes und ge faltetes v.M., dunkelchromgelb	weiß; sehr schwache Spuren	sehr schwach bräunlich gelb
Agar nach Emerson (Anm. C)	gut	dickes und ge faltetes v.M., dunkelchromgelb	weiß; sehr geringe Spuren	keines
Agar mit Hefeextrakt nach Pridham (Anm. D)	gut	dickes und ge faltetes v.M., dunkelchromgelb	keiner	keines
Agar mit Hafer und Tomate nach	gut	dickes und ge faltetes v.M., hellbraungelb	weiß; sehr spärlich entwickelt	keines
ΓL lUüdHI (Anm. E)
Grlucose- pepton- agar (W-b)	gut	gelbbraune Unterseite	weiß; ziemlich gut entwickelt	sehr schwach braungelb

σ\ ι

tv) fsj CD CD O CD

PO O CD

(D	(2)	b)	(4)	keiner	(5)	(6)
Nähragar (W-5)	mäßig	hellbraungelbes v.M.	weiß; mäßig ent wickelt	keines
Tyrosin- Hefeextrakt- agar zur Bildung von Melanin (Anm. P)	ziemlich gut	hellgelbe Unterseite	weiß; spärlich entwickelt	keines	Bildung von Melanin: negativ (nach den Angaben des Autors durchgeführte Ablesungen)
Agar mit Calcium- malat nach Krainsky (Anm. G)	sehr mäßig	hellbraun gelbe Unter seite	keiner	keines	Löslich- machung von Malat: positiv, ziemlich gut
Agar mit Ovalbumin (W-12).	sehr spärlich	schwach gelbliches v.M.; sehr spärlich entwickelt	keiner	keines
Glucose- asparagin- agar (W-2)	mittel	hellchromgelbes v.M.	weiß; in Form von Spuren	schwach bräun lich- gelb
Glycerin- asparagin- agar (w-3)	ziemlich gut	d unke1chromgelbe s v.M.	schwach bräun- lich- ' gelb

O CO O

(D	(2)	(3)	(4)·.	weiß;	(5)	(6)
Agar mit	gut	dickes und ge	sehr spärlich	keines	zylindrische
Stärke nach		faltetes v.M.,	entwickelt		Sporen mit
Pridham		dunkelchromgeIb			Abmessungen von
(Anm. H)					0,3 - 0,4/U / 0,8 - 1,4yu;
					gerade oder ge
					bogene Sporen
					fäden
					Hydrolyse von
					Stärke:
			weiß;		positiv
Stärke-Nitrst-	gut	dickes und ge	in Form von	keines	Hydrolyse von
Agar		faltetes v.M.,	Spuren		Stärke:
(W-10)		he1Igelbbraun;			positiv
		dunkelchrom-
		gelbe Unterseite	weiß;
Syntheti	gut	dickes und ge	sehr spärlich	schwach
scher Agar		faltetes v.M.,	entwickelt	braun
nach Czapek		hellchromgelb;		gelb
mit Saccha		dunkelchromgelbe
rose		Unterseite
(w-D			weiß;
Syntheti	ziemlich gut	heiIchromgelbe	sehr spärlich	schwach^
scher Agar		Unterseite	entwickelt	braungeit
nach Czapek
mit Glucose
(Anm. I)			weiß;
Syntheti	gut	dunkelchromgelbe	sehr mäßig	schwach	zylindrische
scher Agar		Unterseite	entwickelt	gelb	Sporen mit Ab
nach Czapek				braun	messungen von
mit Glycerin					0,3 - 0,4/U / *A R Λ Il f \* ι ·**
(Anm. J)					gerade δα^v*ge
				I	bogene Sporen-
	.1	- -	#	fäden

CD CO CD CD

ro CD CD 00 CO

(D	(2)	O)	(²O	(5)	(6)
Stärke - Nitrat- Bouillon (W-19)	ziemlich gut	dicker Schleier; gelbe Unterseite	weiß; sehr mäßige entwickelt .	keines	Produktion von Nitriten aus Nitraten: stark positiv
Bouillon naoh Czapek mit Saccha rose (W-18)	mittel	weißlicher Schleier	weiß; mäßig entwickelt	keines	Produktion von Nitriten aus Nitraten: stark positiv
Bouillon nach Czapek mit Glucose (Anm. K)	mittel	weißlicher Schleier:	weiß; sehr mäßig ■ entwickelt	keines	Produktion von Nitriten aus Nitraten: stark positiv
Bouillon nach Czapek mit Cellu lose (Anm. L)	keiner				keine Verwer tung von Cellulose
Nitratierte Nährbouillon (Anm. M)	ziemlich gut	ziemlich gut ent wickelter Schleier; gelbliche Unterseite	weiß; mäßig entwickelt	keines	Produktion von Nitriten aus Nitraten: stark positiv
Kultur auf Kartoffeln (W-27) .	sehr gut	sehr dickes und stark gefaltetes v.M., Chromgelb	weiß; in Form von Spüren	schwach bräun lich

ro ο to

CD CD

VD

ro CD CD OO CO

(D	(2)	(3)	(*)	(5)	(6)
Reine Gelatine mit 12 % (Anm. N)	gut	dicke zentrale Kolonie; hellgelbe Unterseite	weiß; mittelmäßig entwickelt	keines	gute Ver flüssigung von Gelatine
Magermilch a) bei 25⁰C (Anm. P)	gut	hellgelblicher Ring			Peptonisation mit anschlie ßender Ko agulation; wenig Ver änderung des pH-Werts
Magermilch b) bei 37⁰C	mäßig	schlecht ent wickelter gelber Ring			Koagulation mit anschließender Peptonisation; sehr schwaches Sauerwerden des pH-Werts
Agar nach Presner und Danga (Anm. Q)	gut	gelbes v.M.	weiß; spärlich entwickelt	sehr schwach bräun lich	Produktion von H₂S: negativ (nach den An gaben des Autors durch geführte Ab lesungen)

CD CD CD

ro

Streptomyces chryseus, Stamm DS 12 JfJO weist eine Gesamtheit von Eigenschaften auf, die mit keiner derjenigen der bereits beschriebenen Stämme genau übereinstimmt.

Unter den Species, deren Beschreibung in "Bergey^s Manual of Determinative Bacteriology" (7· Auflage, The Williams and Wilkins Company, Baltimore, I96I) sowie in "The Actinomycetes" (Bd. 2, S.A. Waksman, The Williams and Wilkins Company, Baltimore, 1901) gegeben ist, ist die Species, der er sich durch seine Eigenschaften am meisten nähert, in einem oder dem anderen dieser Werke Streptomyces achromogenes.

Wie S. chryseus, Stamm DS 12 370 produziert S. achromogenes ein braunes lösliches Pigment hauptsächlich auf synthetischen Medien und kein solches Pigment oder ein solches Pigment nur in sehr schwacher Weise auf den meisten organischen Medien. Er bildet gerade oder gebogene nicht spiralige Sporophoren, und seine Sporen sind zylindrisch.

S. achromogenes zeigt jedoch ein vegetatives Mycel, dessen Tönung je nach den Medien ungefärbt bis bräunlich oder braungelblich ist, wobei die Tönung selbst nach braunrötlich auf "Eimedien" geht. Diese Tönungen sind mit dem ausgeprägten Chromgelb nicht vergleichbar, das das vegetative Mycel von Streptomyces chryseus, Stamm DS 12 JfJO auf der Gesamtheit aller Medien, sowohl der synthetischen als auch der organischen, auf denen er gezüchtet wurde, färbt. Außerdem bildet S. achromogenes im Gegensatz zu S. chryseus, Stamm DS 12 JfJO auf "Glycerin-Nitrat-Agar" ein Luft-ausgesetztes Mycel, das eine dunkelgräuliche Färbung erreicht, produziert ein braunrötliches lösliches Pigment auf Kartoffeln und ein hellbraunes lösliches Pigment auf Gelatine und verflüssigt diese letztere nur sehr schwach. Dies ist der Grund, warum die beiden Stamme, obwohl sie sich in gewissen Punkten ähnlich sind, nicht als vergleichbar angesehen werden können.

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Die Fähigkeit von S. chryseus, Stamm DS 12 370, verschiedene Kohlenstoffquellen und Stickstoffquellen zur Gewährleistung seiner Entwicklung zu verwerten, wurde nach dem Prinzip der Methode nach Pridham und Gottlieb (J. of Ba'ct. 56, 107 - 114, 19^8) bestimmt. Der Entwicklungsgrad wurde auf dem von diesen Autoren angegebenen Grundmedium beobachtet, wobei die Glucose durch die verschiedenen jeweilig untersuchten Kohlenstoffquellen oder das (NH^)₂SOh durch die verschiedenen jeweils untersuchten Stickstoffquellen ersetzt wurde, und zwar nach einer geeigneten Inkubationszeit bei 25⁰C. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle angegeben.

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Tabelle VII

Geprüfte Kohlen stoffquellen	Verwertung	negativ	Geprüfte Stick st off quellen	Verwertung	negativ
J-Ribose	positiv		NaNCK	positiv
D-Xylose	positiv		NaNO₂	positiv
L-Arabinose			(NH^)₂SO₄	positiv	zögernd
L-Rhamnose	positiv		(NH^)₂HPO₄	positiv	negativ
b-Glucose	positiv		Adenosin	positiv
L D-Galactose	positiv	negativ	Uracil
D-Fructose	positiv	zögernd	Harnstoff	positiv
D-Mannose	positiv		L-Asparagin	positiv
L-Sorbose			Glykokoll	positiv,
Lactose	positiv,		Sarcosin		negativ
Maltose	positiv		DL-Alanin	positiv
Saccharose	positiv	negativ	DL-Valin	positiv
- Trehalose	positiv		DL-Asparaginsäure	positiv	zögernd
Cellobiose	positiv	negativ	L-Glutaminsäure	positiv	negativ
Raffinose			L-Arginin	positiv
Dextrin	positiv		L-Lysin
Inulin			DL-Serin	positiv	negativ
Stärke	positiv	negativ	DL-Threonin	positiv
Glykogen	positiv		DL-Methionin	positiv.
Glycerin	positiv	negativ	Taurin		negativ
Erythrlt			L-Tyrosin	positiv
Adonit	positiv		DL-Prolin	positiv
Dulcit			L -Hy d r oxy pr ο 1 in
D-Mannit	positiv	L-Histidin	positiv
D-Sorbit	positiv	L-Tryptophan	positiv
Inosit	positiv	Betain

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Verfahren zur Herstellung der Antibiotika 23 671 RP und 23 67g RP Das Verfahren zur Herstellung von 23 671 RP und 23 072 RP besteht im wesentlichen darin, Streptornyces chryseus, Stamm.
DS 12 370 oder seine Mutanten in einem geeigneten Medium und unter geeigneten Bedingungen zu züchten und die im Verlaufe der Züchtung gebildeten Produkte abzutrennen.

Die Züchtung von Streptomyces chryseus, Stamm DS 12 yjO kann nach jeder beliebigen aeroben Oberflächenzüchtungsmethode oder SubmerszUchtungsmethode erfolgen, doch ist die letztere aus Gründen der Bequemlichkeit zu bevorzugen. Man verwendet zu
diesem Zweck die verschiedenen Apparaturtypen, die jetzt
üblicherweise in der FermentetionsIndustrie verwendet werden.

Man kann insbesondere den folgenden Weg für die Durchführung der Arbeitsgänge einschlagen:

Streptomyces chryseus, DS 12 370 - Stammansatz

Kultur auf Agar

Kultur im Kolben unter Bewegung

Impfkultur im Fermenter

Produktionskultur im Fermenter

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Das Permentationsmedium soll im wesentlichen eine assimilierbare Kohlenstoffquelle und eine assimilierbare Stickstoffquelle, Mineralstoffe und gegebenenfalls Wachstumsfaktoren enthalten, wobei alle diese Bestandteile in Form von gut definierten Produkten oder von komplexen Gemischen, wie man sie in biologischen Produkten verschiedenen Ursprungs antrifft, zugeführt werden können.

Als assimilierbare Kohlenstoffquellen kann man Kohlehydrate, wie beispielsweise Glucose, Maltose, Dextrine, Stärke,oder andere Kohlehydratsubstanzen, wie beispielsweise Zuckeralkohole, z.B. Glycerin oder Mannit, oder wie gewisse organische Säuren, verwenden. Gewisse tierische oder pflanzliche öle, wie beispielsweise Schmalzöl oder Sojaöl, können mit Vorteil diese verschiedenen Kohlehydratqueilen ersetzen oder ihnen beigefügt werden.

Die geeigneten assimilierbaren Stickstoffquellen sind außerordentlich verschiedenartig. Sie können sehr einfache chemische Substanzen, wie beispielsweise anorganiscne oder organische Ammoniumsalze, Harnstoff und gewisse Aminosäuren, sein. Sie können auch in Form von komplexen Substanzen, die den Stickstoff hauptsächlich in protidischer Form enthalten, zugeführt werden, wie beispielsweise in Form von Casein, Lactalbumin, Gluten und deren Hydrolysate*!., Sojamehl, Arachismehl, Fischmehl, Fleischextrakten, Hefe extrakt en, Distillers' Solubles und Maisqueliwasser.

Unter den zugeführten mineralischen Stoffen können gewisse eine Pufferwirkung oder eine neutralisierend® Wirkung besitzen, wie beispielsweise die Alkali- oder Erdalkaliphosphate oder Calcium- und Magnesiumcarbonate

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Andere führen zu dem zur Entwicklung von Streptomyces chryseus, Stamm DS 12 370 und zur Erzeugung von 23 671 RP und 23. 672 RP erforderlichen Ionengleichgewicht, wie beispielsweise Alkali- und Erdalkalichloride und -sulfate. Schließlich wirken gewisse in spezieller Weise als Aktivatoren der Stoffwechselreäktionen von Streptomyces chryseus. Es sind dies die Zink-, Kobalt-, Eisen-, Kupfer- und Mangansalze.

Der pH-Wert des Fermentationsmediums sollte zu Beginn der Züchtung zwischen 6,0 und 7,8 und vorzugsweise zwischen 6,5 und 7,5 liegen. Die zur Fermentation optimale Temperatur beträgt 25 bis 30⁰C, doch wird auch eine zufriedenstellende Produktion bei Temperaturen zwischen 23 und 33°C erhalten. Die Belüftung der Züchtung kann zwischen ziemlich weiten Werten variieren. Es wurde jedoch gefunden, daß Belüftungen von 0,3 bis 3 Liter Luft je Liter Bouillon und je Minute besonders gut geeignet sind. Die maximale Ausbeute an 23 67I RP und 23 672 RP wird nach 2- bis 8-tägiger Züchtung erhalten, wobei diese Zeitspanne hauptsächlich von dem verwendeten Medium abhängt.

Das 23 671 RP und das 23 672 RP können aus den Fermentations maischen in verschiedener Weise isoliert werden:

Das Gemisch der beiden Antibiotika wird direkt aus den Fermentationsmaischen mit mit Wassern nicht mischbaren Lösungsmitteln, wie beispielsweise aliphatischen Alkoholen mit zumindest 4 Kohlenstoffatomen, wie Butanol, Estern, wie Äthylacetat, chlorierten Lösungsmitteln, wie Dichloräthan, Methylenchlorid oder Chloroform, und Ketonen, wie Methylisobutylketon, extrahiert. Es ist vorteilhaft, diesen Arbeitsgang bei pH 7 oder einem schwach alkalischen pH-Wert vorzunehmen.

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Nach Filtrieren und Dekantieren kann das rohe Gemisch aus den zuvor genannten organischen Lösungen durch Einengen der Lösung unter vermindertem Druck und anschließende Ausfällung mit einem Nichtlösungsmittel oder schlechten Lösungsmittel, wie beispielsweise Hexan, isoliert werden.

Die Trennung der Antibiotika 23 671 RP und 23 672 RP kann aus den organischen Extrakten der Fermentationsmaischen, gegebenenfalls nach Einengen dieser Extrakte, durch Anwendung geeigneter chromatographischer Techniken vorgenommen werden. Eine bequeme Arbeitsweise besteht darin, das aus der Extraktion der Maische stammende Gemisch durch Leiten über eine Kolonne von Florisil (Magnesiumsilicat) unter gradieller Elution mit Lösungsmitteln mit einem System auf der Basis von chlorierten Lösungsmitteln zu fraktionieren. Diese erste Fraktionierung, die durch chromatographische Analyse des Eluats durch Dünnschichtchromatographie an Kieselgel geleitet wird, führt zu zwei Fraktionen: Fraktion A, die an 23 67I RP angereichert ist und noch 23 672 RP enthält, und einer weiteren Fraktion B mit einem großen Mengenanteil an 23 672 RP, die noch 23 67I RP enthält.

Die Fraktion A wird ihrerseits durch Chromatographie an einer Silicagel- oder Aluminiumoxydsäule unter Elution mit einem System von Lösungsmitteln steigender Polaritäten fraktioniert. Ein geeignetes System ist beispielsweise ein Gemisch von Hexan und Äthylacetat, das fortschreitend an Äthylacetat angereichert ist, oder eine Reihe von reinen oder gemischten oder mit einem niedrigen Alkohol, wie beispielsweise Methanol, versetzten chlorierten Lösungsmitteln.Die Fraktionen, die das 23 67I RP enthalten, werden durch chromatographische DünnschichtanaIyse mittels Kieselgel festgestellt. Das 23 671 RP wird schließlich durch Umkristallisation aus einem Gemisch Äther-Hexan und anschließendes Waschen der Kristalle mit Isopropyläther gereinigt. 209837/1247

Die Fraktion B wird ebenfalls zur Isolierung des 23 672 RP durch erneute Führung durch eine Kolonne von Florisil unter Elution mit einer Reihe von Lösungsmitteln steigender Polarität auf der Basis von chlorierten Lösungsmitteln und A'thylacetat fraktioniert. Die fraktionierte Elution wird durch Analyse durch Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von Kieselgel verfolgt, und das isolierte 23 672 RP wird durch Umkristallisation aus einem Gemisch Äther-Hexan und anschließende Umkristallisation aus Tetrachlorkohlenstoff gereinigt.

Die folgenden Beispiele dienen zur weiteren Erläuterung der Erfindung. Im folgenden wird die Aktivität stets mittels mikrobiologischer Diffusionsmethode mit Staphylococcus aureus 209 P (ATCC 6538 P) als empfindlichem Keim und, bezogen auf eine halb gereinigte Probe von 23 671 RP, die als Eichmaß für die Bestimmung verwendet wird und einen Gehalt von 64O/Ug/mg aufweist, bestimmt.

Diese Aktivität wird in /Ug/mg für die Festsubstanzen ausgedrückt. Die Aktivität von 23 672 RP wird ebenfalls in /Ug/mg ausgedrückt. Hierbei wird berücksichtigt, daß bei der Methode durch Diffusion das 23 67I RP viermal so aktiv als das 23 672 RP gegenüber Staphylococcus aureus 209 P ist.

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- 29 Beispiel 1

In einen 170 Liter-Fermenter	600 g
teile ein:	600 g
Peρton	1200 g
Fleischextrakt	600 g
Dextrose	240 g
Natriumchlorid	ad 110 1
Agar
Leitungswasser

Der pH-Wert wird mit 14O cnr 1On-Natronlauge auf 7*50 eingestellt. Man sterilisiert das Medium durch Einleiten von Dampf von 122⁰C während 4o Minuten. Nach Abkühlen beträgt das Volumen der Bouillon 120 1 und der pH-Wert 6,90. Man beimpft mit 200 cnr einer gerührten bzw. geschüttelten Erlenrneyer-Kultur von Streptomyces chryseus, DS 12 370 (NRRL 3892). Die Kultur wird bei 30⁰C 26 Stunden lang unter Bewegung und unter Belüftung mit steriler Luft entwickelt. Sie ist dann zur Beimpfung der Produktionskultur geeignet.

Die Produktionskultur wird in einem 800 Liter-Fermenter durchgeführt, der mit den folgenden Substanzen beschickt ist: Distillers¹ Solubles 2 kg
Prinzeßbohnen 16 kg

Glycerin 4 kg

Natriumchlorid 2 kg

Leitungswasser ad 360 1

-7.

Der pH-Wert wird mit 400 cnr 10n-Natronlauge auf 8,25 eingestellt. Man sterilisiert das Medium durch Durchleiten von Dampf von 122⁰C während 40 Minuten. Nach Abkühlen setzt man zu der Bouillon 10 1 einer sterilen wässrigen Lösung mit einem Gehalt von 4 kg Dextrose zu.

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Das Gesamtvolumen der Bouillon beträgt dann 400 1 und der pH-Wert 6,90. Man beimpft mit 4o 1 der zuvor beschriebenen Impfkultur aus dem 170 Liter-Fermenter. Die Züchtung wird bei 28⁰C während 97 Stunden unter Bewegen mittels einer Turbine, die mit 260 U/min betrieben wird und unter Belüftung mit steriler Luft in einer Menge von 35 m /Stunde durchgeführt. Der pH-Wert beträgt dann 7,55 und das Volumen der Maische 370 l.Die vorhandene Antibiotikamenge beträgt 110/ug/cm .

Beispiel 2

10 1 der gemäß Beispiel 1 erhaltenen Maische mit einem Gehalt von 85 /Ug/cm werden in einen mit einem Rührer ausgestatteten Behälter eingebracht und mit 900 g Filterhilfe versetzt·. Das Rühren wird eine Viertelstunde bei pH 7*5 fortgesetzt.

Das Gemisch wird über ein Filter, das mit einem Bett von 2 kg Filterhilfe versehen ist, filtriert. Man gewinnt 10 1 Filtrat.

Dieses Filtrat wird aufeinanderfolgend mit 4 1 und 3 1 Butanol extrahiert, wobei das Gemisch mit einer 6n-Chlorwasserstofflösung auf pH 7 eingestellt wird.

Der Butylextrakt wird bei 30⁰C unter vermindertem Druck (20 mm Hg) bis auf ein Volumen von 100 cnr eingeengt.

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Durch Zugabe von 1 1 Hexan zu dem Rückstand wird ein rohes Gemisch von 23 671 RP und 23 672 RP ausgefällt, das gewaschen, abgesaugt und getrocknet wird. Das Gemisch wiegt 2,1 g und liegt in Form eines braunen amorphen Pulvers mit einem Gehalt von 36yug/mg vor.

Beispiel 3

380 1 gemäß Beispiel 1 erhaltene Maische mit einem Gehalt von 110/Ug/cnr werden in ein mit einem Rührer ausgestattetes Gefäß eingebracht, und der pH-Wert wird mittels einer ver-• dünnten Natriumhydroxydlösung auf 8 eingestellt. Das Rühren wird 1/2 Stunde fortgesetzt. Dann setzt man 30 kg Filterhilfe zu. Das Gemisch wird auf einer Filterpresse filtriert und der Filterkuchen mit 100 1 Wasser, das mit 6n-Natronlauge bis zu pH 8 alkalisch gemacht ist, gewaschen.

Das Filtrat, dessen Volumen 380 l beträgt, wird durch Zugabe einer 6η-SaIzsäurelösung auf pH 7 eingestellt, 10 Minuten gerührt und dann im Gegenstrom mittels einer 2_rstufigen Zentrifuge mit 230 1 Methylenchlorid extrahiert.

Der Methylenchloridextrakt wird unter vermindertem Druck (20 mm Hg) bei 30⁰C bis auf ein Volumen von 1 1 eingeengt.

Das Methylenchloridkonzentrat wird dann durch eine Säule von 1,5 kg Florisil (Durchmesser: 7*5 cm; Höhe: 65 cm) geleitet. Das Konzentrat durchströmt das Florisil von oben nach unten in 3 Stunden. Die Säule wird anschließend weiter von oben nach unten mit 15 1 Methylenchlorid in einer Menge von 1,5 1/ Stunde gewaschen. Die verschiedenen Abflußflüssigkeiten werden verworfen, und die Kolonne wird dann mittels eines Lösungsmittelgradienten durch fortschreitende Zugabe von 20 1 eines Methylenchlorid-Methanol-Gemischs (95 : 5 Volumina) zu 5 1 Methylenchlorid eluiert. Der Elutionsdurchsatz beträgt 1,5 l/Stunde. 209837/1 247

Das Eluat wird alle 500 cnr fraktioniert. Man erhält so 44 Fraktionen. Jede Fraktion wird durch Dünnschichtchromatographie durch Aufbringen von 20/Ul Lösung auf eine Dünnschicht aus Silicagel Merck F 254 in gesättigter Kammer (bei 22°C) und mit einem Lösungsmittelgemisch CHCl^-CH^OH (87 t 13 Volumina) analysiert. Die Wanderungen werden durch Aufsprühen von konzentrierter Schwefelsäure nachgewiesen. Die Rf-Werte sind die folgenden:

23 671 RP Rf= 0,55 2^ 072 RP Rf = 0,45·

Nach den Ergebnissen dieser Analyse sammelt man getrennt die Fraktionen, die hauptsächlich 23 67I RP enthalten, und diejenigen, die hauptsächlich 2} 672 RP enthalten, und engt die so erhaltenen beiden Lösungen bei 30⁰C unter vermindertem Druck (20 mm Hg) zur Trockne ein.

Man erhält so 30 g rohes 2J> 67I RP' in Form eines hellbeigen amorphen Pulvers mit einem Gehalt von 525 /Ug/mg und 7 g rohes 23 762 RP in Form eines hellbeigen amorphen Pulvers.

Beispiel 4

36 g gemäß Beispiel 3 hergestelltes rohes 23 67I RP mit einem Gehalt von 815/Ug/mg werden durch Rühren in I80 cm Aceton gelöst.

Die Acetonlösung wird mit 220 g Kieselgel Merck F 254 (0,05 bis 0,2 mm) versetzt. Dann wird das Ganze bei 45^eC unter vermindertem Druck (20 mm Hg) 4 Stunden getrocknet.

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Der Rückstand wird auf das obere Ende einer Säule von 2 kg Kieselgel Merck P 254 (0,05 - 0,2 mm), eingefüllt in Hexan, (Durchmesser 5 cm; Höhe 1 m) aufgebracht.

Die Kolonne wird nacheinander wie folgt gewaschen mit:

5 1 Hexan

8 1 Hexan-Äthylacetat-Gemisch (75 : 25 Volumina) ' 8 1 Hexan-Äthylacetat-Gemisch (50 : 50 Volumina)

6 1 Hexan-Äthylacetat-Gemisch (25 : 75 Volumina)

Die Abflußflüssigkeiten werden verworfen.

Die Säule wird dann mit 12 1 Äthylacetat eluiert. Das Eluat wird alle 100 cnr fraktioniert, und die Fraktionen werden durch Dünnschichtchromatographie nach der zuvor beschriebenen Technik analysiert.

Die das 23 67I RP enthaltenen Fraktionen werden bei

unter vermindertem Druck (20 mm Hg) zur Trockne eingeengt.

Man erhält so 20 g Antibiotikum 23 671 RP in Form eines gelblichen amorphen Pulvers mit einem Gehalt von praktisch 1000/Ug/mg.

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Beispiel 5

16,5 g des gemäß Beispiel 3 hergestellten rohen 23 67I RP mit einem Gehalt von 400 /Ug/mg werden unter Rühren in 250 cnr Methylenchlorid gelöst. Man setzt 250 cm Isopropyläther zu dieser Methylenchloridlösung zu. Das erhaltene Gemisch wird dann über einem Faltenfilter geklärt und dann durch eine Säule von 400 g auf pH 4 angesäuertem Aluminiumoxyd geleitet (Durchmesser: 4 cm; Höhe: 33 cm).

Man entwickelt die Säule durch aufeinanderfolgendes Durchleiten in der folgenden Reihenfolge:

1.) 1 1 Methylenchlorid-Isopropyläther-Gemisch (1 : 1 Volumina)

2.) 1 1 reines Methylenchlorid

3.) 11 Methylenchlorid-Chloroform-Gemisch (1:1 Volumina)

4.) 11 reines Chloroform

5«) 1 1 Chloroform-Methanol (9 : 1 Volumina)

Man erhält so 5 Fraktionen F 1, F 2, F 3, F 4 und F 5, die durch DUnnschichtchromatographie nach der ζμνοΓ beschriebenen Technik geprüft werden.

Die Fraktion F 1 ist ohne Interesse und wird verworfen.

Die Fraktionen F 2 und F 3 werden vereinigt und bei 30⁰C unter vermindertem Druck (20 mm Hg) zur Trockne eingeengt. Man erhält so 8,3 g Antibiotikum 23 671 RP in Form eines weißlichen amorphen Pulvers mit einem Gehalt von 1000yUg/mg.

Die Fraktionen F 4 und F 5 werden vereinigt und dann wie zuvor zur Trockne eingeengt. Man erhält so 7,2 g Antibiotikum 23 672 RP in Form eines weißlichen amorphen Pulvers mit einem Gehalt von 860 yug/mg an 23 672 RP.

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Beispiel 6

20 g Antibiotikum 23 671 RP, hergestellt gemäß Beispiel 5, werden unter Rühren in 400 cnr Äthyläther gelöst. Die erhaltene Lösung wird durch Filtrieren über ein Faltenfilter geklärt.

Man setzt langsam und unter Rühren 16OO cnr Hexan zu. Das erhaltene Gemisch wird 2 Stunden bei 4⁰C stehengelassen. Es scheiden sich Kristalle ab, die abfiltriert, gewaschen und getrocknet werden. Man erhält so 18 g Antibiotikum 23 671 RP in Form eines weißen kristallinen Pulvers.

Beispiel 7

25 g kristallisiertes Antibiotikum 23 671 RP, hergestellt gemäß Beispiel 6 werden in 515 cnr Isopropyläther unter kräftigem Rühren, das 2 Stunden aufrechterhalten wird, suspendiert.

Die Suspension wird anschließend über ein Glasfrittenfilter filtriert. Das erhaltene Produkt wird gewaschen und unter vermindertem Druck (5 mm Hg) bei 50⁰C 24 Stunden getrocknet.

Man erhält so 20,2 g Antibiotium 23 67I RP in Form eines weißen kristallinen Pulvers mit einem Gehalt von 1000 /Ug/mg.

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Beispiel 8

13 g rohes 23 6'J 2 RP, hergestellt nach der in Beispiel 3 angegebenen Weine, werden in 1300 crn Aceton gelöst. Die
Acetonlösung wird durch Zugabe von J, 1 g Aktivkohle 2 S
entfärbt.

Die so entfärbte Acetonlösung wird bei 30⁰C unter vermindertem Druck (20 mm Hg) zur Trockne eingeengt.

Der Rückstand wird in 50 cm Benzol wieder in Lösung gebracht und auf das obere Ende einer Säule von 500 g Florisil aufgebracht (Durchmesser: 1,5 cm; Höhe: 55 cm).

Die Säule wird nacheinander mit den folgenden Mitteln gewaschen :

2 1 Benzol

3 1 Methylenchlorid

2 1 Methylenchlorid-Äthylacetat-Gemisch (95 : 5 Volumina)

2 1 Methylenchlorid-Äthylacetat-Gemisch (90 : 10 Volumina)

2 1 Methylenchlorid-Äthylacetat-Gemisch (80 : 20 Volumina)

5 1 Methylenchlorid-Äthylacetat-Gemisch (50 : 50 Volumina) 2 1 Äthylacetat

Man erhält so mehrere Fraktionen, die durch Dünnschicht Chromatographie nach der zuvor angegebenen Technik analysiert werden.

Die an 23 672 RP reichen Fraktionen werden vereinigt und dann bei 30⁰C unter vermindertem Druck (20 mm Hg) zur Trockne eingeengt.

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Man erhält so 4 g halb gereinigtes 23 672 RP in Form eines weißlichen amorphen Pulvers."

Beispiel 9

4 g gemäß Beispiel 8 hergestelltes 23 ü72 RP werden in 80 cm-⁵ Diäthyläther gelöst. Die Kristallisation wird durch langsame Zugabe von 120 cnr Hexan bewirkt.

Man erhält so 2,5 S weiße Kristalle mit einem Gehalt von 1000/Ug/mg.

Beispiel 10

8 g gemäß Beispiel 9 hergestelltes kristallisiertes Antibiotikum 2^ 672 RP werden in 800 cnr Tetrachlorkohlenstoff unter kräftigem Rühren, das 2 Stunden aufrechterhalten wird, suspendiert.

Die erhaltene Suspension wird über ein Glasfrittenfilter filtriert. Die Kristalle werden mit 50 cm Tetrachlorkohlenstoff gewaschen und dann 2 Stunden bei 4o°C unter vermindertem Druck (5 mm Hg) getrocknet.

Das trockene Produkt wird erneut in I50 cm Tetrachlorkohlenstoff suspendiert, und das Gemisch wird 1 Stunde unter Rückfluß erhitzt. Die erhaltene Lösung wird langsam gerührt und 15 Stunden bei 20⁰C und dann 24 Stunden bei O⁰C gekühlt. Es bilden sich Kristalle, die abfiltriert, gewaschen und 15 Stunden bei 45⁰C unter vermindertem Druck (5 mm Hg) getrocknet werden.

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Man erhält so 4,2 g Antibiotikum 23 672 RP in Form eines weißen kristallinen Pulvers mit einem Gehalt von 1000/Ug/mg.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch die medizinischen Zusammensetzungen, die zumindest eines der erfindungsgemäßen Produkte zusammen mit jedem anderen verträglichen Produkt, das inert oder selbst physiologisch wirksam sein kann, enthalten.

Diese Zusammensetzungen können in jeder geeigneten pharmazeutischen Form zur Verabreichung auf dem vorgesehenen Wege vorliegen.

Der Mengenanteil des oder der wirksamen Produkte in diesen Zusammensetzungen kann nach dem gewünschten therapeutischen Effekt variieren.

In der Humantherapie sind die neuen erfindungsgemäßen Produkte insbesondere bei Staphylokokkeninfektionen und tuberkulösen Affektionen wirksam. Sie können auf oralem, rektalem oder parenteralem Wege verabreicht werden, wobei der orale Verabreichungsweg der bevorzugte Verabreichungsweg bleibt. Die täglichen Dosen betragen 250 mg bis 3 g für einen Erwachsenen.

Als feste Zusammensetzungen zur Verabreichung auf oralem Wege können Tabletten, Pillen, Pulver oder Granulate verwendet werden. Diese Zusammensetzungen können 0,5 bis 95 % an erfindungsgemäßer Wirksubstanz, gemischt mit einem oder mehreren inerten Verdünnungsmitteln, wie beispielsweise Saccharose, Lactose oder Stärke, enthalten. Diese Zusammensetzungen können auch andere Substanzen als die Verdünnungsmittel, wie beispielsweise ein Gleitmittel, z.B. Magnesiumstearat, enthalten.

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Als flüssige Zusammensetzungen zur oralen Verabreichung kann man pharmazeutisch verwendbare Emulsionen, Lösungen, Suspensionen, Sirupe und Elixiere verwenden, die inerte Verdünnungsmittel, wie beispielsweise Wasser oder Paraffinöl enthalten. Diese Zusammensetzungen können auch andere Substanzen als die Verdünnungsmittel, wie beispielsweise Netzmittel, Süßstoffe, geschmacksverbessernde Mittel oder Aromastoffe, enthalten.

Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen zur parenteralen Verabreichung können sterile nicht-wässrige Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen sein. Als Lösungsmittel oder Träger kann man Propylenglykol, Polyäthylenglykol, pflanzliche öle, insbesondere Olivenöl, und injizierbare organische Ester, wie beispielsweise A'thyloleat, verwenden. Diese Zusammensetzungen können auch Adjuvantien, insbesondere Netzmittel, Emulgiermittel und Dispergiermittel, enthalten. Die Sterilisation kann auf verschiedenen Wegen vorgenommen werden, beispielsweise mittels eines bakteriologischen Filters, durch Einbringen von sterilisierenden Mitteln in die Zusammensetzung, durch Bestrahlung oder durch Erhitzen. Sie können auch in Form von sterilen festen Zusammensetzungen hergestellt werden, die zum Zeitpunkt des Gebrauchs in sterilem Wasser oder jedem anderen injizierbaren sterilen Medium gelöst oder dispergiert werden können.

Die Zusammensetzungen zur rektalen Verabreichung sind Suppositorien, die außer dem wirksamen Produkt Excipientien, wie beispielsweise Kakaobutter oder Suppowachs, enthalten können,

Das folgende Beispiel erläutert eine erfindungsgemäße Zusammensetzung.

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- 4ο -

Beispiel 11

Man stellt nach der üblichen Technik Tabletten mit einer Dosis von 100 mg 2J> 671 RP der folgenden Zusammensetzung her:

23 671 RP 0,100 g

Getreidestärke 0,090 g

kolloidale Kieselsäure 0,008 g

Magnesiumstearat 0,002 g

Diese Tabletten können in der Humantherapie in einer Menge von 3 bis 20 Tabletten je Tag für einen Erwachsenen verwendet werden.

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Claims

Patentansprüche

< jieichnet, daß das Antibiotikum 2j5 67I RP in Form eines kristallinen weißen Pulvers vom P = I30 bis I32⁰C vorliegt, in Wasser unlöslich ist, in Alkoholen, Aceton, Äther, Dimethylformamid und chlorierten Lösungsmitteln löslich ist, aus Kohlenstoff, Wasserstoff und Sauerstoff in den Mengenanteilen C = 58,45 bis 58,6 %, H = 8,6 bis 8,7 %, O = 31,35 bis 31,55 % besteht, im UV in methanolischer Lösung bei 285 nm absorbiert und ein spezifisches Drehvermögen von [a.]^ '^ _ -71,5° + 1,5° (_G = 1 % in Methanol) aufweist und daß das Antibiotikum 23 672 RP in Form eines weißen kristallinen Pulvers vom F = 153 °is 155°C vorliegt, in Wasser unlöslich ist, in Alkoholen, Aceton, Ä'ther, Dimethylformamid und chlorierten Lösungsmitteln löslich ist, aus Kohlenstoff, Wasserstoff und Sauerstoff in den Mengenanteilen C = 58,6 bis 58,7 %, H = 8,4 bis 8,5 %, 0 = 32,6 bis 32,8 % besteht, im UV in methanolischer Lösung bei 285 nm absorbiert und ein spezifisches Drehvermögen von [α]_β ^>0 = -71° + 1,5° (c = 1 % in Methanol) aufweist.
2. Verfahren zur Herstellung der Produkte nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man aerob Streptomyces chryseus, DS 12 370 (NRRL 3892) oder seine Mutanten in einem geeigneten üblichen Medium und unter üblichen Bedingungen für diese Art der Züchtung züchtet und dann die im Verlaufe der Züchtung gebildeten Antibiotika abtrennt und reinigt.

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J5. Pharmazeutische Zusammensetzungen, die in der Humanmedizin verwendbar sind, gekennzeichnet durch einen Gehalt von 0,5 bis 95 Gew.-^ an zumindest einem Produkt nach Anspruch 1 als Wirksubstanz, zusammen mit jedem beliebigen anderen verträglichen selbst inerten oder physiologisch· wirksamen Produkt .

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