DE2746253C2

DE2746253C2 - Verfahren zur Herstellung von Maytansinol und dessen Derivaten

Info

Publication number: DE2746253C2
Application number: DE2746253A
Authority: DE
Inventors: Mitsuko Takatsuki Osaka Asai; Eiji Takarazuka Hyogo Higashide; Seiichi Kyoto Tanida
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1977-03-31
Filing date: 1977-10-14
Publication date: 1986-08-21
Also published as: SU938746A3; IT7821819A0; FR2385798A1; CA1092999A; FR2385798B1; SE7711543L; IE45888B1; IE45888L; DK143570B; JPS53121998A; CH631740A5; HU177391B; IT1094003B; GB1554395A; PL201539A1; PL108863B1; JPS6010718B2; AU507869B2; PT67853B; AU2907377A

Description

1. Morphologische Eigenschaften

Das vegetative Mycel dehnt sich gut aus und entwickelt sich zu Verzweigungen und dies sowohl auf Agar als auch im flüssigen Medium. Manche der Hyphen haben einen Durchmesser von 0,8 bis 1,2 μπι und können sich in gewissen Fällen unter Bildung von Bruchstücken teilen, welche Stäbchenbakterien oder verzweigten kurzen Hyphen ähneln. Der Stamm zeigt ein gutes Wachstum auf verschiedenen taxonomischen Medien, wobei auf dem vegetativen Mycel sich ein Luftmycel anlagert. Häufig bilden sich auch coremiaähnliche Körper (50—200x200—1000μηι), auf welchen weiteres Luftmycel wächst. Manche der Luftmycele sind gewunden, wobei hin und wieder auch gerade oder weite spiralähnliche Konfigurationen auftreten können. Die mikroskopische Untersuchung von älteren Kulturen zeigt, daß nur in wenigen Fällen die conidienartigen Zellen in Ketten vorliegen, während die aus den Oberflächen solcher Kulturen erhaltenen Zellsuspensionen bei der Betrachtung unter dem Mikroskop verschiedentlich verlängerte, ellipsoidale (0,8—1,2 μίτι χ 4,8—6,8 μίτ») und ellipsoidal (0,8—1,2 μπι χ 1,0—2,0 μπι) Körper, welche Arthrosporen ähneln, enthielten.

Beobachtungen unter dem Elektronenmikroskop ergaben, daß diese Körper glatte Oberflächen haben.

2. Zellenzusammensetzung

Der Stamm wurde in einem modifizierten ISP No. 1-Medium während 66 bis 90 Stunden bei 28°C unter Schütteln gezüchtet, worauf man die Zellen sammelte und spülte. Nach der Methode von B. Becker et al. [Applied Microbiology 12, 421 (1964)] und der Methode nach M. P. Lechevalier [Journal of Laboratory and Clinical Medicine 71,934 (1968)] wurden die so erhaltenen, ganzen Zellen auf ihren Gehalt an Diaminopimelinsäure und Zuckerzusammensetzung untersucht. Die Säure lag in der meso-Form vor, während Stellen beobachtet werden konnten, weiche auf Galactose und Arabinose deuteten.

3. Eigenschaften auf taxonomischen Medien

Der Stamm zeigte ein verhältnismäßig gutes Wachstum auf verschiedenen Medien, wobei das vegetative Myce! in den Anfangsphasen der Züchtung farblos bis blaßgelb und in den letzteren Phasen hellgelblich-lohfarben bis gelblichlohfarben war. Der Stamm erzeugte lösliche Pigmente, welche in verschiedenen taxonomischen s Medien gelb bis gelblichlohfarben waren. Das Luftmycel war pulvrig und zeigte im allgemeinen ein mäßiges Wachstum bei weißer bis gelber oder hellgelblichlohfarbener Färbung. Die Eigenschaften des Stammes in verschiedenen taxonomischen Medien finden sich in der folgenden Tabelle I.

Tabelle I
Züchtungseigenschaften des Stammes No. C-15003 auf taxonomischen Medien

(A) Saccharosenitrat-Agar: 15 Wachstum (G):

üppig, leuchtendmelonengelb (3 ia)*) bis bernsteinlohfarben (3 Ic)*), Bildung von coremiaähnlichen Gebilden

Luftmycel (AM): spärlich, weiß
Lösliches Pigment (SP): keines oder blaß gelblichlohfarben 20

(B) Glycerinnitrat-Agar:

G: mäßig, hellelfenbeinfarbig (2 ca)*), Bildung von coremiaähnlichen Gebilden

AM: mäßig, weiß
SP: kein

(C) Glucose-Asparagin-Agar: 25 G: mäßig, hellringelblumenfarbig (3 pa)*) bis leuchtendgelb (2 pa)*) AM: spärlich, weiß

SP: leuchtendgelb (2 pa)*)

(D) Glycerin-Asparagin-Agar:

G: mäßig, hellelfenbeinfarbig (2 ca)*), Bildung von coremiaähnlichen Körpern 30

AM: spärlich, weiß
SP: kein

(E) Stärkeagar:

G: mäßig, hellelfenbeinfarbig (2 ca)*) bis hellweizenfarbig (2 ea)*), Bildung von coremiaähnlichen

Körpern 35

A M: reichlich, elfenbeinfarbig (2 ca)*)
SP: kein

(F) Nähragur:

G: mäßig, hellelfenbeinfarbig (2 ca)*) bis khakigelb (2 ga)*), Bildung von coremiaähnlichen Körpern

AM: spärlich, weiß 40

SP: kein

(G) Calciummaleat-Agar:

Körpern

AM: mäßig, weiß bis hellelfenbeinfarbig(2 ca)*) 45

SP: kein
(H) Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar:

G: mäßig, bernsteinfarbig (3 Ic)*) bis leuchtend gelb (3 Ia)*), Bildung von coremiaähnlichen Körpern

AM: mäßig, weiß bis hellelfenbeinfarbig(2 ca)*)

SP: kein 50

(I) Hafermehl-Agar:

G. mäßig, hellelfenbeinfarbig (2 ca)*) bis khakigelb (2 ga)*), Bildung von coremiaähnlichen Körpern

AM: spärlich, weiß bis hellgelb

SP: kein
(J) Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Agar: 55

G: mäßig, khakigelb (2 ga)*)

AM: kein

SP: khakigelb (2 ga)*)
(K) Tyrosin-Agar:

G: mäßig, hellelfenbeinfarbig (2 ca)*) bis hellmelonengelb (3 ea)*), Bildung von coremiaähnlichen 60

Körpern

AM: mäßig, weiß bis hellelfenbeinfarbig (2 ca)*)

SP: kamelfarben (3 ie)*)

*) Farbcode nach »Color Harmony Manual«, 4. Auflage (Container Corporation of America, 1958). 65

4. Physiologische Eigenschaften

Die physiologischen Eigenschaften des Stammes finden sich in der folgenden Tabelle IL Der Temperaturbereich für das Wachstum lag bei 12 bis 38°C. Der Temperaturbereich, in welchem ein gutes Wachstum des Luftmycel auf Agar (ISP No. 2) eintrat, lag bei 20 bis 35°C.

Tabelle Il Die physiologischen Eigenschaften des Stammes No. C-15003 waren die folgenden:

Temperaturbereich für das Wachstum Temperaturbereich für das Wachstum des Luftmycels Verflüssigung von Gelatine Hydrolyse von Stärke Reduktion von Nitraten Peptonisierung von Milch Coagulierung von Milch Zersetzung von Casein Herstellung von Melanoid-Pigmenten

Zersetzung von Tyrosin Zersetzung von Xanthin Zersetzung von Hypoxanthin Toleranz in bezug auf Lysozym Toleranz in bezug auf Natriumchlorid

12bis38°C

20 bis 35⁰C

positiv

negativ

positiv

negativ (Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Agar), positiv (Tyrosin-Agar) positiv negativ negativ positiv

5. Verwendung von verschiedenen Kohlenstoffquellen

Die Verwendung von verschiedenen Kohlenstoffquellen wurde unter Verwendung eines Mediums, wie es in Pridham und Gottlieb [Journal of Bacteriology 5S, 107 (1948)] beschrieben ist, und eines Grundmediums gleicher Zusammensetzung plus 0,1% Hefeextrakt untersucht. Dabei ließen sich die in der folgenden Tabelle III wiedergegebenen Werte eruieren.

Tabelle III

Verwendung von Kohlenstoffquellen durch den Stamm No. C-15003

Kohlenstoffquelle

Wachstum

D-Xylose + + + L-Arabinose + + D-Glucose + + + D-Galactose + -ΙΟ-Fructose + + + L-Rhamnose + + D-Mannose + + + Saccharose + + + Lactose — — *) Maltose ± + Trehalose + + + Raffinose ± ±*) Melibiose + + i-Inosit — — D-Sorbit - — D-Mannit + + + Glycerin — ± lösliche Stärke + + Blindversuch — —

*) Grundmedium bei Zusatz von 0,1 % Hefeextrakt.

Anmerkung: + + +:

üppiges Wachstum gutes Wachstum Wachstum

schlechtes Wachstum kein Wachstum

6. Andere Eigenschaften

Die Zellen wurden nach der weiter oben unter 2) wiedergegebenen Methode gesammelt und DNA nach einer analogen Methode jener von J. Marmur et al. [Journal of Molecular Biology, 3, 208, 1961] hergestellt. Der G-QGuanin-Cytosin^Gehalt des DNA betrug ungefähr 71 Mol-%.

Die Gramfärbung des vegetativen Mycels dieses Stammes war positiv.

Die obigen Eigenschaften des Stammes No.C-15003 wurden mit den Angaben in S.A. Waksman's »The Actinomyectes« Bd. 2[The Williamsand WilkinsCo., 1961]; R. E. Buchanan und N. E.Gibbons,»Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Ausgabe, 1974«; und anderen Literaturstellen verglichen.

Es wurde angenommen, daß dieser Stamm zur Gruppe III der Gattung Nocardia gehören würde. Es konnte aber unter den bekannten Stämmen keine Art gefunden werden, welche die beschriebenen Eigenschaften aufwies. Daraus ist zu schließen, daß dieser Stamm eine neue Art der Gattung Mocardia darstellt.

Der besagte Stamm No. C-15003 ist beim »Institute for Fermentation, Osaka, (IFO)« unter der Nummer IFO 13726 registriert worden.

Das für die Züchtung des Stammes verwendete Medium (nachstehend der Kürze wegen als »herstellbarer Stamm« bezeichnet) kann ein beliebiges flüssiges oder festes iviedium sein, vorausgesetzt, daß es durch den Stamm verwertbare Nährstoffe enthält Vorzugsweise wird man aber zur Erzielung einer hohen Produktion ein flüssiges Medium verwenden. Das Medium kann Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, welche durch den Stamm No. C-15003 assimiliert werden, anorganische Stoffe, Spurennährstoffe usw. enthalten. Als Beispiele von in Frage kommenden Kohlenstoffquellen kann man Glucose, Lactose, Saccharose, Maltose, Dextrin, Stärke, Glycerin, Mannit Sorbit usw., Fette und öle, ζ. B. Sojabohnenöl, Specköl, Hühneröl usw., und dgl. nennen. Als Stickstoffquellen seien beispielsweise Fleischextrakt, Hefeextrakt, getrocknete Hefe, Sojabohnenmehl, Maisquellwasser, Pepton, Casein, Baumwollsamenmehl, behandelte Melassen, Harnstoff, Ammoniumsalze, ζ. Β. Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumnitrat, Ammoniumacetat usw., und dgl. verwendet werden. Das Medium kann ferner Natrium-, Kalium-, Calcium-, Magnesiumsaize usw., Eisen-, Magnesium-, Zink-, Kobalt-, Nickelsalze usw., Salze der Phosphorsäure, Borsäure usw. und organische Salze, ζ. Β. Acetate und Propionate, enthalten. Ferner kann das Medium zusätzlich verschiedene Aminosäuren, wie z. B. Glutaminsäure, Asparaginsäure. Alanin, Glycin, Lysin, Methionin, Prolin etc., Peptide, z. B. Dipeptide, Tripeptide etc., Vitamine, z. B. die Vitamine Bi, B2, Nicotinsäure, B12, C, E etc., Nucleinsäuren, z. B. Purin, Pyrimidin und Derivate davon, enthalten. Zur Einstellung des pH-Wertes des Mediums kann man auch eine anorganische oder organische Säure, ein Alkali, ein Puffermittel oder dgl. verwenden. Geeignete Mengen Ölen, Fetten, oberflächenaktiven Mitteln usw. können ebenfalls als schaumverhindernde Mittel zugesetzt werden.

Die Züchtung kann unter beliebigen stationären Bedingungen, unter Schütteln, unter submersen aeroben Bedingungen oder unter anderen Züchtungsbedingungen erfolgen. Um eine hohe Ausbeute zu erhalten, wird man vorzugsweise eine submerse, aerobe Züchtung vornehmen. Die Züchtungsbedingungen hängen selbstverständlich vom Zustande und von der Zusammensetzung des Mediums, des Stammes, der Züchtungsmethode und anderen Faktoren ab. Normalerweise erfolgt sie bei 20 bis 35⁰C bei einem anfänglichen pH-Wert von ungefähr 7,0. Vorzugsweise wird man als Züchtungstemperatur eine solche von 23 bis 30°C bei einem anfänglichen pH-Wert von 6,5 bis 7,5 anwenden. Auch die Inkubationsdauer schwankt je nach den oben erwähnten Faktoren, wobei man die Inkubation so lange fortsetzt, bis der Titer des gewünschten antibiotischen Produktes einen Maximalwert erreicht hat Im Falle von Schüttelkulturen oder aerob submersen Kulturen in einem flüssigen Medium liegt die normalerweise erforderliche Zeitdauer bei ungefähr 48 bis 144 Stunden.

Das Wirkungsvermögen des Antibiotikums wurde mit Tetrahymena pyriformis W als Testorganismus getestet. Dabei wurde der oben erwähnte Mikroorganismus auf einem Testmedium [20 g Proteose-Pepton, 1 g Hefeextrakt 2 g Glucose, 1000 ml destilliertem Wasser und 10 ml 1-molarer Phosphatpuffer (pH 7,0)] bei 28°C während 44 bis 48 Stunden wachsen gelassen, worauf man das Wirkungsvermögen des Antibiotikums durch die Reihenverdünnungsmethode unter Beobachtung der Wachstumstrübung und durch Dünnschichtchromatographie, abgekürzt TLC, nach den weiter unten beschriebenen Angaben bestimmt.

Maytanacin, Maytansinolpropionat oder Maytansinol wurde sowohl extrazellulär als auch intrazellulär in der erzielten Kullurbrühe erhalten und angereichert

Keine dieser Substanzen zeigt eine eindeutige antibiotische Wirkung. Die Bestimmung erfolgte daher durch TLC und parallel dazu durch Nachweis der Wirkung gegen den Tetrahymenastamm. Die Fermentierungsbrühe wurde somit durch Filtrieren oder Zentrifugieren in Zellen und Filtrat aufgeteilt und das Filtrat mit dem gleichen Volumen Athylacetat extrahiert Dann wurde den Zellen die gleiche Menge an 70%igem wäßrigen Aceton wie die Menge des Filtrates zugegeben, worauf man nach 1 stündigem Rühren bei 20⁰C die Suspension filtrierte. Das Aceton wurde aus dem Filtrat entfernt und das erhaltene wäßrige Filtrat mit Athylacetat extrahiert Jeder dieser Extrakte wurde im Volumenverhältnis 1 :100 eingeengt und über einer Kieselgel-Glasplatte (Kieselgel 60 F254, 0,25 mm, 20 χ 20) (Lösungsmittelsystem: Chloroform und Methanol in einem Mischungsverhältnis von 9:1) der Dünnschichtchromatographie unterworfen. Das Wirkungsvermögen wurde auf Grund der Intensität der bei Bestrahlung mit ultraviolettem Licht von 2537 Ä beobachteten Stellen bestimmt.

Das auf diese Weise in der Kulturbrühe erzeugte Maytanacin, Maytansinolpropionat oder Maytansinol ist lipophyl und neutral. Diese Substanzen lassen sich durch bei der Gewinnung solcher mikrobieller Metabolite normalerweise übliche Trenn- und Reinigungsmethoden isolieren. So kann man beispielsweise so arbeiten, daß man sich die Unterschiede zwischen dem Antibiotikum und den Verunreinigungen bezüglich der Löslichkeit zu nutze macht Man kann aber auch die fraktionierte Adsorptionsaffinität verschiedener Adsorptionsmittel, wie z. B. Aktivkohle, makroporösen, nichtionogener Harze, Kieselgel, Aluminiumoxyd usw. zur Anwendung bringen. Ferner kann man auch die Verunreinigungen mit Hilfe von Ionenaustauschharzen beseitigen. Man kann aber schließlich auch andere Methoden oder aber die vorgenannten Methoden in geeigneter Kombination oder aber

wiederholt anwenden.

Da, wie oben erwähnt, Maytanacin, Maytansinolpropionat oder Maytansinol sowohl im Filtrat als auch in den

Zellen vorhanden sind, wird man die Antibiotika mit Hilfe eines solchen Adsorptionsmittels, sofern ein solches

verwendet wird, entweder direkt oder nach erfolgter Extraktion mit einem Lösungsmittel im Falle eines Filtrates

oder nach erfolgter Extraktion mit einem Lösungsmittel im Falle von mikrowellen Zellen trennen und reinigen.

Die Extraktion mit einem Lösungsmittel kann nach einer beliebigen folgenden Methode oder mit Hilfe einer

anderen Methode, beispielsweise (1) durch Lösungsmittelextraktion aus der Kulturbrühe vor dem Abtrennen

der Zellen und (2) durch Lösungsmittelextraktion der Zellen und des durch Filtrieren gewonnenen Filtrates,

Zentrifugieren oder in anderer Weise, durchgeführt werden. Um das Filtrat und die Zellen unabhängig voneinan-

ο der zu extrahieren, wird man mit Vorteil die folgende Methode anwenden.

Für die Extraktion des Filtrates geeignete Lösungsmittel sind mit Wasser nicht mischbare, organische Lösungsmittel, wie z. B. Fettsäureester, wie Äthylacetat oder Amylacetat, Alkohole, wie Butanol, halogenierte Kohlenwasserstoffe, wie Chloroform, und Ketone, z. B. Methylisobutylketon. Die Extraktion erfolgt bei einem dem neutralen pH-Wert nahen pH-Wert und vorzugsweise wird die zuvor auf einen pH-Wert von 7 eingestellte Kulturflüssigkeit mittels Äthylacetat extrahiert. Der Extrakt wird mit Wasser gewaschen und unter vermindertem Druck eingeengt. Hierauf wird das Konzentrat mit einem nichtpolaren Lösungsmittel, z. B. Petroläther oder Hexan, versetzt und das rohe Produkt I, welches die wirksame Verbindung enthält, gewonnen. Da bei der Dünnschichtchromatographie eine gewisse Zahl von Stellen festgestellt wurden, welche Maytanacin, Maytansinolpropionat oder Maytansinol nicht entsprechen, wird das Produkt I anschließend den folgenden Reinigungs-

verfahren unterzogen. Dabei zeigt sich, daß eine routinemäßige Reinigungsmethode, insbesondere die Adsorptionschromatographie, wertvoll ist, wobei für diesen Zweck eines der üblichen Adsorptionsmittel, wie Kieselgel, Aluminiumoxyd, ein makroporöses, nichtionogenes Adsorptionsharz usw., verwendet werden kann. Zur Reinigung des rohen Produktes I ist Kieselgel besonders wertvoll. Die Entwicklung kann beispielsweise, ausgehend von Petroläther und Hexan, erfolgen, während die Eluierung durch Zugabe eines polaren Lösungsmittels, wie

Äthylacetat, Aceton, Äthanol oder Methanol, erfolgt. Gemäß einem typischen Verfahren verwendet man Kieselgel (0,05 bis 0,2 mm) als Trägermittel und führt die Säulenchromatographie mit einer Mischung von Hexan und Äthylacetat durch, wobei der Hexananteil nacheinander zunimmt. Das Eluat wird gesammelt und durch TLC geprüft, wobei man die die wirksamen Bestandteile enthaltenden Fraktionen sammelt und unter vermindertem Druck einengt. Hierauf versetzt man das Konzentrat mit Petroläther oder Hexan, wodurch das rohe Produkt II erhalten wird. Da dieses Produkt immer noch Verunreinigungen enthält, wird es in der nachstehend beschriebenen Weise weiter gereinigt. So kann man das Produkt II beispielsweise mit Hilfe einer zweiten Kieselgelsäule unter Verwendung eines andersartigen Lösungsmittelsystems reinigen. Das für diesen Zweck verwendete Entwicklungssystem kann aus einem halogenierten Kohlenwasserstoff, z. B. Dichlormethan oder Chloroform, bei Zugabe eines polaren Lösungsmittels, wie einem Alkohol, z. B. Äthanol oder Methanol, einem Keton, z. B.

Aceton oder Methyläthylketon, oder dgl. bestehen Auf diese Weise läßt sich Maytanacin, Maytansinolpropionat

oder Maytansinol isolieren. Die Reihenfolge der Lösungssysteme für diese erste und die zweite Kieselgelsäulen

kann auch umgekehrt werden, wobei man überdies nötigenfalls auch übliche organische Lösungsmittel in

Verbindung mit den obigen Systemen verwenden kann.

Verwendet man für das Reinigen des rohen Produktes II ein makroporöses Adsorptionsharz, so erfolgt die

Eluierung von Maytanacin, Maytansinolpropionat oder Maytansinol mit einer Mischung von Wasser mit einem niederen Alkohol, einem niederen Keton oder einem Ester. Als niederer Alkohol kann man beispielsweise Methanol, Äthanol, Propanol oder Butanol und als niederes Keton beispielsweise Aceton oder Methyläthylketon verwenden. Der Ester kann beispielsweise Äthylacetat sein. Gemäß einer typischen Arbeitsweise löst man das rohe Produkt II in 60% wäßrigem Methanol und adsorbiert auf einer Säule von Diaion HP-10. Diese Säule \vird anschließend mit 70°/oigem wäßrigem Methanol gewaschen und mit 90%igem wäßrigem Methanol eluiert. Auf diese Weise wird Maytanacin, Maytansinolpropionat oder Maytansinol aus der Säule eluiert.

Bei jeder der vorgenannten Methoden werden die die gewünschten Komponenten enthaltenden Fraktionen gesammelt und unter vermindertem Druck eingeengt Dem getrockneten Produkt wird dann das 5- bis 8fache Volumen Äthylacetat zugesetzt und das Gemisch stehengelassen, worauf sich Kristalle von Maytanacin, Mayt-

ansinolpropionat oder Maytansinol ausscheiden. Enthalten die Kristalle Maytanacin und Maytansinolpropionat, so werden sie mit Hilfe eines Adsorptionsmittels beispielsweise der oben genannten Art voneinander getrennt. Verwendet man somit Kieselgel oder ein makroporöses, nichtionogenes Adsorptionsharz und die oben erwähnten Lösungsmittel, so können die gewünschten Verbindungen fraktioniert eluiert werden. Verwendet man beispielsweise Kieselgel, so erfolgt die Entwicklung mittels Hexan, Äthylacetat oder einer Mischung von Chloro-

form und Methanol, wodurch Maytansinolpropionat und Maytanacin in der erwähnten Reihenfolge erhalten werden. Nimmt man die Bildung dieser Substanzen durch Dünnschichtchromatographie wahr, so werden die Fraktionen unter vermindertem Druck eingeengt und Äthylacetat den Konzentraten zugegeben. Auf diese Weise erhält man die entsprechenden Verbindungen in Form von Kristallen. Verwendet man ein makroporöses, nichtionogenes Adsorptionsharz, so kann man eine stufenmäßige Eluierung mit schwankenden Verhältnissen an

Alkohol, Keton oder Ester in bezug auf das Wasser anwenden. Bei Anwendung der stufenweisen Eluierungsmethode unter Verwendung von 60%igem wäßrigem Methanol und 95%igem wäßrigem Methanol unter Zugabe von 5% Natriumchlorid erhält man in der vorgenannten Reihenfolge Maytanacin und Maytansinolpropionat. Nachdem man durch Dünnschichtchromatographie behandelt hat, wird jede Gruppe der aktiven Fraktionen unter vermindertem Druck eingeengt und aus Äthylacetat zum Auskristallisieren gebracht. Die isolierten

Kristalle enthalten Äthylacetat als Kristallisierungslösungsmittel und zeigen nach dem Trocknen über Phosphorpentoxyd während 8 Stunden bei 70°C die nachstehenden physikalischen und chemischen Eigenschaften (Tabelle iV).

Tabelle IV

Maytanacin C₃₀H₃₉ClN₂O₉

Maytansinolpropionat
C₃₁H₄ICIN₂O₉

Maytansinol
C₂₈H₃₇CIN₂O₈

Schmelzpunkt (⁰C)

Spezifische
Drehung .

Analyse
Gef.:(%)

Ultraviolettabsorptions
spektrum nm (ε)

Infrarotabsorptions
spektrum (cm-¹)

235-236°

(c= 0,25, CHGl₃)

C
H

N
Cl

59,62 6,93 4,28 5,74

C 59,85

H 6,48

N 4,61

Cl 5,84

233(30330) 240 (Sch. 28240) 252(27850) 280(5680) 288 (5660)

1740,1730,1670, 1580

Massenspektrum (m/e) 545,485,470,450

sauer, neutral
oder alkalisch

Farbreaktionen

lipophile und neutrale Substanz

Dragendorffreaktion: positiv

Beilsteinreaktion: positiv

188-190°

O]f-127°±10°
(c=0,35, CHCl₃)

59,93
6,82
4,32
5,57

59,94
6,65
4,51
5,71

233(30240)
240 (Sch. 28400)
252(27650)
280(5740)
288(5710)

1740,1730,1670
1580

559,485,470,450

lipophile und
neutrale Substanz

Dragendorffreaktion:
positiv

Beilsteinreaktion:
positiv

172,5-174°

[>]if-313°±10°
(c= 0,22, CHCl₃)

59,28
6,38
5,02
6,15

59,52
6,60
4,96
6,27

232(32750)
244 (Sch. 30850)
252(31650)
281 (5750)
288 (5700)

1715,1670,1580

503,485,470,450

lipophile und
neutrale Substanz

Dragendorffreaktion: positiv

Beilsteinreaktion:
positiv

Die oben genannten Daten in bezug auf die Elementaranalysen, spezifische Drehungen, Ultraviolettspektren, Infrarotspektren, Massenspektren usw. sind in Übereinstimmung mit den Werten für Maytanacin, Maytansinolpropionat und Maytansinol, wie sie aus Kupchan et al. ersichtlich sind. (The Journal of American Chemical Society 97,5294 [1975].)

Die folgenden Beispiele erläutern die vorliegende Erfindung. Die Teile sind jeweils Gew.-Teüe, sofern nichts anderes ausgesagt wird. Das Verhältnis zwischen den Teilen und Vol.-Teilen entspricht jenen zwischen g und ml. Der Ausdruck »%« bezieht sich auf »Gew./Vol«, sofern nichts anderes ausgesagt wird.

Beispiel 1

Der Mikroorganismus Nocardia No. C-15003 IFO 13726, welcher auf Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar gezüchtet worden war, wurde verwendet, um einen 200 Vol.-Teile fassenden Fermentierbehälter, welcher 40 Vol.-Teile eines Samenkulturmediums (2% Glucose, 3% lösliche Stärke, 1 % rohes Sojabohnenmehl, 1 % Maisquellflüssigkeit, 0,5% Polypepton, 0,3% NaCI, 0,5% CaCO₃, pH 7,0) enthielt, zu beimpfen. Das beimpfte Medium wurde während 48 Stunden bei 28°C inkubiert, um ein Inokulum zu erhalten. 0,5 VoL-Teile des so erhaltenen Inokulums wurden in einen 200 Vol.-Teile fassenden Fermentierbehälter, welcher 40 Vol.-Teile eines Fermentiermediums enthielt, welches aus 5% Dextrin, 3% Maisquellwasser, 0,1% Polypepton und 0,5% Calciumcarbonat (pH 7,0) bestand, enthielt, eingebracht und während 90 Stunden bei 28° C gezüchtet, um auf diese Weise ein Inokulum (Samenkuitur) zu erhalten.

Wie nach der Reihenverdünnungsmethode unter Verwendung von Tetrahymena pyriformis W als Testorganismus und Maytansinolpropionat als Standardprodukt festgestellt werden konnte, wies die obige Kultur einen Titer von 25 μg/ml auf.

Beispiel 2

VoL-Teile des gemäß Beispiel 1 erhaltenen Inokulums (Impfmaterial) wurden einem 2000 Vol.-Teile fassenden Fermentierbehälter zugesetzt, welcher 500 Vol.-Teile eines Samenkulturmediums gleicher Zusammensetzung wie oben enthielt, worauf man während 48 Stunden bei 28° brütete. 500 Vol.-Teile der so erhaltenen

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Kultur wurden in einen 50 000 Vol.-Teile fassenden Tank aus rostfreiem Stahl eingetragen, welcher 30 000 Vol.-Teile Samenkulturmedium enthielt, worauf man die Züchtung unter Belüftung (30 000 Vol.-Teile/Minute) bei 28°C züchtete und bei einem Inndruck von 1 kg/cm² bei 280 Umdrehungen pro Minute rührte, um auf diese Weise eine Samenkultur zu erhalten. Diese Kultur wurde zum Animpfen eines 200 000 Vol.-Teile enthaltenden Tanks aus rostfreiem Stahl verwendet, welcher 100 000 Vol.-Teile eines Fermentationsmediums ähnlicher Zusammensetzung wie im obigen Beispiel 1 enthielt, wobei eine Impfrate von 10% eingehalten wurde. Das angeimpfte Medium wurde unter Belüftung (100 000 Vol.-Teile/Minute) bei 28°C inkubiert und bei einem Innendruck von 1 kg/cm² während 90 Stunden bei 200 Umdrehungen pro Minute gerührt. Bei der Bestimmung des Titers in gleicher Weise wie in Beispiel 1 konnte man feststellen, daß die so erhaltene Kultur einen Tiler von

ίο 25 μg/ml aufwies.

90 000 Vol.-Teile der nach den obigen Angaben erhaltenen Kultur wurden mit 2000 Teilen Hyflo-supercel versetzt und das Gemisch nach gründlichem Mischen über einem Druckfilter filtriert, wobei 85 000 Vol.-Teile Filtrat und 32 000 Teile feuchte Zellen erhalten wurden. Das Filtrat (85 000 Vol.-Teile) wurde gerührt und mit 30 000 Vol.-Teilen Äthylacetat extrahiert. Diese Maßnahme wurde ein weiteres Mal wiederholt. Die Äthylacetatschichten wurden gesammelt, zweimal mit jeweils 30 000 Vol.-Teilen Wasser gewaschen, durch Zugabe von 500 Teilen wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck auf 200 Vol.-Teile eingeengt. Dann wurde das Konzentrat mit Petroläther versetzt und der entstandene Niederschlag durch Filtrieren gewonnen (53 Teile). Dieses rohe Produkt I wurde mit 100 Vol.-Teilen Äthylacetat verrührt, worauf die unlöslichen Bestandteile abfiltriert wurden. Das Filtrat wurde mit 10 Teilen Kieselgel (0,05 bis 0,2 mm) gerührt und das

Äthylacetat unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde oben auf eine Kieselgelsäule (400 Vol.-Teile) zugegeben. Dann wurde mit 500 Vol.-Teilen Hexan, 500 Vol.-Teilen einer Mischung von Hexan und Äthylacetat (Mischungsverhältnis 3:1), 500 Vol.-Teilen einer Mischung von Hexan und Äthylacetat (Mischungsverhältnis 1 :1), 500 Vol.-Teilen einer Mischung von Hexan und Äthylacetat (Mischungsverhältnis 1 :3), 500 Vol.-Teilen Äthylacetat, 1000 Vol.-Teilen einer Mischung von Äthylacetat und Methanol (Mischungsverhältnis 50 :1) und 1000 Vol.-Teilen einer Mischung von Äthylacetat und Methanol (Mischungsverhältnis 25 : 1) eluiert, wobei das Eluat in Fraktionen von 100 Vol.-Teilen gesammelt wurde.

1 Vol.-Teil einer jeden Fraktion wurde zur Trockne eingeengt, worauf man dem Konzentrat 0,1 Vol.-Teile Äthylacetat hinzugab. Dann wurde das Gemisch auf eine 2,5 cm über dem unteren Rand einer Kieselgel-Glasplatte (60 F254, 0,25 mm, 20x 20) liegende Stelle aufgebracht und in einer Länge von ungefähr 17 cm mit einem

Lösungsmitielsystem aus Äthylacetat und Methanol (Mischungsverhältnis 19:1) entwickelt. Nach erfolgter Entwicklung wurde mit ultraviolettem Licht (2537 Ä)das gewünschte Produkt festgestellt.

Die aktiven Fraktionen No. 25—30 mit Rf 0,58-0,63 und die Fraktionen No. 38-40 mit Rf 0,25-0,30 wurden gesammelt und unter vermindertem Druck jeweils auf ungefähr 20 Vol.-Teile eingeengt. Diese Konzentrale wurden jeweils mit 150 Vol.-Teilen Petroläther versetzt, wobei man 5 Teile eines rohen Produktes Il und 2 Teile rohes Maytansinol erhielt.

In 10 Vol.-Teilen Äthylacetat wurden 0,5 Teile des nach den obigen Angaben erhaltenen rohen Produktes Il gelöst und die Lösung gründlich mit 4 Teilen Kieselgel (0,05 bis 0,2 mm) gerührt. Das Äthylacetat wurde unier vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde oben auf eine Säule von 300 Vol.-Teilen Kieselgel eingeführt und die Säule zuerst mit 500 Vol.-Teilen Chloroform gewaschen und hierauf mit 500 Vol.-Teilen einer Mischung von Chloroform und Methanol (Mischungsverhältnis 50:1), 500 Vol.-Teilen einer Mischung von Chloroform und Methanol (Mischungsverhältnis 20 :1) und 500 Vol.-Teilen einer Mischung von Chloroform und Methanol (10 : 1) eluiert. Diese Eluate wurden in Fraktionen von 25 Vol.-Teilen gesammelt.

Jeweils 0,5 Vol.-Teile einer jeden Fraktion wurden unter vermindertem Druck eingeengt. Das Konzentrat wurde mit 0,05 Vol.-Teilen Äthylacetat versetzt und das Gemisch der Dünnschichtchromatographie (Entwicklungssystem: Mischung von Chloroform und Methanol im Mischungsverhältnis 9 :1) unterworfen.

Die Fraktionen Nr. 40 und 41 in der Zone von RF 0,48—0,50, welche bei 2537 Ä absorbierten, wurden gesammelt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wurde hierauf mit 0,5 Vol.-Teilen Äthylacetat versetzt und das Gemisch stehen gelassen, worauf man 0,05 Teile Mischkristalle, bestehend aus Maytanacin und Maytansinolpropionat, erhielt

0,05 Teile der soeben erwähnten Mischkristalle von Maytanacin und Maytansinolpropionat wurden in 5 Vol.-Teilen Methanol gelöst und dann mit 0,1 Teilen Natriumchlorid und 5 Vol.-Teilen Wasser versetzt. Eine mit 200 Vol.-Teilen Diaion HP-10 beschickte Säule wurde mit 600 Vol.-Teilen 50%igem wäßrigem Methanol, enthaltend 5% Natriumchlorid, gewaschen. Die so hergestellte Lösung wurde durch eine Säule geführt und eine Gradienten-Eluierung unter Verwendung von 1500 Vol.-Teilen 60%igem wäßrigem Methanol enthaltend 5% Natriumchlorid und 1500 Vol.-Teilen 95°/oigem wäßrigem Methanol durchgeführt Das Eluat wurde in verschiedenen Fraktionen von jeweils 15 Vol.-Teilen gesammelt und jede Fraktion durch Dünnschichtchromatographie geprüft Die Fraktionen 130 bis 135 enthielten Maytanacin und die Fraktionen 138 bis 142 Maytansinolpropionat. Jede Gruppe der Fraktionen wurde eingeengt und durch Zugabe von 30 ml Wasser und 50 ml Äthylacetat gelöst Die Lösung wurde in einem Scheidetrichter geschüttelt und die wäßrige Schicht abgetrennt Nach zweimaligem Waschen mit jeweils 30 ml Wasser wurde die Äthylacetatschicht über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, eingeengt und stehen gelassen. Auf diese Weise erhielt man in jeder Gruppe der Fraktionen Kristalle. Diese Kristalle wurden durch Filtrieren gesammelt und getrocknet. Auf diese Weise erhielt man 0,013 Teile Maytanacin und 0,025 Teile Maytansinolpropionat.

0,2 Teile des nach den obigen Angaben erhaltenen, rohen Maytansinols wurden in 3 Vol.-Teilen Äthylaceiat gelöst und die Lösung gründlich mit 0,5 Teilen Kieselgel (0,05 bis 0,2 mm) gründlich gerührt. Das Äthylacetat wurde unter vermindertem Druck entfernt Der Rückstand wurde oben auf eine Säule von 80 Vol.-Teilen Kiesclgel eingebracht und die Säule zuerst mit 150 Vol.-Teilen Chloroform gewaschen und hierauf mit 150 Vol.-Teilen einer Mischung von Chloroform und Methanol (Mischungsverhältnis 50 :1), 150 Vol.-Teilen einer

Mischung von Chloroform und Methanol (Mischungsverhältnis 20 :1) und 300 Vol.-Teilen einer Mischung von Chloroform und Methanol (Mischungsverhältnis 10:1) ehiiert Das Eluat wurde dann in Fraktionen von jeweils 10 Vol.-Teilen gesammelt

0,5 Vol.-Teile einer jeden Fraktion wurden unter vermindertem Druck eingeengt Das Konzentrat wurde hierauf mit 0,05 Vol.-Teilen Athylacetat versetzt und das Gemisch in Form einer Probe der Dünnschichtchromatographie (Entwicklungssystem: Mischung von Chloroform und Methanol im Mischungsverhältnis von 9 :1) unterworfen.

Die Fraktionen Nr. 50 bis 52 in der Zone von Rf 0,33—0,38, welche bei 2537 Ä absorbierten, wurden gesammelt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt Der Rückstand wurde hierauf mit 0,5 Vol.-Teilen Athylacetat versetzt und das Gemisch stehen gelassen, worauf man 0,020 Teile Maytansinol in Form von Kristallen erhielt

Beispiel 3

32 000 Teile der gemäß Beispiel 2 erhaltenen Zellen wurden unter Rühren mit 50 000 VoL-Teilen 7O°/oigem wäßrigem Aceton während 3 Stunden extrahiert und hierauf auf einem Druckfilter filtriert. Die Extraktion mittels 50 000 Vol.-Teilen 70%igem wäßrigem Aceton und die anschließende Filtrierung wurden einmal mehr wiederholt. Die Filtrate wurde gesammelt und das Aceton durch Einengen unter vermindertem Druck entfernt Das entstandene, wäßrige System wurde durch eine Säule von 5000 Vol.-Teilen Diaion HP-10 hindurchgeleitet. Die Säule wurde mit 20 000 Vol.-Teilen Wasser und 50°/oigem wäßrigem Methanol gewaschen und anschließend mit 15 000 Vol.-Teilen 90°/oigem wäßrigem Methanol eluiert. Das Eluat wurde unter vermindertem Druck auf 3000 VoL-Teile eingeengt und mit 3000 Vol.-Teilen Wasser und 3000 Vol.-Teilen Athylacetat geschüttelt. Diese Arbeitsweise wurde einmal mehr wiederholt. Die Äthylacetatschichten wurden vereinigt, mit Wasser gewaschen, durch Zugabe von wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck bis auf ein Volumen von 200 Teilen eingeengt. Dann wurde Petroläther hinzugegeben uni.. der entstandene Niederschlag durch Filtrieren gesammelt wobei man 280 Teile rohes Produkt I erhielt. Dieses Produkt wurde mittels einer Kiesclgelsäule in ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 gereinigt, wobei man 1,0 Teile rohes Produkt II und 0,5 Teile rohes Maytansinol erhielt.

B e i s ρ i e 1 4

1000 Vol.-Teile der Kultur gemäß Beispiel 2 wurden in einem Tank aus rostfreiem Stahl, welcher ein Fassungsvermögen von 200 000 Vol.-Teilen aufwies und 100 000 Vol.-Teile eines Samenkulturmediums enthielt, geimpft und das angeimpfte Medium unter Belüftung (100 000 Vol.-Teile/Minute) und unter Rühren mit 200 Umdrehungen pro Minute während 48 Stunden bei 28°C bebrütet, um eine Samenkultur zu erhalten. Diese Samenkultur wurde in einen Tank aus rostfreiem Stahl mit einem Fassungsvermögen von 2 000 000 Vol.-Teilen, welcher 1 000 000 Vol.-Teile eines Fermentiermediums gleicher Zusammensetzung wie in Beispiel 1 enthielt, bei einer Übertragungsrate von 10% eingetragen. Die Züchtung erfolgte unter Belüftung (1 000 000 Vol.-Teile/Minuten) bei 28°C während 90 Stunden unter Rühren bei 120 Umdrehungen pro Minute und bei einem Innendruck von 1 kg/cm². Die so entstandene Kultur wies beim Testen gemäß der Methode nach Beispiel 1 einen Titer von 20 μg/ml auf. 900 000 Vol.-Teile der so erhaltenen Kulturflüssigkeit wurden mit 900 000 Vol.-Teilen Aceton versetzt und nach 1 stündigem Rühren mit 20 000 Teilen Hyflo-Supercel versetzt. Dieses Gemisch wurde weiter gerührt und in einem Druckfilter filtriert. 1 700 000 Vol.-Teile des so erhaltenen Filtrates wurden mit 500 000 Vol.-Teilen Wasser versetzt und das Gemisch in einer Podbielniak-Vorrichtung mit 1 000 000 Vol.-Teilen Athylacetat extrahiert. Die Äthylacetatschicht wurde mit Wasser gewaschen, durch Zugabe von wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingeengt. Das Konzentrat wurde mit Petroläther versetzt und der entstandene Niederschlag durch Filtrieren gewonnen und getrocknet. Auf diese Weise erhielt man 680 Teile des rohen Produktes I. Hierauf wurde dieses rohe Produkt nach den Angaben, wie sie in den Beispielen 2 und 3 gemacht worden sind, gereinigt. Auf diese Weise erhielt man 1,1 Teile Maytanacin, 2,2 Teile Maytansinolpropionat und 0,1 Teile Maytansinol.

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Gewinnung von Maytansinol, Maytanacin oder Maytansinolpropionat, dadurch gekennzeichnet, daß man Nocardia IFO 13726 in einem Kulturmedium, welches assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffauellen enthält, züchtet und Maytansinol, Maytanacin oder Maytansinolpropionat mit für ]ipophile und neutrale Substanzen üblichen Trenn- und Reinigungsmethoden isoliert

Bekanntlich besitzen die Verbindungen Maytanacin und Maytansinolpropionat starke cytostatische Wirkungen (Kupchan et al.: Journal of the American Chemical Society 97,5294 (1975)]. Andererseits besitzt Maytansinol selbst lediglich eine schwache cytostatische Wirkung (vergl. obige Literaturstelle), ist jedoch als Zwischenprodukt für die Herstellung von Maytanacin und Maytansinolpropionat und von anderen Derivaten wertvoll, weil damit eine leichte Herstellungsweise dieser Verbindungen gewährleistet wird.

Maytansinol und Maytanacin wurden gemäß obiger Literaturstelle aus der Rinde von Putterlickia verrucosa (eine Pflanze, welche zur Gattung Maytenus gehört) bei äußerst geringer Ausbeute von 0,025 mg an ersterer Verbindung und 0,36 mg an letzterer Verbindung aus 1 kg getrockneter Pflanzenrinde erhalten. Maytansinol- ■' propionat wurde durch chemische Propionierung von Maytansinol erhalten.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich aber auf ein Verfahren zur Gewinnung von Maytansinol, Maytanacin oder Maytansinolpropionat, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Nocardia IFO 13726 in einem Kulturmedium, welches assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, züchtet und Maytansinol, Maytanacin oder Maytansinolpropionat mit für lipolphile und neutrale Substanzen üblichen Trenn- und Reinigungsmethoden isoliert.

Es ist bekannt, daß die oben erwähnten Verbindungen aus Pflanzen erhalten werden können, doch handelt es

sich hierbei um ganz spezifische Pflanzen, deren Wachstum lange dauert. Auch das Abschneiden, das Abschälen, das Abhacken, das Trocknen und das Pulverisieren der Pflanzen ist zeitaufwendig. Hinzu kommt das Extrahieren, das Trennen und das Reinigen. Somit handelt es sich um teure, langwierige Maßnahmen bei äußerst geringer Ausbeute.

Demgegenüber läßt sich das erfindungsgemäße Verfahren leicht und ohne Schwierigkeiten durch Züchten des Mikroorganismus Nocardia IFO 13726 durchführen, wobei man die gewünschten Verbindungen in großen Mengen erzeugen kann.

Die vorliegende Erfindung stellt das erste Beispiel der Herstellung dieser Verbindungen als Metabolite von Mikroorganismen dar, wobei es sich um eine ausgezeichnete Methode für die Herstellung dieser Verbindungen handelt.

Der im vorliegenden Verfahren eingesetzte Mikroorganismus ist der Actinomycetenstamm No. C-15003, der aus dem Boden oder anderen Proben isoliert wurde.

Die mikrobiologischen Eigenschaften des Stammes No. C-15003 wurden in analoger Weise, wie dies von Schirling & Gottlieb [International Journal of Systematic Bacteriology 16,313—340 (1966)] vorgeschlagen wurde, erforscht. Die Resultate dieser Beobachtungen bei 28°C in einer Zeitspanne von 21 Tagen finden sich nachfolgend.