DE3012565A1 - Antitumor-antibakterielle mittel - Google Patents
Antitumor-antibakterielle mittelInfo
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Description
PATENTANWÄLTE
J. REITSTÖTTER
W. BUNTE (1ΟΒ8-1Ο7Θ)
DR. ING.
W. KINZEBACH
K. P. HÖLLER
TELEFON ι (089) 37 6883
TBLEXi 0210Ξ0Θ ISAR D
Müncheni 31. März 1980
M/21 065
BRISTOL-MYERS COMPANY 345 Park Avenue
New York, N.Y.10022 USA
Anti tumor-antibakteriel le Mittel
004 37 0725
■'■ ί! Ι
Die Erfindung betrifft einen neuen antitumor-antibiotischen Komplex und Verfahren für die Herstellung, Gewinnung und
Trennung in bioaktive Bestandteile.
Aufgrund der vorliegenden Spektraldaten und der physikalischchemischen Eigenschaften scheint der erfindungsgemäße antitumorantibiotische
Komplex strukturell verwandt zu sein mit der Chinoxalingruppe von Antibiotika wie z.B. Echinomycin, Dell et al,
J. Am. Chem. Soc, 9_7, 2497 (1975), Chinomycine, Shoj i et al,
J.Antibiotics, 14A, 335 (1961) und Triostin C, Merck Index,
9. Auflage, 9399. Jedoch unterscheidet sich der antitumor-antibiotische Komplex von diesen Antibiotika in folgender Hinsicht:
1. Der vorliegende Komplex und seine Bestandteile enthalten als Chromophor einen Chinolinkern anstelle von Chinoxalin, der
bei der Actinoieukingruppe von Antibiotika vorhanden ist.
2. Der vorliegende Komplex und seine Bestandteile enthalten
kein Schwefel , während in der Struktur der Actinoleukin-Antibiotika
eine Disulfid- oder Thioacetalbrücke vorhanden ist.
3. Der vorliegende Komplex und seine Bestandteile besitzen nur eine verhältnismäßig geringe antimikrobieile Aktivität im
Vergleich zu den Actinoleukinen, die starke antibakterielle
Antibiotika sind.
Die Erfindung betrifft einen neuen antitumor-antibiotischen Komplex, der als BBM-928 bezeichnet wird. Dieser Komplex enthält
wenigstens sechs Bestandteile und wird gewonnen durch Kultivieren eines BBM-928 produzierenden Actinomycetesstammes
(ATCC 31491) oder eines Mutanten in einem wäßrigen Nährmedium unter submersen aeroben Bedingungen. Die Erfindung betrifft
auch ein Verfahren zur Gewinnung des BBM-928-Komplexes aus
dem Kulturmedium und die Trennung des Komplexes in seine bio-
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JS-
aktiven Bestandteile durch Gegenstromverteilung oder chromatographische
Techniken.
Die Erfindung betrifft den BBM-928-Komplex und auch seine bioaktiven
Bestandteile BBM-928 A5 B, C, D, E und F. Sie betrifft
insbesondere die Bestandteile BBM-928 A5 B, C und D in verdünnter
Form., als echte Konzentrate und in gereinigter Form.
Von den Zeichnungen zeigen:
Figur 1 ein Infrarot-Absorptionsspektrum von BBM-928A in KBr5
Figur 2 das Infrarot-Absorptionsspektrum von BBM-928B in KBr,
Figur 3 das Infrarot-Absorptionsspektrum von BBM-928C in KBr,
Figur 4 das Infrarot-Absorptionsspektrum von BBM-928D in KBr5
Figur 5 das NMR-Spektrum von BBM-928A,gelöst in deuteriertem
Chloroform mit TMS als internem Standard,aufgezeichnet
auf einem 90 MHz NMR-Spektrometer,
Figur 6 das NMR-Spektrum von BBM-928B, gelöst in deuteriertem Chloroform mit TMS als internem Standard, aufgezeichnet
auf einem 90 MHz' NMR-Spektrometer,
Figur 7 das NMR-Spektrum von BBM-928C, gelöst in deuteriertem Chloroform mit TMS als internem Standard, aufgezeichnet
mit einem 90 MHz NMR-Spektrometer,
Figur 8 das NMR-Spektrum von BBM-928D, gelöst in deuteriertem [
Chloroform mit TMS als internem Standard, aufgezeichnet;
auf einem 90 MHz NMR-Spektrometer. ι
030043/0725
copy
Die Erfindung betrifft einen neuen antitumor-antibiotischen
Komplex, der als BBM-928 bezeichnet wird. Von diesem Komplex wird angenommen, daß er strukturell verwandt ist mit der Actinoleukingruppe
von Antibiotika. Er wird gebildet durch Fermentation von einem bis jetzt unidentifizierten Stamm von Actinomyceten.
Jeder Actinomycetenstamm, der zur Bildung von BBM-928 in einem Kulturmedium in der Lage ist, kann benutzt
werden, wobei der bevorzugte produzierende Mikroorganismus in der Bristol-Banyu-Kulturensammlung als Actinomycetenspecies
Stamm Nr. G455-101 bezeichnet wird. Der Mikroorganismus wurde
aus einer auf den Philippinischen"Inseln entnommenen Bodenprobe
isoliert und wurde in der amerikanischen Kulturensammlung von
Mikroorganismen als ATCC 31491 hinterlegt.
Der neue antitumor-antibiotische Komplex der vorliegenden Er- !
findung besitzt mindestens sechs Bestandteile, die als BBM-928A,
B, C, D, E und F bezeichnet sind. Bestandteile A, B, C und D ; vom BBM-928-Komplex wurden in kristalliner Form isoliert, wobei ;
die chemischen Strukturen der Bestandteile A, B und C identifiziert wurden. Der erfindungsgemäße Komplex (und die einzelnen
Bestandteile) besitzen antitumor-antibakterielle Eigenschaften.
< Wegen der antibakteriellen Aktivität können der Komplex und
seine einzelnen Bestandteile als Nahrungszusätze für Tierfutter \ und als therapeutische Mittel zur Behandlung von bakteriellen ;
Infektionen bei Säugetieren eingesetzt werden. Zusätzlich kön- l nen die Antibiotika für die Säuberung und Sterilisierung von
Laborglasgeräten und chirurgischen Instrumenten eingesetzt wer- i den und können in Verbindung mit Seifen, Waschmitteln und Wasch-,
lösungen für sanitäre Zwecke verwendet werden. Aufgrund der Antitumor-Eigenschaften sind der Komplex und seine einzelnen
Bestandteile speziell wirksam gegen eine Vielzahl von intraperitoneal
implantierten Mäusetumoren.
043/07.26
.■>**■■
Im folgenden wird der bevorzugte, den antibiotischen Antitumorkomplex
BBM-928 produzierenden Mikroorganismus generell beschrieben. Die kulturraäBigen, physiologischen
und morphologischen Eigenschaften des Organismus wurden nach den üblichen taxonomischen Methoden bewertet,
z.B. Shirling et al, Int. J. Syst. Bacteriol. J_6_, 313 (1966)
und Lechevalier et al, Biol. Actinomycetes Related Org. JJ_,
(1976).
Der Stamm Nr. G455-101 bildet sowohl Substrat- als auch Luftmyzele.
Das Substratmyzel ist gut entwickelt, lang und verzweigt (0,5-0,8 μ breit). Eine ausgeprägte Fragmentierung des
Substratmyzels wird nicht beobachtet. Im Gegensatz zu gewöhnlichen
Specien von Streptomyces bildet der Stamm G455-101 nur kurze
oder rudimentäre Luftmyzele. In einigen Agarmedien werden überhaupt keine gebildet. In dem Luftmyzel werden kurze oder lange
Sporenketten gebildet, die 2-50 ovale Sporen in einer Kette (meistens 5-20 Sporen) enthalten. Die Sporenketten besitzen eine
gerade, sich schlängelnde oder gewundene Form. Die Sporen besitzen eine sphärische (0,3-0,4 μ), ovale oder zylindrische
(0,3 χ 1,5 - 3,0 μ) Form mit einer glatten Oberfläche. Die
Sporen sind oft durch leere Hyphen voneinander getrennt. Gelegentlich wird eine amorphe Sporangium-ähnliche Blase auf
dem Luftmyzel beobachtet, die kurze, spiralenförmige Sporenketten
umschließt.
Die Zellwand des Stammes G455-101 enthält Meso-diaminopimelinsäure
jedoch kein Glycin. Das Hydrolyseprodukt der gesamten Zelle zeigt die Anwesenheit von Glukose, Mannose und Madurose
(3-0-Methyl-D-galactose). Die zuvor erwähnte Zellwandzusammen-Setzung
und die Gesamtzellzuckerbestandteile deuten darauf hin,
daß der Stamm G455-101 eine Actinomycetesspecie des Zellwand-
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typs HIB ist.
Der Stamm G455-101 wächst reichlich, bildet ein blaß-rötliches
oder gräulich-blaß-rötliches Luftmyzel und produziert in nährstoffreichen
Agarmedien, wie Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar und Hafermehlagar,
ein rötliches, wasserunlösliches Pigment. Im anorganischen
SaIz-Stärkeagar , Glycerin-Asparaginagar und Tyrosinagar
wächst es spärlich, bildet ein weißes oder beiges rudimentäres Luftmyzel und produziert nur geringe Mengen des rötlichen Pigmentes.
Das Melanoidpigment wird in Pepton-Hefe-Eisenagar und
Tyrosinagar nicht produziert. Nitrat wird zu Nitrit reduziert. Es wächst reichlich bei 28°C, 37°C und 45°C, jedoch nicht bei
100C oder 500C. Pentosen und Hexosen werden gut von dem Stamm
verwertet. Kulturmäßige und physiologische Charakteristika des Stammes G455-101 sind in den Tabellen 1 und 2 gezeigt. Die
Verwertung von Kohlenstoffquellen ist in der Tabelle 3 gezeigt.
03 00 4.3/072
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Daten von Kulturen des Stammes Nr. G455-101*
1 . Czapeks Agar (Sucrose - Nitratagar) G**
R
A
D
R
A
D
kein oder dürftiges Wachstum
dunkel-rosa
weiß bis schwach-rosa
kein
2. Trypton-Hefeextraktbrühe (ISP Nr. 1) geringes Wachstum, flockig
sedimentiert und nicht pigmentiert
3. Hefeextrakt-Malzextraktagar (ISP Nr. 2) G reichlich
R dunkelrot bis rötlich braun
A reichlich, gräulich rosa bis purpurrosa
D kein
4. Hafermehlagar (ISP Nr. 3)
5. anorganische Salze-Stärkeagar (ISP Nr. 4)
6. Glycerin-Asparaginagar (ISP Nr. 5)
G | reich! | ich | :h-braun bis |
R | stark | bis beige | |
A | wenig, | gelblich-rot | |
D | gräuli | rosa | |
G | wenig | ch-gelb | bis rötlich |
R | leicht dunkel |
||
A | dürfti | gelbli( rot |
|
D | kein | g , weiß | |
G | wenig | ||
R | gelbli braun |
||
A | dürfti | ch-rosa | |
D | kein | g, we i ß | |
Ö30CU3/072B-
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TABELLE 1 (Fortsetzung)
.47
7. Pepton-Hefeextrakt-Eisen· agar (ISP Nr. 6)
8. Tyrosinagar (ISP Nr. 7)
9. Glucose-Ammoniumsalzagar
10. Bennetts-Agar
G | wenig, faltig |
R | stark rötlich-orange |
A | kein |
D | leicht gelblich-orange |
G | wenig |
R | dunkelrot |
A | dürftig, weiß |
D | kein |
G | wenig |
R | rötlich-braun |
A | dürftig, leicht grau |
D | kein |
G | mäßig |
R | rötlich-braun |
A | eingeschränkt, qräulic |
rosa kein
* beobachtet nach einer Inkubation von 3 Wochen bei 27°C.
** Abkürzung:
G - Wachstum
R - rückseitige Farbe des Substratmyzels
A - Luftmyzel
D - diffusionsfähiges Pigment
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Test
Bildung von Melanoid
Ergebnis
Nitrit aus Nitrat | positiv |
Nitrit aus Nitrat | positiv |
Kaseinhydrolyse in Agarmedium |
schwach positiv |
MagermiIchkoagulation | positiv |
Gelatineverflüssigung | negativ |
H?S-Produktion aus L-Cystein |
positiv |
negativ
anorganisches Medium: Czapeks Sucrosenitratbrühe
organisches Medium: 0,5 % Hefeextrakt, 1,0 % Glucose, 0,5 % KNO3, 0,1 % CaCO3
Lüdemanns Agarmedium
15 % Gelatine in Trypton-Hefeextraktbrühe (ISP Nr.1
Medium)
L-Cystein (0,1 %) hinzugegeben zu Trypton-Hefeextraktbrühe
(ISP Nr.1 Medium) plus Agar. H^S nachgewiesen mit
einem Papierstreifen 10 % wäßrige Bleiacetatlösung enthaltend.
Pepton-Hefe-Eisenagar (ISP Nr.6) und Tyrosinagar (ISP Nr.7).
Katalasereaktion | positiv | H2O2 wäßrige Lösung |
Oxidasereaktion | positiv | Kovacs-Reagens |
Wachstumstemperatur | reichliches Wachstum bei 28, 37 und 45°C. Geringes Wachstum bei 2Ö°C, kein Wachstum bei 100C und 500C |
Bennetts Agar |
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Verwertung von Kohlenstoffquellen für Stamm
Nr. G455-101
PG -H-
1, | Glycer i η |
2. | D(-)-Arabinose |
3. | L (+)-Arabinose |
4. | D-Xylose |
5. | D-Ribose |
6. | L-Rhamnose |
7. | D-Clucose |
8. | D-Galactose |
9. | D-Fructose |
10. | D-mannose |
11· | χ, (_)-Sorbose |
12. | Sucrose |
13. | Lactose |
14. | Cellobiose |
15. | Melibiose |
16. | Trebalose |
17. | Rafflnose |
18. | D(+)-Melez±tose |
19. | lösliche Stärke |
20. | Dulcltol |
21. | Inositol |
22. | D-Mannitol |
23. | D-Sorbitol |
24. | Sallein |
25. | Cellulose |
26. | Chitin |
27. | Keratin |
■H- +
Grundmedium PG : Pridham-Gottliebs anorganisches Medium, ver
sehen mit 0,1 % Hefeextrakt Lm : Liidemanns organisches Medium
Inkubation für ?. Wochen bei 37°C.
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ORIGINAL- J
Selbstverständlich ist die Herstellung des erfindungsgemäßen
BBM-928-Komplexes nicht auf den durch die oben genannten
Wachstums- und mikroskopischen Daten beschriebenen Actinomycetenspecien-Stamm Nr. Q455-101 beschränkt. Diese Daten sind nur
für beispielhafte Zwecke genannt. Die Erfindung betrifft auch die Verwendung von Stämmen oder Mutanten, die durch den oben
beschriebenen Organismus mit Hilfe von konventionellen Mitteln des Standes der Technik hergestellt werden, wie Bestrahlung mit Röntgenstrahle
Ul traviolettbestrahlung , Stickstoff lost (Senfgas),Phagenbestrahlung
und ähnlichem, die in der Lage sind, den ßßM-928-Komplex oder
einzelne Bestandteile von ihm herzustellen.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung des antitumorantibiotischen
BBM-928-Komplexes ist dadurch gekennzeichnet, daß der Actinomycetes-Stamm Nr. G455-101 in einer wäßrigen Lösung,
die eine assimilierbare Kohlenstoffquelle und eine assimilierbare
Stickstoffquelle enthält, durch Fermentation unter submersen aeroben Bedingungen kultiviert wird, bis die Lösung
eine beträchtliche antitumor-antibiotische Aktivität aufweist.
Konventionelle Fermentationsmethoden werden für die Kultivierung
des Actinomycetes-Stamm Nr. G455-101 angewendet. Die für die Herstellung der erfindungsgemäßen antibiotisehen Antitumormittel
zweckdienlichen Medien enthalten eine assimilierbare
KohlenstoffquelIe wie Stärke, Glucose, Dextrin, Maltose, Lactose,
Sucrose, Fructose, Mannose, Melasse, Glycerin und ähnliches. Das Nährmedium sollte auch eine assimilierbare Stickstoffquelle
enthalten, wie Protein, Proteinhydrolysate, Polypeptide, Aminosäuren, Getreidequel Ibriihe, Kasein, Harnstoff und ähnliches
so wie anorganische Nährsalze, die anorganische Anionen und Kationen liefern wie Kalium, Natrium, Ammonium, Calcium, Sulfat,
Carbonat, Phosphat, Chlorid, Nitrat und ähnliches.
Für die Herstellung des BBM-928-Komplexes kann jede für ein befriedigendes Wachstum des Organismus förderliche Temperatur
angewendet werden. Die Temperaturen können zwischen ungefähr
Ö 3 G Q 4 3 / Q 7 2 B
20° und 45°C liegen, wobei die für ein optimales Wachstum des Organismus bevorzugte Temperatur zwischen ungefähr 28° bis 34°C,
am besten jedoch zwischen 30° und 32°C liegt. Eine maximale Produktion des BBM-928-Komples wird im allgemeinen in ungefähr
4 bis 6 Tagen erhalten. Konventionelle Methoden werden während der Fermentationsperiode angewendet. Die Herstellung von kleinen
Mengen wird z.B. geeigneterweise in Schütte!kolben oder mittels
Oberflächenkulturen durchgeführt..Die Herstellung von
größeren Mengen wird vorzugsweise unter submersen aeroben Kulturenbedingungen
in sterilen Behältern durchgeführt. Bei der Behälterfermentation wird zuerst ein vegetatives Inoculum in
einer Nährbrühe hergestellt. Dies geschieht durch Animpfen der
KulturbrUhe mit einer Spore des Organismus, damit eine junge
aktive Samenkultur erhalten wird, die dann aseptisch in das Medium des Fermentationsbehälters übertragen wird. Die Be-Vüftunq
in den Behältern und Flaschen kann durch Einblasen von steriler Luft durch oder auf die Oberfläche des Fermentierungsmediums
geschehen. Zudem wird das Fermentierungsmedium in den Behältern mit einem mechanischen Rührer gerührt. Antischaummittel,
wie Silikonöl, Sojabohnenöl und Schweinefettöl,
können, falls erforderlich, hinzugefügt werden.
Der antibiotische Gehalt in der Fermentationsbrühe oder den Extrakten des BBM-928-Komplexes kann durch Papierscheibenagar-Diffusionsanalyse
bestimmt werden» indem Sarcina lutea als Testorganismus und ein Nähragar als Analysemedium benutzt werden.
Für die optimale Empfindlichkeit des Analysesystemes,
das für die Bestimmung der optimalen Wirksamkeit der Brühe benutzt wird, wird der pH auf 9,0 eingestellt.
Der BBM-928-Komplex wird mit konventionellen Mitteln wie Lösungsmittelextraktion
aus der Fermentationsbrühe isoliert. Die Reinigung wird geeigneterweise durch präparative Gegenstromverteilunqs-
und Chromatographierverfahren durchgeführt. Diese wer-
030043/072S
-33-
den noch eingehender in den Beispielen 2 und 3 bei der Gewinnung der BBM-928-Bestandteile A, B, C, D, E und F beschrieben.
Physikalisch-chemische Eigenschaften der BBM-928-Bestandteile
A, B, C und D von Beispiel 3
Die einzelnen Bestandteile von BBM-928 zeigen eine einander ähnliche Löslichkeit und Farbreaktionen. So sind sie z.B. gut
löslich in Chloroform und Methylenchlorid, wenig löslich in Benzol, Äthanol, Methanol und n-Butanol und unlöslich in Wasser
und η-Hexan. Sie zeigen eine positive Reaktion mit Eisen-(III)-Chlorid
und Ehr!ich-Reagens und eine negative Reaktion mit Tollens, Sakaguchi und N.inhydrin.
Die charakteristischen physikalisch-chemischen Eigenschaften
der BBM-928-Bestandteile des Beispiels 3 sind in der Tabelle 4 gezeigt.
In den Infrarot-Spektren zeigen
BBM-928A, B, C und D u.a. die folgenden Absorptionen (Wellenzahl in cm" ), wobei s =
b = breit, sh = Schulter.
b = breit, sh = Schulter.
zahl in cm" ), wobei s = stark, m = mittel, sw = schwach,
BBM-928 A
Figur 1 ca. 3450 m, b; 3330 m, b; 2970 sh; 2920 m; 2840 sh;
1740 s; 1680 sh; 1640 s; 1530 s; 1490 m; 1420m; 1395 m; 1340 m; 1290 m; 1230 s; 1195 m;
1150 sw; 1130 sw; 1025 m; 970 sw; 905 m; 830m;790 sw; 770 sw
BBM-928 B
Figur 2 3450 m, b; 3330 m, b; 2950 m; 2930 m;1740 s; 1670 sh
1640.s; 1530 s; 1480 m; 1420 m; 1340 m; 1290 m.;
030043/072B
1230 s; 1195 m; 1150 sw; 1020 m; 970 sw; 905 m; 830 m;
760 m
BBM-928 C 3380 m, b; 2920 m; 2840 sh; 1740 m; 1670 sh; 1650 s;
Figur 3 1530 s; 1485 m; 1430 m; 1340 m; 1285 m; 1225 m;
1195 sw; 1150 sw; 1025 m; 960 sw; 910 sw; 830 sw
BBM-928 D 3470 m, b; 3320 m; 2950 m; 2930 sh; 1740 s; 1640 s, b;
Figur 4 1530 s; 1480 m; 1420 m; 1340 m; 1295 m; 1230 s; 1200 m;
1170 sh; 1130 sh; 1040 m; 970 sw; 910 m; 830 m; 810 sw;
770 m;
In den NMR-Spektren zeigen
BBM-928 A, B, C und D u.a. die folgenden Absorptionen (ppm):
BBM-928 A 11,7, 9,25, 9,15, 8,8, 7,65, 7,55, 7,45, 7,3, 6,9,
Figur 5 ' 5,7, 5,5, 5,2, 4,45, 4,05, 3,9, 3,6, 3,25, 3,15, 2,9, 2,0, 1 ,25, 1,05
BBM-928 B 11,6, 11,55, 9,3, 7,4, 7,25, 6,9, 5,7, 5,3, 5,2, 4,5, Figur 6 3,9, 3,25, 3,2, 3,1, 2,9, 2,35, 2,05, 1,35, 1,05
BBM-928 C 11,5, 9,3, 9,4, 8,75, 7,7, 7,6, 7,45, 7,25, 6,85, Figur 7 5,65, 5,4, 5,2, 4,65, 4,2, 3,9, 3,65, 3,5, 3,2, 3,1,
2,85, 2,4, 1 ,8, 1 ,35, 1,05
BBM-928 D 11,6, 9,25, 9,2, 7,65, 7,6, 7,4, 7,2, 7,15, 7,0, Figur 8 6,9, 6,8, 5,8, 5,7, 5,5, 5,2, 4,4, 4,05, 3,9, 3,6,
3,3, 3,2, 2,95, 2,65, 2,3, 2,05, 1,3, 1,0.
030043/072
M/21 065
Phys | C : | TABELLE | 4 | ile A, "B, | C und D | B | C | D | |
der | H : | BBM-928 | 214-217°C | 244-248°C | .224-2270C | ||||
N : | ikalisch-chemische Eigenschaften | -74° | -91° | -13° | |||||
O : | BB-928-Bestandte | 50.14 | 51.77 | 50.75 | |||||
5.29 | 5.29 | 5.25 | |||||||
Schmelzpunkt | [a]*5 (c 1, CHCl3) | A | 12.34 | 13.55 | 12.58 | ||||
Anal. gef. | 246-248°C | 32.23 | 29.39 | 31.42 | |||||
-27° | |||||||||
53.19 | |||||||||
( Differenz) | 5.40 | ||||||||
12.92 | |||||||||
28.49 |
in η (E
in EtOH |
235(586)
264(415) 345(165) |
235(570)
264(400) 345(163) |
235(638)
264(442) 345(173) |
235(550)
264(380) 345(155) |
in EtOH-HCl |
234(610)
264(410) 345(165) |
234(556)
264(446) 349(188) |
234(650)
264(442) 345(173) |
234(565)
264(405) 345(165) |
in EtOH-NaOH |
230(564)
256(763) 330(180) 383(170) |
230(530)
256(775) 330(116) 383(122) |
230(580)
256(704) 330(117) 383(122) |
230(650)
256(930) 330(140) 383(145) |
Mol.-Gew.
(Osmometer, in CHCl.) |
1,450 | _ | 1,470 |
0043/0725
. 25·
Infrarot-(IR) und kernmagnetisch Resonanz-(NMR) Spektren der
Bestandteile A, B, C und D werden jeweils in den Figuren 1 bis und Figuren 5 bis 8 der begleitenden Zeichnungen gezeigt. Die
NMR-Spektren von BBM-928A (Fig. 5), BBM-928B (Fig. 6) und
BBH-928C (Fig. 7) ähneln einander sehr mit dem einzigen Unterschied,
daß Acetylgruppen in den BestandteilenA (ti : 2,03 ppm, 2 Mol Äquivalente)
und B [S : 2,05 ppm, 1 Mol Äquivalent) jedoch nicht in C vorhanden sind. Durch Acetylierung mit Acetanhydrid in Pyridin
wurden 2, 3 und 4-molare Äquivalente von Acetylgruppen in
die jeweiligen Bestandteile A, B und C von BBM-928 eingeführt. Die so erhaltenen Acetylierungsprodukte zeigen identische Eigenschaften
in DC, UV, IR und NM.R-Spektren, wodurch angezeigt wird,
daß BBM-928A ein Monoacetylderivat von BBM-928B und ein Diacetylderivat
von BBM-928C ist.
Säurehydrolyse von BBM-928A ergab fünf in n-Butanol-lösliche
UV-absorbierende Fragmente (I, II, III, IV und V) und fünf wasserlösliche Ninhydrin-postive Substanzen (NPS-1 , 2, 3, 4 und 5).
Letztere Substanzen wurden durch Dowex 50 χ 4 Chromatographie getrennt und als folgende Aminosäuren identifiziert:
Verbindungen | Rf (S-123)* | Identifizierung |
NPS-1 | 0,72 | ß-Hydroxy-N-methylvalin (HM-VaI) |
NPS-2 | 0,49 | Glycin (GIy) |
MPS-3 | 0,46 | Serin (Ser) |
NPS-4 | 0,45 | Sarcosin (Sar) |
NPS-5 | 0,23 | (nicht zugeordnet) |
*DC, Silikagelplatte
S-123: 10 % Ammoniumacetat-Methanol-10 %-ige Ammoniaklösung
(9:10:1)
0300A3/0726
M/21 065
M-
Die oben erwähnten fünf UV-absorbierenden Fragmente haben die folgenden Strukturformeln:
CH7OH
CO-NH-CH-CO2H
Fragment I .
C14H14N2°6
MS: m/e 306 (M+)
1I 227, 233, 251, 345 nm
C20H25N3°8
OH O-CO-CH-C(CHj)2 ms: m/e 377 (M+-58)
fs
NH OH
ι ι
CO-NH-CH-CO2H
λΜβ0Η.
C0-(NPS-5)
Fragment III xMe0H.
max
MS: m/e 205 (M+) xMe0H
max
030043/07
""^ C H NO
OH 0-CO-CH-N-CO-CH9NH 3 30 9
ι ι *t
CH- CH, CH,X"_ : 230, 235, 262, 345 nm
ι 2 3 J OBX
CO-NH-CH-CO2H
Nach Säurehydrolyse (6N HCl) ergeben die Fragmente I, II, III und V die folgenden Abbauprodukte:
Hydrolysebedingung
verschlossenes Gefäß | _ _ | am | Rückfluß | |
Fragment | 110°, 20 Stunden | 11 | 00C, 3 Stunden | |
I | IV, Ser | |||
II | IV, Ser, HM-VaI | I, | HM-VaI | |
III | IV | -- | ||
V | I, | HM-VaI , Sar |
Ser : Serin
HM-VaI : ß-Hydroxy-N-methylvalin
Sar : Sarcosin
Basische Hydrolyse von BBM-928A oder BBM-928C mit 0,1 N NaOH bei 25°C für 3 Stunden ergibt Fragment VI (Abkürzungen Ser, HM-VaI
und Sar wie oben angegeben, wobei Gly=Glycin und das Symbol "X" eine unzugeordnete Einheit darstellen)
030043/0725
Die Behandlung von Fragment VI mit 0,1N HCl bei 1100C für
eine Stunde ergibt das Fragment VII plus HM-VaI:
Die Behandlung von Fragment VI mit 0,1N NaOH bei 370C für
40 Stunden ergibt das Fragment VIII plus Fragment I:
χ _> GIy -^ Sar -» HM-VaI
Fragment VIII
Die Behandlung von Fragment VII mit 0,1N NaOH bei 37°C für 40 Stunden ergibt das Fragment IX plus Fragment I:
X -» GIy -* Sar
Fragment IX
Die unzugeordnete Einheit (X) besitzt eine Molekularformel von C5HgN2O2 (in Peptidform), bestimmt durch Mikroanalyse von
Fragment IX und anderen Peptidfragmenten, die (X) enthalten,
und Spektralanalysen, die weiter unten zusammengefaßt sind.
Q30043/Q72S
M/21 065
13
C-NMR 30.14 (t)
61.4 (d)^
61.7
140.7 (d) 171 (s)
- tf -
Protonen-KMR 2.36 ppm (2H, m)
4.2-4.5 (2H, m) 6.76 (IH, t)
2565
Zuordnung
-CH2-
21^O od. N)
-CH-N-
-CO- (Afflid) -OH
NH
Gemäß den Spektraldaten für die Fragmente VIII und IX und einem 360 MHz Protonen-NMR-Spektrum von BBM-928APdes Beispiels 4
scheint die nicht zugeordnete Aminosäureneinheit (X) am besten durch die folgende Tetrahydropyridazinstruktur wiedergegeben
werden zu können:
(X)
Aufgrund der Ergebnisse der oben beschriebenen Abbauexperimente, Spektraldaten, Mikroanalysen und Molekulargewichtsbestimmungen
wird angenommen, daß die nachfolgenden Strukturen BBM-928A, B
und C am besten darstellen:
030043/0728
A | !i | Ac | Ser | Senn | |
B | H | GIy : | Glycin | ||
BBM-928 | C | Ac | H | Sar : | Sarcosin |
BBM-928 | Ac | HM-VaI: | ß-Hydroxy-N-methylvalin | ||
BBM-928 | H | ||||
Die antimikrobielle Aktivität der BBM-928-Bestandteile wurde
gegenüber einer Vielzahl von Bakterien und Pilzen mit Hilfe der Reihenagarverdünnungsmethode in einem Nähragar bei pH 7
bestimmt, wobei Steers Mehrfach-Impfvorrichtung benutzt wurde.Die
Größe des Inoculums wurde standardisiert, um ein 0,0025 ml Aliquot
des Testorganismus anzuwenden, das etwa MP Zellen/ml enthält
bezogen auf alle Bakterien und Pilze mit Ausnahme von säurebeständigen Bakterien, für die eine Suspension mit 106 Zellen/ml b'<
nutzt wurde. Nach einer Inkubation über Nacht bei 37°C wurden die Mindesthemmkonzentrationen (MIC) bestimmt, die
in Tabelle 5 gezeigt sind. Wie dort zu sehen ist, sind die BBM-928-Bestandteile mäßig bis schwach aktiv gegen gram-positive
und säurebeständige Bakterien,jedoch praktisch inaktiv gegen gram-negative Bakterien und Pilze.
Die Aktivität der prophagen Induktion im lysogenen Bakterium (ILB) wurde für die BBM-928-Bestandteile bestimmt. Die BBM-928-Bestandteile
A, B und C weisen bis zu einer Konzentration von 100 mcg/ml keine signifikante ILB-Aktivitat auf.
Ö3Q043/072S
M/21 065
S. | -34 TABELLE ! |
• 5 |
tat von | B | C | D | sn | F | |
S. | Antimikrobielle in | vitro-Aktivi | Ten gegen aerobe Bakterii | 5 25 | 50 | 100 | mcg/ml) | 25 | |
1:
M. |
BBM-928-Bestandtei | BBM-928-Bestandtei1e(MIC in | 3 12. | .5 25 | 50 | E | 12.5 | ||
BBRI | Ci | A |
3 12.
5 25 |
.5 50
50 |
50
100 |
100 |
25
25 |
||
Code | B. | Testoroanismus | 12. | 50 | MOO | MOO | 50 | 50 | |
Sa-I | B. | aureus 209P | 6. | 25 | 100 | 100 |
50
100 |
25 | |
Sp-I | B. | pyogenes S-23 |
6.
12. |
25 | 50 | 100 | MOO | 25 | |
Sl-I
Mf-I |
M. |
_ lutea PCI 1001
flavus D12 |
25 | 3 12. | ,5 25 | 50 | 100 | 12.5 | |
Cr-I | M. | zerosis 53K-1 | 25 | 25 | 25 | 100 | 100 | 25 | |
Bs-I | E. | subtilis PCI 219 | 25 | 5 12. | 5 12.5 | 50 | 50 | 12.5 | |
Bg-I | K. | megaterium D2 | 6. | >100 | MOO | MOO | 100 | MOO | |
Ba-3 | P. | anthracls A9504 | 25 | MOO | MOO | MOO | 50 | MOO | |
M6-1 | P. | smegmatis 607 D87 | 12. | MOO | MOO | MOO | MOO | MOO | |
Mp-I | P. | phlei D88 | >100 | MOO | MOO | MOO | MOO | MOO | |
Ec-I | P. | coil NIBJ | >100 | MOO | MOO | MOO | MOO | MOO | |
Kp-I | S. | pneumoniae D-U | >100 | MOO | MOO | MOO | MOO | MOO | |
Pa-3 | A. | aeruginosa A9930 | >100 | MOO | MOO | MOO | MOO | MOO | |
Pv-I | C. | vulgaris A9436 | >100 | MOO | MOO | MOO | MOO | MOO | |
Pm-I | C. | mirabilis A9554 | >100 | MOO | MOO | MOO | MOO | MOO | |
Pg-I | morganll A9553 | >100 | MOO | 100 | MOO | MOO | MOO | ||
Sm-I | marcescens A20019 | >100 | MOO | ||||||
Al-I | faecalis ATCC 8750 | >100 | MOO | ||||||
Ca-I | arbicans IAM 4888 | 100 | |||||||
Cn-3 | neoformans | ||||||||
0300A3/0725
m/21 065 · - au - . 3012S65
Für die Antitumor-Aktivitat der Bestandteile A, B, C und D
von BBM-928 wurden Vergleichstests mit Mitomycin C mit intraperitoneal
implantierten Tumoren durchgeführt: P388-Leukämie, L121O-Leukämie, B16-Melanom, Lewis-Lungen(LL)-Karzinom und
Sarkom 180 Aszites (S180). Testlösungen von BBM-928-Bestandteilen in 0,9 %-iger Salzlösung, die 10 % Dimethylsulfoxid enthält,
und von Mitomycin C in 0,9 %-iger Salzlösung wurden einmal pro Tag entsprechend dem Dosierungsplan verabreicht. Dieser
Dosierungsplan reichte von einer einmaligen Behandlung an einem Tag bis zu einer mehrtägigen Behandlung. Durch Variation der
Dosis wurde die minimale effektive Dosis (MED) bestimmt, die bei den behandelten Tieren die Überlebenszeit mindestens um
den Faktor 1,25 - im Vergleich zur Kontrollgruppe - vergrößert.
Diese Aktivität wird als Maß einer signifikanten Antitumor-Aktivität
betrachtet. Die Ergebnisse sind zusammen mit den berechneten Aktivitätsverhältnissen in der Tabelle 6 gezeigt,
woraus sich ergibt, daß BBM-928A um den Faktor 10 bis 300 in Abhängigkeit von dem Tumorstamm und dem Dosierungsplan aktiver
ist als Mitomycin C. Die nach der Methode von Van der Waerden, Arch. Expt. Path. Pharmak., 195, 389 (1940) bestimmten intraperitonealen
LD5Q-Werte von den BBM-928-Komponenten A, B, C
und D und von Mitomycin C sind ebenfalls in der Tabelle 6 aufgeführt.
0300A3/0725
M/21 065
-X-•33.
Antitumor-Aktivi tat und Toxizitä't von BBM-928 A, B, C und D und Mitomycin C
Miniaale effektive Dosis(MED, mg/kg/Tag) 10SO4 1^"
P388 | L1210 | 3 | B16 | 30 | - | 300 | LL | S180 | (mR/kR/Taq) | - | 0.013 | |
Behandlung8 | 100 | 100 | 100 | 1.4 | ||||||||
BBM-928A | 0.003 | >O.l | 0.003 | 0.003 | 0.03 | 0.003 | 0.13 | |||||
BBM-928B | 0.1 | - | 0.3 | - | - | - | 0.18 | |||||
BBM-928C | - | - | - | - | - | 0.81 | ||||||
BBM-928D | 0.003 | - | - | - | - | 0.083 | ||||||
Mitomycin C | 0.1 | 1 | 0.3 | 0.3 | 9.3 | |||||||
Behandlung | ||||||||||||
BBM-928A | 0.001 | 0.003 | 0.003 | 0.0001 | ||||||||
Mitomycin C | 0.1 | 0.3 | 0.3 | 0.03 | ||||||||
AktivitätsverhäTthis": (BBM-928A gegenüber | Mitomycin | O | ||||||||||
Behandlung9 | 10 | 100· | ||||||||||
Behänd!una | 100 | 100 |
a. einmalige Behandlung am ersten Tag
b. tägliche Behandlung vom 1. bis 9. Tag
030043/0728
Ein gut gewachsener, schräg angelegter Agar eines Stammes von Actinomycetes Species G455-101 wird für die Animpung des vegetativen
Mediums benutzt, das 2 % lösliche Stärke, 1 % Glucose, 0,5 % Pharmamedien, 0,5 % Hefeextrakt, 0,5 % NZ-Amin (Typ A) und
0,1 % CaCO3 enthält, wobei der pH vor der Sterilisation auf 7,2 eingestellt
wird. Die Saatkultur wird bei 32°C für 72 Stunden auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung (250 Upm) inkubiert. Danacl
werden 5 ml der gewachsenen Kultur in einen 500 ml-Erlenmeyer-Kolben
gegeben, der 100 ml des Fermentationsmediums enthält, bestehend aus 2 %-iger löslicher Stärke, 1 % Pharmamedien,
0,003 % ZnS04-7H?0 und 0,4 % CaCO3. Die Herstellung des BBM-928-Komplexes
erreicht normalerweise nach 5 Tagen Schütteln ihr Maximum. ;
Eine Samenkultur wird für 4 Tage in Erlenmeyer-Kolben geschüttelt
und dann in 100 Liter des Keimungsmediums eingeimpft, das aus 2,0 % Hafermehl (Quaker Produkte, Australien), 0,5 % Glucose
0,2 % trockene Hefe, 0,0008 % MnCl2-4H20, 0,0007 % CuS04-7H20,
0,0002 % ZnS04-7H20 und 0,0001 % FeS04-7H20 besteht. Dieses Medium b(
findet sich.in einem 200 Liter-Sa atfermentierungstanks der
bei 300C 54 Stunden mit 200 Upm gerührt wird. 15 Liter dieser
Saatkultur werden dann in 170 Liter des Fermentationsmediums eingeimpft, das 2,0 % lösliche Stärke, 1,0 % Pharmamedien,
0,003 % ZnS04-7H20 und 0,4 % CaCO3 enthält. Dieses Medium befindet
sich in einem 400 Liter-Fermentierungstank, der bei 3O0C
mit 200 Upm gedreht wird, wobei die Belüftungsrate bei 150 Liter/Minute
liegt. Der pH der Brühe steigt schrittweise mit dem Fortschreiten der Fermentation und erreicht nach 100 bis 120
Ö300A3/072S
Stunden 8,4 bis 8,5. Zugleich wird ein Antibiotikum-Höchstwert
von 30 mcg/ml erhalten.
Die aus dem Beispiel 1 erhaltene Brühe (170 Liter, pH 8,5) wird
mit einem Klärungsmittel filtriert. Eine Aktivität wird sowohl in dem Myzelkuchen als auch in dem Filtrat beobachtet.
Der Myzel kuchen wird zweimal mit einem Lösungsmittel gemisch aus Aceton und Methanol (1:1, 30 Liter x 2) extrahiert. Die
Extrakte werden vereinigt und unter vermindertem Druck eingeengt. Es ergibt sich ein wäßriges Konzentrat, das mit n-Butanol
extrahiert wird. Das Filtrat der Brühe wird zweimal mit n-Butanol (40 Liter χ 2) extrahiert. Die Einengung der
vereinigten n-Butanolextrakte unter vermindertem Druck und die Lyophilisation des Rückstandes ergeben ein festes Rohprodukt
(21,4 g). Gemäß der Dünnschichtchromatographie-Analyse enthält dieses Material einen Komplex von drei Hauptbestandteilen A, B
und C und drei Unterbestandteilen D, E und F, die die in der Tabelle 7 angegebenen R^-Werte aufweisen.
0300A3/0728
M/21 065
BBM-928A BBM-928B BBM-928C BBM-928D BBM-928E BBM-928F
Rf-Werte * | |
System N-1 | 18** System N-103*** |
0,71 | 0,48 |
0,53 | 0,26 |
0,27 | 0,07 |
0,73 | 0,53 |
0,56 | 0,34 |
0,39 | 0,17 |
* aufgezeichnet mit einem UV-Detektor (Shimadzu CS-910) bei 345 nm
** n-Butanol-Methanol-Wasser (63:27:10)
*** Xylol-Methyläthylketon-Methanol (5:5:1)
B e i spiel
Reinigung des BBM-928-Komplexes.
Der Rohkomplex des Beispiels 2 wird in einem präparativen Gegenstromvertei1ungsapparat
(Mitamura, 1.00 ml/Röhre) gereinigt, wobei ein Lösungsmittel system von Tetrachlorkohlenstoff-Chloroform-Methanol-Wasser
(5:2:5:1) verwendet wird. Nach 50 Durchgängen werden die Röhren Nr. 5 bis 20 vereinigt und konzentriert
was ein schwach-gelbes Pulver (4,4 g) ergibt, das die Bestandteile
A, B, D, E und F enthält. Die Mischung wird in geringen
Mengen von Chloroform gelöst und auf eine Säule von Silikagel
Ö300A3/072I
• 3?·
C-200 (500 ml) gegeben, die mit Äthylacetat vorbehandelt wurde.
Die Säule wird mit Äthylacetat entwickelt, wobei der Anteil an Methanol (2 bis 5 %t V/V) steigt und die Fraktionen werden durch
Messung der optischen Dichte bei 345 nm überwacht. Der geringere Bestandteil D wird zuerst mit Äthylacetat eluiert gefölgt von
dem Bestandteil A. Die Bestandteile E, B und F werden danach in dieser Reihenfolge bei einer 3 /£-igen Methanol konzentration
eluiert. Jede Fraktion, die die entsprechenden Bestandteile enthält, wird unter vermindertem Druck eingeengt und der Rückstand
wird aus Chloroform-Methanol kristallisiert. In ähnlicher
Weise wird die Rohherstellung des Bestandteiles C aus den Röhren
Nr. 21 bis 35 der oben beschriebenen Gegenstromverteilung durchgeführt. Die Reinigung des Bestandteiles C wird mit Silikagelchromatographie
und Kristallisation aus Chloroform-Methanol durchgeführt. Ausbeuten für die Bestandteile A, B, C, D, E und
F sind jeweils 988 mg, 420 mg, 848 mg, 130 mg, 119 mg und 114 mg.
Die Dünnschichtchromatographie-Analyse des BBM-928A-Bestandteiles des Beispiels 3 (wobei ein System von 10 % Methanol in
Toluol benutzt wird) zeigte, daß die Probe nicht vollständig homogen war. Sie enthielt zusätzliche Substanzen, die gerade
vor dem BBM-928A-Bestandteil liefen. Die folgenden Schritte wurden
unternommen, um eine Reinigung durchzuführen.
(1) Die Probe wird auf iSil ikagel chromatographiert, wobei ein
linearer Gradient von Chloroform nach 6 % Methanol in Chloroform
eingestellt wird. Die bei 2,4 bis 3,3 % Methanol in Chloroform eluierten Fraktionen (den BBM-928A-Bestandteil
und etwas Verunreinigung enthaltene} werden für die nächste Stufe zusammengegeben.
Ö30043/0726
(2) Ein konkaver Gradient wird dadurch eingestellt, daß drei Gefäße benutzt werden, die 2 % Methanol in Toluol in den
beiden ersten und 6 % Methanol in Toluol in dem dritten enthalten. Die bei diesem Gradienten chromatographierten
zusammengegebenen Fraktionen aus Stufe 1 (SiIikagelsäule)
ergeben einen kleineren Anteil, der als erstes eluiert wird, dicht gefolgt durch den gereinigten Bestandteil
BBM-928A (hier bezeichnet als BBM-928A ).
Molekulargewicht von BBM-928A , bestimmt durch Feld-Desorptions
massen-Spektrometrie, beträgt 1427 und entspricht einer empirischei
Formel von C54H78N14O24 (MW 1427.417).
Elementaranalyse (Proben getrocknet bei 1000C für 18 Stunden)
für C64H78N14O24:
• a | 53 | C | 5 | H | 1 | 3 | N | 26 | 0a | |
ber | b. • a |
52 | ,85 | 5 | ,51 | 1 | 3 | ,74 | 28 | ,90 |
gef | ,47 | ,48 | ,81 | ,24a | ||||||
a. durch Differenz
b. Durchschnitt von drei Bestimmungen.
Ill/V.
Ö 3 0 (H 3 / Q 7 2 S
L e e r s e 11 e
Claims (12)
- .j Antitumor-antibiotische Verbindung BBM-928A, dadurch gekennzeichnet:(a) daß sie in Chloroform und Methylenchlorid löslich, in Benzol, Äthanol, Methanol und n-Butanol wenig löslich und in Wasser und η-Hexan im wesentlichen unlöslich ist;(b) daß sie eine positive Reaktion mit Eisen-(III )-Chl orid '. und Ehrlich-Reagentien und eine negative Reaktion mit Tollens-, Sakaguchi-und Ninhydrin-Reagentien ergibt;(c) daß sie ein wirksames Antitumormittel gegen P388-Leukämie, L1210-Leukämie, B16-Melanom, Lewis-Lungen-Karzinom und intraperitoneal in "Mäuse implantierte Sarkom 180 Aszitestumore darstellt;(d) daß sie einen Schmelzpunkt von 246 bis 248°C hat;tJ~\ 25(e) daß sie eine spezifische Drehung von I0M n = 27° (c 1 ,CHCl3) aufweist;D .(f) daß sie ein Molekulargewicht von 1427 besitzt; ;(g) daß sie eine ungefähre elementare Zusammensetzung von ; 52,47 % Kohlenstoff, 5,48 % Wasserstoff, 13,81 % Stick- . stoff und 28,24 % Sauerstoff hat,(h) daß sie bei der SiIikageldünnschichtchromatographie mit einem Lösungsmittel system n-Butanol-Methanol-Wasser (63:27:10) einen Rf-Wert von 0,71 besitzt, und daß sie bei Verwendung eines Lösungsmittelsystemes Xylol-Methyl-030043/Q725 original inspectedäthylketon-Methanol (5:5:1) einen R^-Wert von 0,48 besitzt;(i) daß sie bei der sauren Hydrolyse wasserlösliche Ninhydrin-positive Substanzen inklusive ß-Hydroxy-N-methyl valin, Glycin, Serin und Sarcosin ergibt;(j) daß sie bei der basischen Hydrolyse das Fragment VI ergibt:Fragment VIwobei Ser für Serin, GIy für Glycin, Sar für Sarcosin, HM-VaI für ß-Hydroxy-N-methylvalin und das Symbol X für eine Aminosäureneinheit steht;(k) daß sie ein Infrarot-Absorptionsspektrum in KBr aufweist, das in der Figur 1 gezeigt.ist; und(1) daß sie in deuteriertem Chloroform gelöst das in Figur 5 gezeigte Protonen-NMR-Spektrum ergibt.
- 2. Antitumor-Antibiotikum gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäureneinheit X in der Peptid-"form die empirische Formel C5H-N2O2 besitzt.
- 3. Antitumor-Antibiotikum gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß in der Peptidform die Aminosäureein- ;030ÖA3/072SM/21 065heit X der TetrahydropyridazinrestItc—OHist.
- 4. Antitumor-antibiotische Verbindung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie die folgende Struktur besitzt:C+Gly+Sar*BM-ValO ^ HO«-SerKJOOCH.wobei Ser für Serin, GIy für Glycin, Sar für Sarcosin, HM-VaI für ß-Hydroxy-N-methylvalin und R. und Rg für Acetyl stehen.
- 5. Antitumor-antibiotische Verbindung BBM-928B, die eio Chinolinchromophor enthält und die bei saurer Hydrolyse wasserlösliche Bestandteile inklusive Serin, Glycin, Sarcosin und ß-Hydroxy-N-methylvalin ergibt, und die in ihrer im wesentlichen reinen Form dadurch gekennzeichnet ist:(a) daß sie in Chloroform und Methylenchlorid löslich, in Benzol, Äthanol, Methanol und n-Butanol wenig löslich030043/0726M/21 065 - 4 -und in Wasser und η-Hexan im wesentlichen unlöslich ist;(b) daß sie mit Eisen-(III)-Chlorid und Ehrlich-Reagentien eine positive Reaktion und mit Tollens·; Sakaguchi-und Ninhydrin-Reagentien eine negative Reaktion ergibt;(c) daß sie ein wirksames Antitumormittel gegen P388-Leukämie, intraperitoneal in Mäuse implantiert, darstellt;(d) daß sie einen Schmelzpunkt von 214 bis 217°C besitzt;(e) daß sie eine spezifische Drehung von [oi u = -74° (c 1, CHCl3) aufweist;(f) daß sie eine ungefähre elementare Zusammensetzung von 50,14 % Kohlenstoff, 5,29 % Wasserstoff, 12,34 % Stickstoff und 32,23 % Sauerstoff besitzt;(g) daß sie bei der Si 1ikageldünnschichtchromatographie mit einem Lösungsmittel system von n-Butanol-Methanol Wasser (63:27:10) einen R^-Wert von 0,53 und bei Verwendung eines Losungsmittelsystemes Xylol-Methyläthylketon-Methanol (5:5:1) einen R^-Wert von 0,26 aufweist;(h) daß sie das in Figur 2 gezeigte in KBr aufgenommene Infrarot-Spektrum aufweist; und(i) daß sie in deuteriertem Chloroform gelöst im wesentlichen das in Figur 6 gezeigte Protonen-NMR-Spektrum aufweist.030043/0725M/21 065
- 6. Verbindung gemäß Anspruch 5, gekennzeichnet durch die Strukturformel:worin Ser für Serin, GIy für Glycin, Sar für Sarcosin, HM-VaI für ß-Hydroxy-N-methylvalin und R^ für Acetyl steht.
- 7. Antitumor-antibiotische Verbindung BBM-928C, die ein Chinolinchromophor besitzt und bei saurer Hydrolyse wasserlösliche Bestandteile inklusive Serin, Glycin, Sarcosin und ß-Hydroxy-N-methylvalin ergibt und die in ihrer im wesentlichen reinen Form dadurch gekennzeichnet ist:(a) daß sie in Chloroform und Methylenchlorid löslich,in Benzol, Äthanol, Methanol und n-Butanol wenig löslich und in Wasser und η-Hexan im wesentlichen unlös-1 ich ist;(b) daß sie mit Eisen-(III)-Chlorid und Ehrlich-Reagentien eine positive Reaktion und mit Tollens-, Sakaguchi-und Ninhydrin-Reagentien eine negative Reaktion ergibt;(c) daß sie ein wirksames Antitumormittel gegen P388-Leukämie, L121O-Leukämie, B16-Melanom, Lewis-Lungen-Karzinom und intraperitoneal in Mäuse implantierte Sarkom 180-Aszites-Tumore darstellt;030043/0726M/21 065 - 6 -(d) daß sie einen Schmelzpunkt von 244 bis 2480C besitzt;7 c(e) daß sie eine spezifische Drehung von [<* ~\i = -91° (c 1, CHCl3) besitzt;(f) daß sie ein ungefähres Molekulargewicht von 1470 besitzt;(g) daß sie eine ungefähre elementare Zusammensetzung von 51,77 % Kohlenstoff, 5,29 % Wasserstoff, 13,55 % Stickstoff und 29,39 % Sauerstoff aufweist;(h) daß sie bei der SiIikageldünnschichtchromatographie mit einem Lösungsmittel system von n-Butanol-Methanol Wasser (63:27:10) einen Rf-Wert von 0,27 und daß sie mit einem Lösungsmittelsystem von XyI öl-Methyl äthyl keton-Methanol (5:5:1) einen R--Wert von 0,07 aufweist;(i) daß sie im wesentlichen das in Figur 3 gezeigte in KBr aufgenommene Infrarot-Absorptionsspektrum aufweist; und(j) daß sie in deuteriertem Chloroform gelöst im wesentlichen das in Figur 7 gezeigte Protonen-NMR-Spektrum aufweist.
- 8. Verbindunq gemäß Anspruch 7, gekennzeichnet durch die Strukturformel:030043/0725M/21 065V—μ ♦— SerKJOOCH.worin Ser für Serin, GIy für Glycin, Sar für Sarcosin und HM-VaI für ß-Hydroxy-N-methyl valin steht.
- 9. Antitumor-Antibiotikum BBM-928D, dadurch gekennzeichnet:(a) daß es in Chloroform und Methylenchlorid löslich, in Benzol, Äthanol, Methanol und n-Butanol wenig löslich und in Wasser und η-Hexan im wesentlichen unlöslich ist;(b) daß es eine positive Reaktion mit Eisen-(III )-Chlorid und Ehrlich-Reagentien und eine negative Reaktion mit Tollens-; Sakaguchi-und Ninhydrin-Reagentien ergibt;(c) daß es ein wirksames Antitumormittel gegen intraperitoneal in Mäuse implantierte P388-Leukämie darstellt;(d) daß es einen Schmelzpunkt von 224 bis 227°C besitzt;(e) daß es eine spezifische Drehung von [VJn = "13° (c 1, CHCl3) besitzt;(f) daß es eine ungefähreelementare Zusammensetzung von 50,75 % Kohlenstoff, 5,25 % Wasserstoff, 12,58 % Stickstoff und 31,42 % Sauerstoff besitzt;(g) daß es bei cferSil ikageldünnschichtchromatographie mit einem Lösungsmittel system von n-Butanol-Methanol-Was-030043/072Bser (63:27:10) einen R^-Wert von 0,73 und mit einem Lösungsmittelsystem von XyI öl-Methyläthylketon-Methanol (5:5:1) einen Rf-Wert von 0,53 aufweist;(h) daß es im wesentlichen das in Figur 4 gezeigte in KBr aufgenommene Infrarot-Spektrum aufweist; und(i) daß es in deuteriertem Chloroform im wesentlichen das in Figur 8 gezeigte Protonen-NMR-Spektrum aufweist.
- 10. Fermentationsverfahren für die Herstellung des antitumor-antibiotischen BBM-928-Komplexes,dadurch gekennzeichnet, daß ein'Actinomycetesstamm, der die Charakteristi ka des Stammes Nr. G455-101 aufweist, in einer wäßrigen Lösung, die eine assimilierbare Kohlenstoffquelle und eine assimilierbare Stickstoffquelle enthält, unter submersen aeroben Bedingungen kultiviert wird, bis der hergestellte BBM-928-Komplex der Lösung eine beträchtliche antitumor- ' antibiotische Aktivität verleiht. ■
- 11. Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß der BBM-928-Komplex in einer weiteren Stufe aus dem Kulturmedium gewonnen wird.
- 12. Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daßin einer weiteren Stufe der BBM-928-Komplex in die Bestandteile A, B, C, D, E und F getrennt wird, wobei die Bestandteile bei der Si 1ikageldünnschichtchromatographie die folgenden R-r-Werte aufweisen:030<U3/072BRf-Werteη-Buta no1-Methanol - XyI öl-Methläthylke-Wasser (63:27:10) ton-Methanol (5:5:1)BBM-928A 0,71 0,48BBM-928B 0,53 0,26BBM-928C 0,27 0,07BBM-928D 0,73 0,53BBM-928E 0,56 0,34BBM-928F 0,39 0,170300A3/072B
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