CS214881B2 - Method of making the maytanacine or maytanasinol propionate - Google Patents

Description

214881

Vynález se týká způsobu výroby maytan-sinolu, maytanacinu a propionátu maytan-sinolu, které mají protinádorovou účinnost. Jé známo, že z uvedených sloučenin vy-kazují maytacin a propionát maytansinoluvysokou protinádorovou účinnost [Kupchanse spolupracovníky: Journal cf the Ameri-can Chemical Society 97, 5294 (975)].

Naproti tomu samotný maytansinol mápouze slabou protinádorovou účinnost (vizshora uvedený odkaz] ale je cenným mezi-produktem, ze kterého se dá snadno vyrá-bět maytanacin, propionát maytansinolu arůzné další deriváty.

Maytansinol a maytanacin byly izoloványKupchanem a spolupracovníky (viz výše)z kůry rostliny Putterlickia verrucosa (rost-lina patřící do rodu Maytenus) ve velminízkých výtěžcích, asi 0,025 mg prvé látkya 0,36 mg polsléze uvedené látky z 1 kg vy-sušené kůry rostliny. Pokud se týká propio-nátu maytansinolu, byl získán chemicky pro-pionací maytansinolu.

Autoři vynálezu shromažďovali různévzorky půdy a zkoumali antibiotika produ-kovaná mikroorganismy izolovaných ze zmí-něných vzorků a nalezli, že některé taktoizolované mikroorganismy mají schopnosthrOmadit maytansinol, maytanacin nebo pro-pionát maytansinolu v kultivačním prostře-dí a že tyto mikroorganismy patří do roduNocardia a že zmíněné sloučeniny lze rov-něž získávat kultivací různých mutantů od-vozelných od těchto mikroorganismů vevhodném živném prostředí za vhodnýchpodmínek.

Na základě těchto nálezů byly provedenydalší studie, které vedly ke kompletaci to-hoto vynálezu.

Vynález se týká způsobu výroby maytan-sinolu, maytanacinu nebo propionátu may-tansinolu, který se vyznačuje tím, že semikroorganismus kmene Nocardia číslo C--15003 (IFO 13726) kultivuje v živném, pro-středí obsahujícím asimilovatelné zdroje u-hlíku a stravitelné zdroje dusíku při teplotě12 až 38 toC tak dlouho, dokud se maytan-sinol, maytanacin nebo propionát maytansi-nolu nenahromadí ve zmíněném prostředí,a že se poté uvedené sloučeniny izolují zapoužití rozpouštědel, adsorbentů a/neboiontoměničQvých pryskyřic.

Podle dosud známého způsobu se shorauvedené sloučeniny dají získávat z rostlin,avšak tento způsob není výhodný, protožese k uvedenému účelu dají použít pouze ur-čité rostliny a protože je třeba vysokýchnákladů a dlouhé doby k výrobě v každémstadiu postupu, jakými jsou například růstrostlin, jejich kácení, sušení a mletí kůry,eixtrakce a čištění produktu. Výtěžky jsoukromě toho mimořádně nízké.

Naproti tomu způsob podle vynálezu lzeprovádět snadno a hladce kultivací vhod-ných mikroorganismů, a je-li třeba, lze vy-rábět velká množství uvedených sloučenin.

Způsob podle vynálezu, je prvním příkla- dem, jak získávat zmíněně'sloučeniny jakometabolity mikroorganismů, a lze konstato-vat, že je vynikající metodou k jejích pří-pravě1.. , ; í

Jako příklad mikroorganismu, kterého lzepoužít při způsobu- podle vynálezu, lze uvéstkmen aktinomycet číslo C-15003, který bylizolován z půdy i’ž jiných vzorků při skre-eningu mikroorganismů produkujících zmí-něná antibiotika. ;

Mikrobiologické vlastnosti kmene čísloC-15003 byly stanoveny analogickými postu-py, jak jsou popsány Schirlingem & Gottlie-bem [International Journal of SystematicBacteriology 18, 313—340 [1966]]. Výsledkypozorování prováděných během 21 dnů přiteplotě 28 °C jsou uvedeny níže. 1 j Morfologické znaky

Vegetativní mycelium roste dobře a vyvíjíse ve formě rozvětvených vláken, a to jakna agaru, tak tekutém živném prostředí.Četné hyfy mají průměr 0,8—1,2 μία a v ně-kterých případech se mohou rozpadat načástečky podobající se tyčinkovitým bakte-riím nebo krátkým rozvětveným hyfám.Kmen rdste dobře na různých taxonoímic-kých půdách, přičemž vzdušné mycelium setvoří na povrchu vegetativního mycelia ačasto tvoří útvary podobné koremiu (svaz-ky konidioforů o rozměrech 50-200 X 200--1000 ^m), na kterých je umístěno budoucívzdušné mycelium. Četná vzdušná myceliajsou zprohýbaná, přímá nebo volně spirálo-vitá, jak byl útvar určen při různých pří-ležitostech.

Mikroskopické hodnocení zralých kulturukazuje, že jen v řídkých případech se navláknech objevují buňky podobné konidiím,zatím co buněčné suspenze získané z po-vrchů zmíněných kultur obsahují, jak bylozjištěno mikroskopicky, četná protáhlá elip-soldní (0,8—1,2 Tím X 4,8-6,8 μπι) a elip-soldní (0,8—1,2 μία, X 1,0—2,0 μΐη] tělískapodobající se arthrosporám. Při pozorování pomocí elektronovéhomikroskopu bylo zjištěno, že tato tělískamají hladký povrch. 2) Složky buněk

Kmen byl kultivován za třepání na modi-fikované ISP živné půdě číslo 1 při 28 °Cpo dobu 66—90 hodin a po uvedené doběbyly buňky odděleny a propláchnuty. Veš-keré získané buňky byly poté hodnocenymetodou posanou B. Beckerem a spolupra-covníky (Applied Microbiology 12, 421(1964]] a metodou popsanou Μ. P. Leche-valierem [Journal of Laboratořy and Clini-cal Medicine 71, 934 (1968)] na obsah ky-seliny diaminojpimelové a na složení cukrů.Bylo nalezeno, že prvá látka je přítomnav meso-formiě, a byly detegovány stopy lá-tek, které odpovídaly galaktolse a arabinose. 214381 3) Charakteristické znaky na různýchtaxonomických živných půdách

Kmen vykazuje poměrně dobrý růst narůzných živných půdách, přičemž v počá-tečních fázích kultivace je vegetativní my-celium bezbarvé až bledě žluté a v pozděj-ších fázích světle žlutohnědé až žlutohnědé.V různých taxonomických prostředích pro-dukuje kmen rozpustná barviva, žlutá ažžlutohnědá. Vzdušné mycelium je prachové,obvykle středního růstu, bílé až žluté nebosvětle žlutohnědé. Charakteristické znakykmene na různých talxonomických půdáchjsou uvedeny v tabulce 1.

Tabulka 1

Kultivační charakteristické znaky kmenečíslo C-15O03 na různých taxonomických pů-dách A) Nitrátový agar se sacharosou: Růst (G): bujný, barva melounověžlutá (3 ia)* až jantarová (3 lc)*,tvorba tělísek podobných koremiuVzdušné mycelium (AM): sporé, bílé

Rozpustná barviva (SP): žádné nebosvětle žlutohnědé B) Nitrátový agar s glycerolem: G: střední , barva světlé slonové kos-ti [2 ca) *, tvorba tělísek podobnýchkoremiu AM: střední, bíléSp: žádné C) Asparaginový agar s glukosou: G: střední, barva aksamitnlku (3 pa)*až jasně žlutá (2 pa) * AM: sporé, bíléSP: žluté (2 paj* D) Asparaginový agar s glycerolem: G) střední, barva světlé slonové kosti (2 ca] *, tvorba útvarů podobnýchkoremiu AM: sporé, bílé SP: žádné E) Škrobový agar G: Střední, barva světlé slonové kcstl (2 ca] * až barva světlé kukuřice (2ea) *, tvorba útvarů podobných ko-remiu AM: hojné, barva světlé slonové kosti(2 ca] * SP: žádné F) Živný agar: G: střední, barva světlé slonové kcsti(2 ca) * až starobylé žlutí (2 ga) *,tvorba útvarů podobných koremiuAM: sporé, bílé SP: žádné G) Kalciummalátový agar: G: střední, barva světlé slonové kcsti(2 ca) * až barva světlé kukuřice (2ea) *, tvorba útvarů podobných ko-remiu AM: střední,, barvy bílé až barvy švět-lé s’onové kosti (2 ca) * SP:žádné H) Agar s kvasničným extraktem a slado-vým extraktem: G: střední, barva jantarová (3 lc) *až jasně žlutá (3 la) *, tvorba útva-rů podobných koremiu AM: střední, barvy bílé až barvy svět-lé slonové kosti (2 ca) * SP: žádné I) Agar s ovesnou moukou: G: střední, barva světlé slonové kosti(2 ca) * až starobylé žluti (2 ga) *,tvorba útvarů podobných koremiuAM: sporý, barvy bílé až světle žlutéSP:žádné J) Peptonový agar s kvasničným extraktema železem: G: střední, barva starobylé žlutí (2ga) * AM: žádné SP: starobylá žluť (2 ga) * K) Tyrosinový agar: G: střední, barva světlé slonové kosti (2 ca) * až melounové žlutí (3 ea) tvorba útvarů podoných koremiu 214881 AM: střední, barvy bílé až barvy svět-lé slonové kosti (2 ca] * SP: hnědorůžové (3 ie] * *] Označení barev podle příručky ColorHarmony Manual, 4. vydání (vydavatelContainer Corporation of America, 1958] 4) Fyziologické vlastnosti

Fyziologické vlastnosti kmene jsou uve-deny v tabulce 2. Kmen roste v rozmezí tep-lot 12—38 °C. Rozsah teploty, ve kterémdochází k dobrému vzdušnému růstu naajgaru (ISP číslo 2] jest 20—35 %C.Tabulka 2

Fyziologické vlastnosti kmene číslo C-15003

Rozmezí teplot pro růst: 12—38 °C

Rozmezí teplot pro vzdušný růst 12—35 °CZtekucování želatiny: pozitivní

Hydrolýza škrobu: pozitivní

Redukce dusičnanů: pozitivní

Peptonizace mléka: pozitivní

Koagulace mléka: negativní

Rozklad kaseinu: pozitivní

Tvorba melaninových barviv: negativní (peptonový agars kvasničným extraktema železem)pozitivní(tyrosinový agar)

Rozklad tyrcsinu: pozitivní

Rozklad xanthinu: negativní

Rozklad hypclxanthinu: negativní

Tolerance vůči lysozymu: pozitivní

Tolerance vůči chloridu sodnému: 2 % 5) Využívání různých zdrojů uhlíku

Využívání různých druhů uhlíku kmenemC-15003 bylo· sledováno za použití prostředípopsaného Pridhamem a Gottliebem [Jour-nal of Bacterioilogy 58, 107 (1948)] a zapoužití základního živného prostředí o stej-ném složení, ke kterému bylo přidáno 0,1procenta kvasničného extraktu. Získanéspektrum je uvedeno v následující tabulce 3.

Tabulka 3

Využívání různých zdrojů uhlíku kmenem číslo C-150Ói3

Zdroj uhlíku Růst Zdroj uhlíku Růst D-xylóza + ++* rafinóza + + * L-arahinóza + + melibioza + + D-glukóza ++ ++ i-inositol D-galaktéza + + D-sorbitol — — D-frukťóza 4—1—1—1—h D-mannitol 4-4- 4-4- L-rhamnóza + + glycerol - + D-mannóza 4—1—1—1—H rozpustný škrob + 4- sacharóza +4- +4- kontrola laktóza maltóza + + trehalóza . . 4- 4-4- kvasničného extraktu *) Základní živné prostředí s přídavkem 0,1 %

Poznámka: +++ bujný růst++ dobrý růst + růst+ slabý růst— žádný růst 6) Další charakteristické znaky

Buňky byly vypěstovány způsobem popsa-ným1 výše ad 2) a DNA byla připravena způ-sobem popsaným J. Mermurem a spolupra-covníky [Journal of Molecular Biology, 3, 208 (1961)]. Obsah G—C (guanin-cytosin)v DNA byl nalezen asi 71 mol %.

Gramové barvení vegetativního· myceliatohoto kmene bylo pozitivní.

Shora uvedené charakteristické znakyčíslo C-15003 byly srovnány s popisy uve-denými v S. A. Waksmanově monografii„The Actinomycetes”, svazek 2 (vydavatelWilliams and Wilkins Co., 1961), s popisy v příručce R. E. Buchanana a N. E. Gibboín-Se ,,Bergey’s Manual of Determinative Bac-teriology”, 8. vydání, 1974, a s popisy v dalšíliteratuře. Ačkoliv se autoři vynálezu domnívali, žetento kmen patří do· skupiny III rodu Nocar-dia, nepodařilo se jim najít mezi známýmikmeny žádný druh mající shora popsanécharakteristické znaky a proto usuzují, žetento kmen představuje nový druh mikro-organismů. Předmětný kmen číslo C-15003 je uloženve Výzkumném ústavu pro· fermentaci [Fer-mentatřon Research Institute, Agency of 214881 10

Industrial Science and Technology (FERM)]pod přijímacím číslem 3992 a v Ústavu profermentaci v Osace [Institute for Fermenta-tion, Osaka (IFO)j pod přijímacím, číslemIFO 13726 a v Americké sbírce typovýchkultur [American Type Culture Collection(ATCC), Maryland, USA] pod přijímacím,číslem' 31281. Ačkoliv je kmen číslo C-15003, jak jižbylo uvedeno, novým druhem rodu Nocar-dia, je schopný, jako všechny mikroorga-nismy, podléhat různým variacím a muta-cím, buď spontánně, nebo působením mu-tagenů. Například lze získat četné variantykmene ozařováním X-paprsky, gama-paprs-ky, ultrafialovým světlem atd., izolací jed-nobuněčných buněk, kultivací kmene naživných půdách obsahujících různé chemic-ké látky, anebo jakýmkoliv jiným mutagen-ním působením, a rovněž mutanty vznikléspontánně z původního kmene nelze v pod-statě pokládat za jiný odlišný druh, alespíše lze kteréhokoliv takového variantanebo mutanta původního kmene, schopné-ho produkovat maytansinol, maytanacin apropionát maytansinolu, používat beze změ-ny pro účely tohoto vynálezu stejně jako*kmene číslo C-15003.

Když se kmen číslo C-15003 podrobí pů-sobení různých rputagenů, získají se napří-klad mutanty, kterým v podstatě chybíschopnost produkovat rozpustná barvivá,nebo mutanty, jejichž základní mycelia jsoubezbarvá, žlutavě zelená, červenohnědá ne-bo oranžově červená, nebo mutanty, jejichžhyfy jsou schopné se rozpadat na tyčinko-vité částečky nebo krátké rozvětvené frag-menty hyf, nebo mutanty s hojným bílýmvzdušným myceliem· anebo téměř vůbec bezvzdušného mycelia.

Jako prostředí lze pra kultivaci kmeneschopného produkovat maytansinol, may-tanacin nebo propionát maytansinolu (vdalším zkracováno někdy jako „produkčníkmen”) použít tekutého nebo pevného pro-středí, jen pokud obsahuje živiny, které mů-že kmen využít; tekuté prostředí je výhodnépři výrobě velkých násadách. Živná prostře-dí musí obsahovat zdroje uhlíku a dusíku,které je kmen číslo C-15003 scopen asimilo-vat a strávit, anoranické látky, stopové ži-viny a další látky. Jako příklad zmíněnýchzdrojů uhlíku lze uvést glukózu, laktózu,sacharózu, maltózu, dextrín, škrob, glyce-rol, mannitol, sorbitol a podobné látky, tu-ky a oleje (například sójový olej, olej vy-lisovaný ze sádla, kuřecí olej a podobné)atd. Jako zdroje dusíku mohou sloužit napří-klad masový výluh, kvasniičný výluh, sušenékvasnice, sójová moučka, kukuřičný výluh,pepton, kasein, bavlníková moučka, prokva-šená melasa, močovina, amonné soli (napří-klad síran amonný, chlorid amonný, dusič-nan amonný, octan amonný atd.) a podob-né suroviny. Živná půda může dále obsahovat soli so-díku, draslíku, vápníku, hořčíku atd., soili železa, manganu, zinku, kobaltu, niklu atd.,soli kyseliny fosforečné, kyseliny borité atd.,a soli organických kyselin, jako octany apropionany. Živné prostředí může dále ob-sahovat jako přídavek různé aminokyseliny(například kyselinu glutamovou, kyselinuasparagovou, alanin, glycin, methionin, pro-lin atd.), peptidy (například dipeptidy, tri-peptidy atd.), vitaminy (například vitaminBi a Bz, kyselinu nikotinovou, vitaminy B12,C, E a další), nukleové kyseliny (napříkladpurin, pyrimidin a jejich deriváty) a dalšílátky. Za účelem úpravy pH živného pro-středí lze přidat anorganickou nebo orga-nickou kyselinu, alkálii, pufr a podobné lát-ky. Dále lze k prostředí přidat vhodnémnožství odpěňovacích prostředků, napří-klad olejů, tuků, povrchově aktivních láteka podobných prostředků.

Kultivaci kmene lze provádět za stacio-nárních podmínek, za třepání, za submerz-ních aerobních podmínek i za jiných kulti-vačních podmínek. Pro velkoprodukční ná-sady je samozřejmě výhodná submerzní ae-robní kultivace. Podmínky kultivace závisísamozřejmě na formě a složení živného pro-středí, na druhu kmene, na způsobu kulti-vace a na dalších faktorech; normálně sedává přednost provádění při 20—35 °C připočátečním pH asi 7,0 nebo podobném. Ob-zvláště výhodná teplota ve středním stadiukultivace je 23—30 °C, při počátečním' pH6,5 až 7,5. Doba kultivace je rovněž pro-měnlivá a je závislá na stejných faktorech,jaké byly uvedeny výše; je vhodné pokračo-vat v kultivaci tak dlouho, dokud titr vzni-kajícího antibiotika nedosáhne maxima. V případě provádění kultivace za třepánínebo v případě aerobní submerzní kultivacev tekutém živném prostředí se potřebná do-ba kultivace pohybuje normálně v rozmezí48—144 hodin.

Množství vzniklého antibiotika se stano-vuje za použití mikroorganismu Tetrahyme-na pyriformis W jako testovacího· oganismú.Uvedený mikroorganismus se pěstuje na tes-tovací živné půdě [20 g prateázopeptonu(Difco), 1 g kvasničného extraktu (značkyDifco), 2 g glukózy, 1000 ml destilované vo-dy a 10 ml IM-fosfátového pufru (pH 7,0) ]při 28 °C po dobu 44—48 hodin a množstvíantibiotika se stanoví sériovou zřeďovanímetodou, při které se sleduje zákal způso-bený buňkami mikroorganismů; současněse antibiotikum stanoví tenkovrstevnouchromatografií (TICj, která je popsána níže.

Maytanacin, propionát maytansinolu ne-bo· maytansinol jsou mikroorganismem pro-dukovány a hromaděny v kultivační živnépůdě jednak extracelulárně, jednak intrace-lulárně. Žádná z těchto látek nevykazuje zřetel-nou antibiotickou účinnost, a proto se dele-gují výhodněji pomocí tenkovrstvé chroma-tografie, která se provádí paraleně se sta-novováním aktivity pomocí kmene Tetrahy- 214881 11 měna. Fermentační kapalina se filtrací neboodstředěním rozdělí na podíl obsahující buň-ky a na filtrát, a filtrát se vytřepe stejnýmobjemem ethylacetátu. K buňkám se přidástejné množství 7Q% vodného acetonu jakok filtrátu, suspenze se míchá jednu hodinupři 20 °C a pak se zfiltruje. Z filtrátu se odstraní aceton za sníženéhotlaku a zbývající vadný podíl se vytřepeethylacetátem. Každý jednotlivý ethylacetá-tový elxtrakt se' zahustí na 1/100 původníhoobjemu a koncentrát se podrobí tenkovrstev-né chromatografii na vrstvě silikagelu na-nesené na skleněné desce (Merck, Němec-ká spolková republika, Kieselgel 60 F254,0,2,5 mm, 20 X 20 cm) za použití rozpouš-tědlové soustavy chloroform-methanol 9 :1.Množství látek se stanoví na základě inten-zity flourescence skvrn po detekci ozáře-ním ultrafialovým světlem při 2,537 A.

Maytancin, propionát maytansinolu a may-tansinol, které jsou uvedeným způsobemprodukovány do kultivační živné půdy, jsoulipofilní a neutrální látky, které lze izolo-vat a čistit běžnými separačními a čisticímipostupy, kterých se normálně používá přiizolaci podobných mikrobiálních meitaboli-tů. Tak například lze použít postupů, kterévyužívají rozdílů v rozpustnosti mezi anti-biotikem a nečistotou, nebo způsobů, kterévyužívají frakční adsorpční afinity různýchadsorbentů, jako aktivního uhlí, makropoi-rézních nelnogenních pryskyřic, silikagelu,kysličníku hlinitého a podobných, nebo po-stupů využívajících k odstranění nečistotiontoiměničových pryskyřic nebo podobnýchpostupů; uvedené postupy lze aplikovat jed-notlivě nebo ve vhodných kombinacích ne-bo opakovaně.

Vzhledem k tomu, že se, jak již bylo· uve-deno výše, maytanacin, propionát maytansi-nOlu nebo maytansinol vyskytují jak ve fil-trátu živného prostředí, tak v buňkách, dajíse zmíněná antibiotika izolovat a čistit po-mocí uvedených adsorbentů buď přímo, ne-bo po extrakci filtrátu rozpouštědlem, nebopo extrakci mikrobiálních buněk rozpouš-tědlem.

Extrakci antibiotik rozpouštědlem lze pro-vádět jedním z níže uvedených způsobů ne-bo jinými způsoby, například: 1) extrakcírozpouštědlem z kultivační živné půdy bezoddělení buněk,’2) extrakcí rozpouštědlemz buněk a z filtrátu po jejich vzájemnémoddělení filtrací, odstředěním nebo jinýmizpůsoby. K extrakci filtrátu a buněk, kaž-dého uvedeného podílu samostatně, lze svýhodou použít následujícího, postupu:

Jako vhodných rozpouštědel lze k extrak-ci filtrátu použít organických rozpouštědelnemísitelných s vodou, jako esterů mast-ných kyselin, například ethylacetátu nebo-amylacetátu; alkoholů, například butanolu;halogenovaných uhlovodíků, například chlo-roformu; ketonů, například methylisobutyl-ketonu. Extrakce se provádí při pH blízkémneutrální hodnotě a výhodně se kultivační 12 kapalina, upravená předem na pH 7, extra-huje ethylacetátem. Extrakt se promyje vo-dou a zahustí za. sníženého tlaku. Ke kon-centrátu se pak přidá nepolární rozpouštědlo,jako- petrolether nebo hexan, a získá se su-rový produkt I, obsahující účinnou látku.Vzhledem k tomu, že při hodnocení pomocíTLC obsahuje produkt I řadu skvrn jinýchnež maytanacinu, propionát maytansinolunebo maytansinol, podrobí se dalším čisti-cím operacím, Vhodné jsou rutinní čisticípostupy, zvláště adsorpční chromatografie,ke které lze použít jednoho z následujícíchběžných adsorbentů: silikagelu, kysličníkuhlinitého, makroporézní neionogenní ad-sorpční pryskyřice a podobných. K čištění surového produktu I je nejvý-hodnější silikagel, Eluce se může provádětnapříklad nejdříve petroletherem a hexa-nem a poté jejich směsmi s polárními roz-pouštědly, například s ethylacetátem, ace-tonem, ethanolem nebo methanolem. Přitypickém' postupu se používá sloupcovéchromatografie na silikagelu (Merck, Ně-mecká spolková republika, 0,05—0,2 mm]jako nosiči a eluce látek se provádí nejprvehexanem, pak směsí hexanu se stoupajícímmnožstvím ethylacetátu a nakonec ethylace-tátem. Eluát se jímá po frakcích, které sehodnotí pomocí TLC, a frakce obsahujícístejné účinné složky se spojí a zkoncentrujíza sníženého tlaku. Ke koncentrátu se při-dá petrolether nebo heXan a získá se suro-vý produkt II. Jelikož tento produkt obsa-huje ještě nečistoty, čistí se dále následu-jícím způsobem. Například se surový pro-dukt II čistí pomocí druhé chromatografiena sloupci silikagelu v odlišném rozpouš-tědlovém systému. K tomuto účelu je vhodnýnapříklad rozpouštědlový systém skládajícíse z halogenovaného uhlovodíku, jako di-chlormethanu nebo chloroformu, s přídav-kem polárního rozpouštědla, jako alkoholu,například ethanolu nebo methanolu, ketonu,například acetonu nebo methylethylketonu,nebo podobných rozpouštědel. Tímto způ-sobem se získá čistý maytanacin, propio-nát maytansinolu nebo maytansinol. PořadíPozpouštědlOvých systémů pro první a dru-hou sloupcovou chromatografii na silikage-lu může být i obrácené, a dále se může po-užít, v kombinaci s výše uvedenými systémy,popřípadě dalších běžných organických roz-pouštědel. íPoužije-li se k čištění surového produktuII makroporézní adsorpční pryskyřice, pro-vádí se eluce maytanacinu, propionátumatyansinolu nebo matyansinolu směsí vodys nižším alkoholem, nižším ketonem nebo sesterem. Jako nižšího· alkoholu se může po-užít například methanolu, ethanolu, propa-nolu nebo butanolu, jako nižšího ketonunapříklad acetonu nebo methylethylketonua jako esteru například ethylacetátu. Přitypickém postupu se surový produkt II roz-pustí v 60% vodném methanolu, roztok se 214881 13 naadsorbuje na sloupec pryskyřice DiaionHP-liO výrobek firmy Mitsubishi Kasei K. K.),sloupec se promyje 70% vodným methano-lem a pak se provádí eluce 90% vodnýmmethanolem, kterým se ze sloupce vyeluujemayťanaícin, propionát maytansinolu a may-tansinol. Pří kterémkoliv ze shora popsaných způ-sobů čištění se frakce obsahující žádanésloučeniny spojí a rozpouštědla se oddesti-lují za sníženého tlaku. K suchému odparkuse přidá 5 až 8 objemů ethylacetátu a směsse ponechá stát, přičemž se vyloučí krysta-ly maytanacinu, propionátu maytansinolunebo maytansinolu; v případě, že se získákrystlický produkt obsahující směs maytan-acinu s propionátem maytansinolu, oddělíse tyto· látky jedna od druhé chromatogra-fií na vhodném arsorbentu, například najednom ze shora uvedených adsorbentů.

Například za použití silikagelu nebo ma-kroporézní neionogenní absorpční prysky-řice a shora uvedených rozpouštědlovýchsystémů lze frakčně eluovat žádané slouče-niny v Čistém stavu. Použije-li se k dělenízmíněné směsi silikagelu a eluce se prová-dí hexanem, ethylacetátem nebo směsí chlo-roformu s methanolem, vytékají ze sloupce 11 nejdříve frakce obsahující propionát may-tansinolu a pak frakce obsahující maytan-acin.

Po zhodnocení pomocí TLC se příslušnéfrakce spojí, rozpouštědla se oddestilují zasníženého tlaku a k odparku se přidá eťhyl-acetát. Tímto způsobem se získají krystalyčistých sloučenin. Použije-li se k dělení zmí-něné směsi makroporézní neionogenní ab-sorpční pryskyřice, aplikuje se gradientováeluce za použití stoupajícího množství alko-holu, ketonu nebo esteru ve vodě. Napříkladpři gradientově eluci za použití 60% vodné-ho methanolu až 95% vodného· methanolu spřídavkem .5 % chloridu sodného vytékajíze sloupce nejprve frakce obsahující maytan-acin a pak frakce obsahující propionát may-tansinolu. Frakce se zhodnotí pomocí TLC,skupiny frakcí obsahující stejnou účinnoulátku se spojí, rozpouštědla se oddestilujíza sníženého tlaku a odparky se krystalizujíz ethylacetátu. Získané krystalické látky ob-sahují ethylacetát jako krystalové rozpouš-tědlo; po vysušení nad kysličníkem fosfo-rečným při 70 °C (po dobu 8 hodin) vyka-zují následující fyzikální a chemické vlast-nosti (viz tabulku 4). T a b u 1 k a 4

Fyzikální a chemické vlastnosti maytancinu, propionátu maytansinolu a maytansi-nolu

Sloučenina Mayťanacin C30H39CIN2O9 Maytansinolpropionát C31H41CÍN2O9 Maytansinol C28H37CIN2O8 Teplota tání, ° C 235—236° 188—190 0 172,5-174° Specifická [u]n22— [«]o22= [as]D22= rotace —1210 +10 0 —127° +10° —313 0 +100 (c=0,25, CHCI3) (c=O,35, CHCI3) (c=0,22, CHCls) Analýza, C 59,62 59,93 59,28 nalezeno' (%) H 6,93 6,82 6,38 N 4,28 4,32 5,02 Cl 5,64 5,57 6,15 Analýza, C 59,85 59,94 59,52 vypočteno (%) H 6,48 6,65 6,60 N 4,61 4,51 4,96 Cl 5,84 5,71 6,27 Ultrafialové 233 (30330) 233 (30240) 232 (32750) absorpční 240 (sh. 28240) 240 (sh. 28400) 244 (sh. 30850) spektrum 252 (27850) 252 (27650) 252 (31650) nm (s) 280 (5680) 280 (5740) 281 (5750) 288 (5660) 288 (5710) 288 (5700) Infračervené 1740, 1730, 1740, 1730, 1715, 1670, absorpční 1670, 1580 1670, 1580 1580 spektrum (cm“1) Hmotové 545, 485, 470 559, 485, 470, 503, 485 , 470, spektrum 450 450 450 (m/e) 1 214881

15 1B

Sloučenina

Maytanacin Maytansinolpropionát C30H39CIN2O9 C31H41CIN2O9

Maytansínol C28H37CIN2O8

Kyselý lipofilní a neutrální neutrální nebo látka bazický

Barevné reakce Dragendorfova reakce: pozitivní

Beilsteinova reakce: pozitivní lipofilní a neutrální lipofilní a neutrálnílátka látka

Dragendorfova reakce: Dragendorfova reakce: pozitivní- pozitivní

Beilsteinova reakce: Beilsteinova reakce: .pozitivní ' pozitivní

Shora uvedené reakce hodnoty elemen-tárních analýz, specifických rotací, ultra-fialových spekter, infračervených spekter,hmotových spekter atd. jsou v dobré shoděs daty uvedenými v literatuře [Kupchan .sespolupracovníky, The Journal of AmericanChemical Society 97, 5294 (1975)] pro may-tanacin, propionát maytansinolu a maytan-sinol.

Způsob podle vynálezu je dále ob jasně vnásledujících příkladech provedení, kterévšak rozsah vynálezu nijak neomezují. Po-kud není jinak uvedeno, znamenají „díly”hmotnostní a vztah mezi „díly" a objemový-mi díly” odpovídá vztahu mezi „gramy” a„mililitry“; „%!“ se vztahují, pokud není ji-nak udáno, na poměr „hmotnost/objem”. Příklad 1

Kmen číslo C-1'5003 (IFO 13726; FERM39,92; ATCC 312(81) druhu Nocardia, produ-kující maytanacin, maytansínol a propionátmaytansinolu, jak byl vypěstován na agaro-vé živné půdě (agar s kvasničným a slado-vým výluhem), se použije k naočkování 40objemových dílů násadního kultivačníhomédia (složení: 2 % glukózy, 3 °/o rozpust-ného škrobu, 1 % surové sójové moučky,1 % kukuřičného výluhu, 0,5 % polypepto-nu, 0,3 % chloridu sodného, 0,5 % uhliči-tanu vápenatého, pH 7,0), nacházejícího seve fermentoru o obsahu 200 objemovýchdílů. Naočkované médium Se inkubuje 48hodin při 28 °C, čímže se získá inokulum. 0,5 objemových dílů takto získaného ino-kula se přenese do fermentoru o obsahu200! objemových dílů, ve kterém je umístěno40 objemových dílů fermentační půdy slo-žené z 5 '% dextřinu, 3 % kukuřičného vý-luhu, 04 % polypeptonu a 0,5 % uhličitanuvápenatého (pH 7,0) a kultivuje se 9Ό ho-din při 28 °C, čímž se získá inokulum (ná-sadní kultura). Sériovou zřeďovací metodou, za použitímikroorganismu Tetrahymena pyriformis Wjako testovacího organismu a propionátumaytansinolu jako standardu, bylo nalezeno·,že shora uvedená kultura má titr 25 ^m/ml.Příklad 2 Dávka 10 objemových dílů inokula (ná- sadní kultura) získaného postupem popsa-ným v příkladu 1 se přenese do fermentoruo obsahu 2 000 objemových dílů, který ob-sahuje 500 objemových dřlů násadního kul-tivačního .média (stejného složení, jak uve-deno výše v příkladu 1) a iníkubuje se 48hodin při 28 °C. 500 objemových dílů získanékultury se přenese do fermentačního tankuz nerezové oceli o obsahu 50 000 objemovýchdílů, který Obsahuje 30 000 objemových dí-lů násadního kultivačního média a mikro-organismus se kultivuje při 28 °C za pro-vzdušňování (30 000 objemových dílů za mi-nutu), za míchání, 280 otáček za minutu(1/2DT) a za vnitřního tlaku 1 kg/cm2;získá se násadní kultura. Získaná násada sepoužije k naočkování fermentačního tankuz nerezové oceli o obsahu 200 000 objemo-vých dílů, ve kterém je 100 000 objemovýchdílů fermentační živné půdy podobnéhosložení jako půda použitá v příkladu 1, vinokulačním poměru 10· %. Naočkovanápůda se inkubuje při 28 °C za provzdušňo-vání (1O0 000 objemových dílů za minutu),za míchání, 200 otáček za minutu (1/2 DT)a za vnitřního tlaku 1 kg/cm2 po dobu 90hodin. Za použití testovací metody popsanév příkladu 1 bylo nalezeno, že shora uve-deným způsobem získaná kultura má titr25 (Ug/ml. K 90 000 objemovým dílům kapaliny získa-né způsobem shora uvedeným se přidá2000 dílů křemeliny Hyflo-supercel ® (vý-robek firmy Johnes and Manville Products,USA) a po důkladném promíchání se směszfiltruje tlakovým filtrem; získá se 85 000objemových dílů filtrátu a 32000 dílů vlh-kých buněk.

Filtrát (85 000 objemových dílů) >se za mí-chání extrahuje 30 000 objemovými dílyethylaeetátu a uvedená operace se ještějednou opakuje. Ethylacetátové podíly sespojí, prcimyjí dvakrát 30 000 objemovýmidíly vody, vysuší přidáním 500 dílů bezvo-dého síranu sodného a zahustí za sníženéhotlaku na 200 objemových dílů. Ke zkoncen-trovanému roztoku se přidá petrolether avyloučená sraženina se odfiltruje (výtěžek53 dílů). Získaný surový produkt I se mícháse 100 objemovými díly ethylaeetátu a ne-rozpuštěný podíl se odfiltruje. Filtrát se roz- 214881 17 18 ""<íf, ίΤ"·<- Λνί * , Α%£ , máchá s 10 díly silikagelu (Merck, Německáspolková republika, zrnění 0,05—0,2 mim,)a ethylacetát se odstraní za sníženého tlaku.Zbylý silikagel s naadsorbovaným produk-tem se nane!se na horní konec sloupce sili-kagelu (400 objemových dílů) a látky seeluují postupně 500 objemovými díly hexa-nu, 500 objemovými díly směsi hexanu sethylacetátem (3 :1), 500 objemovými dílysměsi hexanu s ethylacetátem (1:1), 500objemovými díly Směsi hexanu s ethylace-tátem (1:3), 500 objemovými díly ethylace-tátu, 1000 objemovými díly směsi ethylace-tátu s methanolem (50: 1) a 1000 objemo-vými díly směsi ethylacetátu s methanolem(25 :1), přičemž se eluát jímá po frakcícho 100 objemových dílech. Z každé frakce se odebere 1 objemovýdíl roztoku, rozpouštědla se oddestilují ksuchu a k odparku se přidá 0,1 objemovéhodílu ethylacetátu. Roztok se nanese vevzdálenosti 2,5 cm od spodního okraje navrstvu silikagelu nanesené na skleněné des-ce (Merck, Německá spolková republika,60 F254, 0,25 mm, 20 X'20 cm) a vyvolá dovzdálenosti asi 17 cm v rozpouštědlovémsystému ethylácetát-methanol (19:1), Povyvolání se provede detekce pomocí ultra-fialového světla o vlnové délce 2 537 A.

Frakce číslo 25 — 30, obsahující účinnoulátku o Rf 0,58—0,63, a frakce číslo 38-40,obsahující účinnou látku o RF 0,25—0,30, sespojí a zahustí za sníženého tlaku, každá naobjem asi 20 objemových dílů. K těmtokoncentrátům se přidá po 150 objemovýchdílech petroletheru a získá se 5 dílů suro-vého produktu II a 2 díly surového maytan-sinolu. 0,5 dílů surového produktu II se rozpustív 10 objemových dílech ethylacetátu a roz-tok se dobře promíchá se 4 díly silikagelu(Merck, Německá spolková republika, 0,05——0,2 mm). Ethylacetát se odpaří za snížené-ho tlaku a zbytek se nanese na vrchní částsloupce připraveného z 300 objemových dí-lů silikagelu, sloupec se. promyje nejdříve500 objemovými díly chloroformu a pak Selátky eluují postupně 500 objemovými dílysměsi chloroformu s methanolem, (50:1),50Q objemovými díly směsi chloroformu smethanolem (20: 1) a 500 díly směsi chlo-roformu s methanolem (10:1); eluát se jí-má po frakcích o 25 objemových dílech. Z každé frakce se odebere 0,5 objemovéhodílu roztoku, rozpouštědla se oddestilují zasníženého tlaku, k odparku se přildá 0,05objemového dílu ethylacetátu a směs se po-drobí tenkovrstevné chromatografii v roz-poiuštědlové soustavě chlorofor-methanol9 : 1.

Frakce číslo 40 a 41, absorbující při2 537 A v zóně o RF 0,48—0,50, se spojí arozpouštědla se oddestilují za sníženého1tlaku. K odparku se přidá 0,5 objemovéhodílu ethylacetátu a směs se ponechá stát;vyloučí se 0,05 dílu směšných krystalů may-tanacinu s propionátem maytansinolu. 0,05 dílu shora uvedených směsných krys-talů maytanacinu s propionátem maytansi-nolu se rozpustí v 5 objemových dílech me-thanolu, k roztoku se přidá 0,1 dílu chlo-ridu sodného a 5 objemových dílů voidy.Chromaťografická trubice se naplní 200 ob-jemovými díly iontoměničové pryskyřiceDiaíon HP-10 (výrobek firmy Mitsubishi Ka-se! K. K.) a sloupec se promyje 600 Objemo-vými díly 50j% vodného methanolu obsahu-jícího· 5 % chloridu sodného. Shora uvede-ným způsobem připravený roztok účinnýchlátek se nanese na sloupec iontoměniče alátky se eluují gradientovou elucí za pou-žití 1 500 objemových dílů 60% vodného me-thanolu obsahujícího 5 % chloridu sodnéhoa 1 500 objemových dílů 95% vodného me-thanolu. Eluát se jímá po frakcích o 15 ob-jemových dílech a každá frakce se zhodnotíterikovrstevnou chromatografii. Frakce číslo130 až 135 obsahují maytanacin a frakcečíslo 138 a'ž 142 obsahují propionát maytan-sinolu.

Každá skupina frakcí obsahující čistoulátku se spoijí, rozpouštědla sé oddestilujía odparek se rozpustí přidáním 30 ml vodya 50 ml ethylacetátu. Směs se protřepe vdělicí nálevce, vodná vrstva se oddělí, ethyl-acetátový potdíl se promyje dvakrát ,po 30 mívody, vysuší nad bezvodým síranem sodným,zahustí na malý objem a zkoncentrovanýroztok se odstaví ke krystalizaci. Uvedenýmzpůsobem se zláká z každé shora uvedenéskupiny frakcí krystalická látka. Krystaly,se odfiltrují a vysuší; získá se 0,013 dílumaytanacinu a 0,025 dílu prúpionátu may-tansinolu.

Ve 3 objemových dílech ethylacetátu serozpustí 0,2 dílu surového maytansinolu,získaného shora uvedeným postupem, a roz-tok se dobře rozmíchá s 0,5 dílu silikagelu(Merck, Německá spolková republika, 0,05——0,2 mm). Ethylacetát se opaří za snížené-ho tlaku, zbylý silikagel s naadsorbovanoulátkou se nanese na horní konec sloupcepřipraveného z 80 objemových dílů silika-gelu, sloupec se nejdříve promyje 150 dílychloroformu a pák se provede eluce látekpostupně ISO objemovými díly směsi chloro-formu s methanolem (50 : 1), 150 objemo-vými díly směsi chloroformu s methanolem(20:1) a 300 objemovými díly směsi chlo-roformu s methanolem (10 : l);eluát se jímáve frakcích po 10 objemových dílech. Z každé frakce se odebere 0,5 objemovéhodílu roztoku a rozpouštědlo se oddesťilujeza sníženého tlaku. K odparku se přidá 0,05objemového dílu ethylacetátu a vzorky sepodrobí tenkovrstevné chromatografii v roz-pouštědlovém systému chloroform-methanol9 : 1.

Frakce číslo 50 až 52, absorbující při 2 537A v zóně o Rf 0,33—0,38, se spojí a rozpouš-tědla se oddestilují za sníženého tlaku. K od-parku se přidá 0,5 objemového dílu ethyl-acetátu a směs se odstaví ke krystalizaci;

Claims (3)

1 214881 19 získá se 0,Q2Q dílu krystalického maytan-sinolu, P ř í k 1 ad 3 32 000 dílů odfiltrovaných buněk získa-ných způsobem popsaným v příkladu 2 seextrahuje za míchání 50 000 objemovýmidíly 70% vodného acetonu po dobu 3 ho-din, Směs se zfiltruje na tlakovém filtru aextrakce 50 000 objemovými díly 70% vod-ného acetonu s následující filtrací se opa-kuje ještě jednou. Filtráty se spojí, acetonse. clddestiluje za sníženého tlaku a zbylývodný podíl se adsorbuje na sloupci z 5 000objemových dílů iontorašničové pryskyřiceDiaton HP-10 (výrobek firmy Mitsubishi Ka-sei K. K.l. Sloupec se promyje 20 OOO obje-movými díly vody a 50% vodného methano-lu a látky se eluují 15 000 objemovými díly60%. vodného methanolu. Eluát se zahustí zasníženého tlaku na 3000 objemových dílů,přidá se 3 OOO objemových dílů vody a směsse protřepe s 3 000 objemovými díly ethyl-acetátu. Uvedená operace se opakuje ještějednou, ethylace,tátové extrakty se spojí,promyjí vodou, vysuší nad bezvodým síra-nem sodným a zahustí za sníženého tlakuna 200 objemových dílů. Ke zkoncentrova-nému roztoku se přidá petrolether a vylou-čená sraženina se odfiltruje. Získá se 280dílů; surového produktu I, který se čistísloupcovou chromatografií na silikagelupodobným způsobem, jak bylo popsáno vpříkladu 1. Získá se 1,0 díl surového pro-duktu II a 0,5 dílu surového maytansinolu.Přikládá ,ΙΟΟΟΟΟ objemových dílů násadní živnépůdy, nacházející se ve fermentačnímtair-ku ž nerezové oceli o obsahu 200 000 obje-mových, dílů, se Inokuluje 1000 objemový- 20 mi díly kultury získané způsobem popsanýmv příkladu 2, a naočkovaná půda se inku-buje při teplotě 28 °C, za provzdušňování(100 OOO objemových dílů za minutu) a zamíchání (200 otáček za minutu] po dobu48 hodin. Získaná násadní kultura se pře-vede do fermentačního tanku z nerezovéoceli o obsahu

2 OOO OOO objemových dílů,obsahujícího 1 000 000 objemových dílů fer-mentační živné půdy stejného složení, jakbylo popsáno v příkladu 1, v transplantač-ním poměru 10 %. Kultivace se provádí přiteplotě 28 °C, za provzdušňování (1000 OOOobjemových dílů za minutu), za míchání[120 otáček za minutu (1/3 DT) ] a za vnitř-ního tlaku 1 kg/cm2, po dobu 90 hodin,Získaná kultura má titr 20 jug/ml, jak bylozjištěno testovací metodou popsanou v pří-kladu 1. K 900 000 dbjemovým dílům kultivační ka-paliny získané shora uvedeným způsobemsa přidá 600 000 objemových dílů acetonu,směs se jednu hodinu míchá a pak se přidá20 000 dílů křeméliny Hyflo-supercel (vý-robce Johnes &amp; Manvilie, USA). Směs sedále míchá a pak se zfiltruje pomocí tlako-vého filtračního přístróje. K 1 700 OOO obje-movým dílům získaného filtrátu se přidá500 0100 objemových dílů vody a směs se ex-trahuje na PcdbielniakOvě koloně ( výrobcePodbielniak, lne., USA] 1 OOO 00.0 objemový-mi díly ethylacetátu. Ethylacetátový extraktse promyje vodou, vysuší přidáním bezvodé-ho síranu sodného a zahustí za sníženéhotlaku. K zahuštěnému roztoku se přidá pe-trolether a vyloučená sraženina se odfiltrujea vysuší. Uvedeným způsobem se získá 680dílů surového produktu I, který se potéčistí způsoby popsanými v příkladech 2 a

3.Získá se 1,1 dílu maytanacinu, 2,2 dílu pro-pionátu maytansinolu a 0,1 dílu maytansi-nolu. ' ' pSedmét Způsob výrctby maytansinolu, maytanacinunebo- propionátu maytansinolu, vyznačujícíse tím, že se mikroorganismus kmene No-cardia číslo C-15003 [IFO 13726] kultivuje vživném prostředí obsahujícím asimilova,těl-ně zdroje uhlíku a stravitelné zdroje dusíku VYNÁLEZU při teplotě 12 až 38 °C tak dlouho, dokudse maytansinol, maytanacin nebo propionátmaytansinolu nenahromadí ve zmíněném pro-středí, a že se poté uvedené sloučeniny izo-lují za použití rozpouštědel, adsorbentů a/ne-bo iontoměničových pryskyřic.