DE2537902A1

DE2537902A1 - Neue rifamycine

Info

Publication number: DE2537902A1
Application number: DE19752537902
Authority: DE
Inventors: Piero Antonini; Giancarlo Lancini; Richard White
Original assignee: Lepetit SpA
Current assignee: Gruppo Lepetit SpA
Priority date: 1974-08-30
Filing date: 1975-08-26
Publication date: 1976-03-18
Also published as: SU578014A3; NL162429C; DK137866C; NO142446B; LU73270A1; AU8392675A; CS188235B2; JPS5151590A; NZ178519A; IL47897A; IE42605L; JPS5910798B2; YU39744B; NL162429B; IN140843B; US4263404A; DK379075A; SE7509571L; DK137866B; ES440560A1

Description

Unsere Nr. 20 094

G-ruppo Lepetit. S.p.Ä Mailand / Italien

Neue Rifamycine

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Rifamycin-Verbindungen, die durch Fermentation von Mutations stammen von Streptomyces
mediterranei in wässrigem Nährmedium unter aeroben Bedingungen produziert werden. Diese neuen Rifamycine werden in. vorliegender Beschreibung als Rifamycin P, Rifamycin Q, Rifamycin R und Rifamycin U bezeichnet.

Kürzlich wurde berichtet, daß ütreptomyces mediterranei während

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der j?ermentation in normalem >»achstumsmedium. eine Gruppe von Antibiotika erzeugt, die gemeinsam als Rifamycin-Komplex bezeichnet werden (P. Sensi et al., Antibiotics Annual 1959 1960, 3. 262). Anschließende Arbeiten ergaben, daß bei Zusatz von Natriumdiäthylbarbiturat zum Kulturmedium im wesentlichen ein einziges iPermentationsprodukt entsteht, nämlich Rifamycin B (Margalith P. und Pagani H., Applied Microbiology, j}, 325, 1961). Ferner wurde ein Mutationsstamm von Streptomyces me= diterranei gefunden, der im wesentlichen nur Rifamycin B erzeugt, unabhängig von An- oder Abwesenheit von ÜTatriumdiäthyl= barbiturat im i'ermentationsmedium, so daß ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von Rifamycin B resultierte. Der Rifa= mycin B produzierende Stamm wurde als Streptomyces mediterranei Ai¹GC 21789 bezeichnet (vergleiche US-PS 3 871 965).

Die den Gegenstand vorliegender Erfindung bildenden neuen Antibiotika werden durch Mutationsstämme von Streptomyces medi= terranei A¹TCG 13685 erzeugt.

Die neuen Stämme werden erhalten, wenn man einen Stamm von AiDCC 13685 mit üblichen chemischen Mutagenen wie salpetriger Säure oder Nitrosoguanidinderivaten oder physikalischen Mutagenen wie Röntgen- oder UV-Strahlung behandelt. Die neuen Mutationsstämme sind in Übereinstimmung mit den Vorschlägen von J.E. Thiemann et al., Arch. Mikrobiol., βχ, 147-155 (1969) eher der Gattung Nocardiow als der Gattung Streptomyces medi— terranei zuzuordnen.

Isolierung der neue Rifamycine produzierenden mutierten Stämme.

Eine Sporensuspension von Streptomyces mecTterranei ATCC 13685 wird mit N-Methyl-N'-nitro-N—nitrosoguanidin in einer Menge von 1 mg/ml in einem Iris(hydroxymethyl)aminomethan-puff er vom pH 9,0 60 Minuten lang bei 23⁰G behandelt. Die mit Mutagen be-

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handelten Sporen v/erden dann gewaschen und auf Petrischalen, die Bennett-Ägar enthalten, ausgebreitet. Nach 14-tägiger Inkubation bei 23 C werden die überlebenden Kolonien herausgenommen und auf ihre .Fähigkeit zur Inhibierung des Wachstums von Bacillus subtilis in folgender weise untersucht: Eine Agar-Scheibe (Durchmesser 4 bis S mm), welche eine einzige Kolonie trägt, wird auf eine Petrischale übertragen, die Penassay-Agar bei pH 7,2 enthält und vorgängig in 2°ß> iger Konzentration (Volumen/Volumen) mit Bacillus subtilis angeirapft worden ist.

Unter diesen Bedingungen ist Rifamycin B praktisch unwirksam und eine normale, Rifamycin B produzierende Kolonie verursacht keine Inhibierung des Wachstums von Bacillus subtilis auf der Agar-Unterschicht; jede, ein neues Rifamycin mit antimikrobieller Wirkung erzeugende Kolonie hingegen verursacht eine klargeschnittene Zone der Wachstumsinhibierung um die Agar-Scheibe. Auf diese Vveise wurden 3 Stämme isoliert, denen ursprünglich die internen Bezeichnungen D-2, 151/118-6 und M-36 gegeben wurden. Proben dieser Mikroorganismen wurden bei der American Type Culture Collection deponiert und sind dort unter den Bezeichnungen Nocardia mediterranea ATCC 31064, Nocardia medi= terranea ATCC 31065 und Nocardia mediterranea ATCC 31066 registriert.

Die folgende Tabelle 1 berichtet über die makroskopische und mikroskopische Untersuchung der Nocardia mediteranea-Stämme ATCC Nr. 31064, 31065 und 31066. Tabelle 2 berichtet über die Kultureigenschaften dieser Stämme. Auch die Eigenschaften des Ausgangsstamms Streptomyces mediterranei ATCC 13685 (ME/83) werden wiedergegeben:

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TABELLE. 1

N.mediterranea ATCC 31064 CD-2)

Kolonien

Luf tinycel

Kolonien konisch-kraterförmig gräulich bis rosa, und ringeiförmig, 2-3 mm Durch- verzweigt, 0,6-0,8 messer, röti.-braun mit ocker- 13m Durchmesser gelbem löslichem Pigment *

Sporen

zylindrisch (0,8-1umx3,0-5,0ia)

N.Mediterranea ATCC 31065 (MM18-6)

N.mediterranea JC 31066

^ (M-36) ο

o» Streptomycea medi- «> terranei ATCC 13685

ME/83

Kolonien konisch-kraterförmig rosa bis hell orange und ringeiförmig, 2-3 mm Durch- verzweigt, 0,6-0,8 messer, tief orange mit tief um Durchmesser orange-gelbem löslichem Pigment'

Kolonien konisch-kraterförmig rosa bis rosa-orange, und ringeiförmig, 2-3 min Durch- verzweigt, 0,6-0,8 messer, orange-braun mit bern- pm Durchmesser steinfarbenem löslichem Pigment

zylindrisch (

Kolonien konisch-kraterförmig rosa, verzweigt, und ringeiförmig, 2,3 mm Durch- 0,6-0,8 jam Durchmesser, orange-gelb mit hell messer bernsteinfarbenem löslichem
Pigment

zylindrisch

(ο,8-1umx3,0-5,

zylindrisch (

O K)

TABJSLLiS H

Medium

N.mediterranea ATGC 31064

(D-2)

N.mediterranea ATOC 31065

J(MM 18-6)

N.mediterranea
ATCC 31066

(M-36)

Streptomyces me= diterranei

ATCC 13635
(ME/83)

Hafermehl-Agar

Hefeextrakt-Glucose-Agar
(Medium Nr.2,
Whirling und
Gottlieb)

Bmerson's
Glucose-Agar

Üppiges Wachstum mit etwas runzeliger Oberfläche, haselbraun mit orangefarbenen Kanten; rosa-beiges lösliches Pigment.

Üppiges Wachstum mit sehr runzeliger Oberfläche, bernsteinfarben; gräuliches Luftmycel, tief-rostfarbenes lösliches Pigment.

Üppiges 'Wachstum mit sehr runzeliger und krustiger Oberfläche, backsteinrot; bernsteinfarbenes lösliches Pigment.

Üppiges Wachstum mit glatter Oberfläche, orange, Spuren von rosafarbenem Luftmycel, einige Sporen; rosa-beiges lösliches Pigment.

Üppiges Wachstum mit sehr runzeliger Oberfläche, backsteinrot; tief-rostfarbenes lösliches Pigment.

Üppiges Wachstum mit ■sehr runzeliger und krustiger Oberfläche, backsteinrot; bernsteinfarbenes lösliches Pigment.

Üppiges Wachstum mit
glatter Oberfläche,
tief bernsteinfarben;
ijpuren von rosa Luftmycel; dunkel bernsteinfarbenes lösliches Pigment.

Mittleres Wachstum mit glatter Oberfläche, gelblich mit rosa Unterseite. Weibliches Luftmycel
mit rosa Tönung; Spuren von gelblichem löslichem Pigment.

Üppiges Wachstum mit Üppiges v/a das tv m runzeliger Oberfläche;mit rauher Obervegetatives Mycel, fläche, gelblich dunkel-bernsteinfar- bis rosa; wenig ben. Dunkel-bernstein-Luftmycel.
farbenes lösliches
Pigment.

Üppiges Wachstum mit Üppiges Wachstum runzeliger Oberfläche,mit rauher Oberdunkel-bernsteinfar- fläche, gelblich ben; dunkel-bernstein-bis rosa-orange; farbenes lösliches rosa Luftmycel, Pigment. blaß bernstein-

farbenes i
ches Pigment

Medium

N.mediterranea
ATGC 31064

CD-2)

N.mediterranea ATGG 31065

(MM 18-6) N.mediterranea
ATCG 31066

(M-36

Streptomyce medi=

terranei

ATGG 13635

(MS/83)

Bennett 's
Agar

	Penassay-
	Agar
O
CO
GO
t\>	Hefeextrakt-
O	Melasse-Agar
to
σ>
co

Ozapek-Dox-Saccharose-

Agar

üppiges Wachstum,
sehr runzelig, rötlich-braun; Spuren
von gräulichem Luftmycel, ockergelbes
lösliches Pigment.

Mäßiges Wachstum, etwas runzlig, hell
orange; kein lösliches Pigment.

Üppiges Wachstum mit sehr runzeliger Oberfläche, tief orange; tief gelbes lösliches Pigment.

MäfSiges Wachstum, etwas runzlig, hell orange; kein lösliches Pigment.

Üppiges Wachstum, sehr Üppiges Wachstum mit runzlig, backsteinrot, sehr runzliger Ober-Tief rostfarbenes lös- fläche, backsteinrot; liches Pigment. tief rostfarbenes

lösliches Pigment.

Mäßiges Wachstum mit Gutes wachstum mit glatter und danner glatter Oberfläche, Oberfläche, hell orange; hell orangeorange ;. blaßroaa Luft- farbenes Luftmycel. mycel, einige Sporen,
tief zitronengelbes
lösliches Pigment.

Üppiges Wachstum mit Gutes Wachstum, runzeliger Oberflä- gelblich nach ehe, orange-braun; orange-gelb gehend; bernsteinfarbenes lös- rosa Luftmycel, liches Pigment hell bernsteinfarbenes lösliches Pigment.

Mäßiges Wachstum mit
glatter und dünner
Oberfläche, hell
orange; kein lösliches Pigment.

Üppiges Wachstum mit
krustiger Oberfläche,
dunkel bernsteinfarben; dunkel-bernsteinfarbenes lösliches
Pigment.

Üppiges Wachstum mit
glatter Oberfläche,
lachsfarben·, üppiges
Luftmycel rosa-orange;
Spuren eines hellgelben löslichen Pigments

Schlechtes Wachs.-tum.

Üppiges wachstum mit rauher Oberfläche, farblob hii gelblich; weißliches Luftmycel, ⁽ tief bernsteinfarbenes lösliches Pigment.

Schlechtes »vachstui mit dünner Ober- .[ fläche, farblos bii hell melonenfarbig Spuren eines, rosaweißen Luftmycels.

Medium

N-mediterranea
ATOC 31064

(D-2)

N.mediterranea ATGC 31Q65

(MM-13-6) N.mediterranea
ATCC 31066

(M-36)

Streptomyce medi= terranei
ATCC 13635
(ME/83)

Kartoffel-A.gar

Glucose-

Asparagin-Agar

Glycerin-Asparagin-Agar(Medium
Nr.5 Shirling und
Gottlieb)

Nähr-Agar

Spärliches Wachstum,
hell orange; hell
haaelbraunes lösliches Pigment.

Üppiges Wachstum mit
glatter Oberfläche,
orange; hellgelbes
lösliches Pigment.

Üppiges Wachstum mit
glatter Oberfläche,
tief orange; Spuren
eines gelblichen löslichen Pigments.

Kein Wachstum.

Spärliches Wachstum mit glatter Überfläche, hell orange; kein lösliches Pigment .

Spärliches Wachstum, tief orange; kein lösliches Pigment.

Mäßiges Wachstum mit Mäßiges Wachstum mit dünner und glatter runzliger und dünner Oberfläche, blaßorange;Oberfläche, blaßkein lösliches Pig- orange; kein lösliment. ches Pigment.

Mäßiges Wachstum mit
glatter Oberfläche,
hell orange; kein
lösliches Pigment.

Mittleres Wachstum,
goldfarben; kein
lösliches Pigment.

Mäßiges Wachstum mit
schwach gerunzelter
Oberfläche, tief
orange; Spuren eines
gelben löslichen
Pigments.

Mittleres Wachstum mit
dünner und glatter
Oberfläche, orange;
kein lösliches Pigment

Schlechtes wadstum mit dünner Oberfläche, farblos; Spuren eines weißlichen Luftmycels, kein lösliches Pigment.

Mittleres Wachstum mit glatter und dünner Oberfläche, hell orange/rosa; etwas hellgelbes lösliches Pigment.

Mittleres Wachstum mit glatter und dün-% ner Oberfläche, hell orange/rosa ^ etwa hellgelbes löbliches Pigment.

Mäßiges Wachstum mit glatter Oberfläche* melonenfarben bis orange; rosa/weißes Luftmycel.

ζ ο 6 Z, έ ς 2

Medium

N~mediterranea
ATCC 31064

(D~2)

N.mediterranea ATOC 31065

(MM 18-6) N.mediterranea
AT 31066

(M-36)

Streptomyce mediterranei ATCC 13685 (ME/83)

Pridham's-Agar ·.

Mäßiges wachstum mit glatter und dünner \ Oberfläche, bernsteinfarben; hell
rosa/oranges Luftmycel; rosafarbenes
lösliches Pigment.

Üppiges Wachstum mit glatter Oberfläche, backsteinrot; rosa Luftmycel, gelbes lösliches Pigment.

gy Stärke-Agar Mäßiges Wachstum mit ο (Medium Nr. glatter Oberfläche, cd 4· Shirling orange; üppiges rosa oo und Gottlieb)Luftmycel, üppige
-* Sporenproduktion; gel-

^ bes lösliches Pigment;

StärkehydroIyse negativ.

«ο Dextrose-Trip-üppiges wachstum mit ton-Agar runzliger Überfläche, melonenfarbig; orangf . melonenfarbiges lösliches Pigment.

Mäßiges wachstum mit glatter Überfläche, tief orange; Spuren eines strohfarbenen löslichen Pigments; Stärkehydrolyse negativ.

Mäßiges Wachstum, gerunzelt, orange; orange/gelbes lösliches Pigment.

Hickey's und Mäßiges Wachstum mit Üppiges Wachstum mit Tresner's glatter und dünner glatter Oberfläche, Oberfläche, farblos; weißliches Luftmycel, beiges lösliches Pigment.

Kobalt-Agar

^^^ ■■■! «tf« W ^ ^V ^^ ~^r V^ «^ BV «^ ^B^ V»V ^^ BB* ^r V

rosa/melonenfarben; hell beige/rosa lösliches Pigment.

Üppiges Wachstum, et- Mäßiges Wachstum mit was krustig, bernstein-glatter Oberfläche, farben/braun; Spuren farblos mit hummereines rosa Luftmycels, roten Flecken; rosa bernsteinfarben/brau- Luftmycel. nes lösliches Pigment.

Üppiges Wachstum mit Schlechtes wachstum, glatter Überfläche, farblos bis hell orange; Spuren von ro- orange/rosa; spärsa Luftmycel, hellgel- liches weites Luftbes lösliches Pigment; myeel, Stärkehydro-Stärkehydrolyse nega- lyse zweifelhaft. tiv.

Üppiges Wachstum mit Üppiges Wachstum, gerunzelter überfläche, rosa/orange; rosa rosenfarben/melonenfar-Luftmycel, hell ben; rosen/melonenfar- goldgelbes löslibenes lösliches Pig- ches ment.

Pigment

Mäßiges Wachstum mit Mäßiges wachstum, schwach gerunzelter hellrosa/orange; Oberfläche, rosa/melo- etwas rosa Luftmycel, nenfarben; hellbeiges gelbliches lösliches lösliches Pigment. Pigment.

Medium

N^mediterranea ATCC 31064

(D-2)

N.mediterranea ATCC 31065

(MM 13-6) N.mediterranea
ATCC 31066

(M-36)

Streptomyce niediterranei ATCC 13685 (ME/83)

Tyrosin-Agar Üppiges Wachstum, sehr (Medium Nr.7 runzlig und krustig', Whirling und backateinrot; tiefgel-G-ottlieb) bes lösliches Pigment j Tyrosinreaktion posi-

tiv(gut).

Üppiges Wachstum, sehr gerunzelt und krustig, tief orange; rosa/lederfarbenes lösliches Pigment, Tyrosinreaktion stark positiv.

Ca-I/lalat-

Sialbumin-Agar

Pepton-G-lucose-Agar Üppiges Wachstum mit
krustiger Oberfläche,
tief gebräunt/orange;
gelb/ockerfarbenes
lösliches Pigment;
Tyrosinreaktion stark
positiv.

Schlechtes Wachstum.

Spärliches Wachstum Spärliches Wachstum, Schlechtes Wachstum, mit glatter und dünner hell orange; Hydrolyse hell orange; kein lösüberfläche, hellorange-des Ca-MaIats negativ, liches Pigment, Cagelb; Chromgelbes lös- Malat-Verwertung ne-

liches Pigment nahe gativ.

dem wachstum und korallenfarben/rosa in der Mitte, Hydrolyse positiv.

Üppiges Vvachstum mit gla-Üppiges Wachstum Gutes wachstum mit ter Oberfläche, hell mit glatter Oberfläche,glatter Oberfläche, orange; hellgelbes lös-orange; kein lösli- orange/gelb; hellliches Pigment. ches Pigment. gelbes lösliches

Pigment.

Mittleres Wachstum farblos, weißlich/ rosa Luftmycel; teilweise Verwertung des Ca-Malats.

Mittleres Wachstum, rosafarben.

Üppiges Wachstum, schwach gerunzelt, tief orange; rosa. goldgelbes lösliches Luftmycel, gelbes lös- Pigment.

liches Pigment.

Üppiges Wachstum, ge- Üppiges Wachstum mit
runzelt, tief orange; gerunzelter Oberfläche,

gebräunt bernsteinfarben; gebräunt bernsteinfarbenes lösliches Pigment.

to cn

co

-J

CD CD

ro

Medium'

N.mediterranea ATCG 31064

(D-2)

N .med iterranea ATCC 31065

(MM 13-6)

N.mediterranea ATCC 31066

(M-36)

Streptomyce mediterranei ATCC 13685 (MS/33)

Gelatine Hydrolyse positiv. Nitrat-Brühe Reduktion negativ.

Lackmusmilch Keine Koagulierung

keine Peptonisierung.

ro Pepton-Hefe= Mäßiges Wachstum mit extrakt-Ei- glatter Überfläche,

sen-Agar blaßorange; HpS-

^(Medium Nr.6 Produktion negativ.

P₀ Shirling und

^Gottlieb)

'Kartoffelbrei Spärliches Wachstum,

orangefarben.

Loefflers Blutserum

NpO+Agar DIf co 2i°

Kein Wachstum.

Spärliches Wachstum, farblos, Spuren von weißem Luftmycel; üppige Sporenprodukt ian.

Hydrolyse positiv. .Reduktion negativ.

Keine Koagulierung keine Peptonisierung

Mäßiges Wachstum mit glatter überfläche, blaßorange; H^S-Produktion negativ.

Sehr spärliches Wachstum, orangefarben.

Kein Wachstum

Spärliches Wachstum, farblos, Spuren von weißem luftmycel; üppige Sporenproduktion.

Hydrolyse positiv. Reduktion negativ.

Keine Koagulierung keine Peptonisierung

Schlechtes Wachstum mit glatter Oberfläche, farblos; kein lösliches Pigment, H₉S-Produktion negativ.

Schlechtes Wachstum, hellorange.

Kein Wachstum.

Hydrolyse positiv. Reduktion negativ.

Keine Koagulierung keine Peptonisierung-

Schlechtes wachstum; farblos.

οι

CD

ro

Medium

N.mediterranea ATGU 31064

(D-2)

N.mediterranea ASCC 31065

(MM 18-6)

N.mediterranea ATCC 31066

(M-36)

Streptomyce mediterranei Ai¹CC 13685 (ME/83)

Magermilch-Agar

Üppiges Wachstum mit glatter Oberfläche, orange; Cadmiumgelbes lösliches Pigment, Caseinhydrolyse gut.

Gutes Wachstum, schwach gerunzelt, orange mit braunem Schatten; haselnußbraunes lösliches Pigment, Caseinhydrolyse gut.

üppiges Wachstum mit gerunzelter Oberfläche, orange; goldbraunes lösliches Pigment, Caseinhydrolyse stark positiv.

Shirling und Gottlieb: "Methode for characterization of Streptomyces species", Intern. J. Syst.Bact., Ji, 313-338 (1966). ' ±

Folgende Tabelle 3 macht Angaben über die physiologischen Eigenschaften der neuen Nocardia-Stämme unter Vergleich mit den Eigenschaften des Ausgangsstammes.

- TABELLE 3

N.mediterranea N.mediterranea N.mediterranea Streptomyces mediterrane i (D-2) (MM 18-6) (M-36) (ME/83)

ο Stärkehydrolyse - - - +

^ Tyrosinhydrolyse

v^ Caseinhydrolyse

to Ca-Malat-hydrolyse

*° Nitratreduktion ' - _

Lackmusmilch keine Koagulierung keine Koagulierung keine Koagulierung keine Koagulierung keine Peptonisierung keine Peptonisierung keine Peptonisierung keine Peptonisierung

Gelatineverflüssigung

ro I

Tabelle 4 berichtet über die Verwertung von Kohlenstoffquellen, wobei die folgenden Daten nach der Methode von tfridham und Gottlieb (J.Bact. Jj6, 107, 1948) erhalten wurden.

TABELLE 4

	Arabinose	N.mediterranea	+	N.mediterranea	N.mediterranea	Streptomyces mediterranei	+++
	Xylose	CD-2)	+	(MM 18-6)	(lfl-36)	(ME/83)	++
	Glucose	++	+++	++	++
	Mannose	+	+	++	++ .
	fructose	++	+++	++	++
σ>	Lactose	+	++ ■	++	++
ο to	Sucrose Inosit Rhamnose		+++	++	I ⁺⁺ O» ++ *
OO	Raffinose	-	+++	++	—
12/096	Salicin	+	♦	::	+
CD	Mannit	++		-	++
	Glycin	■+■	+	+	-
	Sorbit	-	+++		-
	Na-Succinat	-	+	+	ro ⁺ Ol
	Na-citrat	-	- _t	- ■	•GO
	Na-acetat Inulin	—	-	—	KJD O
	-	-

	Dulcit	N.mediterranea	-	0	.mediterranea	N.mediterranea	-	Streptomyces	-	mediterranei	1 JC
	Cellulose	(D-2)	++		Mi 18-6)	(M-36)	++	(ME/83)	+
	Maltose		+				++		+++
	Galactose	++		-	++	+++
	Glycerin			+++			¹
				++
f—»				+++
i 9 8 1 ;
6 9 6 0/2

Das Fermentationsverfahren besteht im wesentlichen darin, daß man eine der genannten Mutanten von Streptomyces mediterranei in einem Nährmedium züchtet, welches Quellen fllr assimilierbaren Kohlenstoff und Stickstoff und essentielle Mineralsalze enthält, bis das Medium eine wesentliche antibiotische Y/ir— kung erreicht hat, worauf man die Rifamycine aus dem Medium extrahiert. Insbesondere züchtet man die Mutanten unter Rührung und Belüftung bei submersen Bedingungen und Temperaturen von 25 bis 37 und vorzugsweise 28⁰C. Als Kohlenstoffquellen können folgende Kohlehydrate und Kohlenstoffverbindungen- eingesetzt werden: Glucose, Galactose, Lactose, Rohrzucker, Maltose, Glycerin, Mannit und dergleichen. Brauchbare Stickstoffquellen sind zum Beispiel Aminosäuren und deren Gemische, Peptide, Proteine und deren Hydrolyseprodukte, zum Beispiel Pepton, Hefeextrakt, Soyabohnenmehl, Corn Steep Liquor, gelöste Fischbestandteile, Ji¹I eise hext rakte, wässrige Fraktionen aus Getreidesamen. Die Fermentation kann während 180 bis 220 Stunden durchgeführt werden. Der Ausgangs-pH-Vvert, der im allgemeinen auf etwa 6,4 bis 6,6 eingestellt wird, steigt am Ende der Fermentation auf 1,0 bis 3,5 an. Im allgemeinen beobachtet man die besten Ergebnisse nach 200 Stunden Fermentation. Nach beendeter Fermentation können die Rifamycine auf folgende Weise isoliert werden: Das Fermentationsmedium wird beim End~pH-»vert von 7»0 bis 8,5 filtriert. Das FiItrat wird rasch angesäuert, vorzugsweise auf einen. pH-wert unterhalb etwa 5» um die beste Stabilität der Antibiotika sicherzustellen. Das aktive Prinzip wird durch mit Wasser nicht mischbare Lösungsmittel wie Chloroform, Butanol, Äthyl-, Propyl-, Butyl- oder Amylacetat extrahiert. Das Volumenverhältnis zwischen Medium und Lösungsmittel hängt vom jeweiligen Lösungsmittel ab. Im allgemeinen arbeitet man mit einem Volumenverhältnis von 2:1 bis 10:1.

Das Mycel enthält daraufhin noch mikrobiologisch wirksame Be-

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standteile, die durch ein mit Wasser nicht mischbares Lösungsmittel extrahiert werden, worauf die organischen Phasen, die bereits die Hauptmenge der Rifamycine enthalten, vereinigt werden. Die Extraktion des wirksamen Prinzips aus dem Myeel kann auch mit einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel wie Aceton erfolgen. In diesem ü'all wird die Flüssigkeit filtriert, das Aceton wird im Vakuum abdestilliert und die Rifamycine werden mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel extrahiert, worauf das Verfahren wie vorstehend beschrieben weitergeführt wird.

Sobald die Hauptmenge der antibiotisch wirksamen Substanzen in das Lösungsmittel überführt worden ist, wird dieses im Vakuum zur Trockene eingeengt, vorzugsweise bei einer unterhalb 3O⁰C liegenden 'temperatur.

Der Rohextrakt der Rifamycine kann chromatographischean einer Silikagel-Säule gereinigt werden. Vor dem Chromatographieren wird der Rohextrakt zweckmäßig in einem Phosphatpuffer vom pH 7,0 bis 8,0 gelöst und mit einem milden Oxidationsmittel behandelt. Die Pufferlösung wird dann mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel extrahiert und dieser organische Extrakt enthält ein neues Rifamycin, welches als Rifamycin R bezeichnet wird. Die extrahierte Pufferlösung wird auf pH 2-4 angesäuert und erneut mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel extrahiert. Dieser Extrakt enthält drei neue Verbindungen der Rifamycin-Gruppe, die als Rifamycine P, Q und U bezeichnet werden.

Die weitere Reinigung des Rifamycin R erfolgt durch Chromatographieren an einer mit einem geeigneten Adsorbents wie zum Beispiel Silikagel gefüllten Säure unter Eluieren mit einem passenden Gemisch organischer Lösungsmittel.

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Der zweite, die Rifamycine P, Q und U enthaltende organische Extrakt wird in ähnlicher Vveise gereinigt.

Beispiel 1

Der als Nocardia mediterranea ATGG 31064 identifizierte Mutationsstamm wird 6 bis 8 Tage auf Bennett's-Agar vermehrt und bei 2S°C inkubiert.

Mit der vom Agar-Schrägnährboden erhaltenen Kultur werden 2 500 ml-Erlenmeyerkolben unter sterilen Bedingungen inokuliert. Die Kolben enthalten 100 ml Vegetationsmedium folgender Zusammensetzung:

Rindfleischextrakt 5 g

Hefeextrakt 5g

Pepton 5g

Gaseinhydrolysat 3 g

Glucose 20 g

' NaCl 1,5g

H₂O auf 1 Liter.

Der pH—wert wird mit Natriumhydroxid auf 7|3 eingestellt.

Die so inokulierten Kolben werden 72 stunden bei 28⁰C in einer Scfaüttelmaschine mit Hin- und Herbewegung gehalten. Der Inhalt der beiden Erlenmeyer-Kolben wird als Inokulum verwendet, wobei man ihn in einen 10 Liter-Vorfermenter schüttet, der 4 Liter des obigen Vegetationsmediums enthält. Die Inkubierung erfolgt bei 28⁰C unter Bewegung mit 300 Umdrehungen pro Minute und Belüftung mit 1 Vol./Vol./Min. Nach einer Wachstumszeit von 43 Stunden erhält man ein Volumen von 7 bis IO5S gepackter Zellen. In der nächsten ötufe wird ein 10 Liter-Glasfermenter verwendet, der 4 Liter des nachstehenden J^ermentationsmediums enthält:

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-W-

Erdnußmehl	25 g
Soyabohnenmehl	5 g
(NH₄)₂S0₄	9,5 g
MgSO₄.7H₂O	0,85 g
Glucose	95 g
Glycerin	40 g
KH₂PO₄	1 S
Pro pylenglyc öl	5 g
GaGO₃	3,5 g
Na-diäthylbarbiturat	1,7 g
GuSO₄.5H₂O	2,8 mg
FeSO₄.7H₂O	8,5 mg
ZnSO₄.7H₂O	42,5 mg
MnSO₄.4H₂O	3,4 mg
CaGl₂.6H₂O	1,7 mg
(NH₄J₆Mo₇O₂₄.4H₂O	0,85 mg
H₂O auf	1 Liter.

Der pH-Wert wird mit Natriumhydroxid auf 7,8 eingestellt, dann wird 60 Minuten bei 120⁰G sterilisiert, worauf der pH 6,4 beträgt. Als Inokulum verwendet man den Inhalt des Vorfermenters in einer Menge, die 5$ des Fermenterinhalts entspricht.

Die Fermentation erfolgt bei 28⁰C unter Bewegung mit 750 Umdrehungen pro Minute und einer Belüftungsgeschwindigkeit von 1 Vol./Vol./Min. Als Antischaummittel wird Silicon A verwendet. Während der Fermentation schlägt die Farbe des Mediums um in ein charakteristisches Rotbraun. Each 200 Stunden Wachstumszeit erhält man das Gesamtvolumen gepackter Zellen. Der pH—Viert der Brühe beträgt dann 7,5, und zu diesem Zeitpunkt wird das Medium aufgearbeitet.

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Beispiel 2 -Λ*

Eine nach der Vorschrift von .Beispiel 1 erhaltene Kultur von Nocardia mediterranea ATCC 31064 wird in einem Kolben unter Rühren zubereitet. Zur Vorkultur wird sie in einen 10 Liter-Glasfermenter gegossen, der 4 Liter folgenden Mediums enthält:

Glucose 5 g

Erdnußmehl 7,5 g

CaCO₃ 1,65 g

MgSO₄.7H₂O 0,33 g

KH₂PO₄ " 0,33g

FeSO₄^H₂O 3,3 mg

ZnSO₄.7H₂O 16,5 mg

MnSO₄.4H₂O 1,3 mg

H₂O auf . 1 Liter

Der pH-wert wird auf 7»5 eingestellt, dann wird 50 Minuten bei 120⁰C sterilisiert, worauf der pH 6,4 beträgt. Nach 48 Stunden Wachstumszeit beträgt das Volumen gepackter Zellen 6 bis 850 des Gesamtvolumens. Ein 10^ entsprechendes Inokulum wird für einen 20 Liter-Glasfermenter verwendet, der 10 Liter folgenden iTermentationsmediums enthält:

Corn Steep Liquor Soyabοhnenmehl

MgSO

Glucose

KH₂PO₄ CaCO,

20	85	g
15		g
6		g
0,		g
100	5	g
.1	g
6	g
8,	mg

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ZnSO₄.7H₂O 42,5 mg lO 6 I \ä\} Δ

MnSO₄.4H₂O 3,4 mg

CuSO₄.5H₂O 2,8 mg

CoCl₂.6H₂O 1,7 mg

H₂O auf 1 Liter.

Der pH-wert wird mit Natriumhydroxid auf 7_f8 eingestellt, dann wird 50 Minuten bei 120⁰C sterilisiert, worauf der pH 6,4 beträgt. Die fermentation erfolgt bei 28°C 200 Stunden lang. Bei der Aufarbeitung beträgt der pH der Fermentationsbrühe 7»5·

Die gemäß den Beispielen 1 und 2 erhaltenen Fermentationsbrühen werden wie folgt gereinigt: Das Mycel wird abfiltriert und verworfen, das Mitrat wird mit 10$ iger (Volumen/Volumen) Salzsäure auf pH 2,0 eingestellt und dreimal mit einem gleichen Volumen Äthylacetat extrahiert. Dieser organische Extrakt wird im Vakuum bei 35⁰C zur Trockene eingeengt und der Rückstand (4 g bei Beispiel 1 und 11g bei Beispiel 2) wird in 0,05-molarer Natriumphosphatpufferlösung vom pH 7,5 unter Zusatz von Natriumnitrit gelöst, wobei man eine Endkonzentration von 0,2$ (Gewicht/Volumen) erhält. Nach 1/2 stündigem Rühren bei Raumtemperatur wird die Pufferlösung dreimal mit einem gleichen Volumen Äthylacetat extrahiert. Die vereinigten organiachen Extrakte werden im Vakuum bei 35°C zur Trockene eingeengt (erster Äthylacetat-Extrakt). Die extrahierte Pufferlösung wird mit 10>ό iger Salzsäure auf pH 2,0 eingestellt und dreimal mit einem gleichen Volumen Äthylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte werden im Vakuum bei 35⁰C zur Trockene eingeengt (2. Äthylacetat-Extrakt).

Das aus dem 1. Äthylacetat-Extrakt erhaltene Trockenpulver (1,4 g bei Beispiel 1 und 4*2 g bei Beispiel 2) wird in Chloroform gelöst und an einer mit Silikagel (0,21 - 0,063 mm ASTM)

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gepackten Säule chromatographiert, wobei man 2$ Methylalkohol (Volumen/Volumen) enthaltendes Chloroform als Eluier.ungsmittel verwendet. Als erstes Hauptprodukt wird Rifamycin R aus der Säule eluiert, das man an seiner orange/braunen Farbe erkennt.

Bei der Dünnschichtenchromatographie auf Silikagel-Platten (Merck 60 F₂₅.) mit Ohloroform/Methylacetat (95:5) als Lösungsmittelsystem ergibt Rifamycin R den R»-Wert 0,59. Hie Rifamycin R enthaltenden Fraktionen werden vereinigt, im Vakuum bei 35⁰C zur irockene eingeengt und erneut in Äthylacetat gelöst, worauf die Lösung mit 0,01 η-Salzsäure und dann mit Wasser gewaschen wird. Der organische Extrakt wird auf ein kleines Volumen eingeengt und das Rifamycin R kristallisiert dann bei 4⁰C aus der Lösung (Ausbeute 600 mg bei Beispiel 1 und 1,6 g bei Beispiel 2). Der zweite Äthylacetatextrakt wird durch Säulenchromatographie an Silikagel in ähnlicher ΐι/eise gereinigt. Der trockene Rückstand (2,4 g bei Beispiel 1 und 4,2 g bei Beispiel 2) wird in Chloroform gelöst und einer Silikagelsäule zugeführt. Die Säule wird mit einem Gemisch aus Chloroform und Methanol (93:2) eluiert. Die zunächst austretende Verbindung ist Rifamycin U, dann folgt Rifamycin P und schließlich Rifamycin Q. Sämtliche 3 Verbindungen zeigen in der Eluierungslösung einegelb-orange Farbe und können auf Grund ihrer Mobilität im Dünnschichtenchromatogramm identifiziert werden. Auf Silikagelplatten (Merck 60 Fpc*) besitzen diese Rifamycine bei Verwendung von Chloroform: Methanol (95:5) als Lösungsmittelsystem folgende R~-\Verte:

Rifamycin U R_f = 0,63

Rifamycin P Rf = 0,57

Rifamycin Q Rf = 0,32.

Die die Rifamycine U, P bezw. Q enthaltenden Fraktionen werden jeweils vereinigt und im Vakuum zur i'rockene eingeengt, der Rückstand wird aus Äthylacetat kristallisiert. Bei Beispiel 1

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erhält man 80 mg Rifamycin U, 400 mlg Rifamycin P und 280 mg _o Rifamycin Q, bei Beispiel 2 190 mg Rifamycin U, 900 mg Rifa= mycin P und 75ü mg Rifamycin Q.

wiederholt man die Verfahren der obigen Beispiele, jedoch unter Verwendung von Nocardia mediterranea ATCC 31065 oder No= cardia mediterranea Ai¹CC 31066 als produzierende,- Stämme;., so erhält man Ausbeuten gleicher Größenordnung.

Physikalische und chemische Eigenschaften der neuen Rifamycine Rifamycin P

1) Elementaranalyse

gefunden: C=6O,6; H=6,2; N=3,3; 0=25,2;' S=4,1 2) Absorptionsbanden: im TJV und sichtbaren Licht:

	Methanol	1 cm	A»,	0,1	n-HCl
Λ max	(mu)	197	416	c (mu)	Bp
406		(Schulter)	300		183
350		344	225		319
297		423			521
257		550
224

cm

Das gesamte Spektrum zeigt Figur 1. Das Spektrum wurde mit einem Perkin Eimer Spectracord 4000 A aufgenommen.

3) Infrarot-Spektrum:

Die wichtigsten Absorptions-Peaks in Nujol liegen "bei folgenden Frequenzen (cm~ ):

3700-3150 (in,br); 3100 (w); 3060-2800 (vs); 1465 (s); 1380 (b): Nujol; 1722 (m·); 1645 (m,Br); 1580 (m); 1510 (m); 1325 (m); 1250 ( s br); 1160 (m); 1130 (w); 1070 (m, br) 1030 (w); 982(m);

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960 (m); 925 (w); 390 (m); 318 (w)_{ 770 (w); 735 (w).

Das vollständige Spektrum zeigt Figur 2, es wurde mit einem Spektrometer Perkin Eimer Modell 421 aufgenommen.

4) Massenspektrum:

Das bei 70 eV erhaltene Massenspektrum zeigt den Peak für das Molekülion M bei m/e 738. Das Spektrum wurde mit einem Hitachi Perkin Eimer RMÜ-6I~Spektrometer aufgenommen. "

5) Kernmagnetisches Resonanzspektrum:

Das vollständige Spektrum bei 100 MH₂ in CDGI₅ zeigt Figur 3.

Die Verbindung zeigt nicht das charakteristische polarographische Verhalten der Rifamycine, die ein Chromophor mit Ghinonstruktur besitzen.

Rifamycin Q

1) Elementaranalyse:

gefunden: C=60,7; H=6,3; N=3,60; 0=25,3; S=4,2

2) Absorptionsbanden: im UV und sichtbaren Licht

(in Methanol):

(mp)

max „, _. _cm

406	178
350	(Schulter)
297	305
257	405
224	518
Infrarot-Spektrum:

Die wichtigsten Absorptions-Peaks in Nujol liegen bei folgenden Frequenzen (cm*" ):

3700-3300 (s,br); 3300-3080 (m br); 3040-2730 (vs); 1460 (s)j

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1378 (s); Nujol; 1740 (m); 1700 (m); 1650 (s, br); 1605 (s, br); 1555 (a); 1510 (m, br); 1315 (w); 1275 (m); 1240 (m); 1220 (m); 1160 (m); 1090 (n); 1050 (m,br); 1020 (w); 970 (m); 945 (w); 910 (m); 80S (e); 765 (w); 720 (w);

Das vollständige IR-Spektrum zeigt Figur

4) Kernmagnetisches Resonanzspektrum:

Das vollständige Spektrum bei-60 MHz in CDCl, zeigt Figur 7.

Rifamycin R

1) Elementaranalyse (°/o) :

gefunden: C=62,Ü; H=6,4; N=2,2; 0=29,6

2) Absorptionsbanden: im UV und sichtbaren Licht

(in 0,1 η HCl in Methanol):

(mi)

max „, _, _cm

219 444

281 415

340 114

410 72

3) Infrarot-Spektrum;

Die wichtigsten Absorptions-Peaks in Nujol liegen bei fol-

—1 genden Frequenzen (cm ):

3700-3100 (s br); 3040-2780 (vs); 1465 (s); 1380 (s); Nujol; 1745 (s); 1710 (m); 1640 (s); 1600 (s); 1505 (s);, 1415 (m); 1325 (s); 1260 (s, br); 1220-1130 (s, br); 1120 (w); 1075 (a); 1020.(w); 975 (b); 950 (w); 920 (w); 888 (m); 823 (m); 785 (w, br); 735 (w, br); 650 (w, br).

Das vollständige IR-Spektrum zeigt Figur

4) Massenspektrum:

Das bei 70 eV erhaltene lassenspektrum zeigt den Peak für das Molekül ion -M m/e 711·

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5) Kernmagnetisph.es Resonanzspektruin:

Das vollständige Spektrum bei 60 MHz in CDCl, zeigt Figur 6,

Die Verbindung zeigt das charakteristische polarographische Verhalten der Rifamycine mit einem Chromophor mit Chinonstruktür.

Obige Daten führen zu folgender Struktur für Rifamycin R:

CH

CH₃COO

CH₂OH

Rifamycin U

1) Absorptionsbanden; im UV und sichtbaren Licht

(in Methanol):

. λ

max

(mu)

412	163
353	(Schulter)
299	265
258	389
220	451
Infrarot-Spektrum: .

Die wichtigsten Absorptions-Peaks in Nujol liegen bei folgenden Frequenzen (cm~ ):

37OO-3IOO (m,br); 3Ο6Ο (vw); 3040-274U (vs); 2720 (vw); I46O (s),

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■ -26- ■

1378 (m); Nujol; 1750-1705 (in, br) j 1680-1620 (in, br); 1600 (s);, 1558 (a); 1490 (w, Schulter); 1303 (w) ; 1270 (w, Schulter); 1245 (m, Schulter); 1225 (m); 1160 (m); 1120 (w); IO9O (vw) ; 1070 (w); 1030 (vw); 1020 (vw); 1000 (vw); 975 (w); 960 (w, Schulter); 905 (m); 850 (m); 800 (vw, Schulter); 777 (vw); 802 (w); 760 (vw); 720 (vw); 685 (vw); 670 (vw).

(s = stark, m = mittel, w = schwach, br = breit, vs = sehr stark, vw = sehr schwach).

Biologische Wirkung der Verbindungen:

Das Wirkungsspektrum der Kifamycine P, Q und R in vitro zeigt

folgende Tabelle:

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■Stämme

TABELLE	b,	·'	kleinste	inhibierende Konzentration (;ug/ml)	Rifamycin U
			Rifamycin	Q ' Rifamycin R	0,05-0,1
Rifamycin P		0,039 0,078	0,01.9 0,0047
0,00235 0,00235

O (D O

Staphylococcus aureus ATCG 6538

Staphylococcus aureus ATGG 6538 ■(20$ Rinderserum)

Staphylococcus aureus Sour

Staphylococcus aureus Tour Rifampicin-resistent

Streptococcus hemolyticus G Streptococcus faecalis ATGC 10541 Diplococcus pneumoniae UG Proteus vulgaris X 19 H ATCG Escherichia coli Al¹CC 10536 Klebsiella pneumoniae ATCC 10031 Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145 Mycobacterium tub. H37Rv ATCC 9360 ~: Aktivität nicht ermittelt 0,0035

0,06

0,00235

25-50	>100	100
0,ÜU47	0,019	0,00312
O,üO35	0,312	0,19
0,0047	0,039	0,00625
0,78	12,5	12,5
3,12	12,5	50
12,5	50	-
12,5	50	100
1	2,5	0,1

>50

2,5

£. g ο ι g u £.

Die neuen Verbindungen waren auch bei Labortieren wirksam, denen Staphylococcus aureus oder Lscherichia coli injiziert worden war. folgende l'abelle gibt die Ergebnisse repräsentativer Versuche an Mäusen wider, bei denen die neuen Rifamycine mit einem bekannten natürlichen itifamycin, nämlich Rifamycin SV, verglichen wurden.

Verbindung infiz. Stamm ED_Knmg/kg

Rifamycin P Staphylococcus aureus

Rifamycin P Escherichia eoli

Rifamycin Q Staphylococcus aureus

Rifamycin SV Staphylococcus aureus

Rifamycin P, das demgemäß das wirksamste der bisher isolierten natürlichen Rifamycine ist, besitzt auch eine geringe Toxicität. Die Ilen bei Mäusen ist höher als 500 mg/kg i.p«

S .C.	O	.S
0,3	0	,3
40		-
3		—
17	74

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Claims

1. Verfahren zur Herstellung der neuen Rifamycine Rifamycin P, Rifamycin Q, Rifamycin ίί und Rifamycin U, dadurch gekennzeichnet, dais man unter aeroben Bedingungen in Gegenwart einer Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff, assimilier-

.baren Stickstoff und essentieller Mineralsalze einen der Mutationsstämme von Nocardia mediterranea, nämlich oder deren Äquivalente fermentiert, bis das iiⁿermentationsmedium wesentliche antibiotische Wirksamkeit zeigt, die Rifamycine aus dem ^ermentationsmedium gewinnt und als Einzelverbindungen isolierte

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Fermentation bei einer !Temperatur von 25 bis 37 G und einem pH von etwa 6,4 bis etwa 3,5 130 bis 200 Stunden druchführt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß nan die Rifamycine durch Extraktion der JTermentationsbrühe mit einem mit v.-a.yser nicht mischbaren Lösungsmittel bei einem unterhalb 5 liegenden pH-Wert gewinnt.

4„ Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Gemisch der neuen Rifamycine durch Säulenchromatographie in die .üinzelkomponenten zerlegt«

5. Verfahren nach Anspruch 1, zur Herstellung von Rifamycin P. Verfahren nach Anspruch 1, zur Herstellung von Rifamycin R. 7· Verfahren nach Anspruch 1 zur Herstellung von Rifamycin Q.

⁺ Nocardia mediterranea A¹IGO 31064 (D-2), Nocardia medi= terranea Al¹GC 31065 (&ÜM18-6) oder llocardia mediterranea aTGC 31066 (K-36)

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3. Verfahren nach Anspruch 1 zur Herstellung von Rifamycin U.

9. Verfahren zur Herstellung einer der neuen Nocardia medi= terranea-Mutanten Nocardia mediterranea Al¹CG 31064 (D-2), Nocardia mediterranea aTCO 31065 (1.2.113-6) oder Nocardia' mediterranea ATGC 31066 (M-36) und deren Äquivalenten, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Suspension von Sporen von Streptomyces mediterranei ATGG 13635 mit einem mutagenen Mittel behandelt, die mit iviutagen behandelten Sporen 14 Tage lang bei 28⁰G auf Bennett-Agar inkubiert und die überlebenden Kolonien, die zur Inhibierung des 'Wachstums von Bacillus subtilis befähigt sind, isoliert.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daßman als Mutagenes Mittel N-kethyi-N'-nitro-N-nitrosoguanidin verwendet und die .Behandlung bei pH 9,0 und 28°G durchführt .

11. Rifamycin P mit folgenden Eigenschaften:

1. Elementaranalyse: ($):

0=60,6; -H=6,2} N=3,S; 0=25,2; S=4,1

2. Absorptionsbanden im UV und sichtbaren Licht

(tfigur 1):

Methanol (rna) ^E]cm. λ 0, 1 η HCl E¹^ max 197 max (mtt) 183 406 (Schulter) 416 319 350 344 300 521 297 423 225 257 550 224

Y/ichtigste Infrarot-Absorptionspeaks in Nujol bei den .Frequenzen (cm ) (.Figur 2):

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3700-3150 (m,br); 3100 (w); 306ü-2300 (vs); 1465 (s); 1380 (b): Nujol; 1722 (ε); 1645 (m,br); 1530 (m); 1510 (m)j 1325 Ce); 1250 (s,br); 1160 (m); 1130 (w); 1ü7ü (m, br); 1030 (w); 982 (e);; 960 (m); 925 (w) ; 390 (in); 818 (w); 770 (w); 735 (w).

4· Molekül im-Peak M im LassenspektruEi bei 70 ev bei m/e 738.

5. KKR-Spektrum bei 100 MIJ in CDCl, gemäiS Pigur 3»

6. R_f-V/ert 0,57 (Silikagelplatte, Chloroform/Methanol 95:5).

12J Rifamycin R der j?ormel

^: . "CH, CH CH₃COO.

13o Rifamycin Q mit folgenden -Eigenschaften:

1. Elementsranalyse: (^c/o)

C=6O,7; H=6,3; N=3,6O; 0=25,3; S=4,2

2. Absorptionsbanden im UV und sichtbaren Licht:

λ max (mp)

406 178

350 (Schulter)

297 305

257 405

224 518

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3. 'wichtigste mfrarot-Absorptionspeaks in Nujol bei den Frequenzen (cir~ ) (Figur 4):

37OO-33OO (s,br); 3300-3030 (in,br); 3040-2780 (vs); 1460 (s); 1373 (s); ITujol; 1740 (m); 1700 (m); 1650 (s, br); 1605 (s, br); 1555 (s);, 1510 (m, br); 1315 (w); 1275 (m); 1240 (m); 1220 (m); 1160 (n); 1090 (m); 1050 (m,br); 1020 (w); 970 (m); 945 (w); 910 (m); 808 (m); 765 (w); 720 (w).

4. NMR-Sρektrum bei 60 MHz in COCl₅ gemäß Figur 7-

5. R_f-V;ert 0,32 (Silikagelplatte, Chloroform/Methanol 95:5).

14· Rifamycin U mit folgenden Eigenschaften:

1. Absorptionsbanden: im UV und sichtbaren Licht:

λ max {ψ) E^_cm

412 163

353 (Schulter)

299 265

253 339

220 · 451

2. Wichtigste IR-Absorptionspeaks in Nuj öl bei den Frequenzen (cm" ):

3700-3100 (m,br); 3060 (vw); 3040-2740 (vs); 2720 (vw) ; 1460 (s), 1373 (m): Nujol; 1750-1705 (m,br); 1680-1620 (m,br); 1600 (s); 1553 (s); 1490 (w, Schulter); 1308 (w); 1270 (w, Schulter); 1245 (m, Schulter); 1225 (m); 1160 (m); 1120 (w); IO9O (vw); IO7O (w); IO3O (vw); 1020 (vw); 1000 (vw); 975 (w); 960 (w, Schulter); 905 (m); 850 (m); (w); 800 (vw, Schulter); 777 (vw); 76O (vw); 720 (vw); 685 (vw); 670 (vw).

3. E._f~Wert 0,63 (Silikagelplatte, Chloroform/Methanol 95:5).

Für: Gruppo Lepetit S.p.A. Mailand / Italien

Di»;;h. J If Wo iff Rechtsanwalt

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