Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania maytansinolu i jego pochodnych, takich jak may- tanacyny i propionianu maytansinolu, wykazujacych wlasciwosci czynników przeciwnowotworowych.Wiadomo jest, ze sposród powyzszych zwiazków wysoka czynnosc przeciwnowotworowa wykazuja maytanacyna i propionian maytansinolu (Kupchan i inni, Journal of the American Chemical Society 97, 5294 (1975). Maytansinol ma jedynie slaba czyn¬ nosc przeciwnowotworowa (patrz powyzszy odnos¬ nik), lecz stanowi uzyteczny zwiazek przejsciowy, z którego latwo mozna otrzymac maytanacyne i propionian maytansinolu oraz inne pochodne.Maytansinol i maytanacyna zostaly otrzymane przez Kupchena i innych z kory Putterlickia ver- rucosa (roslina nalezaca do rodzaju Maytenus), jednak z bardzo niska wydajnoscia (0,025 mg pierw¬ szego i 0,36 mg drugiego zwiazku z kilograma wy¬ suszonej kory). Propionian maytansinolu zostal otrzymany przez chemiczne propionowanie maytan¬ sinolu.W trakcie badania próbek gleby wyodrebniono mikroorganizmy, które w pozywce hodowlanej nie¬ oczekiwanie wytworzyly maytansinol, maytanacyne lub propionian maytansinolu. Sa to mikroorganiz¬ my, nalezace do rodzaju Nocardia.Sposób wytwarzania maytansinolu, maytanacyny lub propionianu maytansinolu wedlug wynalazku polega na tym, ze poddaje sie fermentacji mikro¬ organizm, nalezacy do rodzaju Nocardia, Nocardia 10 1S it 23 10 C 15003 (ATCC 31281, IFO 13726, FERM 3992) w pozywce, zawierajacej zródla przyswajalnego wegla i azotu, i wytworzony w pozywce maytansi¬ nol, maytanacyne lub propionian maytansinolu wyodrebnia sie z pozywki hodowlanej.Wedlug dotychczasowego stanu techniki, powyz¬ sze zwiazki mozna bylo uzyskiwac z roslin, lecz jedynie z nielicznych. Produkcja jest kosztowna i czasochlonna na kazdym z etapów, tj. hodowli, wyrebu, suszenia i proszkowania roslin oraz eks¬ trakcji, wyodrebniania i oczyszczania zwiazków, a przy tym wydajnosc jest niska.W przeciwienstwie do tego, prowadzac proces sposobem wedlug wynalazku porzez hodowle mikroorganizmu, uzyskuje sie pozadane zwiazki z wysoka wydajnoscia.Sposób wedlug wynalazku jest pierwszym przy¬ kladem uzyskiwania maytansinolu i jego pochod¬ nych jako metabolitów mikroorganizmów.Szczep Nocardia C-15003 wyodrebniony zostal z gleby i innych próbek w skriningowych poszuki¬ waniach mikroorganizmów, wytwarzajacych anty¬ biotyki.Mikrobiologiczna charakterystyke szczepu C-15003 okreslono sposobami analogicznymi do zapropono¬ wanych przez Schirlinga i Gottlieba (International Journal of Systematic Bacteriology 16,313-340 (1966).Wyniki obserwacji, prowadzonych w 28°C w ciagu 21 dni sa nastepujace: 1) Charakterystyka morfologiczna 108 863108 .... ¦.'¦ , = 3 ;- ¦. - , ¦ , .. ¦ Grzybnia wegetatywna rozprzestrzenia sie dob¬ rze i rozwija w rozgalezieniach, zarówno na agarze, jak i w pozywce plynnej. Wiele sposród strzepków ma srednice 0,8 do 1,2 jim, a w pewnych przypad¬ kach moga one dzielic sie na fragmenty, przypomi¬ najace bakterie paleczkowe lub na krótkie odga¬ lezienia. Szczep daje dobre wzrosty na róznych pozywkach taksononicznych, z grzybnia powietrzna nalozona na grzybnie wegetatywna, choc czesto przyjmuje postac tworów podobnych do koremii (50—200X200—1000 jim), na których nastepuje dal¬ szy wzrost powietrzny. Grzybnia powietrzna czesto jest 'falista, a czasami napotyka sie konfiguracje proste lub w postaci luznej spirali.Mikroskopowe badania starszych hodowli wyka¬ zuja, ze jedynie w nielicznych przypadkach komór- * ki konidialne wystepuja w lancuchach, natomiast zawiesiny komórkowe, uzyskane z powierzchni ta¬ kich hodowli, wykazuja w badaniach mikroskopo¬ wych wiele tworów w ksztalcie wydluzonej elip¬ soidy (0,8—1,2 ^imX4,8—6,8 \xm) i elipsoidalnych (0,8—1,2 1,0—2,0 pim), przypominajacych artrospory.Obserwacje pod mikroskopem elektronowym wy¬ kazuja, ze powierzchnia powyzszych tworów jest gladka. 2) Skladniki komórek Szczep hodowano na. wstrzasarce, w zmodyfiko-.. wanej pozywce ISP nr 1, w 28°C, w ciagu 66 do 90 godzin. Po zakonczeniu hodowli komórki zbie¬ rano i przemywano. Sposobami B. Beckera i innych [Applied Microbiolojgy 1Z 421 (1964] i sposobem, M. P. Lechevaliera [Journal of Laboratory and Clinical Medicine, 71, 934 (1968)] powyzsze cale ko¬ mórki badano na obecnosc kwasu dwuaminopime- linowego i sklad cukrów. Stwierdzono, ze kwas dw^aminopimelinowy jest w konfiguracji mezo i znaleziono plamy, odpowiadajace galaktozie i arabi- nozie. ¦ .. . 3). Charakterystyka na pozywkach taksomicznyeh Szczep wykazal stosunkowo dobry wzrost na róznych pozywkach, z grzybnia wegetatywna bez¬ barwna do jasnozóltej w poczatkowych fazach ho¬ dowli i jasnozóltawobrazowa do zóltawobrazowej w fazach pózniejszych. W róznych pozywkach tak¬ sonomicznych szczep produkuje rozpuszczalne pig¬ menty, zólte- do zóltawobrazowych. Grzybnia po¬ wietrzna jest proszkowana i zwykle daje umiarko¬ wany wzrost, barwy bialej do zóltej lub jasno- zóltawobrazowej. Charakterystyke szczepu w róz¬ nych pozywkach taksonomicznych przedstawiono w tablicy I.Tablica I Charakterystyka hodowlana szczepu C-15003 na pozywkach taksonomicznych (A) Agar sacharozowo-azotanowy Wzrost (G): bujny, barwa jasnozólta melonowa (3 ia)* do bursztynowej (31C)*, two¬ rza sie ciala podobne do koremii Grzybnia powietrzna (AM): skapa, barwy bialej 863 4 Rozpuszczalny pigment (SP): brak lub jasno- (B) zóltawobrazowy Agar glicerynowo-azotowy: G: AM: SP: umiarkowany, barwy kosci sloniowej (2 ca)*, tworza sie ciala .podobne do ko¬ remii - umiarkowana, barwy bialej brak (C) Agar glukozowo-asparaginowy: G: AM: SP: umiarkowany: barwa jasnej nagietki (3 pa)* do jasnozóltej (2 pa)* skapa, barwy bialej jasnozólty (2 pa)* (D) Agar glicerynowo-asparginowy: G: AM: SP: (E) .Agai (F) G: AM: SP: umiarkowany, barwy kosci sloniowej (2 ca)*, tworza sie ciala podobne do koremii skapa, barwy bialej brak skrobiowy: umiarkowany, barwy kosci sloniowej (2 ca)* do pszenicznej (2 ea)*, tworza sie ciala podobne do koremii obfita, barwy kosci sloniowej (2 ca)* brak .Agar odzywczy: G: AM: SP: (G) Agai G: AM: SP: (H) Agai (I) (J) umiarkowany, barwy kosci sloniowej (2 ca)* do zólcieni kolonialnej (2 ga)*, tworza sie ciala podobne do koremii skapa, barwy bialej brak • z jablezanem wapnia: umiarkowany, barwy kosci sloniowej (2 ca)* do pszenicznej (2 ea)*, tworza sie ciala podobne do koremii umiarkowana, barwy bialej do kosci ' sloniowej (2 ca)* brak • z ekstraktem z drozdzy i z ekstraktem slodowym: G: AM: SP: Agar G: AN: SP: Agai umiarkowany, barwy bursztynowej (3 lc)* do jasnozóltej (3 la)* tworza sie ciala podobne do koremii umiarkowana, barwy bialej do kosci sloniowej (2 ca)* brak z maka owsiana: umiarkowany, barwy kosci sloniowej (2 ca)* do zólcieni kolonialnej (2 ga)*, tworza sie ciala podobne do koremii skapa, barwy bialej do jasnozóltej brak * z peptonem, ekstraktem z drozdzy i ze- lazem: |108863 1 G: AM: | SP: umiarkowany, barwy zólcieni kolonial¬ nej (2 ga)* brak zólcien kolonialna (2 ga)* | (K) Agar tyrozynowy: | G: AM: ' SP: umiarkowany, barwy kosci sloniowej (2 ca)* do jasnozóltej melonowej (3 ca)*, tworza sie ciala podobne do koremii umiarkowana, barwy bialej do kosci sloniowej (2 ca)* wielbladzi (3 ie)* | * Oznaczenie barw wedlug Color Harmony Manual, wyda¬ nie czwarte (Container Corporation of America, 1958) 4) Charakterystyka fizjologiczna Charakterystyke fizjologiczna szczepu przedsta¬ wiono w tablicy II. Zakres temperatury wzrostu: 12—38°C. Dobry wzrost powietrzny na agarze (ISP nr 2) wystepuje w zakresie 20—35°C.Tablica II Fizjologiczna charakterystyka szczepu C-15003 Zakres temperatury dla wzrostu: zakres temperatury dla wzrostu powietrznego: uplynnianie zelatyny: hydroliza skrobi: redukcja azotanów: peptonizacja mleka: koagulacja mleka: rozklad kazeiny: wytwarzanie pigmentów melanoidowych: rozklad tyrozyny:. rozklad ksantyny: rozklad hipoksantyny: tolerancja na lizozym: tolerancja na chlorek sodu: 12 do 38°C i 20 do 35°C dodatnie dodatnia dodatnia dodatnia ujemna dodatni ujemne (agar z peptonem, ekstraktem z drozdzy i zela- lazem) dodatnie (agar tyrozyno¬ wy) dodatni ujemny ujemny dodatnia 2f/o 5) Utylizacja zródel wegla Utylizacje róznych zródel wegla badano, stosu¬ jac pozywke opisana przez Pridhama i Gottlieba [Journal of Bacteriology 56, 107 (1948)] i pozywke podstawowa o tym samym skladzie +0,1% eks¬ traktu z drozdzy. Uzyskane widmo przedstawiono w tablicy III. 15 25 30 35 50 55 6 Tablica III Utylizacja zródel wegla przez szczep C-15003 10 Zródlo wegla D-ksyloza L-arabinoza 1 D-glukoza D-galaktoza D-fruktoza L-ramnoza D-mannoza sacharoza rafinoza i-inozytol D-mannitol gliceryna skrobia rozpuszczalna laktoza maltoza trehaloza kontrola wzrosit + +,+• + + + +•' + + + +' + + + +,+ + h-: + + + H-rf" ++¦ +¦+; | ± + 1 — <— | ++ ¦++; | — * | + ¦+: | — — - *~~ + ++ 1 1 * pozywka podstawowa +0,1% ekstraktu z drozdzy Skala ocen: + + + wzrost obfity, ++wzrost dobry, +' wzrost, ± wzrost slaby, — brak wzrostu ) Dalsza charakteryzacja Komórki zbierano sposobem opisanym w 2), a DNA preparowano sposobem, analogicznym do opisanego przez J. Marmura i innych (Journal of 40 Molecular Biology, 3, 208, 1961). Zawartosc G-C (guanina-cytozyna) w DNA wynosi okolo 71 mol%.Wybarwienie Grama grzybni wegetatywnej szczepu jest dodatnie.Powyzsza charakterystyke szczepu nr C-15003 tó porównano z opisami w dzielach S. A. Waksmana „The Actinomycetes", tom 2 (The Williams and Wilkins Co., 1961) i R. E. Buchanana i N. E. Gib- bonsa „Bergey's Manual of Determinative Bacterio¬ logy", wydanie ósme, 1974 oraz w innej literaturze.Szczep C-15003 nalezy do grupy III rodzaju Nocardia, a z faktu, ze opisana charakterystyka nie odpowiada zadnemu ze szczepów znanych wynika, ze szczep C-15003 jest mikroorganizmem nowego gatunku.Szczep C-15003 zdeponowano w Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology (FERM) z numerem 3992 i w In¬ stitute for Fermentation, Osaka (IFC) z numerem IFO 13726 oraz w The American Type Culture 60 Collection (ATCC), Maryland, USA, z numerem 31281.Jako pozywke do hodowli szczepu, wytwarzaja¬ cego maytansinol, maytanacyne lub propionian maytansinolu (szczepu produkcyjnego), mozna sto- 65 sowac jakakolwiek pozywke plynna lub stala, za-7 wierajaca skladniki odzywcze, utylizowane przez szczep. W celu uzyskania wysokiej wydajnosci ko¬ rzystnie jest stosowac pozywke plynna. Pozywka moze zawierac zródla wegla i azotu, asymilowane i metabolizowane przez szczep, skladniki nieorga¬ niczne, sladowe skladniki odzywcze itp. Jako przy¬ klady zródel wegla mozna wymienic glukoze, lak¬ toze, sacharoze, maltoze, dekstryne, skrobie, glice¬ ryne, mannit, sorbit itp., tluszcze i oleje (np. olej sojowy, olej smalcowy, olej kurzy itp.) i inne. Zród¬ lem azotu moze byc np. ekstrakt miesny, suszone drozdze, maka sojowa, namok kukurydziany, pep¬ ton, kazeina, maka z nasienia bawelny, odpadowa melasa, mocznik, sole amonowe (np. siarczan amo¬ nu, chlorek amonu, azotan amonu, octan amonu itp,) i inne. Pozywka moze ponadto zawierac sole sodu, potasu, wapnia, magnezu, zelaza, manganu, cynku, kobaltu, niklu itp., sole kwasu fosforowego, kwasu borowego itp., oraz sole kwasów organicz¬ nych, jak octany i propioniany. Do pozywki mozna równiez dodac róznych aminokwasów, jak np. kwas glutaminowy, kwas asparaginowy, alanina, glicyna, lizyna, metionina itp., peptydów, np. dwu- peptydów, trójpeptydów itp., witamin, np. Bly B2, kwasu nikotynowego, B12, C, E itp., kwasów nuklei¬ nowych, np. puryny, pirymidyny i ich pochodnych itp. W celu doprowadzenia pH do pozadanej war¬ tosci mozna do pozywki dodac nieorganicznych lub organicznych kwasów, zasad, buforów itp. Jako czynniki, przeciwdzialajace pienieniu, mozna sto¬ sowac w pozywce odpowiednie ilosci olejów, tlusz¬ czów, srodków powierzchniowo-czynnych itp.Hodowle mozna prowadzic stacjonarnie, na wstrzasarce, podpowierzchniowo aerobowo i w in¬ nych warunkach. W celu uzyskania wysokiej wy¬ dajnosci korzystnie jest oczywiscie prowadzic ho¬ dowle podpowierzchniowo aerobowo. Warunki ho¬ dowli sa oczywiscie zalezne od wlasciwosci fizycz¬ nych i .skladu pozywki, szczepu, sposobu hodowli i innych czynników, jednak zwykle korzystne jest prowadzic inkubacje w 20 do 35°C, przy poczatko¬ wej wartosci pH=7,0 lub zblizonej. Szczególnie pozadana jest temperatura 23—30°C w przejscio¬ wym etapie hodowli, z poczatkowa wartoscia pH= =6,5—7,5. Czas inkubacji równiez jest zmienny, w zaleznosci od wyzej wymienionych czynników.Zaleca sie prowadzic inkubacje do uzyskania ma¬ ksymalnej wartosci pozadanego miana antybioty¬ ków. W przypadku hodowli na wstrzasarce lub pod- powierzchniowej aerobowej, czas inkubacji wynosi zwykle od okolo 48 do 144 godzin.Aktywnosc antybiotyku oznacza sie stosujac jako organizm testowy Tetraphyrriena pyriformis W.Powyzszy organizm hoduje sie na pozywce testowej m. (20 g proteo^y-peptonu (Difco), 1 g ekstraktu z drozdzy (Difco), 2 g glukozy, 1000 ml wody desty¬ lowanej i 10 ml IM buforu fosforanowego (pH= =7,0) w 28°C, w ciagu 44 do 48 godzin/a aktywnosc antybiotyku oznacza sie metoda seryjnych rozcien- czen, mierzac zmetnienie hodowli oraz technika chromatografii cienkowarstwowej (TLC), dalej opi¬ sanymi.Maytanacyna, propionian maytansinolu lub may- tansinol jest wytwarzany i akumuluje sie w brze- 863 s czce hodowlanej, zarówno pozakomórkowo, jak i ' wewnatrzkomórkowo.Zadna z powyzszych substancji nie wykazuje wy¬ raznej czynnosci antybiotycznej, w zwiazku z czym 5 wykrywa sie je rozwijajac równolegle chromato- gram cienkowarstwowy, z wywolaniem biologicz¬ nym za pomoca szczepu Tetraphymena. Przez sa¬ czenie lub wirowanie brzeczke fermentacyjna roz¬ dziela sie na komórki i ciecz, a ciecz ekstrahuje 10 w stosunku 1:1 octanem etylu. Komórki zalewa sie w stosunku 1:1 70% acetonem w wodzie, miesza sie w ciagu godziny w 20°C i odsacza zawiesine.Z przesaczu odpedza sie aceton, a otrzymany roz¬ twór wodny ekntrahuje octanem etylu. Kazdy 15 z ekstraktów zateza sie do 1/100 objetosci poczatko¬ wej i poddaje chromatografii cienkowarstwowej na plytach z zelem krzemionkowym (Merck, RFN, Kieselgel 60 F254, warstwa grubosci 0,25 mm, wy¬ miary plyty 20X20, uklad rozpuszczalników chloro- 20 form-metanol 9:1). Aktywnosc okresla sie na pod¬ stawie intensywnosci plam, wykrywanych przez napromieniowanie swiatlem nadfioletowym 2537 A.Maytanacyna, propionian maytansinolu i may- tansinol, wytworzone w brzeczce, sa zwiazkami li- 25 pofilowymi i obojetnymi. Dogodnie mozna je od¬ zyskac metodami wyodrebniania i oczyszczania, zwykle stosowanymi do odzyskiwania takich me¬ tabolitów. Przykladowo, mozna zastosowac sposoby, wykorzystujace róznice rozpuszczalnosci antybioty- so ku i zanieczyszczen, frakcjonowanie, wykorzystuja¬ ce róznice w powinowactwie adsorpcyjnym na róz¬ nych adsorbentach, jak wegiel aktywny, makro- porowate zywice niejonowe, zel krzemionkowy, tle¬ nek glinu itp., usuwanie zanieczyszczen za pomoca 35 zywic jonitowych itp., oddzielnie lub w odpowied¬ niej kombinacji lub w powtórzeniach.Poniewaz, jak wspomniano, maytanacyna, pro¬ pionian maytansinolu i maytansinol wystepuja za¬ równo w plynie, jak i w komórkach, antybiotyki 40 wyodrebnia sie i oczyszcza za pomoca adsorbentu, jezeli takowy jest stosowany, badz to bezposrednio badz tez po ekstrakcji rozpuszczalnikiem w przy¬ padku plynu lub po ekstrakcji rozpuszczalnikiem w przypadku komórek. Ekstrakcje rozpuszczalni- 45 kiem mozna przeprowadzic np. z brzeczki hodo¬ wlanej przed oddzieleniem komórek, albo z ko¬ mórek i plynu uzyskanego przez saczenie, wirowa¬ nie lub innymi sposobami. Niezalezna ekstrakcje plynu i komórek mozna korzystnie przeprowadzic 50 nizej opisanym sposobem.Rozpuszczalnikami odpowiednimi do ekstrakcji plynu sa nie mieszajace sie z woda rozpuszczalniki organiczne, jak estry kwasów tluszczowych, np. octanu etylu i octanu amylu, alkohole, np. butanol, 55 chlorowcowane weglowodory, np. chloroform i ke¬ tony, np. keton metyloizobutylowy. Ekstrakcje przeprowadza sie przy odczynie bliskim obojetne¬ mu, korzystnie plyn hodowlany, doprowadzony do pH=7, ekstrahuje sie octanem etylu. Ekstrakt prze- 60 mywa sie woda i zateza pod zmniejszonym cisnie¬ niem. Do koncentratu dodaje sie niepolarnego roz¬ puszczalnika, takich jak eter naftowy lub heksan, uzyskujac surowy produkt I, zawierajacy zwiazek czynny/Poniewaz w chromatografii cienkowarstwo- 65 wej wykrywa sie szereg plam innych poza odpo-108 863 9 10 wiadajacymi maytanacynie, propionianowi maytan¬ sinolu lub maytansinolowi, produkt I poddaje sie procesowi oczyszczania. Uzyteczne sa rutynowe pro¬ cedury, zwlaszcza chromatografia adsorpcyjna na takich t zwykle stosowanych adsorbentach jak zel krzemionkowy, mikroporowate niejonowe zywice adsorpcyjne itp.Najkorzystniejszym adsorbentem do oczyszcza¬ nia surowego produktu I jest zel krzemionkowy.Chromatogram mozna rozwijac poczatkowo eterem naftowym i heksanem, a elucje prowadzic rozpusz¬ czalnikiem polarnym, jak octan etylu, aceton, eta¬ nol lub metanol. W typowym procesie z zastosowa¬ niem jako nosnika zelu krzemionkowego (Merck, RFN, 0,05—0,2 mm) chromatografie kolumnowa pro¬ wadzi sie mieszanina heksanu z octanem etylu o wzrastajacym stezeniu drugiego skladnika. Eluat zbiera sie, bada chromatografia cienkowarstwowa, a frakcje, zawierajace skladniki czynne, laczy i za- teza pod zmniejszonym cisnieniem. Do koncentra¬ tu dodaje sie eteru naftowego lub heksanu, uzys¬ kujac surowy produkt II. Poniewaz produkt ten nadal zawiera zanieczyszczenia, oczyszcza sie go dalej, np. na drugiej kolumnie z zelem krzemionko¬ wym, stosujac inny uklad rozpuszczalników. Sto¬ sowany do tego celu uklad rozwijajacy moze skla¬ dac sie z chlorowcowanego weglowodoru, jak dwu- chlorometan lub chloroform z dodatkiem rozpusz¬ czalnika polarnego, takiego jak alkohol, np. etanol lub metanol, ketonu, np. acetonu lub ketonu me- tyloetylowego itp. W powyzszy sposób wyodrebnia sie maytanacyne, propionian maytansinolu lub may- tansinol. Kolejnosc ukladów rozpuszczalników dla pierwszej i drugiej kolumny mozna odwrócic, a je¬ zeli to jest konieczne, lacznie z powyzszymi ukla¬ dami mozna uzyc innych, zwyklych rozpuszczalni¬ ków organicznych.W przypadku oczyszczania surowego produktu II za pomoca makroporowatej zywicy adsorpcyjnej, elucje maytanacyny, propionianu maytansinolu lub maytansinolu przeprowadza sie mieszanina wody z nizszym alkoholem, nizszym ketonem lub estrem.Nizszym alkoholem moze byc np. metanol, etanol, propanol lub butanol, a nizszym ketonem np. ace¬ ton lub keton metyloetylowy. Estrem moze byc np. octan etylu. W typowej procedurze, surowy pro- 10 15 20 dukt II rozpuszcza sie w 60% wodnym metanolu i adsorbuje na kolumnie z sorbentem Diaion HP-10 (Mitsubishi Kasei K. K.). Kolumne przemywa sie 70% wodnym metanolem, a nastepnie eluuje 90% wodnym metanolem, uzyskujac maytanacyne, pro¬ pionian maytansinolu lub maytansinol.W kazdym z wyzej opisanych procesów frakcje, zawierajace maytancyne, propionian maytansinolu lub maytansinol, laczy sie i odparowuje pod zmniej¬ szonym cisnieniem. Do suchego produktu dodaje, nie 5 do 8 objetosci octanu etylu i pozostawia miesza¬ nine w spoczynku, co powoduje wydzielenie krysz¬ talów maytanacyny, propionianu maytansinolu lub maytansinolu. Mieszanine krysztalów maytancyny i propionianu maytansinolu rozdziela sie na sklad¬ niki, stosujac adsorbent, jak wyzej wspomniane.Frakcjonowana elucje mozna przeprowadzic np. stosujac zel krzemionkowy lub makroporowata nie¬ jonowa zywice i wyzej podane rozpuszczalniki.Jezeli stosuje sie np. zel krzemionkowy, to rozwi¬ janie kolumny prowadzi sie heksanem, octanem ety¬ lu lub mieszanina chloroform-metanol, uzyskujac kolejne propionian maytansinolu i maytanacyne. Po analizie chromatografie cienkowarstwowa frakcje, za¬ wierajace odpowiednie skladniki, zateza sie pod zmniejszonym cisnieniem, a do koncentratu dodaje octanu etylu. W ten sposób odpowiednie zwiazki uzyskuje sie w postaci krysztalów.Przy stosowaniu jako adsorbentu makroporowa¬ tej zywicy niejonowej, elucje prowadzi sie gra- dientowo, stosujac mieszanine alkoholu, ketonu lub estru z woda, o zmiennym udziale skladników.Przykladowo, elucje gradientowa z zastosowaniem 60% wodnego metanolu i 95% wodnego metanolu z dodatkiem 5% chlorku sodu, uzyskuje sie may¬ tanacyne i propionian maytansinolu w podanej ko¬ lejnosci. Po zebraniu i detekcji z zastosowaniem chromatografii cienkowarstwowej, kazda z grup aktywnych frakcji odparowuje sie pod zmniejszo¬ nym cisnieniem i krystalizuje z octanem etylu.Wydzielone krysztaly zawieraja octan etylu jako rozpuszczalnik krystalizacji, a po suszeniu nad pieciotlenkiem fosforu w 70°C w ciagu 8 godzin 45 wykazuja wlasciwosci fizyczne i chemiczne, przed¬ stawione w tablicy IV. 30 40 Tablica IV 1 Temperatura topnienia °C Skrecalnosc wlasciwa [od]22 Analiza elementarna znaleziono (%) Analiza elementarna obliczono (%) Maytanacyna C30H39CIN2O9 2 235—236 —121±10° (c=0,25, CHCla) C 59,62 H 6,93 N 4,28 Cl 5,74 C 59,85 H 6,48 N 4,61 Cl 5,84 Propionian maytansinolu C81H41C1N209 3 183—190 —127±10° (C = 0,35, CHC18) 59,93 6,82 4,32 5,57i 59,94 6,65 4,51 5,71 Maytansinol C28H37C1N208 4 172,5—174 [ —313±10° (c=0,22, CHC18) 59,28 [ 6,38j 5,02 6,13 59,92; [ 6,60 6,27 f108 863 11 1 * ' Widmo absorbcji w nadfio¬ lecie nm (E) Wimo absorpcji w podczer¬ wieni (cm*1) Widmo masowe (m/e) Kwasny, obojetny lub zasa¬ dowy | Reakcje barwne: i 233 (30330) 240 (prze¬ giecie) 252 (27850) 280 (5680) 288 (5660) 1 1740, 1730, 1670, 1580 545, 485, 470, 450 substancja lipofilowa i obojetna Dragendorffa: dodatnia | Beilsteina: dodatnia 12 $ 233 (30240) 240 (prze¬ giecie 28400) 252 (27650) 280 (5740) 288 (5710) 1740, 1730, 1670, 1760 559, 485, 470, 450 substancja lipofilowa i obojetna Dragendorffa: dodatnia Beilsteina: dodatnia 4 232 (32750) 244 (prze¬ giecie 30850) 252 (31650) 281 (5750) 288 (5700) 175, 1670, 1580 503, 485, 570, 450 substancja lipofilowa i obojetna Dragendorffa: dodatnia Beilsteina: dodatnia Powyzsze dane dotyczace skladu elementarnego, skrecalnosci wlasciwej, widma w nadfiolecie, wid¬ ma w podczerwieni, widma masowego itp. sa w do¬ brej zgodzie z odpowiednimi danymi podanymi dla maytanacyny, propionianu maytansinolu i maytan¬ sinolu, podanymi przez Kupchana i innych (The Journal of American Chemical Society, 97, 5294, 1975).Wynalazek jest ilustrowany ponizszymi przykla¬ dami, nie ograniczajacymi jego zakresu. Jezeli nie zaznaczono inaczej, „czesci" oznaczaja czesci wa¬ gowe, stosunek miedzy „czesciami" a „czesciami objetosciowymi" odpowiada stosunkowi miedzy „gramami" a „mililitrami", a „%" odnosi sie do „wagi/objetosc".Przyklad I. Hodowla produkujacego maytan- sinol, maytancyne i propionian maytansinolu szcze¬ pu Nocardia C-15003 (IFO 13726, FERM 3992, ATCC 31281) na agarze z ekstraktem z drozdzy i ekstra¬ ktem slodowym szczepi sie fermentor o objetosci 200 czesci, zawierajacy 40 czesci objetosciowych po¬ zywki hodowli posiewowej (2% glukozy, 3% skrobi rozpuszczalnej, 1% surowej maki sojowej, 1% na- moku kukurydzianego, 0,5% polipeptonu, 0,3% NaCl, 0,5% CaCoa, pH=7,0). Zaszczepiona pozywke inkubuje sie w 28°C w ciagu 48 godzin, otrzymujac inokulum. 0,5 czesci objetosciowych tak otrzyma¬ nego inokulum przenosi sie do fermentora o po¬ jemnosci 200 czesci objetosciowych, zawierajacego 40 czesci objetosciowych pozywki fermentacyjnej, zlozonej z 5% dekstryny, 3% namoku kukurydzia¬ nego, 0,1% polipeptonu i 0,5% CaCOa (pH=7,0) i w 28°C, w ciagu 90 godzin prowadzi fermentacje, otrzymujac inokulum (hodowle pozioma).Z oznaczenia metoda seryjnych rozcienczen, z zastosowaniem jako organizmu testowego Tetra- phymena pyriformis i propionianu maytansinolu jako standardu miano hodowli wynosi 25/ng/ml.Przyklad II. 10 czesci objetosciowych ino¬ kulum (posiewu), otrzymanego w przykladzie I, przenosi sie do fermentora o objetosci 2000 czesci, zawierajacego 500 czesci objetosciowych pozywki hodowli posiewowej (jak powyzsza) i inkubuje w 28°C w ciagu 48 godzin. 500 czesci objetosciowych otrzymanej hodowli przenosi sie do tanku z nie¬ rdzewnej stali o pojemnosci 50 000 czesci objeto- 20 25 35 sciowych, zawierajacego 30 000 czesci objetoscio¬ wych pozywki hodowli posiewowej i prowadzi fer¬ mentacje w 28°cf, przy napowietrzaniu (30 000 czes¬ ci objetosciowych/minute), mieszaniu (28 obrotów/ minute (1/2DT), pod wewnetrznym cisnieniem (1 kg/ /cm2), uzyskujac hodowle posiewowa. Hodowla ta posiewa sie zbiornik z nierdzewnej stali o obje¬ tosci 200 000 czesci objetosciowych, zawierajacy 100 000 czesci objetosciowych pozywki fermenta¬ cyjnej, podobnej do stosowanej w przykladzie I, stosujac inokulum w objetosci 10% pozywki. Za¬ szczepiona pozywke inkubuje sie w 28°C, przy na¬ powietrzeniu (100 000 czesci objetosciowych/minute), mieszaniu (200 obrotów/minute) 1/2 DT), pod we¬ wnetrznym cisnieniem (1 kg/cm2), w ciagu 90 go¬ dzin. Z oznaczenia sposobem, opisanym w przykla¬ dzie I, miano hodowli wynosi 25 ng/ml. 40 45 90 000 czesci objetosciowych powyzszej hodowli zadaje sie 2000 czesci sorbentu Hyflo-SupercelR (Jones and Manville Products, USA). Po doklad¬ nym wymieszaniu mieszanine saczy sie na filtrze cisnieniowym, uzyskujac 85 000 czesci objetoscio¬ wych przesaczu i 32 000 czesci wilgotnych komórek.Przesacz (85 000 czesci objetosciowych) miesza sie i ekstrahuje 30 000 czesci octanu etylu. Powyzszy zabieg powtarza sie. Ekstrakty laczy sie, dwukrot¬ nie przemywa 30 000 czesci objetosciowych wody, suszy dodatkiem 500 czesci bezwodnego siarczanu sodu i pod zmniejszonym cisnieniem zateza do 200 czesci objetosciowych. Do koncentratu dodaje sie 50 eteru naftowego i odsacza wytracony osad (53 czes¬ ci). Powyzszy surowy produkt I miesza sie z 100 czesciami objetosciowymi octanu etylu i odsacza czesci nierozpuszczone. Przesacz miesza sie z 10 czesciami zelu krzemionkowego (Merck, RFN, 0,05— 55 —0,2 mm) i pod zmniejszonym cisnieniem odpedza octan etylu. Pozostalosc nanosi sie na górna ko¬ lumne z zelem krzemionkowym (400 czesci obje¬ tosciowych). Elucje prowadzi sie 500 czesciami ob¬ jetosciowymi heksanu* 500 czesciami objetosciowy- oo mi mieszaniny heksan-octan etylu (3:1), 500 czes¬ ciami objetosciowymi mieszaniny heksan-octan etylu (1:1), 500 czesciami objetosciowymi miesza¬ niny heksan-octan etylu (3:1), 500 czesciami obje¬ tosciowymi octan etylu, 1000 czesci objetosciowych 65 mieszaniny octan etylumetanol (50:1) i 1000 czes-108 863 13 14 ci objetosciowych mieszaniny octan etylu-metanol (25:1), zbierajac wyciek frakcjami po 100 czesci ob¬ jetosciowych.Z kazdej frakcji 1 czesc objetosciowa odparowuje sie do sucha; a do pozostalosci dodaje 0,1 czesci objetosciowej[ octanu etylu. Wytracona mieszanine nanosi sie na plyte szklana, powleczona warstwa zelu krzemionkowego (Merck, RFN, 60 F^, 0,25 mm, 20X20), w odleglosci 2,5 cm od dolnej krawedzi i na dlugosci okolo 17 cm rozwija ukladem rozpuszczal¬ ników, octan etylu — metanol (19:1). Po rozwinie¬ ciu przeprowadza sie detekcje w swietle nadfiole¬ towym (2537 A).Frakcje czynne nr 25—30 o Rf 0,58—0,63 i frak¬ cje nr 38—40 o Rf 0,25—0,30 zbiera sie i odparowu¬ je pod zmniejszonym cisnieniem do objetosci po okolo 20 czesci objetosciowych. Do koncentratów dodaje sie po 150 czesci objetosciowych eteru naf¬ towego, otrzymujac 5 czesci surowego produktu II i 2 czesci surowego maytansinolu.W 4G czesciach objetosciowych octanu etylu roz¬ puszcza sie 0,5 czesci wyzej otrzymanego surowego, produktu II, a roztwór dokladnie miesza z 4 czes¬ ciami zelu krzemionkowego (Merck, RFN, 0,05—0,2 mm). Pod zmniejszonym cisnieniem odpedza sie octan etylu. Pozostalosc nanosi sie na góre kolumny z 300 czesciami objetosciowymi zelu krzemionko¬ wego, po czym przemywa kolumne 500 czesciami objetosciowymi chloroformu, a nastepnie eluuje kolejno 500 czesciami objetosciowymi mieszaniny chloroform-metanol (50:1), 500 czesciami objetoscio¬ wymi mieszaniny chloroform-metanol (20:1) i 500 czesciami objetosciowymi mieszaniny chloroform- -metanol (10:1). Wyciek zbiera sie frakcjami po 25 czesci objetosciowych.Po 0,5 czesci objetosciowych kazdej z frakcji od¬ parowuje sie pod zmniejszonym cisnieniem. Do koncentratu dodaje sie 0,05 czesci objetosciowych octanu etylu, a mieszanine poddaje chromatografii cienkowarstwowej (uklad rozwijajacy: chloroform- -metanol 9:1).Frakcje nr 40 i 41, absorbujace przy 2537 A w strefie o Rf 0,48—0,50, zbiera sie i pod zmniej¬ szonym cisnieniem odparowuje do sucha. Do pozos¬ talosci dodaje sie 0,5 czesci objetosciowej octanu etylu i pozostawia mieszanine w spoczynku, otrzy¬ mujac 0,05 czesci mieszaniny krysztalów maytana- cyny i propionianu maytansinolu. 0,05 czesci powyzszej mieszaniny krysztalów may- tanacyny i propionianu maytansinolu rozpuszcza sie w 5 czesciach objetosciowych metanolu, a do roztworu dodaje sie 04 czesci chlorku sodu i 5 czes¬ ci objetosciowych wody. 200 czesci objetosciowych sorbentu Diaion HP-10 (Mitsubishi Kasei K. K.) upakowuje sie do kolumny i przemywa 600 czes¬ ciami objetosciowymi 50% wodnego metanolu, za¬ wierajacego 5% NaCl. Przez przemyta kolumne przepuszcza sie wyzej sporzadzony roztwór, a na¬ stepnie przeprowadza elucje gradientowa kolumny za pomoca 1500 czesci objetosciowych 60% wodnego metanolu, zawierajacego 5% NaCl i 1500 czesci objetosciowych 95% wodnego metanolu. Wyciek zbiera sie frakcjami po 15 czesci objetosciowych, a kazda z frakcji bada chromatografie cienkowar-6 10 15 stwowa. Frakcje 130—135 zawieraja maytanacyne, a frakcja 138—142 propionian maytansinolu.Kazda grupe frakcji odparowuje sie i rozpuszcza dodatkiem 30 ml wody i 50 ml octanu etylu. Roztwór wstrzasa sie w rozdzielaczu, odrzuca warstwe wo¬ dna, a warstwe octanu etylu dwukrotnie przemywa 30 ml porcjami wódy, suszy nad bezwodnym siar¬ czanem sodu, zateza i pozostawia w spoczynku.W powyzszy sposób z obu grup frakcji otrzymuje sie krysztaly, które odsacza sie i suszy. Otrzymuje sie 0,013 czesci maytanacyny i 0,25 Czesci propionia¬ nu maytansinolu.W 3 czesciach objetosciowych octanu etylu roz¬ puszcza sie 0,2 czesci wyzej otrzymanego surowca maytansinolu, "roztwór dokladnie miesza sie z 0,5 czesciami zelu krzemionkowego (Merck, RFN, 0,05—0,2 mm), po czym pod zmniejszonym cisnie¬ niem odpedza octan etylu. Pozostalosc nanosi sie na góre kolumny z 80 czesciami zelu krzemionko- 20 wego, po czym przemywa kolumne 15Ó czesciami chloroform^, a nastepnie eluuje kolejno 150 czes¬ ciami objetosciowymi mieszaniny chloroform-me¬ tanol (50:1), 150 czesciami objetosciowymi mieszani¬ ny chloroform-metanol (20:1) i 300 czesciami óbje-' 25 tosciowymi mieszaniny chloroform-metanol (10:1).Wyciek zbiera sie frakcjami po 10 czesci objetos¬ ciowych.Po 0,5 czesci objetosciowych kazdej z frakcji od¬ parowuje sie pod zmniejszonym cisnieniem. Do kon- 30 centratu dodaje sie 0,05 czesci objetosciowych oc¬ tanu etylu, a mieszanine podaje chromatografii cienkowarstwowej (uklad rozwijajacy chloroform- -metanol 9:1).Frakcje nr 50—52 absorbujace przy 2537 A w strefie o Rf 0,33 — 0,38 zbiera sie i pod zmniej¬ szonym cisnieniem odparowuje do sucha. Do po¬ zostalosci dodaje sie 0,5 czesci objetosciowych oc¬ tanu etylu i pozostawia mieszanine w spoczynku, uzyskujac 0,020 czesci krysztalów maytansinolu.Przyklad III. Przy mieszaniu, 32000 czesci komórek, uzyskanych w przykladzie II, ekstrahuje sie 50 000 czesci objetosciowych 70% wodnego ace¬ tonu, w ciagu 3 godzin, a nastepnie odsacza na fil- 45 trze cisnieniowym. Operacje ekstrakcji 50 000 czes¬ ci objetosciowych 70% wodnego acetonu i saczenia i powtarza sie. Przesacz laczy sie i pod zmniejszo¬ nym cisnieniem odpedza z nich aceton. Uzyskany uklad wodny przepuszcza sie przez kolumne z 5000 50 czesci objetosciowych sorbentu Diaion HP-10 (Mitsubishi Kasei K. K.). Kolumne przemywa nie 2000 czesci objetosciowych wody i 50% wodnego metanolu, a nastepnie eluuje 15 000 czesci objetos¬ ciowych 90% wodnego metanolu. Wyciek odparo- 55 wuje sie pod zmniejszonym cisnieniem do 3 000 czesci objetosciowych i wytrzasa z 3000 czesci obje¬ tosciowych wody i 3 000 czesci objetosciowych oc¬ tanu etylu. Powyzsza procedure powtarza sie. Ek- straty organiczne laczy sie, przemywa woda, suszy 60 dodaniem bezwodnego siarczanu sodu i pod zmniej¬ szonym cisnieniem odparowuje do 200 czesci obje¬ tosciowych. Po dodaniu eteru naftowego, odsacza sie wytracony osad (280 czesci). Wyzej otrzymany su- .:.-. .^rowy produkt I oczyszcza sie na kolumnie z zelem krzemionkowym, podobnie jak w przykladzie I, u- 35 40108 863 15 16 zyskujac 1,0 czesci surowego produktu II i 0,5 czesci surowego maytansinolu.Przyklad IV. 1000 czesci objetosciowych ho¬ dowli z przykladu II szczepi sie tank z nierdzewnej stali o objetosci 200 000 czesci, zawierajacy 100 000 czesci objetosciowych pozywki hodowli posiewowej, a szczepiona pozywke inkubuje w 28°C, przy napo¬ wietrzaniu (100 000 czesci objetosciowych/minute) i mieszaniu (200 obrotów/minute), w ciagu 48 go¬ dzin, otrzymujac hodowle posiewowa. Te hodowle posiewowa przenosi sie do tanku z nierdzewnej stali o pojemnosci 2 000 000 czesci objetosciowych, zawierajacego 1000 000 czesci objetosciowych po¬ zywki fermentacyjnej, jak uzyta w przykladzie I, a wiec stosujac posiew w ilosci 10% pozywki pro¬ dukcyjnej. Fermentacje prowgdffi sie w 28(*€ przy napowietrzeniu (1 000 000 czesci objetosciowych/mi¬ nute , mieszaniu (120 obrotów/minute) 1/3 DT7 i cis¬ nieniu wewnetrznym (1 kg/cm2), w ciagu 90 godzin.Otrzymana hodowla ma miano 20iig/ml, przy ozna¬ czeniu sposobem opisanym w przykladzie I. Po 900 000 czesci objetosciowych wyzej otrzymanej ho¬ dowli dodaje sie 900 000 czesci objetosciowyuh ace¬ tonu, miesza w ciagu godziny i dodaje 20 000 czesci Hyflo-Supercel (Jones and Mamrille, USA). Calosc 10 19 29 miesza sie dalej, a nastepnie przesacza przez filtr cisnieniowy. Do 1 700 000 czesci objetosciowych ot¬ rzymanego przesaczu dodaje sie 500 000 czesci obje¬ tosciowych wody i w aparacie Podbielniaka (Pod- bielniak, Inc., USA) ekstrahuje mieszanine 1 000 000 czesci objetosciowych octanu etylu. Ekstrakt prze¬ mywa sie woda, suszy dodaniem bezwodnego siar¬ czanu sodu i zateza pod zmniejszonym cisnieniem.Do koncentratu dodaje sie eteru naftowego, wytra¬ cony osad odsacza i suszy. W powyzszy sponób ot¬ rzymuje sie 680 czesci surowego produktu I. Po oczyszczeniu tego produktu, jak w przykladach II i III, otrzymuje sie 1,1 czesci maytanacyny^ 2,2 czes* ci propionianu maytansinolu i 0,1 czesci maytansi¬ nolu.Zastrzezenie patentowe Sposób wytwarzania maytansinolu i jego pochod¬ nych, takich jak maytanacyny i propionianu may¬ tansinolu, znamienny tym, ze prowadzi sie fermen¬ tacje mikroorganizmu Nocardia C-15003 (ATCC 31281, IFO 13728, FERM 3992), w pozywce zawie¬ rajacej zródla asymilowanego wegla i azotu, a wy¬ tworzony w pozywce maytansinol, maytanacyne i/lub propionian maytansinolu wyodrebnia sie.LDA — ZakL 2. Zam. 2557/80. 95 egz.Cena 45 zl PL PL PL The subject of the invention is a method for producing maytansinol and its derivatives, such as maytanacin and maytansinol propionate, which have anticancer properties. It is known that among the above compounds, maytanacin and maytansinol propionate have high anticancer activity (Kupchan et al., Journal of the American Chemical Society 97, 5294 (1975). Maytansinol has only weak anticancer activity (see above reference), but it is a useful intermediate compound from which maytansinol and maytansinol propionate and other derivatives can be easily prepared. Maytansinol and maytanacin were prepared by Kupchen et al. others from the bark of Putterlickia verrucosa (a plant belonging to the genus Maytenus), but with very low yields (0.025 mg of the first and 0.36 mg of the second compound per kilogram of dried bark). Maytansinol propionate was obtained by chemical propionation of maytans. sinol. During the examination of soil samples, microorganisms were isolated which unexpectedly produced maytansinol, maytanacin or maytansinol propionate in the culture medium. These are microorganisms belonging to the genus Nocardia. The method of producing maytansinol, maytanacin or maytansinol propionate according to the invention consists in fermenting a microorganism belonging to the genus Nocardia, Nocardia 10 1S it 23 10 C 15003 (ATCC 31281, IFO 13726, FERM 3992) in a nutrient solution containing sources of available carbon and nitrogen, and the maytansinol, maytanacin or maytansinol propionate produced in the nutrient medium is isolated from the culture medium. According to the current state of the art, the above compounds could be obtained from plants, but only of a few. Production is expensive and time-consuming at each stage, i.e. breeding, cutting, drying and powdering plants as well as extraction, isolation and purification of compounds, and the efficiency is low. In contrast, when carrying out the process according to the invention by culturing a microorganism , the desired compounds are obtained with high efficiency. The method according to the invention is the first example of obtaining maytansinol and its derivatives as metabolites of microorganisms. The Nocardia C-15003 strain was isolated from soil and other samples in a screening search for microorganisms producing anti- biotics. The microbiological characteristics of the C-15003 strain were determined using methods analogous to those proposed by Schirling and Gottlieb (International Journal of Systematic Bacteriology 16, 313-340 (1966). The results of observations carried out at 28°C for 21 days are as follows: 1) Characteristics morphological 108 863108 .... ¦.' ¦ , = 3 ;- ¦. - , ¦ , .. ¦ The vegetative mycelium spreads well and develops in branches, both on agar and in liquid medium. Many of the hyphae have diameters of 0.8 to 1.2 µm, and in some cases they may divide into fragments resembling rod-shaped bacteria or into short branches. The strain produces good growth on various taxonomic media, with aerial mycelium superimposed on vegetative mycelium, although it often takes the form of formations similar to koremia (50-200X200-1000 µm), on which further aerial growth occurs. The aerial mycelium is often wavy, and sometimes straight or loosely spiral configurations are encountered. Microscopic examination of older cultures shows that only in a few cases conidial cells occur in chains, while cell suspensions obtained from the surface of cultures, show in microscopic examination many formations in the shape of an elongated ellipsoid (0.8-1.2 μmX4.8-6.8 μm) and ellipsoidal (0.8-1.2 1.0 2.0 pm), resembling arthrospores. Observations under an electron microscope show that the surface of the above formations is smooth. 2) Cell components The strain was grown on. shaker, in modified ISP medium No. 1, at 28°C, for 66 to 90 hours. After the culture was completed, the cells were harvested and washed. By the methods of B. Becker et al. [Applied Microbiolojgy 1Z 421 (1964] and the method of M. P. Lechevalier [Journal of Laboratory and Clinical Medicine, 71, 934 (1968)], the above-mentioned whole cells were examined for the presence of diaminopimelic acid and sugar composition. Diaminopimelic acid was found to be in the meso configuration and spots corresponding to galactose and arabinose were found. ¦ .. . 3). Characterization on taxonomic media The strain showed relatively good growth on various media, with the vegetative mycelium colorless to light yellow in the initial stages of culture and light yellowish to yellowish in later stages. In various taxonomic media, the strain produces soluble pigments, yellow to yellowish in color. The aerial mycelium is powdery and usually produces moderate growth and is white to yellow or light yellowish in color. The characteristics of the strain in various taxonomic media are presented in Table I. Table I. Cultivation characteristics of strain C-15003 on taxonomic media (A) Sucrose-nitrate agar Growth (G): lush, light melon yellow (3 a)* to amber (31C) )*, coremia-like bodies are formed Aerial mycelium (AM): scanty, white in color 863 4 Soluble pigment (SP): absent or light-(B) yellowish Glycerin-nitrogen agar: G: AM: SP: moderate, ivory color (2 ca)*, coremia-like bodies are formed - moderate, white color absent (C) Glucose-aspartate agar: G: AM: SP: moderate: light marigold color (3 pa)* to light yellow (2 pa)* agar, white, light yellow (2 pa)* (D) Glycerol-aspartate agar: G: AM: SP: (E) . Agai (F) G: AM: SP: moderate, ivory-colored (2 ca)*, bodies similar to bark coma are formed, white in color lack of starch: moderate, ivory-colored (2 ca)* to wheat-colored (2 ea) *, coremia-like bodies are formed, abundant, ivory color (2 ca)* absent. Nutrient agar: G: AM: SP: (G) Agai G: AM: SP: (H) Agai (I) (J) moderate, ivory color (2 ca)* to colonial yellow (2 ga)*, formed coremia-like bodies, white in color absent with calcium malate: moderate, ivory (2 ca)* to wheat (2 ca)*, coremia-like bodies are formed moderate, white to ivory in color (2 ca)* none with yeast extract and malt extract: G: AM: SP: Agar G: AN: SP: Agai moderate, amber color (3 lc)* to light yellow (3 yr)* coremia-like bodies are formed moderate, white to white ivory (2 ca)* none with oat flour: moderate, ivory color (2 ca)* to colonial yellow (2 ga)*, bodies similar to cormia are formed, white to light yellow in color none * with peptone, extract of yeast and iron: |108863 1 G: AM: | SP: moderate, colonial yellow (2 ga)* no colonial yellow (2 ga)* | (K) Tyrosine agar: | G: AM: ' SP: moderate, ivory color (2 ca)* to light melon yellow (3 ca)*, coremia-like bodies are formed moderate, white to ivory color (2 ca)* camel (3 ca)* | * Color designation according to Color Harmony Manual, fourth edition (Container Corporation of America, 1958) 4) Physiological characteristics The physiological characteristics of the strain are presented in Table II. Growth temperature range: 12—38°C. Good air growth on agar (ISP No. 2) occurs in the range of 20-35°C. Table II Physiological characteristics of strain C-15003 Temperature range for growth: temperature range for air growth: gelatin liquefaction: starch hydrolysis: nitrate reduction: peptonization of milk: milk coagulation: casein breakdown: production of melanoid pigments: tyrosine breakdown:. xanthine degradation: hypoxanthine degradation: lysozyme tolerance: sodium chloride tolerance: 12 to 38°C and 20 to 35°C positive positive positive positive negative positive negative (agar with peptone, yeast extract and iron) positive (tyrosine agar ¬ wy) positive negative negative positive 2f/o 5) Utilization of carbon sources Utilization of various carbon sources was studied using the medium described by Pridham and Gottlieb [Journal of Bacteriology 56, 107 (1948)] and a basal medium with the same composition +0 1% yeast extract. The obtained spectrum is presented in Table III. 15 25 30 35 50 55 6 Table III Utilization of carbon sources by strain C-15003 10 Carbon source D-xylose L-arabinose 1 D-glucose D-galactose D-fructose L-rhamnose D-mannose sucrose raffinose i-inositol D-mannitol glycerin soluble starch lactose maltose trehalose control growth + +,+ + + + + ' + + + +' + + + +,+ + h-: + + + H-rf" ++¦ +¦+; | ± + 1 — <— | ++ ¦++; | — * | + ¦+: | — — - *~~ + ++ 1 1 * basic nutrient +0.1% yeast extract Grading scale: + + + abundant growth, ++good growth, +' growth, ± poor growth, — no growth) Further characterization Cells were collected as described in 2), and DNA was prepared in a manner analogous to that described by J. Marmur et al. (Journal of 40 Molecular Biology, 3, 208, 1961). The content of G-C (guanine-cytosine) in DNA is approximately 71 mol%. The Gram stain of the vegetative mycelium of the strain is positive. The above characteristics of strain No. C-15003 were compared with the descriptions in the works of S. A. Waksman "The Actinomycetes", volume 2 (The Williams and Wilkins Co., 1961) and R. E. Buchanan and N. E. Gibbons "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology", eighth edition, 1974 and in other literature. Strain C-15003 belongs to group III of the genus Nocardia, and due to the fact that the described characteristics do not correspond to any of the known strains, it follows that the C-15003 strain is a new species of microorganism. The C-15003 strain was deposited at the Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology (FERM) with number 3992 and at the Institute for Fermentation , Osaka (IFC) with IFO number 13726 and in The American Type Culture 60 Collection (ATCC), Maryland, USA, with number 31281. As a medium for culturing a strain producing maytansinol, maytanacin or maytansinol propionate (production strain), use any liquid or solid medium containing nutrients utilized by the strain. In order to obtain high efficiency, it is preferable to use a liquid medium. The medium may contain carbon and nitrogen sources assimilated and metabolized by the strain, inorganic components, trace nutrients, etc. Examples of carbon sources include glucose, lactose, sucrose, maltose, dextrin, starch, glycerin, mannitol, sorbitol, etc., fats and oils (e.g. soybean oil, lard oil, chicken oil, etc.) and others. The source of nitrogen may be, for example, meat extract, dried yeast, soy flour, corn liquor, peptone, casein, cottonseed flour, waste molasses, urea, ammonium salts (e.g. ammonium sulfate, ammonium chloride, nitrate ammonium, ammonium acetate etc.) and others. The medium may also contain salts of sodium, potassium, calcium, magnesium, iron, manganese, zinc, cobalt, nickel, etc., salts of phosphoric acid, boric acid, etc., and salts of organic acids, such as acetates and propionates. You can also add various amino acids to the medium, such as glutamic acid, aspartic acid, alanine, glycine, lysine, methionine, etc., peptides, e.g. dipeptides, tripeptides, etc., vitamins, e.g. Bly B2, nicotinic acid, B12 , C, E, etc., nucleic acids, e.g. purine, pyrimidine and their derivatives, etc. In order to adjust the pH to the desired value, inorganic or organic acids, bases, buffers, etc. may be added to the medium as anti-foaming agents. , appropriate amounts of oils, fats, surfactants, etc. can be used in the medium. Cultures can be carried out stationary, on a shaker, subsurface aerobically and in other conditions. In order to obtain high efficiency, it is of course preferable to carry out the cultivation aerobically subsurface. Culture conditions obviously depend on the physical properties and composition of the medium, strain, culture method and other factors, but it is usually preferable to incubate at 20 to 35°C with an initial pH of 7.0 or close to that. . Particularly desirable is a temperature of 23-30°C in the intermediate stage of cultivation, with an initial pH value of 6.5-7.5. The incubation time is also variable, depending on the above-mentioned factors. It is recommended to incubate until the maximum value of the desired antibiotic titer is obtained. In the case of culture on a shaker or subsurface aerobic facility, the incubation time is usually from about 48 to 144 hours. Antibiotic activity is determined using Tetraphyrriena pyriformis W as the test organism. The above organism is cultured on the test medium (20 g of proteo- peptone (Difco), 1 g of yeast extract (Difco), 2 g of glucose, 1000 ml of distilled water and 10 ml of IM phosphate buffer (pH= =7.0) at 28°C, for 44 to 48 hours/ and antibiotic activity is determined by the serial dilution method, measurement of culture turbidity, and the thin-layer chromatography (TLC) technique, hereinafter described. Maytanacin, maytansinol propionate, or maytansinol is produced and accumulates in the culture broth, both extracellularly , as well as intracellularly. None of the above substances has a significant antibiotic activity, therefore they are detected by parallel development of a thin-layer chromatogram, with biological development using the Tetraphymena strain. By filtration or centrifugation, the fermentation broth is separated into cells and liquid, and the liquid is extracted in a 1:1 ratio with ethyl acetate. The cells are poured with 70% acetone in water in a ratio of 1:1, stirred for an hour at 20°C and the suspension filtered. The acetone is removed from the filtrate and the obtained aqueous solution is extracted with ethyl acetate. Each 15 extracts is concentrated to 1/100 of the initial volume and subjected to thin-layer chromatography on silica gel plates (Merck, RFN, Kieselgel 60 F254, layer thickness 0.25 mm, plate dimensions 20X20, chloro-20 solvent system form-methanol 9:1). The activity is determined by the intensity of the spots, detected by irradiation with ultraviolet light. 2537 A. Maytanacin, maytansinol propionate and maytansinol, produced in the wort, are lipophilic and neutral compounds. They may conveniently be recovered by the isolation and purification methods commonly used to recover such metabolites. For example, methods can be used that take advantage of differences in the solubility of the antibiotic juice and contaminants, fractionation that takes advantage of differences in adsorption affinity on different adsorbents such as activated carbon, macroporous non-ionic resins, silica gel, aluminum oxide, etc. , removal of contaminants with ion exchange resins, etc., separately or in appropriate combinations or repetitions. Since, as mentioned, maytanacin, maytansinol propionate and maytansinol occur both in fluid and in cells, antibiotics are isolated and purifies with an adsorbent, if one is used, either directly or after solvent extraction in the case of a liquid or after solvent extraction in the case of cells. Solvent extractions may be performed, for example, from the culture broth before cell separation, or from cells and fluid obtained by filtration, centrifugation or other methods. Independent extraction of fluid and cells can preferably be carried out by the method described below. Solvents suitable for extraction of fluid are organic solvents immiscible with water, such as esters of fatty acids, e.g. ethyl acetate and amyl acetate, alcohols, e.g. butanol, halogenated hydrocarbons, eg chloroform and ketones, eg methyl isobutyl ketone. Extractions are carried out at a pH close to neutral, preferably the culture liquid, adjusted to pH = 7, is extracted with ethyl acetate. The extract is washed with water and concentrated under reduced pressure. A non-polar solvent such as petroleum ether or hexane is added to the concentrate to obtain crude product I, containing the active compound. Since thin-layer chromatography detects a number of spots other than those corresponding to maytanacine, maytan propionate sinol or maytansinol, product I is subjected to a purification process. Routine procedures are useful, especially adsorption chromatography on such commonly used adsorbents as silica gel, microporous non-ionic adsorption resins, etc. The most preferred adsorbent for purification of crude product I is silica gel. The chromatogram can be developed initially with petroleum ether and hexane, and the elutions conduct with a polar solvent such as ethyl acetate, acetone, ethanol or methanol. In a typical process using silica gel (Merck, Germany, 0.05-0.2 mm) as a carrier, column chromatography is performed with a mixture of hexane and ethyl acetate with increasing concentration of the second component. The eluate is collected, examined by thin-layer chromatography, and the fractions containing active ingredients are combined and concentrated under reduced pressure. Petroleum ether or hexane is added to the concentrate to obtain crude product II. Since this product still contains impurities, it is purified further, for example on a second silica gel column, using a different solvent system. The development system used for this purpose may consist of a halogenated hydrocarbon such as dichloromethane or chloroform with the addition of a polar solvent such as an alcohol, e.g. ethanol or methanol, a ketone, e.g. acetone or methyl ethyl ketone. etc. Maytanacin, maytansinol propionate or maytansinol are isolated in the above manner. The order of the solvent systems for the first and second columns can be reversed, and if necessary, other conventional organic solvents can be used in conjunction with the above systems. In the case of purification of crude product II with a macroporous adsorption resin, elution with maytanacin, maytansinol propionate or maytansinol is prepared by mixing water with a lower alcohol, a lower ketone or an ester. The lower alcohol may be, for example, methanol, ethanol, propanol or butanol, and the lower ketone may be, for example, acetone or methylethyl ketone. The ester may be, for example, ethyl acetate. In a typical procedure, crude product II is dissolved in 60% aqueous methanol and adsorbed on a Diaion HP-10 sorbent column (Mitsubishi Kasei K. K.). The column is washed with 70% aqueous methanol and then eluted with 90% aqueous methanol to obtain maytancin, maytansinol propionate or maytansinol. In each of the processes described above, the fractions containing maytancin, maytansinol propionate or maytansinol are combined and evaporated under reduced pressure. 5 to 8 volumes of ethyl acetate are added to the dry product and the mixture is allowed to rest, which causes the separation of crystals of maytanacin, maytansinol propionate or maytansinol. The mixture of maytancin and maytansinol propionate crystals is separated into its components using an adsorbent as mentioned above. Fractional elution can be carried out, for example, using silica gel or macroporous non-ionic resins and the above-mentioned solvents. If, for example, silica gel is used, dissolve The column is quenched with hexane, ethyl acetate or a chloroform-methanol mixture to obtain maytansinol propionate and maytanacin. After thin-layer chromatography analysis, the fractions containing the appropriate components are concentrated under reduced pressure, and ethyl acetate is added to the concentrate. In this way, appropriate compounds are obtained in the form of crystals. When using a macroporous non-ionic resin as an adsorbent, elution is carried out in a gradient using a mixture of alcohol, ketone or ester with water, with a variable share of components. For example, gradient elution using 60 % aqueous methanol and 95% aqueous methanol with the addition of 5% sodium chloride, maytanacine and maytansinol propionate are obtained in the given order. After collection and detection using thin layer chromatography, each group of active fractions is evaporated under reduced pressure and crystallized with ethyl acetate. The separated crystals contain ethyl acetate as a crystallization solvent, and after drying over phosphorus pentoxide at 70°C for 8 hours 45 have the physical and chemical properties shown in Table IV. 30 40 Table IV 1 Melting point °C Specific rotation [from]22 Elemental analysis found (%) Elemental analysis calculated (%) Maytanacin C30H39CIN2O9 2 235—236 —121±10° (c=0.25, CHCla) C 59, 62 H 6.93 N 4.28 Cl 5.74 C 59.85 H 6.48 N 4.61 Cl 5.84 Maytansinol propionate C81H41C1N209 3 183—190 —127±10° (C = 0.35, CHC18) 59.93 6.82 4.32 5.57i 59.94 6.65 4.51 5.71 Maytansinol C28H37C1N208 4 172.5—174 [ —313±10° (c=0.22, CHC18) 59.28 [ 6.38j 5.02 6.13 59.92; [ 6.60 6.27 f108 863 11 1 * ' Ultraviolet absorption spectrum nm (E) Infrared absorption spectrum (cm*1) Mass spectrum (m/e) Acidic, neutral or basic | Color reactions: i 233 (30330) 240 (inflections) 252 (27850) 280 (5680) 288 (5660) 1 1740, 1730, 1670, 1580 545, 485, 470, 450 lipophilic and neutral Dragendorff substance: positive | Beilstein: positive 12 $ 233 (30240) 240 (inflections 28400) 252 (27650) 280 (5740) 288 (5710) 1740, 1730, 1670, 1760 559, 485, 470, 450 lipophilic and neutral substance Dragen doff: positive Beilstein : positive 4 232 (32750) 244 (inflections 30850) 252 (31650) 281 (5750) 288 (5700) 175, 1670, 1580 503, 485, 570, 450 lipophilic and neutral Dragendorff substance: positive Beilstein: positive The above data regarding elemental composition, specific rotation, ultraviolet spectrum, infrared spectrum, mass spectrum, etc., are in good agreement with the corresponding data given for maytanacin, maytansinol propionate and maytansinol by Kupchan et al. (The Journal of American Chemical Society, 97, 5294, 1975). The invention is illustrated by the following non-limiting examples. Unless otherwise indicated, "parts" means parts by weight, the ratio between "parts" and "parts by volume" corresponds to the ratio between "grams" and "millilitres", and "%" refers to "weight/volume". Example I A culture of the Nocardia C-15003 strain (IFO 13726, FERM 3992, ATCC 31281) producing maytansinol, maytancinol and maytansinol propionate on agar with yeast extract and malt extract is inoculated into a 200-part fermenter containing 40 parts volume of seed culture medium (2% glucose, 3% soluble starch, 1% raw soy flour, 1% corn liquor, 0.5% polypeptone, 0.3% NaCl, 0.5% CaCoa, pH=7 .0). The inoculated medium is incubated at 28°C for 48 hours to obtain the inoculum. 0.5 parts by volume of the inoculum thus obtained are transferred to a fermenter with a capacity of 200 parts by volume, containing 40 parts by volume of the fermentation medium, complex with 5% dextrin, 3% corn liquor, 0.1% polypeptone and 0.5% CaCOa (pH = 7.0) and fermented at 28°C for 90 hours, obtaining inoculum (horizontal culture). As determined by the serial dilution method, using Tetraphymena pyriformis as the test organism and maytansinol propionate as the standard, the titer of the culture is 25/ng/ml. Example II. 10 parts by volume of the inoculum (seed) obtained in Example 1 are transferred to a 2000 parts fermenter containing 500 parts by volume of seed culture medium (as above) and incubated at 28°C for 48 hours. 500 parts by volume of the obtained culture are transferred to a 50,000 parts by volume stainless steel tank containing 30,000 parts by volume of seed culture medium and fermented at 28°cf with aeration (30 000 parts/minute by volume), stirring (28 revolutions/minute (1/2DT), under internal pressure (1 kg/cm2) to obtain a seed culture. This culture is inoculated in a stainless steel tank with a volume of 200,000 parts by volume, containing 100,000 parts by volume of a fermentation medium similar to that used in Example 1, using an inoculum at a volume of 10% of the medium. The inoculated medium is incubated at 28°C, with air (100,000 parts by volume/minute ), stirring (200 rpm) 1/2 DT), under internal pressure (1 kg/cm2), for 90 hours. As determined by the method described in Example 1, the titer of the culture is 25 ng/ml. 40 45 90,000 parts by volume of the above culture are mixed with 2,000 parts of Hyflo-SupercelR sorbent (Jones and Manville Products, USA). After thorough mixing, the mixture is filtered on a pressure filter, obtaining 85,000 parts by volume of filtrate and 32,000 parts of wet cells. The filtrate (85,000 parts by volume) is mixed and extracted with 30,000 parts of ethyl acetate. The above procedure is repeated. The extracts are combined, washed twice with 30,000 parts by volume of water, dried with the addition of 500 parts of anhydrous sodium sulfate and concentrated under reduced pressure to 200 parts by volume. 50 g of petroleum ether are added to the concentrate and the precipitate (53 parts) is filtered off. The above crude product I is mixed with 100 parts by volume of ethyl acetate and the insoluble parts are filtered off. The filtrate is mixed with 10 parts of silica gel (Merck, West Germany, 0.05-55-0.2 mm) and the ethyl acetate is removed under reduced pressure. The residue is placed on the upper silica gel column (400 parts by volume). Elution is carried out with 500 parts by volume of hexane, 500 parts by volume of hexane-ethyl acetate mixture (3:1), 500 parts by volume of hexane-ethyl acetate mixture (1:1), 500 parts by volume of hexane mixture. -ethyl acetate (3:1), 500 parts by volume of ethyl acetate, 1000 parts by volume of 65 parts of ethyl acetate-methanol mixture (50:1) and 1000 parts of 108 863 13 14 parts by volume of ethyl acetate-methanol mixture (25:1), collecting the leakage in fractions of 100 parts by volume. From each fraction, 1 part by volume is evaporated to dryness; and to the residue added 0.1 part by volume [ethyl acetate. The precipitated mixture is applied to a glass plate, covered with a layer of silica gel (Merck, Germany, 60 F^, 0.25 mm, 20X20), at a distance of 2.5 cm from the bottom edge and at a length of about 17 cm, developed with a system of solvents, ethyl acetate - methanol (19:1). After development, detection is carried out in ultraviolet light (2537 A). Active fractions No. 25-30 with Rf 0.58-0.63 and fractions No. 38-40 with Rf 0.25-0.30 are collected and evaporated under reduced pressure to approximately 20 parts by volume. 150 parts by volume of petroleum ether are added to the concentrates, obtaining 5 parts of crude product II and 2 parts of crude maytansinol. 0.5 parts of the above-obtained crude product II are dissolved in 4G parts of ethyl acetate, and the solution is thoroughly mixed. with 4 parts of silica gel (Merck, Federal Republic of Germany, 0.05-0.2 mm). Ethyl acetate is removed under reduced pressure. The residue is placed at the top of the column with 300 parts by volume of silica gel, then the column is washed with 500 parts by volume of chloroform, and then eluted successively with 500 parts by volume of the chloroform-methanol mixture (50:1) and 500 parts by volume of the mixture. chloroform-methanol (20:1) and 500 parts by volume of the chloroform-methanol mixture (10:1). The effluent is collected in fractions of 25 parts by volume. 0.5 parts by volume of each fraction is evaporated under reduced pressure. 0.05 parts by volume of ethyl acetate are added to the concentrate, and the mixture is subjected to thin-layer chromatography (developing system: chloroform-methanol 9:1). Fractions No. 40 and 41, absorbing at 2537 A in the zone with Rf 0.48-0.50, are collected and evaporated to dryness under reduced pressure. 0.5 part of ethyl acetate by volume is added to the residue and the mixture is allowed to rest, obtaining 0.05 part of a mixture of maytanacin crystals and maytansinol propionate. 0.05 parts of the above mixture of maytanacine crystals and maytansinol propionate are dissolved in 5 parts of methanol by volume, and 04 parts of sodium chloride and 5 parts of water by volume are added to the solution. 200 parts by volume of Diaion HP-10 sorbent (Mitsubishi Kasei K. K.) are packed into the column and washed with 600 parts by volume of 50% aqueous methanol containing 5% NaCl. The above-prepared solution is passed through the washed column, and then the column is gradient eluted with 1,500 parts by volume of 60% aqueous methanol containing 5% NaCl and 1,500 parts by volume of 95% aqueous methanol. The leakage is collected in fractions of 15 parts by volume, and each fraction is examined by thin-layer chromatography. Fractions 130-135 contain maytanacin, and fraction 138-142 contain maytansinol propionate. Each group of fractions is evaporated and dissolved with the addition of 30 ml of water and 50 ml of ethyl acetate. The solution is shaken in a separatory funnel, the aqueous layer is discarded, and the ethyl acetate layer is washed twice with 30 ml portions of water, dried over anhydrous sodium sulfate, concentrated and left at rest. In the above method, crystals are obtained from both groups of fractions, which are filtered off. it is drying. 0.013 parts of maytansinol and 0.25 parts of maytansinol propionate are obtained. In 3 parts of ethyl acetate, 0.2 parts of the above-obtained maytansinol raw material are dissolved, and the solution is thoroughly mixed with 0.5 parts of silica gel (Merck, Germany). , 0.05-0.2 mm), and then the ethyl acetate is removed under reduced pressure. The residue is placed on top of the column with 80 parts of silica gel, and then the column is washed with 15 parts of chloroform and then eluted successively 150 parts by volume of a chloroform-methanol mixture (50:1), 150 parts by volume of a chloroform-methanol mixture (20:1) and 300 parts by volume of a chloroform-methanol mixture (10:1). are collected in fractions of 10 parts by volume. 0.5 parts by volume of each fraction are evaporated under reduced pressure. 0.05 parts of ethyl acetate by volume are added to the concentrate, and the mixture is subjected to thin-layer chromatography ( chloroform-methanol 9:1 developing system). Fractions No. 50-52 absorbing at 2537 A in the zone with Rf 0.33-0.38 are collected and evaporated to dryness under reduced pressure. 0.5 parts of ethyl acetate by volume are added to the residue and the mixture is allowed to rest, obtaining 0.020 parts of maytansinol crystals. Example III. With stirring, 32,000 parts of the cells obtained in Example II are extracted with 50,000 parts by volume of 70% aqueous acetone for 3 hours and then filtered on a pressure filter. The operations of extraction of 50,000 parts by volume of 70% aqueous acetone and filtration are repeated. The filtrate is combined and acetone is removed from them under reduced pressure. The obtained aqueous system is passed through a column with 5000 parts by volume of Diaion HP-10 sorbent (Mitsubishi Kasei K. K.). The column is washed with 2,000 parts by volume of water and 50% aqueous methanol, and then eluted with 15,000 parts by volume of 90% aqueous methanol. The effluent is evaporated under reduced pressure to 3,000 parts by volume and shaken out with 3,000 parts by volume of water and 3,000 parts by volume of ethyl acetate. The above procedure is repeated. The organic extracts are combined, washed with water, dried with the addition of anhydrous sodium sulfate and evaporated under reduced pressure to 200 parts by volume. After adding petroleum ether, the precipitate formed (280 parts) was filtered off. The above obtained su- .:.-. . The new product I is purified on a silica gel column, similarly to Example I, obtaining 1.0 part of crude product II and 0.5 part of crude maytansinol. Example IV. 1000 parts by volume of the culture from Example II are inoculated into a 200,000-part stainless steel tank containing 100,000 parts by volume of the seed culture medium, and the inoculated medium is incubated at 28°C with aeration (100,000 parts are covered with news/minute ) and stirring (200 rpm) for 48 hours to obtain a seed culture. This seed culture is transferred to a stainless steel tank with a capacity of 2,000,000 parts by volume, containing 1,000,000 parts by volume of the fermentation medium as used in Example 1, i.e. using an inoculation of 10% of the production medium. Fermentation takes place in 28 minutes with aeration (1,000,000 parts/minute, mixing (120 rpm) 1/3 DT7 and internal pressure (1 kg/cm2), within 90 hours. Obtained the culture has a titer of 20µg/ml, determined according to the method described in Example 1. After 900,000 parts by volume of the culture obtained above, 900,000 parts by volume of acetone are added, stirred for an hour and 20,000 parts of Hyflo-Supercel are added ( Jones and Mamrille, USA). The whole mixture is further mixed and then filtered through a pressure filter. To 1,700,000 parts by volume of the obtained filtrate, 500,000 parts by volume of water are added and in a Podbielniak apparatus (Podbielniak, Inc. ., USA) extracts a mixture of 1,000,000 parts of ethyl acetate by volume. The extract is washed with water, dried by adding anhydrous sodium sulfate and concentrated under reduced pressure. Petroleum ether is added to the concentrate, the precipitate is filtered off and dried. using the above method, 680 parts of crude product I are obtained. After purifying this product as in Examples II and III, 1.1 parts of maytancin, 2.2 parts of maytansinol propionate and 0.1 part of maytansinol are obtained. Claim patent method for producing maytansinol and its derivatives, such as maytancin and maytansinol propionate, characterized in that the fermentation of the microorganism Nocardia C-15003 (ATCC 31281, IFO 13728, FERM 3992) is carried out in a medium containing sources assimilated carbon and nitrogen, and maytansinol, maytanacin and/or maytansinol propionate produced in the medium are isolated.LDA - ZakL 2. Order 2557/80. 95 copies. Price PLN 45 PL PL PL