DK143570B

DK143570B - Fremgangsmaade til fremstilling af maytansinol maytanacin og eller maytansinolpropionat

Info

Publication number: DK143570B
Application number: DK458977AA
Authority: DK
Inventors: E Higashide; M Asai; S Tanida
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Priority date: 1977-03-31
Filing date: 1977-10-14
Publication date: 1981-09-07
Also published as: PL108863B1; PT67853B; AT362058B; YU243777A; SE7711543L; FR2385798B1; DK458977A; IT1094003B; ATA736377A; NL7711273A; CA1092999A; PT67853A; GB1554395A; PL201539A1; SU938746A3; IE45888L; DE2746253C2; JPS53121998A; IE45888B1; AU2907377A

Description

(19) DANMARK (§)

|p Π2) FREMLÆGGELSESSKRIFT (,,) 143570 B

DIREKTORATET FOR PATENT- OG VAREMÆRKEVÆSENET

(21) Ansøgning nr. 4589/77 (51) lnt.Cl.e C 12 p 17/1$ (22) Indleveringsdag 14. okt. I977 (24) Løbedag 14. okt. 1977 (41) Aim. tilgængelig 1 . okt. 1978 (44) Fremlagt 7· sep. 1981 (86) International ansøgning nr.

(86) International indleveringsdag (85) Videreførelsesdag -(62) Stamansøgning nr. -

(30) Prioritet 21. mar. 1977* 37167/77, JP

(71) Ansøger TAKEDA CHEMICAL INDUSTRIES LTD., Osaka, JP.

(72) Opfinder Elji Higashide, JP; Mitsuko Asal, JP: Seiichi Ta= nida, JP.

(74) Fuldmægtig Dansk Patent Kontor ApS.

(54) Fremgangsmåde til fremstilling af raaytanelnol, maytanacin og/eller maytansinolpropionat.

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af maytansinol, maytanacin og/eller maytansinolpropionat med formlen

Cl CH, O R

I 3 II o c> CH3°\Α/ ' CV^pXNr/CH3

β ' CH

o V

o λ.

m /0

I [OH

q ch3 och3 H

2 145570 hvori R betyder H, CH^CO eller CH^CI^CO.

Det er kendt, at maytanacin og maytansinolpropionat har stærk antitumoraktivitet [Kupehan et al.: Journal of the American Chemical Society 9J_, 5294 (1975) ]. På den anden side har maytansinol selv kun svag antitumoraktivitet (jf. ovennævnte reference), men er et nyttigt mellemprodukt til enkel fremstilling af maytanacin og maytansinolpropionat samt forskellige andre derivater.

Maytansinol og maytanacin er opnået af Kupehan et al. fra barken af Putterlickia verrucosa (en plante, som tilhører slægten Maytenus), og herved er udbyttet ekstremt lavt, såsom 0,025 mg af den førstnævnte forbindelse og 0,36 mg af den sidstnævnte fra 1 kg tørret plan-tebark. Maytansinolpropionat er opnået ved kemisk propionering af maytansinol.

Ved undersøgelse af mikroorgansimer isoleret fra forskellige jordprøver har det vist sig, at stammen Nocardia nr. C-15003 (IFO 13726) er i stand til at producere maytansinol, maytanacin og/eller maytansinolpropionat i et egnet næringsmedium under passende betingelser.

I overensstemmelse hermed er fremgangsmåden ifølge opfindelsen ejendommelig ved, at man dyrker en mikroorganisme, som hører til den art, hvortil stammen Nocardia nr. C-15003 (IFO 13726) hører, i et dyrkningsmedium, der indeholder assimilerbare carbonkilder og omsættelige nitrogenkilder, og udvinder maytansinol, maytanacin eller maytansinolpropionat eller flere af disse stoffer fra den opnåede dyrkningsblanding.

Ifølge den kendte teknik er de ovenstående forbindelser opnåelige fra planter, men disse planter er begrænset til specifikke arter, og der kræves store omkostninger og lang tid til produktionen på hvert trin af væksten, fældningen, tørringen og pulveriseringen af planterne og ekstraktionen, adskillelsen og rensningen af stofferne. Endvidere er udbyttet ekstremt lavt.

I modsætning hertil kan den omhandlede fremgangsmåde gennemføres let ved dyrkning af mikroorganismen, og der kan fremstilles en større 143570 3 mængde af de omhandlede forbindelser, som ikke tidligere har været fremstillet ved anvendelse af mikrobiologiske fremgangsmåder.

De mikrobiologiske karakteristika af stamme nr. C-15003 undersøgtes ved metoder, der er analoge med de, der foreslås af Schirling & Gottlieb (International Journal af Systematic Bacteriology 16, 313-34-0 (1966)). Resultaterne af observationer ved 28°C i 21 dage er som følger: 1) Morfologiske karakteristika:

Det vegetative mycelium er veludviklet og forgrenet både på agar og i flydende medium. Mange af hyferne måler 0,8 til 1,2 u i diameter og kan under visse omstændigheder dele sig i fragmenter, der ligner stavformede bakterier, eller forgrenede,korte hyfestykker. Stammen giver god vækst på forskellige taksonomiske medier med luftmyceliet overlejret på det vegetative mycelium, skønt det ofte danner coremia-lignende legemer (50-200 x 200-1000 μ ), hvorpå videre vækst i luften finder sted. Mange af luftmycelierne er bugtede eller lige, og en løs spirallignende konfiguration træffes ved enkelte lejligheder.

Mikroskopisk undersøgelse af ældre kulturer viser, at de konidielig-nende celler kun i enkelte tilfælde optræder i kæder, mens de cellesuspensioner, der opnåedes fra overfladen af sådanne kulturer, ved mikroskopisk undersøgelse sås at indeholde mange forlængede ellipsoi-de (0,8-1,2 μ x 4,8-6,8 μ ) og ellipsoide (0,8-1,2 x 1,0-2,0 μ ) legemer, som lignede arthrosporer.

Elektronmikroskopiske undersøgelser viste, at disse legemer havde en glat overflade.

2) Cellebestanddelene:

Stammen dyrkedes under omrystning i modificeret ISP nr. 1 medium ved 28°C i 66 til 90 timer, hvorefter cellerne opsamledes og skylledes. Yed metoden ifølge B. Becker et al. (Applied Microbiology 12, 421 (1964)) og metoden ifølge Μ, P. Lechevalier (Journal of Laboratory and Clinical Medicine £1, 934 (1968)) undersøgtes de ovennævnte he- 4 Μ357Ό le celler for diaminopimelinsyre og sukkersammensætning. Førstnævnte fandtes at være meso-formen, medens der påvistes pletter, som svarede til galactose og arabinose.

3) Karakteristika på taksonomiske medier:

Stammen viste forholdsvis god vækst på forskellige medier, idet det vegetative mycelium var farveløst til bleggult i den indledende dyrkningsfase og lyst gulbrunt til gulbrunt i senere faser. Stammen producerer opløselige pigmenter, som er gule til gulbrune,! forskellige taksonomiske medier. Luftmyceliet er pulveragtigt og giver generelt moderat vækst, idet det er hvidt til gult eller lyst gulbrunt. Stammens karakteristika i forskellige taksonomiske medier er vist i tabel 1.

Jabel 1

Dyrkningskarakteristika for stamme nr. C-15003 på taksonomiske medier: (A) Sucrose-nitrat-agar: Vækst (G): Overdådig, "Brite Melon Yellow" (3 ia)* til "Amber" (3 lc)#, coremia-lignende legemer dannet Luftmycelium (AM): Sparsomt, hvidt

Opløseligt pigment (SP): Intet eller blegt gulbrunt (B) Glycerol-nitrat-agar: G : Moderat, "Lt Ivory" (2 ca)*, coremia-lignende legemer dannet AM : Moderat, hvidt SP : Intet (C) Glucose-asparagin-agar: G : Moderat, "Brite Marigold" (3 pa)4' til "Brite Yellow" (2 pa)* AM : Sparsomt, hvidt SP : "Brite Yellow" (2 pa)* (D) Glycerol-asparagin-agar: G : Moderat, "Lt Ivory" (2 ca)w, coremia-lignende legemer dannet AM : Sparsomt, hvidt SP : Intet (E) Stivelsesagar: G : Moderat, "Lt Ivory" (2 ca)1' til "Lt Wheat" (2 ea)*, coremia- lignende legemer dannet 143570 5 AM : Rigeligt, "Lt Ivory" (2 ca)1 SP : Intet (F) Næringsagar: G : Moderat, "Lt Ivory" (2 ca)1 til "Colonial Yellow" (2 ga)1, coremia-lignende legemer dannet AM : Sparsomt, hvidt SP : Intet (G) Calciummalatagar: G : Moderat, "Lt Ivory" (2 ca)1 til "Lt Wheat" (2 ea)1, coremia- lignende legemer dannet AM : Moderat, hvidt til "Lt Ivory" (2 ca)1 SP : Intet (H) Gærekstrakt-maltekstrakt-agar: G : Moderat, "Amber" (3 lc)1 til "Brite Yellow" (3 la)1, coremia- lignende legemer dannet AM : Moderat, hvidt til "Lt Ivory" (2 ca)1 SP : Intet (I) Havremelsagar: G : Moderat, "Lt Ivory" (2 ca)1 til "Colonial Yellow" (2 ga)1, coremia-lignende legemer dannet AM : Sparsomt, hvidt til lyst gult SP : Intet (I) Pepton-gærekstrakt-jern-agar: G : Moderat, "Colonial Yellow" (2 ga)1 AM : Intet SP : "Colonial Yellow" (2 ga)1 (K) Tyrosinagar: G : Moderat, "Lt Ivory" (2 ca)1 til "Lt Melon Yellow" (3 ea)1, coremia-lignende legemer dannet AM : Moderat, hvidt til "Lt Ivory" (2 ca)1 SP : "Camel" (3 ie)1

Farvekoderne er dem, der er angivet i "Color Harmony Manual", 4th ed. (Container Corporation of America, 1958).

r 143570 b 4) Fysiologiske karakteristika:

Stammens fysiologiske karakteristika er vist i tabel 2. Temperaturområde for vækst: 12 til 38°C. Temperaturområdet, hvori der er god luftvækst på agar (ISP nr 2), er 20 til 35°C.

Tabel 2

Fysiologiske karakteristika for stamme nr. C-15003:

Temperaturområde for vækst: 12 til 38°C

Temperaturområde for luftvækst: 20 til 35°C

Gelatinesmeltning: Positiv

Hydrolyse af stivelse: Positiv

Reduktion af nitrater: Positiv

Peptonisering af mælk: Positiv

Koagulation af mælk: Negativ

Dekomposition af kasein: Positiv

Produktion af melanoide pigmenter: Negativ (pepton-gærekstrakt- jern-agar), positiv (tyrosin-agar)

Dekomposition af tyrosin: Positiv

Dekomposition af xanthin: Negativ

Dekomposition af hypoxanthin: Negativ

Tolerance for lysozym: Positiv

Tolerance for natriumchlorid: 2% 5) Udnyttelse af forskellige carbonkilder:

Udnyttelse af forskellige carbonkilder undersøgtes under anvendelse af et medium beskrevet i Pridham and Gottlieb (Journal of Bacteriology ^6, IO7 (1948)) og et basalmedium af samme sammensætning plus 0,1% gærekstrakt. Det resulterende spektrum er vist i tabel 3.

Tabel 3

Udnyttelsen af carbonkilder af stamme nr. C-I5OO3 Carbonkilde Vækst Oarbonkilde Vækst D-Xylose + ++* Raffinose ± 7

Carborkilde Vækst Carbonkilde Vækst L-Arabinose + + Melibiose + + D-Glucose ++ ++ i-Inositol - - D-Galactose + + D-Sorbitol -- D-Fructose +++ ++ D-Mannitol ++ ++ L-Rhamnose + + Glycerol - ± D-Mannose +++ ++ Opløselig stivelse + +

Sucrose ++ ++ Kontrol - -

Lactose - -*

Maltose ± +

Trehalose + ++ * Basalmedium med 0,1% gøerekstrakt tilsat

Mote: +++: Overdådig vækst ++: God vækst + : Vækst ±: Ringe vækst Ingen vækst 6) Andre karakteristika:

Cellerne udvandtes ved den ovenfor i 2) beskrevne metode, og DNA'et fremstilledes analogt med metoden ifølge J. Marmur et al. (Journal of Molecular Biology, 208, (1961)), G-C(guanin“cytosin)-indholr-det i DNA'et fandtes at være ca, 71 mol-%.

Gramfarvning af det vegetative mycelium af denne stamme var positiv.

De ovennævnte karakteristika af stamme nr. C-15003 sammenlignedes med beskrivelserne i S. A. Waksman's "The Actinomycetes Vol. 2" (The Williams and Wilkins Co., (1961)); R. E. Buchanan and N. E. Gibbons, "Bergey's Manual og Determinative Bacteriology, 8th ed., 197^", og anden litteratur.

Da stammen formodedes at tilhøre gruppe III i slægten Nocardia, og daman ikke fandt arter med de hidtil beskrevne karakteristika blandt de kendte stammer, konkluderede man, at denne stamme repræsenterer en hidtil ukendt mikroorganismeart.

143570 8

Den foreliggende stamme nr. C-15003 er deponeret hos Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology (FERM) under indleveringsnummeret 3992, hos Institute for Fermentation, Osaka (IFO) under accessionsnummeret IFO 13726 og hos The American Type Culture Collection (ATCC), Maryland, U.S.A. under accessionsnummeret 31281.

Stamme nr. C-15003 tilhører en ny art af slægten Nocardia, som netop nævnt, og den er tilbøjelig til, ligesom mikroorganismer generelt, at undergå variationer og mutationer enten spontant eller under indflydelse af et mutagen. De mange varianter af stammen, som er opnåelige ved bestråling med røntgenstråler, gammastråler, ultraviolet lys og lignende, ved isolering af enkelte celler ved dyrkning på medier indeholdende forskellige kemikalier, eller ved enhver anden mutagen behandling, såvel som de mutanter, der spontant afledes fra stammen, og hvis egenskaber i det væsentlige ikke afviger fra de givne karakteristika, og som er i stand til at frembringe maytansinol, maytanacin og maytansinolpropionat, kan udnyttes ved den omhandlede fremgangsmåde ligesom stamme nr. C-15003. Hvis stamme nr. C-15003 eksempelvis underkastes forskellige mutagene behandlinger, opnås mutanter, som i det væsentlige mangler evnen til at producere opløselige pigmenter, mutanter med substratmycelier, der er farveløse, gulgrønne, rødbrune eller orangerøde, mutanter, hvis hyfer er rede til at fragmentere i bacillære elementer eller forgrenede korte hyfefragmenter, og mutanter med rigeligt, hvidt luftmycelium eller i det væsentlige uden luftmycelium.

Mediet, som anvendes til dyrkningen af den maytansinol-, maytanacin-eller maytansinolpropionatproducerende stamme (i det følgende undertiden forkortet som "den producerende stamme"), kan være et hvilket som helst flydende og fast medium, hvis det blot indeholder næringsstoffer, som stammen kan udnytte, skønt et flydende medium er foretrukket til større produktioner. Mediet skal indeholde carbon- og nitrogenkilder, som stamme nr. C-15003 kan assimilere og omsætte, uorganiske stoffer, mikronæringsstoffer m.m.. Som eksempler på carbon-kilder kan nævnes glucose, lactose, sucrose, maltose, dextrin, stivelse, glycerol, mannitol og sorbitol, fedtstoffer og olier (f.eks. sojabønneolie, svinefedt og kyllingefedt). ETitrogenkilderne kan f.eks. være kødekstrakt, gærekstrakt, tørgær, sojabønnemel, majsstøbevand, pepton, kasein, bomuldsfrømel, "spent molasses", urinstof, ammonium- 9 w$s;ro salte (f.eks. ammoniumsulfat, ammoniumchlorid, ammoniumnitrat og ammoniumacetat). Mediet kan endvidere indeholde salte af natrium, kalium, calcium, magnesium og lignende, salte af jern, mangan, zink, cohalt, nikkel og lignende, salte af phosphorsyre og horsyre og salte af organiske syrer, såsom acetater og propionater. Endvidere kan mediet indeholde forskellige aminosyrer (f.eks. glutaminsyre, asparaginsyre, alanin, glycin, lysin, methionin og prolin), peptider (f.eks. dipeptider og tripeptider), vitaminer (f.eks. B^, nicotinsyre, B·^, C og E), haser fra nucleinsyrer (f.eks. purin, pyrimidin og derivater deraf). Til indstilling af me-r-diets pH kan der f.eks. tilsættes en uorganisk eller organisk syre, et alkali eller en puffer. Egnede mængder olier, fedtstoffer, overfladeaktive stoffer og lignende kan også tilsættes som antiskum-midler.

Dyrkningen kan gennemføres stationært, under omrystning, suhmers aeroht og under enhver anden dyrkningsbetingelse. Til større produktioner foretrækkes naturligvis suhmers aeroh dyrkning. Skønt dyrknirøgs--hetingelserne naturligvis afhænger af tilstanden og sammensætningen af mediet, stammen, dyrkningsmetoden og andre faktorer foretrækkes det normalt at gennemføre inkubation ved 20 til 35°C med et indledende pH på ca. 7,0. Særligt ønskelig er en temperatur fra 23 til 30°C

1 et mellemliggende dyrkningstrin med et indledende pH på 6,5 til 7,5· Da inkubationstiden også er variabel afhængig af de samme faktorer som nævnt ovenfor, er det tilrådeligt at fortsætte inkubationen, indtil titeren af det ønskede antibiotiske produkt bliver maksimal. X tilfælde af en rystekultur eller aerob suhmers kultur i flydende medium, er den nødvendige tid normalt fra ca. 48 til 144 timer.

Styrken af antibiotikumet prøvedes med Tetrahymena pyriformis W som prøveorganisme. Således dyrkedes ovennævnte mikroorganisme på et testmedium (20 g proteose-pepton (Difco), 1 g gærekstrakt (Difco), 2 g glucose, 1000 ml destilleret vand og 10 ml 1 M phosphatpuffer (pH 7,0)) ved 28°C i 44 til 48 timer, og styrken af antibiotikumet bestemtes ved seriefortyndingsmetoden med en kontrol af vækstens turbiditet og ved en tyndtlagskromatografisk (forkortet TLC) prøvning, som skal beskrives i det følgende.

Maytanacin, maytansinolpropionat eller maytansinol produceres og akkumuleres i den resulterende kulturvæske, både extracellulært og 143570 10 intr acellulært.

Ingen af disse stoffer viser tydelig antibiotisk aktivitet, og de bestemtes således ved TIC, som udførtes parallelt med påvisning ved aktivitet på Tetrahymena-stammen. Således adskilles fermentationsnæringsvæsken i celler og filtrat ved filtrering eller centrifugering, og filtratet ekstraberes med det samme volumen ethylacetat. Til cellerne sættes den samme mængde 70%'s acetone-vand som filtratet,og efter 1 times omrøring ved 20°C filtreres suspensionen. Acetonet fjernes fra filtratet, og det resulterende vandige filtrat ekstra-beres med ethylacetat. Hver af ekstrakterne koncentreres til 1/100 volumen og underkastes tyndtlagskromatografi på en silicagel-glas-plade (kiselgel 60 ^,25 mm, 20 x 20) (opløsningsmiddelsystem: cbloroform-metbanol = 9:1)· Styrken bestemtes på basis af intensiteten af pletterne, der påvistes ved bestråling med ultraviolet lys ved 2537 Å.

Maytanacin, maytansinolpropionat eller maytansinol, som produceres i kulturvæsken, er lipofile og neutrale. De kan bekvemt udvindes ved de adskillelses- og rensningsmetoder, der normalt anvendes til udvinding af mikrobielle metaboliter. F.eks. kan der anvendes en metode, som udnytter forskellen i opløselighed mellem antibiotikumet og urenheden, metoder, som udnytter den fraktionerende adsorptive affinitet af forskellige adsorptionsmidler, såsom aktivt kul, makroporøse ikke-ioniske harpikser, silicagel og alumina, og en metode til fjernelse af urenhederne ved hjælp af ionbytterharpikser anvendt enkeltvis eller i en egnet kombination eller anvendt gentagne gange.

Som tidligere anført findes maytanacin, maytansinolpropionat eller maytansinol både extracellulært og intracellulært i den udfermenterede kulturvæske. Til oparbejdning af denne kan den opdeles i et filtrat og en cellemasse på gængs måde, hvorpå filtratet underkastes opløsningsmiddelekstraktion med et med vand ikke-blandbart organisk opløsningsmiddel. Cellerne i cellemassen nedbrydes og underkastes opløsningsmiddelekstraktion med et med vand ikke-blandbart organisk opløsningsmiddel. Derpå behandles de isolerede organiske faser med et adsorptionsmiddel til fjernelse af urenheder. Eventuelt kan den udfermenterede kulturvæske underkastes opløsningsmiddelekstraktion inden isolering af cellerne.

11 f«me

Til ekstraktion af filtratet og cellerne uafhængigt af hinanden kan følgende fremgangsmåde med fordel benyttes.

Egnede opløsningsmidler til ekstraktion af filtratet er med vand ikke-blandbare organiske opløsningsmidler, såsom fedtsyreestere, f.eks. ethylacetat og amylacetat, alkoholer, f.eks. butanol, halogenerede carbonhydrider, f.eks. chloroform, og ketoner, f.eks. methyl i s obu tylketon. Ekstraktionen udføres ved et pH nær neutralpunktet, og dyrkningsvæsken, der forinden fortrinsvis er indstillet til pH 7, ekstraheres f.eks. med ethylacetat. Ekstrakten vaskes med vand og koncentreres under reduceret tryk. Derefter sættes et upolært opløsningsmiddel, såsom petroleumsether eller hexan, til koncentratet , og råproduktet I, som indeholder den aktive forbindelse, udvindes.

Da der ved TLC påvises et antal pletter foruden maytanacin, maytan-sinolpropionat eller maytansinol, underkastes produktet I successivt de følgende rensningsmetoder. Således er en rutinerensningsmetode, især adsorptionskromatografi, nyttig, og til dette formål kan anvendes et af de almindelige adsorbenser, såsom silicagel, alumina eller enmakroporøs ikke-ionisk adsorberende harpiks. Til rensning af råproduktet I er silicagel det nyttigste, Eluering kan f.eks. begynde med petroleumsether og hexan og gennemføres ved tilsætning af et polært opløsningsmiddel, såsom ethylacetat, acetone, ethanol eller methanol. Ved en typisk fremgangsmåde,under anvendelse af silicagel (0,05-0,2 mm) som bærer, udføres søjlekromatografi med en gradvis forøgelse af hexan til ethylacetatforholdet. Eluatet opsamles og undersøges ved TLC og fraktionerne, der indeholder effektive ingredienser, samles og koncentreres under reduceret tryk. Derefter sættes petroleumsether eller hexan til koncentratet, hvorved råproduktet II opnås. Da dette produkt stadig indeholder urenheder, renses det yderligere som følger. F.eks. kan produktet II renses ved hjælp af en anden silica-gelsøjle under anvendelse af et andet opløsningsmiddelsystem. Elu-eringssystemet til dette formål kan bestå af et halogeneret carbon-hydrid, såsom dichlormethan eller chloroform, med tilsætning af et polært opløsningsmiddel, såsom en alkohol, f.eks. ethanol eller methanol, en keton, f.eks. acetone eller metbylethylketon. På denne måde isoleres maytanacin, maytansinolpropionat eller maytansinol. Rækkefølgen af opløsningsmiddelsystemerne til den første og anden silicagelsøjle kan være omvendt, og desuden kan almindelige organiske opløsningsmidler anvendes i forbindelse med de ovenstående systemer.

143570 12

Hvis en makroporøs adsorberende harpiks anvendes som rensningsmiddel for råproduktet II, udføres eluering af maytanacin, maytansi-nolpropionat eller maytansinol med en blanding af vand og en lavere alkohol, en lavere keton eller en ester. Den lavere alkohol kan f.eks. være methanol, ethanol, propanol eller butanol, og den lavere keton kan f.eks. være acetone eller methylethylketon. Esteren kan f.eks, være ethylacetat. Ved en typisk fremgangsmåde opløses råproduktet II i 60%'s methanol-vand og adsorberes på en søjle af "Diaion HP-10", som er en non-ionisk makroporøs ionbytterharpiks. Søjlen vaskes med 70%'s methanol-vand, hvorefter eluering udføres med 90%'s methanol-vand. På denne måde elueres maytanacin, maytansinolpropionat eller maytansinol fra søjlen.

Ved de ovenfor beskrevne fremgangsmåder samles fraktionerne, der indeholder de ønskede forbindelser, og koncentreres under reduceret tryk. Til det tørre produkt sættes 5 til 8 volumen ethylacetat ,og blandingen henstår, hvorved der udskilles krystaller af maytanacin, maytansinolpropionat eller maytansinol, eller hvis krystallerne indeholder maytanacin og maytansinolpropionat, adskilles de derefter fra hinanden ved hjælp af et adsorbens, såsom et af de ovennævnte. Under·anvendelse af silicagel eller en makroporøs ikke-ionisk adsor-verende harpiks og de ovenstående opløsningsmidler kan de ønskede forbindelser således elueres fraktioneret. Hvis f.eks. silicagel anvendes, udføres elueringen med hexan, ethylacetat eller chloroform-methanol, hvorved maytansinolpropionat og maytanacin fremkommer i den nævnte rækkefølge. Efter påvisning med TLC koncentreres fraktionerne under reduceret tryk,og ethylacetat sættes til koncentraterne. På denne måde kan de respektive forbindelser opnås som krystaller. Hvis der anvendes en makroporøs ikke-ionisk adsorberende harpiks, kan der benyttes gradienteluering med et varierende forhold af alkohol, keton eller ester til vand. Ved gradientelueringsmeto-den, under anvendelse af 60%'s methanol-vand og 95%'s methanol-vand, med 5% natriumchlorid tilsat, fremkommer maytanacin og maytansinolpropionat i den nævnte rækkefølge. Efter opsamling og påvisning med TLC koncentreres hver gruppe af aktive fraktioner under reduceret tryk og krystalliseres fra ethylacetat. De isolerede krystaller indeholder ethylacetat som krystallisationsopløsningsmiddel og viser efter tørring over phosphorpentoxid ved 70°C i 8 timer de følgende fysiske og kemiske egenskaber. (Tabel h).

13 U3570

Maytanacin Maytansinol- Maytansinol propionat _C50H39C1N2Q9_C31H41C1N2°9 C28H37G1N2°8

Smeltepunkt (°C) 235-236° 188-190° 172,5-174°

Specifik [a]22 -121°±10° [α]22 -127O±10° [ a]^2°-313°±10° drejning (c =0,25, CHClj) (c =0,35,OHClj) (c =0,22,01101^) 0 59,62 59,93 59,28

Analyse, H 6,93 6,82 6,38 fundet {%) N 4,28 4,32 5,02 01 5,74- 5,57 6,15 0 59,85 59,94 59,52

Analyse, H 6,48 6,65 6,60 beregnet N 4,61 4-,51 4,96 (%) Cl 5,84 5,71 6,27

Ultraviolet 233(30330) 233(30240) 232(32750) absorpti- 240(sh.28240) 240(sb.28400) 244(sh.30850) onsspektrum 252(27850) 252(27650)' 252(31650) nm(e) 280(5680) 280(5740) 281(5750) 288(5660) 288(5710) 288(5700)

Infrarødt absorpti- 1740,1730,1670, 1740,1730,1670, 1715,1670,1580 onsspektrum 1580 1580 (cm-1)

Masse- spektrum 545,485,470,450 559^5^0,450 505,485,470, (m/e) 450

Surt, neu- lipofilt og ru*,, «u- lipofilt og neu- lipofilt og neutralt eller trait stof , _ , trait stof trait stof basisk 1A3 5 70 14

Maytanacin Maytansinol- Maytansinol propionat C30HJ9CUr209 03iH4101H2°9 C28H37011I208

Farvereak- Dragendorffre ak- Dragendorffreak- Dragendorffreak- tioner tion: positiv tion: positiv tion: positiv

Beilsteinreakti- Beilsteinreakti- Beilsteinreaktion: positiv on: positiv on: positiv

Ovennævnte data for elementaranalyse, specifik drejning, UV-spektre, IE-spektre, massespektre m.m. er i god overensstemmelse med de data for maytanacin, maytansinolpropionat og maytansinol, der er givet i litteraturen, Eupchan et al. (The Journal of American Chemical Society 9Z, 5294- (1975)).

De følgende eksempler skal yderligere belyse opfindelsen. Dele er vægtdele, medmindre andet er angivet, forholdet mellem dele og volumendele svarer til forholdet mellem g og ml, og % er baseret på vægt/volumen, medmindre andet er angivet.

Eksempel 1.

A.

Maytansinol-, maytanacin- og maytansinolpropionat-producerende No-cardia nr. C-15003 (IFO 13726; FEEM 3992; ATCC 31281) dyrket på et medium (gærekstrakt-maltekstrakt-agar) anvendtes til inokulation af en 200 volumendele fermentor indeholdende 40 volumendele af et podningskulturmedium (2% glucose, 3% opløselig stivelse, 1% råt sojabønnemel, 1% majsstøbevand, 0,5% polypepton, 0,3% EaCl, 0,5% CaCO^, pH 7,0). Det inokulerede medium inkuberedes ved 28°C i 48 timer, hvorved der opnåedes et inokulum. 0,5 volumendele af det således opnåede inokulum overførtes til en 200 volumendeles fermentor indeholdende 40 volumendele af et fermentationsmedium sammensat af ·5% dextrin, 3% majsstøbevand, 0,1% polypepton og 0,5% CaCO^ (pH 7,0) og dyrkedes ved 28°C i 90 timer, hvilket gav et inokulum (podningskultur) .

J.5 H3ST0

Ved seriefortyndingsmetoden under anvendelse af Tetrahymena pyrifor-mis W som prøveorganisme og maytansinolpropionat som standardprodukt fandtes den ovenstående kultur at have en titer på 25 ug/ml.

B.

10 volumendele af det under A opnåede inokulum (podningskultur) overførtes til en 2.000 volumendeles fermentor indeholdende 500 vo-lumendele af et podningskulturmedium (det samme som ovenfor) og inkuberedes ved 28°C i 48 timer. 5°0 volumendele af den resulterende kultur overførtes til en 50.000 volumendeles rustfri ståltank indeholdende 30.000 volumendele podningskulturmedium og dyrkedes ved 28°C under gennemluftning (30.000 volumendele/minut), omrøring (280 om-

O

drejninger/minut (1/2 DT)) og indvendigt tryk (1 kg/cm ), hvorved der opnåedes en podningskultur. Denne kultur anvendtes til podning af en 200.000 volumendeles rustfri ståltank indeholdende 100.000 volumendele af et lignende fermentationsmedium, som det i eksempel 1 anvendte i en inokulationsmængde på 10%. Det inokulerede medium inkuberedes ved 28°C under gennemluftning (lOO.OOO volumendele/minut), om- p røring (200 omdrejninger/minut (l/2 DT)) og indvendigt tryk (l kg/cm ) i 90 timer. Bestemt ved samme metode som under A fandtes den ovenfor opnåede kultur at have en titer på 25 yg/ml.

Til 90.000 volumendele af den ovenfor opnåede kultur sattes 2.000 dele "Hyflo-supercel", og efter grundig omrøring filtreredes blandingen på et trykfilter, hvorved der opnåedes 85.000 volumendele filtrat og 32.000 dele fugtige celler. Filtratet (85.000 volumendele) omrørtes og ekstraheredes med 30.000 volumendele ethylacetat. Denne fremgangsmåde gentoges endnu en gang. Ethylacetatlagene samledes, vaskedes to gange med 30·000 volumendele vand, tørredes ved tilsætning af 500 dele vandfrit natriumsulfat og koncentreredes under reduceret tryk til 200 volumendele. Petroleumsether sattes til koncentratet, og det resulterende bundfald udvandtes ved filtrering (53 dele). Dette råprodukt I omrørtes med 100 volumendele ethylacetat, og de uopløselige bestanddele filtreredes fra. Filtratet omrørtes med 10 dele silicagel (0,05-0,2 mm) og ethylacetatet fjernedes under reduceret tryk. Remanensen anbragtes på en silicagelsøjle (400 volumendele). Eluering udførtes med 500 volumendele hexan, 500 volumendele hexan-ethylacetat (3:1)? 500 volumendele hexan-ethylacetat (1:1), 500 volumendele hexan-ethylacetat (1:3), 500 volumendele ethylacetat 1C 143570 lb og 1000 volumendele ethylacetat-methanol (50:1), og 1000 volumendele ethylacetat-methanol (25:1), idet eluatet opsamledes i 100 volumendeles fraktioner.

1 volumendel af hver fraktion koncentreredes til tørhed, og 0,1 volumendel ethylacetat sattes til koncentratet. Blandingen anbragtes i pletter 2,5 cm fra den nederste kant af en silieagel-glasplade (60 ^254’ °>25 mm, 20 x 20) og elueredes ca. 17 cm med et opløsningsmiddelsystem af ethylacetat-methanol (19:1). Efter eluering gennemførtes påvisning med ultraviolet lys (2557 Å).

De aktive fraktioner nr. 25-30 med Rf 0,58-0,63 og fraktionerne nr. 58-40 med Rf 0,25-0,30 opsamledes og koncentreredes under reduceret tryk til hver ca. 20 volumendele. Til hvert af disse koncentrater sattes 150 volumendele petroleumether, hvorved der opnåedes 5 dele af et råprodukt II og 2 dele råt maytansinol.

I 10 volumendele ethylacetat opløstes 0,5 del af det ovenfor opnåede råprodukt II, og opløsningen omrørtes omhyggeligt med 4 dele si-licagel (0,05-0,2 mm). Ethylacetatet fjernedes under reduceret tryk. Remanensen anbragtes på en søjl-e af 300 volumendele silicagel, og søjlen vaskedes først med 500 volumendele chloroform og elueredes derefter med 500 volumendele chloroform-methanol (50:1), 500 volumendele chloroform-methanol (20:1) og 500 volumendele chloroform-methanol (10:1). Eluatet opsamledes i 25 volumendeles fraktioner.

0,5 volumendele af hver fraktion koncentreredes under reduceret tryk. Til koncentratet sattes 0,05 volumendel ethylacetat, og blandingen underkastedes tyndtlagskromatografi (elueringssystem: chloroform-methanol = 9:1), hvorved der opnåedes en prøveopløsning.

Fraktionerne nr. 40 og 41, der absorberede ved 2537 Å i Rf-området 0,48-0,50, opsamledes og koncentreredes til tørhed under reduceret tryk. Til remanensen sattes 0,5 volumendel ethylacetat, og blandingen henstod, hvorved der opnåedes 0,05 del blandede krystaller af maytanacin og maytansinolpropionat.

0,05 del af de ovennævnte blandede krystaller af maytanacin og maytansinolpropionat opløstes i 5 volumendele methanol, hvorefter der tilsattes 0,1 del natriumchlorid og 5 volumendele vand. En søjle pakkedes med 200 volumendele "Diaion KP-10" og vaskedes med 600 volumen- 17 143570 dele 50%'s methanol-vand indeholdende 5% NaCl. Den ovenfor fremstillede prøveopløsning sendtes gennem søjlen, og der udførtes gradient-eluering under anvendelse af 1500 volumendele 60%'s methanol-vand indeholdende 5% NaCl og 1500 volumendele 95%'s methanol-vand. Elua-tet opsamledes i 15 volumendeles fraktioner, og hver fraktion undersøgtes ved tyndtlagskromatografi. Fraktionerne 130 til 135 indeholdt maytanacin, og fraktionerne 138 til 142 indeholdt maytansinol-propionat.

Hver gruppe fraktioner koncentreredes og opløstes ved tilsætning af 30 ml vand og 50 ml ethylacetat. Opløsningen omrystedes i en skilletragt, og det vandige lag skiltes fra, og efter to ganges vask med 30 ml portioner vand tørredes ethylacetatlaget over vandfrit natriumsulfat, koncentreredes og henstod derefter. På ovennævnte måde opnåedes krystaller fra hver gruppe fraktioner. Krystallerne opsamledes ved filtrering og tørredes. Maytanacin 0,013 del. Maytansinol-propionat 0,025 del.

I 3 volumendele ethylacetat opløstes 0,2 del af det ovenfor opnåede rå maytansinol, og opløsningen omrørtes godt med 0,5 del silicagel (0,05-0,2 mm). Ethylacetatet fjernedes under reduceret tryk. Remanensen anbragtes på en søjle af 80 volumendele silicagel, og søjlen vaskedes først med 150 volumendele chloroform og elueredes derefter med 150 volumendele chloroform-methanol (50:1), 150 volumendele chloroform-methanol (20:1) og 3volumendele chloroform-methanol (10:1). Eluatet opsamledes i 10 volumendeles fraktioner.

0,5 volumendel af hver fraktion koncentreredes under reduceret tryk. Til koncentratet sattes 0,05 volumendel ethylacetat, og blandingen underkastedes tyndtlagskromatografi (elueringssystem: chloroform-methanol = 9:1).

Fraktionerne nr. 50 til 52, der absorberede ved 2537 Å i Rf-området 0,33 til 0,38, opsamledes og koncentreredes til tørhed under reduceret tryk. Til remanensen sattes 0,5 volumendel ethylacetat,og blandingen henstod, hvorefter der opnåedes 0,020 del krystaller af maytansinol.

C.

32.000 dele af de under B opnåede celler ekstraheredes under om- 18 «3570 røring med 50*000 volumendele 70%'s acetone-vand i 3 timer og filtreredes derefter på et trykfilter. Ekstraktionen med 50.000 volumendele 70%'s acetone-vand og den efterfølgende filtrering gentoges endnu en gang. Filtraterne samledes, og acetonet fjernedes ved koncentration under reduceret tryk. Det resulterende vandige system sendtes gennem en søjle af 5*000 volumendele "Diaion BP-10". Søj'len vaskedes med 20.000 volumendele vand og 50%'s vandig methanol, hvorefter der elueredes med 15*000 volumendele 90%'s methanol-vand. Eluatet koncentreredes under reduceret tryk til 3*000 volumendele og omrystedes med 3,000 volumendele vand og 3*000 volumendele ethylacetat. Denne fremgangsmåde gentoges endnu en gang. Ethylacetatlagene samledes, vaskedes med vand, tørredes ved tilsætning af vandfrit natriumsulfat og koncentreredes under reduceret tryk til 200 volumendele. Efter tilsætning af petroleumsether udvandtes bundfaldet ved filtrering (280 dele). Det ovenfor opnåede råprodukt I rensedes ved hj'ælp af en si-licagelsøj'le på lignende måde som under A, hvorved der opnåedes 1,0 del af råproduktet II og 0,5 del råt maytansinol.

Eksempel 2 1000 volumendele af kulturen fra eksempel IB inokuleredes i en 200.000 volumendeles rustfri ståltank indeholdende 100.000 volumendele af et podningskulturmedium, og det inokulerede medium inkuberedes ved 28°C under gennemluftning (100.000 volumendele/minut) og omrøring (200 om-drejninger/minut) i 48 timer til fremstilling af en podningskultur. Denne podningskultur overførtes til en 2.000.000 volumendeles rustfri ståltank indeholdende 1.000.000 volumendele af det samme fermentationsmedium, som det i eksempel 1A anvendte, i en maaigde på 10%. Dyrkningen gennemførtes ved 28°C under gennemluftning (1,000.000 volumendele minut), omrøring (120 omdrejninger/minut (1/3 Dl)) og indvendigt tryk (l kg/cm ) i 90 timer. Den resulterende kultur fandtes at have en titer på 20 pg/ml, prøvet ved den i eksempel 1A beskrevne prøvningsmetode. Til 9OO.OOO volumendele af den ovenfor opnåede kultur sattes 900.000 volumendele acetone og efter 1 times omrøring 20.000 dele "Hyflo-Supercel". Blandingen omrørtes yderligere og filtreredes på en trykfiltreringsmaskine. Til 1.700.000 volumendele af det resulterende filtrat sattes 500.000 volumendele vand, og blandingen ekstraheredes i en "Podbielniak" med 1.000.000 volumendele ethylacetat. Ethylacetatlaget vaskedes med vand, tørredes ved tilsætning af vandfrit natriumsulfat og koncentreredes under reduceret tryk.