RU2120997C1

RU2120997C1 - Method of producing 2-amino-4-(hydroxymethyl)-3a,5,6,6a- -tetrahydro-4h-cyclopent-[d]-oxazole-4,5,6-triol and strains of actinomyces micromonospora and amycolatopsis producing its

Info

Publication number: RU2120997C1
Application number: RU93042470A
Authority: RU
Inventors: Накадзима Мутсуо; Андо Осаму; Такахаси Судзи; Хамано Киеси; Харуяма Хидеюки; Киносита Такеси; Сато Акира; Такаматсу Ясуюки; Енокита Рицуо
Original assignee: Санкио Компани Лимитед
Priority date: 1991-02-15
Filing date: 1992-02-14
Publication date: 1998-10-27

Abstract

FIELD: organic chemistry, biotechnology. SUBSTANCE: invention relates to producing 2-amino-4-(hydroxymethyl)- -3a, 5,6,6a-tetrahydro-4H-cyclopent-[d]-oxazole-4,5,6-triol using new strains of actinomyces Micromonospora of species SANR 62390 FERM BP-3521 and Amycolatopsis of species SANR 60791 FERM BP-3513. This compound shows capability to inhibit activity of sugar hydrolases and can be used for treatment and prophylaxis of patients with cancer, AIDS, diabetes and obesity. EFFECT: new strains of actynomyces; enhanced effectiveness of compound. 5 cl, 6 tbl, 4 ex

Description

Изобретение касается способа получения 2-амино-4-(гидроксиметил)-3a, 5,6,6a-тетрагидро-4H-циклопент- [d] -оксазол-4,5,6-триола, имеющего ценные биологические активности и используемого для терапевтических и профилактических целей, а также штаммов актиномицетов, продуцирующих это соединение. The invention relates to a method for producing 2-amino-4- (hydroxymethyl) -3a, 5,6,6a-tetrahydro-4H-cyclopent- [d] -oxazole-4,5,6-triol, which has valuable biological activities and is used for therapeutic and prophylactic purposes, as well as strains of actinomycetes producing this compound.

Способ по изобретению предназначен для получения соединений, формула которых представляется ниже (формула II). Эти соединения могут существовать в таутомерной форме, представленной формулой IIa

Соединения настоящего изобретения обладают способностью ингибировать активность различных гидролаз сахара, и, в особенности, β-глюкозидазы и β-фруктофуранозидазы (сахаразы инвертазы).The method according to the invention is intended to produce compounds whose formula is presented below (formula II). These compounds may exist in the tautomeric form represented by formula IIa

The compounds of the present invention have the ability to inhibit the activity of various sugar hydrolases, and in particular β-glucosidase and β-fructofuranosidase (invertase sucrase).

Сообщали, что соединения, обладающие сильной ингибирующей активностью против β- -глюкозидазы, такие как кастаноспермин и дезоксиноджиримицин, являются полезными в качестве противодиабетических средств и в качестве анти-СПИД-средств (Синдром Приобретенного Иммунного Дефицита)
[R.A. Gruters et al., Nature, 330, 74-77 (1987);
M.J. Humphries et al., Cancer Res., 46, 5215-5222 (1986)].Compounds with strong inhibitory activity against β-glucosidase, such as castanospermine and deoxynojirimycin, have been reported to be useful as antidiabetic agents and as anti-AIDS agents (Acquired Immune Deficiency Syndrome)
[RA Gruters et al., Nature, 330, 74-77 (1987);
MJ Humphries et al., Cancer Res., 46, 5215-5222 (1986)].

Поэтому предполагается, что соединения, обладающие способностью ингибировать активность β-глюкозидазы, будут полезными в качестве противодиабетических или анти-СПИДных средств. Therefore, it is believed that compounds having the ability to inhibit β-glucosidase activity will be useful as antidiabetic or anti-AIDS agents.

Кроме того сообщали, что соединения, обладающие сильной ингибирующей активностью против β-фруктофуранозидазы, такие как AO-128 и Акарбоуз, являются полезными в качестве противодиабетических средств и в качестве средств против ожирения
[Satoshi Horii et al. Journal of Medicinal Chemistry, 29, 1038 - 1046 (1986);
T. Aida et al. Journal of Japanese Society of Food and Nutrition, 34, (2) 134-139 (1981)].In addition, compounds having strong inhibitory activity against β-fructofuranosidase, such as AO-128 and Acarbose, have been reported to be useful as antidiabetic agents and as anti-obesity agents
[Satoshi Horii et al. Journal of Medicinal Chemistry, 29, 1038-1046 (1986);
T. Aida et al. Journal of Japanese Society of Food and Nutrition, 34, (2) 134-139 (1981)].

Поэтому предполагается, что соединения, обладающие способностью ингибировать активность β-фруктофуранозидазы, будут полезными для лечения и профилактики диабетов и ожирения. Therefore, it is believed that compounds having the ability to inhibit β-fructofuranosidase activity will be useful for the treatment and prevention of diabetes and obesity.

Соединениями, имеющими определенное структурное сходство с соединениями настоящего изобретения, являются:
Манностатины, описанные, между прочим, Аойаги и другими Aoyagi et al. [The Journal of Antibiotics, Vol. XLII No. 6, 883 (1989)], которые, как сказано, обладают способностью ингибировать активность α-D-маннозидазы;
(1S, 2R, 3S, 4R, 5R)-метил-[2,3,4-триокси-5-(оксиметил)-циклопентил] амин, описанный, между прочим, Фарром и другими
R. A. Farr et al. [Tetrahedron Letters, 31, 7109 (1990), который, как сказано, также обладает способностью ингибировать активность α-маннозидазы;
аллосамидин, описанный, между прочим, Сакудой и другими S. Sakuda et al. [Tetrahedron Letters, 27, 2475 (1986)] 2475 (1986), который, как сказано, обладает способностью ингибировать активность хитиназы насекомых; и
кифуненсин, описанный, между прочим, H.Kayakiri et al. [J.Org. Chem., 54, 4015 (1989)], который, как сказано, является иммуномодулятором со способностью ингибировать активность α -маннозидазы.Compounds having certain structural similarities with the compounds of the present invention are:
Mannostatins described, among other things, by Aoyagi and other Aoyagi et al. [The Journal of Antibiotics, Vol. Xlii no. 6, 883 (1989)], which are said to have the ability to inhibit α-D-mannosidase activity;
(1S, 2R, 3S, 4R, 5R) -methyl- [2,3,4-trioxy-5- (hydroxymethyl) cyclopentyl] amine, described, inter alia, by Farr and others
RA Farr et al. [Tetrahedron Letters, 31, 7109 (1990), which, as said, also has the ability to inhibit the activity of α-mannosidase;
allosamidine, described, inter alia, by Sakuda and other S. Sakuda et al. [Tetrahedron Letters, 27, 2475 (1986)] 2475 (1986), which is said to have the ability to inhibit insect chitinase activity; and
kifunensin, described, inter alia, by H. Kayakiri et al. [J.Org. Chem., 54, 4015 (1989)], which, as said, is an immunomodulator with the ability to inhibit the activity of α-mannosidase.

Целью настоящего изобретения является способ получения новых соединений, обладающих ингибирующей активностью против определенных гидролаз сахара. The aim of the present invention is a method for producing new compounds having inhibitory activity against certain sugar hydrolases.

Дополнительной целью настоящего изобретения является предоставление соединений, обладающих такой активностью, которые поэтому, как предполагается, должны быть полезными при лечении и профилактике опухолей (неоплазм), СПИДа, ожирения и диабетов. An additional objective of the present invention is the provision of compounds having such activity, which therefore is supposed to be useful in the treatment and prevention of tumors (neoplasms), AIDS, obesity and diabetes.

Другие цели и преимущества станут очевидными по мере описания изобретения. Other objectives and advantages will become apparent as the description of the invention.

Соединениями настоящего изобретения является 2-амино-4-(оксиметил)-3a, 5,6,6a-тетрагидро-4H-циклопент-[d] -оксазол-4,5,6-триолы, общей формулы (II), представленной выше. The compounds of the present invention are 2-amino-4- (oxymethyl) -3a, 5,6,6a-tetrahydro-4H-cyclopent- [d] -oxazole-4,5,6-triols, of the general formula (II) above .

Изобретение дополнительно предлагает еще способ лечения или профилактики диабетов или ожирения у животных, например, млекопитающих, особенно людей, путем введения им эффективной дозы 2-амино-4-(оксиметил)-3a,5,6,6a-тетрагидро-4H-циклопент-[d] -оксазол-4,5,6-триола. The invention further provides a method of treating or preventing diabetes or obesity in animals, for example, mammals, especially humans, by administering to them an effective dose of 2-amino-4- (hydroxymethyl) -3a, 5,6,6a-tetrahydro-4H-cyclopent- [d] -oxazole-4,5,6-triol.

2-Амино-4-(оксиметил)-3a, 5,6,6a-тетрагидро-4H-циклопент-[d] -оксазол-4,5,6-триол может быть получен ферментацией, используя микроорганизм рода Микромоноспора или Амиколатопсис. 2-amino-4- (oxymethyl) -3a, 5,6,6a-tetrahydro-4H-cyclopent- [d] -oxazole-4,5,6-triol can be obtained by fermentation using a microorganism of the genus Micromonospore or Amikolatopsis.

Трехазолин, который может быть использован в качестве исходного вещества для получения соединений настоящего изобретения, может быть получен культивированием трехазолин-продуцирующего микроорганизма рода Микромоноспора или Амиколатопсис, предпочтительно трехазолин-продуцирующего микроорганизма рода Микромоноспора. Triazolin, which can be used as starting material for the preparation of the compounds of the present invention, can be obtained by culturing a triazoline-producing microorganism of the genus Micromonospore or Amikolatopsis, preferably a triazoline-producing microorganism of the genus Micromonospore.

Примером трехазолин-продуцирующего микроорганизма рода Микромоноспора является Микромоноспора вида SANK62390. Этот микроорганизм сначала хранился в собственной коллекции Исследовательского Института ферментации, Агентство Промышленной Науки и Технологии, Цукуба-ши, Ибараки-кен, Япония, 26 июля 1990 года под номером FERM P-11631, а затем депонирован по условиям Будапештского Договора в Исследовательском Институте ферментации, Агентство Промышленной Науки и Технологии, 21 августа 1991 года под номером FERM BP-3521. An example of a triazoline-producing microorganism of the genus Micromonospore is Micromonospore of the form SANK62390. This microorganism was first stored in its own collection of the Fermentation Research Institute, Agency for Industrial Science and Technology, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan, July 26, 1990 under the number FERM P-11631, and then deposited under the terms of the Budapest Treaty at the Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, August 21, 1991 under the number FERM BP-3521.

Примером трехазолин-продуцирующего микроорганизма рода Амиколатопсис является Амиколатопсис вида SANK 60791, который сдан на хранение по условиям Будапештского Договора в Исследовательский Институт ферментации, Агентство Промышленной Науки и Технологии, Цукуба-ши, Ибараки-кен, Япония, 14 августа 1991 года под номером FERM BP-3513. An example of a triazoline-producing microorganism of the Amicolatopsis genus is Amicolatopsis species SANK 60791, which was deposited under the terms of the Budapest Treaty at the Fermentation Research Institute, Agency for Industrial Science and Technology, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan, August 14, 1991 under the number FERM BP -3513.

Оба эти микроорганизма являются заново выделенными штаммами и оба составляют часть настоящего изобретения. Both of these microorganisms are newly isolated strains and both form part of the present invention.

Характеристика микроорганизмов. Characterization of microorganisms.

Микромоноспора вида SANK 62390. Micromonospore species SANK 62390.

Микромоноспора вида SANK 62390 имеет следующие микологические свойства:
1. Морфологические характеристики.Micromonospore species SANK 62390 has the following mycological properties:
1. Morphological characteristics.

SANK 62390 вырастает нормально или несколько хуже во время культивирования при 28^oC в течение периода времени от 7 до 14 суток на обычной агаровой культуральной среде, используемой для определения штамма. Субстрат (питательная среда) гифов (грибы) вытягивается надлежащим образом и разветвляется со светло-оранжевого, оранжевого в темно-коричневато-сероватый цвет, но без разрезов или резких поворотов, наблюдаемых у штаммов рода Нокардиа. Воздушные мицелии являются недоразвитыми и окрашиваются от белого в коричневато-белый цвет. Споры прослеживаются на самом субстрате гифов и образуются поодиночке на относительно коротком спорангиеносце. Форма спор является шарообразной, а поверхность спор является гладкой (однородной). Не наблюдаются особые организмы, такие как спорангии, склеротии, вирлы (WIRLS) или тому подобные.SANK 62390 grows normally or slightly worse during cultivation at 28 ^o C for a period of time from 7 to 14 days on a conventional agar culture medium used to determine the strain. The substrate (growth medium) of hyphae (fungi) is properly stretched and branches from light orange, orange to a dark brownish-gray color, but without the cuts or sharp turns observed in strains of the genus Nocardia. Aerial mycelia are underdeveloped and turn white to brownish-white. Disputes can be traced on the hyphae substrate itself and are formed singly on a relatively short sporangien. The shape of the spores is spherical, and the surface of the spores is smooth (homogeneous). No specific organisms are observed, such as sporangia, sclerotia, virles (WIRLS) or the like.

2. Выращивание на различных средах. 2. Growing on various media.

Культивируется при 28^oC в течение 14 суток на различных культуральных средах и проявляет свойства, представленные в таблице 1. Выражение "цветовые тона" представлено цветом, передаваемым номером в "Руководстве по цветовому стандарту" ("Guide to Color Standard"), изданному Исследовательским Институтом Красок в Японии.It is cultivated at 28 ^o C for 14 days on various culture media and exhibits the properties shown in table 1. The expression "color tones" is represented by the color transmitted by the number in the Guide to Color Standard, published by the Research Paint Institute in Japan.

В таблице используется следующие сокращения:
В: Выращивание; ВМ: воздушный мицелий; ОС: обратная сторона; РП: растворимый пигмент.The table uses the following abbreviations:
B: Growing; VM: aerial mycelium; OS: reverse side; RP: soluble pigment.

3. Физиологические свойства
Физиологические свойства SANK 62390, наблюдаемые в течение периода времени от 2-х суток до 21-х суток после начала культивирования при 28^oC, представляются в таблице 2.3. Physiological properties
The physiological properties of SANK 62390, observed over a period of time from 2 days to 21 days after the start of cultivation at 28 ^o C, are presented in table 2.

SANK 62390 культивируют также при 28^oC, используя агар Придхема-Готлиба (ISP 9) в качестве культуральной среды. Усваивание источников углерода, наблюдаемое после культивации в течении 14 суток, представляется в таблице 3.SANK 62390 was also cultured at 28 ^° C. using Pridham-Gottlieb agar (ISP 9) as culture medium. The assimilation of carbon sources observed after cultivation for 14 days is presented in table 3.

4. Компоненты клетки. 4. Cell components.

Оболочки клеток SANK 62390 анализируют по методу Беккера и других B. Becker et al. [Applied Microbiology, 12, 421 - 423 (1984)] и находят, что они включают мезо-диаминопимелиновую кислоту. Кроме того, компоненты сахара всех оболочек клеток SANK 62390 анализируют по методу Лешевалье M.P. Lechevalier [Journai of Laboratory & Clinical Medicine, 71, 934 (1968)] и находят, что они включают арабинозу и ксилозу, но не находят миколевую кислоту. Пептидный гликан ацильного типа в оболочке клеток, как было показано, является гликаном гликолильного типа. Основными выявленными компонентами менахинона были МК-10 (H₆), МК-10 (H₄) и МК-10 (H₈).Cell membranes of SANK 62390 were analyzed by the method of Becker and others B. Becker et al. [Applied Microbiology, 12, 421 - 423 (1984)] and find that they include meso-diaminopimelic acid. In addition, the sugar components of all cell wall membranes of SANK 62390 were analyzed by the Lechevalier method MP Lechevalier [Journai of Laboratory & Clinical Medicine, 71, 934 (1968)] and found to include arabinose and xylose, but did not find mycolic acid. The acyl type peptide glycan in the cell membrane has been shown to be a glycol type glycan. The main identified components of menaquinone were MK-10 (H ₆ ), MK-10 (H ₄ ) and MK-10 (H ₈ ).

Поэтому является очевидным то, что этот микроорганизм должен классифицироваться как новый вид, принадлежащий к роду Микромоноспора семейства Актиномицетов. Исходя из этого, он обозначается как Микромоноспора вида SANK 62390. Therefore, it is obvious that this microorganism should be classified as a new species belonging to the genus Micromonospore of the family of Actinomycetes. Based on this, it is designated as Micromonospore of the form SANK 62390.

Амиколатопсис вида SANK 60791. Amicolatopsis species SANK 60791.

Амиколатопсис вида SANK 60791 имеет следующие микологические свойства:
1. Морфологические характеристики
SANK 60791 вырастает нормально или немного хуже во время культивации при 28^oC в течение периода времени от 7 до 14 суток на обычной агаровой культуральной среде, используемой для выявления штамма. Субстрат гифов вытягивается (элонгирует) надлежащим образом и разветвляется однородно или нерегулярно с коричневато-белого, бледно-желтовато-коричневого в слабо-желтый цвет. На последних стадиях инкубации субстрат гифов и воздушные мицелии, разделенные по секциям, и воздушные мицелии, имеющие палочковидную структуру, временами наблюдаются. Гифы вытягиваются (элонгируют) без резких поворотов, наблюдаемых у штаммов рода Нокардиа. Не наблюдаются особые организмы, такие как спорангии, склеротии, вирлы или тому подобные.Amikolatopsis species SANK 60791 has the following mycological properties:
1. Morphological characteristics
SANK 60791 grows normally or slightly worse during cultivation at 28 ^o C for a period of time from 7 to 14 days on a conventional agar culture medium used to identify the strain. The hyphal substrate is elongated (elongated) appropriately and branched uniformly or irregularly from brownish-white, pale yellowish-brown to faint yellow. At the last stages of incubation, hypha substrate and aerial mycelia, divided into sections, and aerial mycelia having a rod-shaped structure are sometimes observed. Hyphae stretch (elongate) without sharp turns observed in strains of the genus Nocardia. No special organisms are observed, such as sporangia, sclerotia, virles or the like.

2. Выращивание на различных средах
Культивируется при 28^oC в течение 14 суток на различных культуральных средах и проявляет свойства, представленные в таблице 4. Выражение цветовые тона представляется цветом, передаваемым номером в "Руководстве по цветовому стандарту" ("Guide to Color Standard"), изданном Исследовательским Институтом Красок в Японии.2. Growing on various media
It is cultivated at 28 ^o C for 14 days on various culture media and exhibits the properties shown in table 4. The expression of color tones is represented by the color transmitted by the number in the Guide to Color Standard, published by the Research Institute of Colors in Japan.

В таблице используются следующие сокращения:
В: Выращивание, ВМ: Воздушный мицелий, ОС: Обратная сторона, РП: Растворимый пигмент.The following abbreviations are used in the table:
B: Cultivation, VM: Aerial mycelium, OS: Reverse side, RP: Soluble pigment.

3. Физиологические свойства
Физиологические свойства SANK 60791, наблюдаемые в течение периода времени от 2-х суток до 21-х суток после начала культивирования при 28^oC, представляются в таблице 5.3. Physiological properties
The physiological properties of SANK 60791, observed over a period of time from 2 days to 21 days after the start of cultivation at 28 ^o C, are presented in table 5.

SANK 60791 культивируют также при 28^oC, используя агар Придхема-Готлиба (ISP 9) в качестве культуральной среды. Усваивание источников углерода, наблюдаемое после культивации в течение 14 суток, представляется в таблице 6.SANK 60791 was also cultured at 28 ^° C. using Pridham-Gottlieb agar (ISP 9) as culture medium. Assimilation of carbon sources observed after cultivation for 14 days is presented in table 6.

4. Компоненты клетки. 4. Cell components.

Оболочки клеток SANK 60791 анализируют по методу Беккера и др. (Applied Microbiology, 12, 421 - 423 (1984)) и найдено, что они включают мезо-диаминопимелиновую кислоту. Кроме того, компоненты сахара всех оболочек клеток штамма SANK 60791 анализируют по методу Лешевалье (Journal of Laboratory and Clinical Medicine, 71, 934 (1968)) и найдено, что они включают арабинозу, но не найдена миколевая кислота. Пептидный гликан ацильного типа в оболочке клеток, как оказалось, является гликаном ацетильного типа. Основным выявленным компонентом менахинона был МК-9 (H₄).Cell membranes of SANK 60791 were analyzed by the method of Becker et al. (Applied Microbiology, 12, 421 - 423 (1984)) and found to include meso-diaminopimelic acid. In addition, the sugar components of all cell membranes of SANK 60791 strain were analyzed by the Leshevalle method (Journal of Laboratory and Clinical Medicine, 71, 934 (1968)) and found to include arabinose, but not found mycolic acid. The acyl type peptide glycan in the cell membrane, as it turned out, is an acetyl type glycan. The main identified component of menaquinone was MK-9 (H ₄ ).

Поэтому разумно, что микроорганизм должен быть классифицирован как новый вид, принадлежащий к роду Амиколатопсис семейства Актиномицетов. Исходя из этого, он обозначается как Амиколатопсис вида SANK 60791. Therefore, it is reasonable that the microorganism should be classified as a new species belonging to the genus Amicolatopsis of the family of Actinomycetes. Based on this, it is designated as Amicolatopsis species SANK 60791.

Идентификацию SANK 62390 и SANK 60791 производят согласно стандартам ISP (Международный Стрептомицесс-Проект), Справочнику Бергея по систематической бактериологии, том 4 (Bergey's Manual of Systematic Bacteriology), Актиномицеты, том 2 (The Actinomycetes, vol 2) и другой последней литературе по Актиномицетам. SANK 62390 and SANK 60791 are identified according to ISP (International Streptomyces Project), Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, Volume 4 (The Actinomycetes, vol 2) and other recent Actinomycetes literature. .

Установлено, что SANK 62390 и SANK 60791 продуцируют трехазолин и 2-амино-4-(оксиметил)-3а, 5,6,6а-тетрагидро-4H-циклопент[d] - оксазол-4,5,6-триол. Однако, как хорошо известно, свойства грибков вообще и актиномицетозных микроорганизмов в частности, могут изменяться значительно и такие грибки могут легко подвергаться мутации, оба посредством естественных факторов (причин) и в результате индукции искусственным способом (например, ультрафиолетовым облучением, радиоактивным излучением, химической обработкой и так далее). Таким образом, настоящее изобретение включает использование любого микроорганизма, который может быть классифицирован в пределах рода Микромоноспора или Амиколатопсис и который разделяет с SANK 62390 и SANK 60791 характерную способность продуцировать трехазолин и 2-амино-4-(оксиметил-3a,5,6,6a-тетрагидро- 4H-циклопент-[d]-оксазол-4,5,6-триол. Новые микроорганизмы SANK 62390 и SANK 60791, как предполагается, не являются исключительными, поскольку все мутанты SANK 62390 и SANK 60791 разделяют вместе с SANK 62390 и SANK 60791 их характерную способность продуцировать трехазолин и 2-амино-4-(оксиметил)-3a,5,6,6a-тетрагидро- 4H-циклопент-[d]-оксазол-4,5,6-триол. Кроме того, эти мутанты включают мутанты, полученные посредством способов генной инженерии, например, рекомбинации, трансдукции (преобразование), трансформации или тому подобными. Является вопросом несложного эксперимента определить, на основании представленного в описании сведения относительно свойств трехазолина и 2-амино-4-(оксиметил)-3a,5,6,6a- тетрагидро-4H-циклопент-[d] -оксазол-4,5,6-триола, продуцирует ли эти соединения какой-либо представленный штамм или продуцирует ли он эти соединения в достаточном количестве, чтобы придавать этому штамму повышенный коммерческий интерес. It was found that SANK 62390 and SANK 60791 produce triazolin and 2-amino-4- (oxymethyl) -3a, 5,6,6a-tetrahydro-4H-cyclopent [d] - oxazole-4,5,6-triol. However, as is well known, the properties of fungi in general and actinomycetal microorganisms in particular can change significantly and such fungi can easily mutate, both by natural factors (causes) and as a result of induction by artificial means (for example, ultraviolet radiation, radiation, chemical treatment and so on). Thus, the present invention includes the use of any microorganism that can be classified within the genus Micromonospore or Amikolatopsis and which shares with SANK 62390 and SANK 60791 the characteristic ability to produce triazoline and 2-amino-4- (oxymethyl-3a, 5,6,6a -tetrahydro-4H-cyclopent- [d] -oxazole-4,5,6-triol. The new microorganisms SANK 62390 and SANK 60791 are not expected to be exclusive, since all mutants SANK 62390 and SANK 60791 are shared with SANK 62390 and SANK 60791 their characteristic ability to produce triazolin and 2-amino 4- (oxymethyl) -3a, 5,6,6a-tetrahydro-4H-cyclopent- [d] -oxazole-4,5,6-triol. In addition, these mutants include mutants obtained by genetic engineering, for example, recombination, transduction (transformation), transformation, or the like. It is a matter of a simple experiment to determine, based on the information provided in the description, regarding the properties of triazoline and 2-amino-4- (hydroxymethyl) -3a, 5,6,6a- tetrahydro-4H- cyclopent- [d] -oxazole-4,5,6-triol, do these compounds produce any present strain or does it produce these Connections in sufficient quantity to give this strain increased commercial interest.

Трехазолин и 2-амино-4-(оксиметил)-3a,5,6,6a-тетрагидро-4H- циклопент-[d]-оксазол-4,5,6-триол, согласно настоящему изобретению, могут быть получены выращиванием из этих штаммов грибка в культуральной среде такого типа, которая обычно используется для продуцирования других продуктов ферментации из подобных микроорганизмов. Такая среда обязательно содержит микробиологически усваиваемые источники углерода и азота, а также неорганические соли, которые хорошо известны специалистам в данной области техники. Triazolin and 2-amino-4- (hydroxymethyl) -3a, 5,6,6a-tetrahydro-4H-cyclopent- [d] -oxazole-4,5,6-triol, according to the present invention, can be obtained by growing from these fungal strains in a culture medium of the type that is commonly used to produce other fermentation products from similar microorganisms. Such an environment necessarily contains microbiologically assimilable sources of carbon and nitrogen, as well as inorganic salts, which are well known to specialists in this field of technology.

Предпочтительные примеры источников углерода включают: глюкозу, фруктозу, мальтозу, сахарозу, маннит, глицерин, декстрин, овес, рожь, кукурузный крахмал, картофельный крахмал, кукурузную муку, соевую муку, жмых (фильтр-прессную лепешку) из семян хлопка, хлопковое масло, патоки (мелассы), лимонную кислоту, винную кислоту и тому подобные. Такие соединения могут быть использованы отдельно или в любом подходящем сочетании. Вообще используемое количество может варьироваться в пределах от 1 до 10 вес.% культуральной среды. Preferred examples of carbon sources include: glucose, fructose, maltose, sucrose, mannitol, glycerin, dextrin, oats, rye, corn starch, potato starch, corn flour, soy flour, cottonseed cake (filter cake), cottonseed oil, molasses (molasses), citric acid, tartaric acid and the like. Such compounds may be used singly or in any suitable combination. In general, the amount used may vary from 1 to 10% by weight of the culture medium.

Предпочтительными источниками азота обычно являются вещества, содержащие белок, такие как обычно используемые в ферментативном процессе. Примеры таких источников азота включают: соевую муку, пшеничные отруби, арахисовую муку, жмых из семян хлопчатника, хлопковое масло, муку из семян хлопчатника, гидролизаты казеина, фармамин, рыбную муку, жидкость от замачивания кукурузы, пептон, мясной экстракт, дрожжи, дрожжевой экстракт, солодовый экстракт, нитрат натрия, нитрат аммония, сульфат аммония и тому подобные. Эти источники азота могут быть использованы отдельно или в любом подходящем сочетании. Вообще, мы предпочитаем применять их в концентрации между 0,2 и 6 вес.% культуральной среды. Preferred nitrogen sources are typically protein containing substances, such as those commonly used in the enzymatic process. Examples of such nitrogen sources include: soybean flour, wheat bran, peanut flour, cottonseed meal, cottonseed oil, cottonseed flour, casein hydrolysates, farmamine, fishmeal, corn steeping liquid, peptone, meat extract, yeast, yeast extract malt extract, sodium nitrate, ammonium nitrate, ammonium sulfate and the like. These nitrogen sources may be used singly or in any suitable combination. In general, we prefer to use them at a concentration between 0.2 and 6 wt.% Of the culture medium.

Пищевые неорганические соли, которые могут быть введены в культуральную среду, являются обычными солями, которые способны предоставлять различные ионы, необходимые для выращивания микроорганизмов, такие как ионы натрия, аммония, кальция, фосфатные, сульфатные, хлоридные и карбонатные. Кроме того, среда должна содержать незначительные количества необходимых микроэлементов, таких как калия, кальция, кобальта, магния, железа и марганца. Inorganic edible salts that can be introduced into the culture medium are common salts that are able to provide various ions necessary for growing microorganisms, such as sodium, ammonium, calcium, phosphate, sulfate, chloride and carbonate ions. In addition, the medium should contain minor amounts of essential trace elements, such as potassium, calcium, cobalt, magnesium, iron and manganese.

Когда способ настоящего изобретения осуществляется методом использования культуры в жидкой среде, в культуральной среде предпочтительно используется противовспенивающее вещество, такое как силиконовое масло, растительное масло или поверхностно-активное вещество. pH культуральной среды для продуцирования трехазолина или 2-амино-4-(оксиметил)-3a,5,6,6a-тетрагидро-4H-циклопент-[d] -оксазол- 4,5,6-триола путем выращивания микроорганизмов рода Микромоноспора или Амиколатопсис, в особенности SANK 62390 и SANK 60791, предпочтительно варьирует в пределах от 5,0 до 8,0, более предпочтительно от 6,5 до 7,5. When the method of the present invention is carried out using the method of using culture in a liquid medium, an anti-foaming agent such as silicone oil, vegetable oil or a surfactant is preferably used in the culture medium. pH of the culture medium for the production of triazoline or 2-amino-4- (oxymethyl) -3a, 5,6,6a-tetrahydro-4H-cyclopent- [d] -oxazole-4,5,6-triol by growing microorganisms of the genus Micromonospore or Amikolatopsis, in particular SANK 62390 and SANK 60791, preferably ranges from 5.0 to 8.0, more preferably from 6.5 to 7.5.

Выращивание может быть проведено при любой температуре в пределах от 15 до 38^oС, хотя температура от 22 до 38^oC является предпочтительной для хорошего выращивания, а температура от 22 до 28^oC является предпочтительной для того, чтобы оптимизировать продуцирование трехазолина и 2-амино-4-(оксиметил)- 3a,5,6,6a-тетрагидро-4H-циклопент-[d]-оксазол-4,5,6-триола.Cultivation can be carried out at any temperature ranging from 15 to 38 ^o C, although a temperature of 22 to 38 ^o C is preferable for good cultivation, and a temperature of 22 to 28 ^o C is preferable in order to optimize the production of triazoline and 2- amino-4- (oxymethyl) -3a, 5,6,6a-tetrahydro-4H-cyclopent- [d] -oxazole-4,5,6-triol.

Эти соединения получаются при условиях аэробного культивирования и могут быть использованы обычные методы аэробного культивирования, такие как твердого культивирования, культивирования со встряхиванием, и методы культивирования с аэрацией и перемешиванием (погруженного культивирования). В случае маломасштабного культивирования культивирование со встряхиванием (покачиванием) в течение нескольких суток при 28^oC является типичным методом. В таком маломасштабном методе культивирования культивирование может быть инициировано с 1 (одной) или 2-мя стадиями пролиферации (быстрого размножения), продуцирующими посевные культуры, например, в колбах Эрленмейера, снабженных отбойными перегородками (пластинами, отклоняющими поток), которые служат в качестве регулятора потока жидкости. Среда для стадий посевного культивирования предпочтительно содержит источники как углерода, так и азота. В предпочтительном ряде операций для такого маломасштабного культивирования колбы с посевной культурой встряхивают (покачивают) в инкубаторе с постоянной температурой при 28^oC в течение 7 суток или до тех пор, пока не достигнется достаточное выращивание (культивирование). Выращенная посевная культура переносится затем во вторую посевную (питательную) среду или в продуцирующую среду. Когда используется фаза промежуточного выращивания, для выращивания используется в основном тот же самый метод и аликвотная часть получающегося промежуточного продукта инокулируется (засевается) в продуцирующую среду. Инокулированная (засеянная) колба может быть инкубирована в течение нескольких суток, встряхиваемая при этом, и, после завершения выращивания, содержимое колбы может быть подвергнуто центрифугированию или отфильтровано.These compounds are prepared under aerobic culture conditions and conventional aerobic culture methods such as solid culture, shake culture, and aeration and stir culture methods (submerged culture) can be used. In the case of small-scale cultivation, shaking (shaking) cultivation for several days at 28 ^° C. is a typical method. In such a small-scale cultivation method, cultivation can be initiated with 1 (one) or 2 stages of proliferation (rapid propagation) producing seed crops, for example, in Erlenmeyer flasks equipped with baffle plates (flow deflecting plates) that serve as a regulator fluid flow. The seed culture medium preferably contains sources of both carbon and nitrogen. In a preferred series of operations for such a small-scale cultivation, the seed culture flasks are shaken (shaken) in an incubator at a constant temperature at 28 ^° C. for 7 days or until sufficient growth (cultivation) is achieved. The grown seed culture is then transferred to the second seed (nutrient) medium or to the producing medium. When the intermediate growth phase is used, basically the same method is used for cultivation and an aliquot of the resulting intermediate is inoculated (seeded) into the production medium. The inoculated (seeded) flask can be incubated for several days, shaken at the same time, and, after growing, the contents of the flask can be centrifuged or filtered.

В случае крупномасштабного продуцирования предпочтительным является использование ферментеров, снабженных мешалкой и аппаратом для аэрации. В этом случае питательная среда может быть приготовлена внутри ферментера. Среда предпочтительно стерилизуется повышением температуры до 125^oC; после охлаждения стерилизованная среда может быть инокулирована предварительно полученной посевной культурой. Культивирование протекает затем при перемешивании и аэрации, например, при 28^oC. Этот метод является подходящим для получения соединений настоящего изобретения в большом количестве.In the case of large-scale production, it is preferable to use fermenters equipped with a stirrer and an aeration apparatus. In this case, the nutrient medium can be prepared inside the fermenter. The medium is preferably sterilized by raising the temperature to 125 ^° C; after cooling, the sterilized medium can be inoculated with the previously obtained seed culture. The cultivation then proceeds with stirring and aeration, for example, at 28 ^o C. This method is suitable for obtaining the compounds of the present invention in large quantities.

Течение культивирования и количество целевых трехазолина и 2-амино-4-(оксиметил)-3a, 5,6,6a-тетрагидро-4H-циклопент- [d] -оксазол-4,5,6-триола, продуцируемых по мере того, как протекает культивирование, могут быть определены измерением биологических активностей соединений или жидкостной хроматографией высокого разрешения или газовой хроматографией/масс-спектрометрией очищенного образца соединения из культурального бульона, как это описывается более подробно ниже. Трехазолин имеет ингибирующую активность против трегалазы тутового шелкопряда, и его продуцирование может быть проконтролировано путем прослеживания за активностью культурального бульона против трегалазы тутового шелкопряда, используя методики, такие как проиллюстрированные в следующем примере испытаний 3. The course of cultivation and the amount of the desired triazoline and 2-amino-4- (oxymethyl) -3a, 5,6,6a-tetrahydro-4H-cyclopent- [d] -oxazole-4,5,6-triol, produced as how the cultivation proceeds can be determined by measuring the biological activities of the compounds or by high-resolution liquid chromatography or gas chromatography / mass spectrometry of a purified sample of the compound from the culture broth, as described in more detail below. Triazolin has inhibitory activity against silkworm trehalase, and its production can be controlled by monitoring the activity of the culture broth against silkworm trehalase using techniques such as illustrated in the following test example 3.

С другой стороны, продуцирование 2-амино-4-(оксиметил)-3a,5,6,6a- тетрагидро-4H-циклопент-[d]-оксазол-4,5,6-триола наилучшим образом контролируется жидкостной хроматографией высокого разрешения или газовой хроматографией/масс-спектрометрией. Это может быть проведено путем контактирования культурального бульона с подходящей адсорбирующей смолой (например смолой, продаваемой под торговой маркой Амберлит IRC-50 [NH $\binom{+}{4}$ ]), чтобы адсорбировать 2-амино-4-(оксиметил)-3a, 5,6,6a-тетрагидро-4H-циклопент-[d] - оксазол-4,5,6-триол, например, в хроматографической колонке. Это можно осуществить следующим образом: промыванием водой; элюированием подходящим элюентом, например 0,5 N водным раствором аммиака; концентрированием элюата, например, выпариванием при пониженном давлении; и лиофилизацией (высушиванием при температуре ниже 0^oC) остатка, чтобы получить порошок. Количество 2-амино-4-(оксиметил)- 3a, 5,6,6a-тетрагидро-4H-циклопент-[d] -оксазол-4,5,6-триола в порошке может быть определено использованием жидкостной хроматографии высокого разрешения. Дополнительно, соединение сначала может быть подвергнуто ацетилированию, и количество 2-амино-4-(оксиметил)- 3a,5,6,6a-тетрагидро-4H-циклопент-[d]-оксазол-4,5,6-триола в порошке может быть определено использованием газовой хроматографии/масс-спектрометрии.On the other hand, the production of 2-amino-4- (hydroxymethyl) -3a, 5,6,6-tetrahydro-4H-cyclopent- [d] -oxazole-4,5,6-triol is best controlled by high performance liquid chromatography or gas chromatography / mass spectrometry. This can be done by contacting the culture broth with a suitable absorbent resin (for example, a resin sold under the trademark Amberlite IRC-50 [NH $\binom{+}{4}$ ]) to adsorb 2-amino-4- (oxymethyl) -3a, 5,6,6a-tetrahydro-4H-cyclopent- [d] - oxazole-4,5,6-triol, for example, in a chromatographic column. This can be done as follows: washing with water; eluting with a suitable eluent, for example a 0.5 N aqueous ammonia solution; concentrating the eluate, for example, by evaporation under reduced pressure; and lyophilization (drying at a temperature below 0 ^° C.) of the residue to obtain a powder. The amount of 2-amino-4- (oxymethyl) -3a, 5,6,6a-tetrahydro-4H-cyclopent- [d] -oxazole-4,5,6-triol in powder can be determined using high resolution liquid chromatography. Additionally, the compound may first be acetylated and the amount of 2-amino-4- (hydroxymethyl) -3a, 5,6,6a-tetrahydro-4H-cyclopent- [d] -oxazole-4,5,6-triol in powder can be determined using gas chromatography / mass spectrometry.

Обычно, количество трехазолина достигает максимума между 72 и 150 часами после инициирования ферментации (брожения), тогда как количество 2-амино-4-(оксиметил)-3a, 5,6,6a-тетрагидро-4H-циклопент- [d] -оксазол-4,5,6-триола достигает максимума между 96 и 168 часами после инициирования ферментаици. Однако точное время варьируется в зависимости от температуры и других условий ферментации, и точное оптимальное время для любого набора условий может быть легко определено, следуя по стадиям продуцирования целевого соединения, которые предложены выше. Typically, the amount of triazoline reaches a maximum between 72 and 150 hours after initiation of fermentation (fermentation), while the amount of 2-amino-4- (hydroxymethyl) -3a, 5,6,6a-tetrahydro-4H-cyclopent- [d] -oxazole -4,5,6-triol peaks between 96 and 168 hours after initiation of fermentation. However, the exact time varies depending on the temperature and other fermentation conditions, and the exact optimal time for any set of conditions can be easily determined by following the steps for producing the target compound as suggested above.

При использовании штамма рода Микромоноспора обычно продуцируются как трехазолин, так и 2-амино-4-(оксиметил)-3a, 5,6,6a- тетрагидро-4H-циклопент-[d]-оксазол-4,5,6-триол, и они могут быть разделены обычным способом во время описанной ниже методики выделения. Штаммы рода Амиколатопсис обычно продуцируют только 2-амино-4-(оксиметил)-3a, 5,6,6a-тетрагидро-4H-циклопент-[d]-оксазол-4, 5,6-триол. Оба соединения выделяются в жидкую фазу, хотя они оба находятся также и в мицелии. Они наиболее легко выделяются из жидкой фазы. When using a strain of the genus Micromonospore, both triazolin and 2-amino-4- (oxymethyl) -3a, 5,6,6-tetrahydro-4H-cyclopent- [d] -oxazole-4,5,6-triol are usually produced and they can be separated in the usual way during the isolation procedure described below. Amicolatopsis strains usually produce only 2-amino-4- (hydroxymethyl) -3a, 5,6,6a-tetrahydro-4H-cyclopent- [d] -oxazole-4, 5,6-triol. Both compounds are released into the liquid phase, although both are also in the mycelium. They most easily stand out from the liquid phase.

После завершения культивирования целевые трехазолин и/или 2-амино-4-(оксиметил)-3a-5,6,6a-тетрагидро-4H-циклопент-[d]-оксазол-4, 5,6-триол, которые находятся в жидкой фазе культурального бульона, могут быть фракционированы отфильтровыванием мицелия и других твердых веществ, используя преимущественно диатомовую землю в качестве фильтра-помощника, или центрифугированием. Эти соединения, которые в таком случае находятся в фильтрате или в надосадочной жидкости, могут быть выделены путем экстракции, а затем могут быть очищены обычным способом, используя их физико-химические свойства. After completion of the cultivation, the desired triazoline and / or 2-amino-4- (hydroxymethyl) -3a-5,6,6a-tetrahydro-4H-cyclopent- [d] -oxazole-4, 5,6-triol, which are in liquid phase of the culture broth, can be fractionated by filtration of mycelium and other solids, using predominantly diatomaceous earth as an aid filter, or by centrifugation. These compounds, which are then in the filtrate or in the supernatant, can be isolated by extraction, and then can be purified in the usual way using their physicochemical properties.

Например, эти соединения могут быть выделены из фильтрата или надосадочной жидкости, пропуская его (ее) через колонку, содержащую адсорбент, такой как ионообменная смола, например, Амберлит IRC-50 или CG-50, или Дауэкс 50WX4 или SBR-P, с тем, чтобы или примеси удерживать на смоле и таким образом удалять их, или целевое соединение удерживать, а затем выделять элюированием, например, с помощью водного аммиака. Примеры других абсорбентов включают активированный древесный уголь или другие адсорбирующие смолы, такие как Амберлит ХАД-2 или ХАД-4 (продукция фирмы Рохм энд Хаас Ко.), или Дайайон НР-10, НР-20, СНР-20-, НР-50 (продукция Асахи Кемикэл Индастри Ко., Лтд. ). Раствор, содержащий трехазолин и/или 2-амино-4-(оксиметил)-3a, 5,6,6a-тетрагидро-4H-циклопент-[d]-оксазол-4, 5, 6-триол, пропускается через адсорбирующий слой, содержащий один из этих других адсорбентов, описанных выше, с тем, чтобы или примеси удерживались адсорбентом и таким образом удалялись, или целевое соединение удерживалось, а затем выделялось элюированием, например, с помощью водного метанола, водного ацетона или тому подобных. For example, these compounds can be isolated from the filtrate or supernatant by passing it (s) through a column containing an adsorbent, such as an ion exchange resin, for example, Amberlite IRC-50 or CG-50, or Dowex 50WX4 or SBR-P, so so that either impurities are retained on the resin and thus removed, or the target compound is retained and then isolated by elution, for example, with aqueous ammonia. Examples of other absorbents include activated charcoal or other adsorbent resins, such as Amberlite XAD-2 or XAD-4 (products from Rohm & Haas Co.), or Dayon HP-10, HP-20, CHP-20-, HP-50 (products of Asahi Chemical Industry Co., Ltd.). A solution containing triazolin and / or 2-amino-4- (oxymethyl) -3a, 5,6,6a-tetrahydro-4H-cyclopent- [d] -oxazole-4, 5, 6-triol is passed through an adsorbing layer, containing one of these other adsorbents described above so that either impurities are retained by the adsorbent and thus removed, or the target compound is retained and then isolated by elution, for example, using aqueous methanol, aqueous acetone or the like.

Трехазолин или 2-амино-4-(оксиметил)-3a, 5,6,6a-тетрагидро-4H-циклопент-[d] -оксазол-4, 5,6-триол, полученный таким образом, может быть очищен далее различными известными методами, например: абсорбционной колоночной хроматографией, используя носитель, такой как силикагель или флорисил; распределительной колоночной хроматографией, используя Авицел (продукция фирмы Асахи Кемикэл Индастри Со., Лтд.) или Сефадекс LH-20 (продукция фирмы Фармасиа Инк.,); или жидкостной хроматографией высокого разрешения, используя обычную обратимую (реверсивную) фазу или ионообменную колонку. Triazolin or 2-amino-4- (oxymethyl) -3a, 5,6,6a-tetrahydro-4H-cyclopent- [d] -oxazole-4, 5,6-triol, thus obtained, can be further purified by various known methods, for example: absorption column chromatography using a carrier such as silica gel or florisil; distribution column chromatography using Avicel (products of Asahi Chemical Industry Co., Ltd.) or Sephadex LH-20 (products of Pharmacia Inc.,); or high-performance liquid chromatography using a conventional reversible (reverse) phase or ion-exchange column.

Получение соединений настоящего изобретения дополнительно поясняется следующими неограничивающими примерами. The preparation of the compounds of the present invention is further illustrated by the following non-limiting examples.

Пример 1. Получение Трехазолина. Example 1. Obtaining triazolin.

I (A) Культивирование. I (A) Cultivation.

Полную петлю Микромоноспоры вида SANK 62390 используют для засева каждой из трех колб Эрленмейера емкостью 500 мл, снабженных отбойными перегородками (пластинами, отклоняющими поток жидкости) и содержащих по 80 мл Среды I (имеющей указанный ниже состав). Инокулированные колбы инкубируют при 28^oC в течение 216 часов на роторной трясучке, вращающейся со скоростью 220 об/мин, чтобы получить первую посевную культуру.The full loop Micromonospores of the SANK 62390 type are used for inoculating each of the three 500 ml Erlenmeyer flasks equipped with baffle plates (plates deflecting the fluid flow) and containing 80 ml of Medium I (having the composition below). The inoculated flasks were incubated at 28 ^° C. for 216 hours in a rotary shaker rotating at 220 rpm to obtain the first seed culture.

Среда I:
Глюкоза - 1%
Глицерин - 1%
Овсяная мука - 0.5%
Сахароза - 1%
Соевая мука - 2%
Кислоты касамино - 0,5%
Прессованные дрожжи - 1%
CaCO₃ - 0,1%
CB442 - 0,01%
Вода (перед стерилизацией pH 7,0) - До 100%
Проценты являются весовыми, основанными на конечном объеме среды.Wednesday I:
Glucose - 1%
Glycerin - 1%
Oatmeal - 0.5%
Sucrose - 1%
Soya flour - 2%
Casamino Acids - 0.5%
Pressed yeast - 1%
CaCO ₃ - 0.1%
CB442 - 0.01%
Water (before sterilization, pH 7.0) - Up to 100%
The percentages are weight based on the final volume of the medium.

Каждая из четырех 2-литровых колб Эрленмейера, содержащих каждая по 800 мл Среды 2 (имеющей указанный ниже состав), инокулируется с 40 мл культурального бульона из первых колб и колбы встряхивают при 28^oC в течение 96 часов на роторной трясучке со скоростью 220 об/мин, чтобы получить вторую посевную культуру. 1,5 л этого второго посевного культурального бульона используют, чтобы инокулировать каждую в двух 30-литровых вибрируемых ферментерах, содержащих в каждом из них 15 л Среды 2 (имеющей описанный ниже состав), которую сначала стерилизуют при 120^oC в течение 35 минут и охлаждают до 28^oC. Ферментеры перемешивают со скоростью 100 об/мин при 28^oC в течение 96 часов с аэрацией при токе воздуха 15 л в минуту.Each of the four 2-liter Erlenmeyer flasks, each containing 800 ml of Medium 2 (having the composition below), is inoculated with 40 ml of culture broth from the first flasks and the flasks are shaken at 28 ^° C for 96 hours on a rotary shake at a speed of 220 r / min to get a second seed crop. 1.5 L of this second inoculum culture broth is used to inoculate each in two 30 L vibrating fermenters containing 15 L of Medium 2 in each of them (having the composition described below), which is first sterilized at 120 ^° C. for 35 minutes and cooled to 28 ^o C. The fermenters are stirred at a speed of 100 rpm at 28 ^o C for 96 hours with aeration at an air flow of 15 l per minute.

Среда 2:
Глюкоза - 2%
Растворимый крахмал - 1%
Прессованные дрожжи - 0,9%
Мясной экстракт (Киокуто) - 0,5%
Полипептон - 0,5%
NaCl - 0,5%
CaCO₃ - 0,3%
CB442 - 0,01%
Вода (перед стерилизацией pH 7,2) - До 100%
Проценты являются весовыми в расчете на конечный объем среды.Wednesday 2:
Glucose - 2%
Soluble Starch - 1%
Pressed yeast - 0.9%
Meat extract (Kyokuto) - 0.5%
Polypeptone - 0.5%
NaCl - 0.5%
CaCO ₃ - 0.3%
CB442 - 0.01%
Water (before sterilization, pH 7.2) - Up to 100%
The percentages are by weight based on the final volume of the medium.

(В) Выделение
3 кг Целита 545 (торговая марка для продукции фирмы Джонс Менвилл Продактс Корп.), в качестве помощника фильтрации, добавляют к 30 л всего бульона, полученного по описанному выше методу, и смесь фильтруют. Фильтрат (29 л) пропускают через колонку, содержащую 6 л Дауэкса SBR-P (Cl^-1) (торговая марка для продукции фирмы Дау Кемикл). pH Элюата доводят затем до величины 5,0, после чего раствор пропускают через колонку, содержащую 6 л Дауэкса 50WX4 (H⁺) (торговая марка для продукции Дау Кемикл). Трехазолин адсорбирует и таким образом удерживается колонкой. Колонку промывают 20 л деионизированной воды, а затем элюируют 30 л 0,5 N водного аммиака, чтобы получить 13 л фракций с действующим (активным) соединением. Весь этот элюат (13 л) концентрируют выпариванием при пониженном давлении и лиофилизируют (высушивают при температуре ниже 0^oC), чтобы получить 43,4 г неочищенного порошка, содержащего трехазолин. Неочищенный порошок растворяют в 2 л 10 мМ буферного раствора формиата аммония (pH 6,0) и раствор адсорбируют на колонке, содержащей 1,5 л Дауэкса 50WX4 (торговая марка), которую предварительно уравновешивают с помощью 20 мМ буферного раствора формиата аммония (pH 6,0). Колонку промывают 3 л того же буферного раствора формиата аммония (20 мМ), за которым следует промывание 2 л деионизированной воды, после чего колонку элюируют с помощью 0,2 N водного аммиака. Элюат фракционируют по частям объемом 500 мл. Фракции 2 - 4, которые содержат фактически весь трехазолин, объединяют и концентрируют выпариванием при пониженном давлении. Продукт реакции затем лиофилизируют, чтобы получить 2,55 г неочищенного порошка. Неочищенный порошок, полученный повторением стадий вплоть до этого момента, используют непосредственно, без какой-либо дополнительной очистки, в примере 3.(B) Isolation
3 kg of Celite 545 (brand name for Johns Menville Products Corp. products), as a filtration aid, was added to 30 L of the total broth obtained by the method described above, and the mixture was filtered. The filtrate (29 L) was passed through a column containing 6 L of Dowex SBR-P (Cl ^-1 ) (trademark for Dow Chemical products). The pH of the eluate was then adjusted to a value of 5.0, after which the solution was passed through a column containing 6 L of Dowex 50WX4 (H ⁺ ) (trademark for Dow Chemical products). Triazolin adsorbs and is thus retained by the column. The column is washed with 20 L of deionized water, and then 30 L of 0.5 N aqueous ammonia is eluted to obtain 13 L of fractions with the active compound. All this eluate (13 L) was concentrated by evaporation under reduced pressure and lyophilized (dried at a temperature below 0 ^° C.) to obtain 43.4 g of a crude powder containing triazoline. The crude powder was dissolved in 2 L of a 10 mM ammonium formate buffer solution (pH 6.0) and the solution was adsorbed on a column containing 1.5 L of Dowex 50WX4 (trade name), which was pre-equilibrated with a 20 mM ammonium formate buffer solution (pH 6 , 0). The column is washed with 3 L of the same ammonium formate buffer solution (20 mM), followed by washing with 2 L of deionized water, after which the column is eluted with 0.2 N aqueous ammonia. The eluate is fractionated in portions with a volume of 500 ml. Fractions 2 to 4, which contain virtually all of the triazoline, are combined and concentrated by evaporation under reduced pressure. The reaction product is then lyophilized to give 2.55 g of a crude powder. The crude powder obtained by repeating the steps up to this point is used directly, without any further purification, in Example 3.

Этот неочищенный порошок абсорбируют на колонке, набитой 200 мл Авицела (торговая марка для продукции фирмы Асахи Кемикл Индастри Ко., Лтд.), используя 80 об.% водного ацетонитрила. Колонку промывают с 700 мл 80 об.% водного ацетонитрила, а затем элюируют сначала с 500 мл 75 об.% водного ацетонитрила, а затем с 700 мл 70 об.% водного ацетонитрила. Элюат фракционируют по частям объемом 19 мл. Фракции 35 - 50, содержащие трехазолин, объединяют и концентрируют выпариванием при пониженном давлении. Остаток затем лиофилизируют, чтобы получить 658 мг порошка. Весь этот порошок растворяют в 150 мл воды и pH полученного раствора доводят до величины 6,0. Затем раствор адсорбируют на колонке, набитой с 300 мл Амберлита CG-50 (H⁺: NH $\binom{+}{4}$ = 2:3, торговая марка). Эту колонку промывают с 500 мл деионизированной воды и элюируют с 0,1 N водным аммиаком. Элюат фракционируют по частям в 20 мл. Фракции 92 - 121, содержащие трехазолин, объединяют и концентрируют выпариванием при пониженном давлении. Полученный остаток затем лиофилизируют, чтобы получить 102,8 мг порошка. Весь этот порошок растворяют в 10 мл 2 мМ буферного раствора формиата аммония (pH 6,0) и полученный раствор адсорбируют на колонке, набитой с 400 мл Дайайона CHP20P (торговое название для продукции Мицубиси Касей Ко.), используя тот же 2 мМ буферный раствор формиата аммония. Колонку элюируют тем же 2 мМ буферным раствором формиата аммония. Элюат фракционируют по частям объемом 5 мл. Фракции 59 - 73, содержащие трехазолин, объединяют и концентрируют выпариванием при пониженном давлении. Полученный остаток затем лиофилизируют, чтобы получить 18 мг порошка, который далее очищают элюированием через Дайайон CHP20P, используя тот же 2 мМ буферный раствор формиата аммония в качестве элюента, чтобы получить 6,2 мг бесцветного порошка.This crude powder is absorbed on a column packed with 200 ml Avicel (brand name for Asahi Chemical Industry Co., Ltd.) using 80 vol.% Aqueous acetonitrile. The column is washed with 700 ml of 80 vol.% Aqueous acetonitrile, and then eluted first with 500 ml of 75 vol.% Aqueous acetonitrile, and then with 700 ml of 70 vol.% Aqueous acetonitrile. The eluate is fractionated in parts with a volume of 19 ml. Fractions 35 to 50 containing triazoline are combined and concentrated by evaporation under reduced pressure. The residue was then lyophilized to give 658 mg of powder. All this powder is dissolved in 150 ml of water and the pH of the resulting solution is adjusted to a value of 6.0. Then the solution is adsorbed on a column packed with 300 ml of Amberlite CG-50 (H ⁺ : NH $\binom{+}{4}$ = 2: 3, trademark). This column is washed with 500 ml of deionized water and eluted with 0.1 N aqueous ammonia. The eluate is fractionated in portions in 20 ml. Fractions 92 to 121 containing triazoline were combined and concentrated by evaporation under reduced pressure. The resulting residue was then lyophilized to give 102.8 mg of powder. All this powder was dissolved in 10 ml of a 2 mM ammonium formate buffer solution (pH 6.0) and the resulting solution was adsorbed on a column packed with 400 ml of Dayon CHP20P (trade name for Mitsubishi Kasei Co. products) using the same 2 mM buffer solution ammonium formate. The column is eluted with the same 2 mM ammonium formate buffer solution. The eluate is fractionated in portions of 5 ml. Fractions 59 to 73 containing triazoline are combined and concentrated by evaporation under reduced pressure. The resulting residue was then lyophilized to obtain 18 mg of powder, which was further purified by elution through Dayon CHP20P using the same 2 mM ammonium formate buffer solution as eluent to obtain 6.2 mg of a colorless powder.

Этот порошок очищают с помощью препаративной тонкослойной хроматографии следующим образом. Порошок (6,2 мг) растворяют в незначительном количестве воды и наносят на 3 пластины с силикагелью (Мерк Арт 5715, 20х20 см). Пластины проявляют с помощью смеси ацетонитрила, уксусной кислоты и воды 6:1:3 в объемном соотношении до высоты 15 см. Полосу между Rf 0,42 и 0,5 выскребывают из пластин и набивают в колонку. Колонку элюируют со 100 мл деионизированной воды. Элюат пропускают через колонку, содержащую 5 мл Дауэкса 50WX4 (H⁺), где адсорбируется и таким образом удерживается трехазолин. Колонку промывают с помощью деионизированной воды, а затем элюируют с 50 мл 0,5 N водного аммиака. Элюат концентрируют выпариванием при пониженном давлении и полученный остаток лиофилизируют, чтобы получить 5,1 мг трехазолина в виде бесцветного порошка, для которого жидкостная хроматография высокого разрешения показывает единственный пик.This powder is purified using preparative thin layer chromatography as follows. The powder (6.2 mg) is dissolved in a small amount of water and applied to 3 plates with silica gel (Merck Art 5715, 20x20 cm). The plates are developed using a mixture of acetonitrile, acetic acid and water 6: 1: 3 in a volume ratio up to a height of 15 cm. The strip between Rf 0.42 and 0.5 is scraped from the plates and filled into a column. The column is eluted with 100 ml of deionized water. The eluate is passed through a column containing 5 ml of Dowex 50WX4 (H ⁺ ), where triazoline is adsorbed and thus retained. The column is washed with deionized water and then eluted with 50 ml of 0.5 N aqueous ammonia. The eluate was concentrated by evaporation under reduced pressure, and the resulting residue was lyophilized to obtain 5.1 mg of triazoline as a colorless powder, for which high-performance liquid chromatography showed a single peak.

Продукт реакции имеет следующие свойства:
1) основные свойства и вид: основной бесцветный порошок;
2) растворимость: растворим в воде и метаноле, нерастворим в ацетоне и хлороформе;
3) цветная реакция: положительная к серной кислоте;
4) молекулярная формула: C₁₃H₂₂N₂O₁₀;
5) молекулярная масса: 366 (определенная с помощью FAB-масс-спектрометрии - "FAB" означает Быстрая Бомбардировка Атомов ("ББА");
6) удельное вращение [α] $\binom{25}{Д}$ + 99,5^o (c = 0,41, H₂O);
7) ультрафиолетовый спектр поглощения λ_макс нм (E $\binom{1%}{1см}$ ), . Спектр ультрафиолетового поглощения, измеренный в воде, не показывает никакого характерного максимума поглощения выше 220 нм;
8) инфракрасный спектр поглощения: ν_макссм^-1 (в KBr), 3367, 2938, 1663, 1552, 1384 и 1056;
9) спектр ¹H-Ядерного магнитного резонанса: δ_м.д., спектр ¹H-Ядерного магнитного резонанса (400 МГц) измеряют в окиси дейтерия (дейтерированной воде), используя ТМС (тетраметилсилан) в качестве внешнего стандарта, и показывает следующие сигналы:
3,22 (1H, дублет дублетов, J = 8,98 и 10,31 Гц);
3,38 (1H, мультиплет, J = 2,44, 5,26 и 10,31 Гц);
3,46 (1H, дублет дублетов, J = 8,98 и 9,99 Гц);
3,53 (1H, дублет, J = 11,96 Гц);
3,55 (1H, дублет дублетов, J = 5,26 и 12,21 Гц);
3,57 (1H, дублет дублетов, J = 5,38 и 9,99 Гц);
3,62 (1H, дублет дублетов, J = 2,44 и 12,21 Гц);
3,63 (1H, дублет, J = 11,96 Гц);
3,77 (1H, дублет, J = 4,89 Гц);
4,02 (1H, дублет дублетов, J = 2,08 и 4,89 Гц);
4,17 (1H, дублет, J = 8,55 Гц);
4,77 (1H, дублет дублетов, J = 2,08 и 8,55 Гц);
5,15 (1H, дублет, J = 5,38 Гц).The reaction product has the following properties:
1) main properties and appearance: the main colorless powder;
2) solubility: soluble in water and methanol, insoluble in acetone and chloroform;
3) color reaction: positive for sulfuric acid;
4) molecular formula: C ₁₃ H ₂₂ N ₂ O ₁₀ ;
5) molecular weight: 366 (determined by FAB mass spectrometry - “FAB” means Fast Atom Bombing (“FAB”);
6) specific rotation [α] $\binom{25}{D}$ + 99.5 ^o (c = 0.41, H ₂ O);
7) ultraviolet absorption spectrum λ _max nm (E $\binom{one%}{1cm}$ ),. The ultraviolet absorption spectrum, measured in water, does not show any characteristic absorption maximum above 220 nm;
8) infrared absorption spectrum: ν _max cm ^-1 (in KBr), 3367, 2938, 1663, 1552, 1384 and 1056;
9) spectrum of ¹ H-Nuclear magnetic resonance: δ _ppm spectrum ¹ H-Nuclear magnetic resonance (400 MHz) is measured in deuterium oxide (deuterated water) using TMS (tetramethylsilane) as an external standard, and shows the following signals:
3.22 (1H, doublet of doublets, J = 8.98 & 10.31 Hz);
3.38 (1H, multiplet, J = 2.44, 5.26, and 10.31 Hz);
3.46 (1H, doublet of doublets, J = 8.98 & 9.99 Hz);
3.53 (1H, doublet, J = 11.96 Hz);
3.55 (1H, doublet of doublets, J = 5.26 & 12.21 Hz);
3.57 (1H, doublet of doublets, J = 5.38 & 9.99 Hz);
3.62 (1H, doublet of doublets, J = 2.44 & 12.21 Hz);
3.63 (1H, doublet, J = 11.96 Hz);
3.77 (1H, doublet, J = 4.89 Hz);
4.02 (1H, doublet of doublets, J = 2.08 & 4.89 Hz);
4.17 (1H, doublet, J = 8.55 Hz);
4.77 (1H, doublet of doublets, J = 2.08 & 8.55 Hz);
5.15 (1H, doublet, J = 5.38 Hz).

10) Спектр ¹³C-Ядерного магнитного резонанса: δ_м.д., . Спектр ¹³C-Ядерного магнитного резонанса (100 МГц) измеряют в окиси дейтерия, используя тетраметилсилан в качестве внешнего стандарта, и показывает следующие сигналы:
60,7, 61,9, 69,6, 69,9, 72,0, 73,0, 73,0, 80,1, 80,3, 80,6, 82,8, 87,3 и 161,1;
11) жидкостная хроматография высокого разрешения:
колонка для разделения: Сеншу Пак ОД⌀5-H-2151 (Сеншу Сайентифик Ко.), 6 x 150 мм (5 мк);
подвижная фаза: 10 об. % ацетонитрила-воды, содержащей 0,5% PIC B8 (продукция фирмы Уотерс Инк.);
скорость течения: 1,5 мл/мин;
контрольная длина волны: ультрафиолетовая 210 нм.10) ¹³ C-Nuclear Magnetic Resonance Spectrum: δ _ppm ,. Spectrum ¹³ C-Nuclear Magnetic Resonance (100 MHz) is measured in deuterium oxide using tetramethylsilane as an external standard, and shows the following signals:
60.7, 61.9, 69.6, 69.9, 72.0, 73.0, 73.0, 80.1, 80.3, 80.6, 82.8, 87.3 and 161, one;
11) high performance liquid chromatography:
separation column: Senshu Pak OD⌀5-H-2151 (Senshu Science Co.), 6 x 150 mm (5 microns);
mobile phase: 10 vol. % acetonitrile-water containing 0.5% PIC B8 (products of Waters Inc.);
flow rate: 1.5 ml / min;
control wavelength: ultraviolet 210 nm.

Пик, имеющий время удерживания 6,9 минут, наблюдают при температуре колонки 25^oC; и
12) тонкослойная хроматография:
Rf величина: 0,44;
адсорбент: силикагель на стеклянной пластине (Мерк Арт 5715);
проявляющий растворитель: смесь ацетонитрила, уксусной кислоты и воды в объемном соотношении 6 : 1 : 3.A peak having a retention time of 6.9 minutes is observed at a column temperature of 25 ^° C; and
12) thin layer chromatography:
Rf value: 0.44;
adsorbent: silica gel on a glass plate (Merck Art 5715);
developing solvent: a mixture of acetonitrile, acetic acid and water in a volume ratio of 6: 1: 3.

Пример 2. Получение 2-амино-4-(оксиметил)-3а,5,6,6а-тетрагидро- 4H-циклопент-[d]-оксазол-4,5,6-триола. Example 2. Preparation of 2-amino-4- (oxymethyl) -3a, 5,6,6a-tetrahydro-4H-cyclopent- [d] -oxazole-4,5,6-triol.

100 г неочищенного порошка, полученного по описанному в примере 1 методу и содержащего установленное количество (225 мг) трехазолина, растворяют в смеси 100 мл воды и 150 мл 4 N водной соляной кислоты и pH полученного раствора доводят до величины 2,5 добавлением 4 N водной соляной кислоты. Затем к раствору добавляют 8 мл концентрированной соляной кислоты и 72 мл воды, чтобы довести общий объем до 480 мл и чтобы получить концентрацию соляной кислоты, равную 0,2 N. Полученный раствор помещают в круглодонную колбу, а затем гидролизуют на масляной бане, поддерживаемой при 100^oC в течение 6 часов. К концу этого времени реакционную смесь смешивают с водой, а затем концентрируют досуха выпариванием при пониженном давлении. Последовательность смешивания с водой и выпаривания досуха повторяют, чтобы отогнать соляную кислоту. Остаток растворяют в 400 мл воды и pH раствора доводят до величины pH 6,0 добавлением 1 N водного раствора гидроокиси натрия. Затем раствор разбавляют с водой до объема 8 л. Полученный раствор пропускают через колонку, набитую с 600 мл Амберлита CG-50 (NH $\binom{+}{4}$ ), и колонку промывают с водой 6 л деионизированной воды, а затем элюируют с помощью 0,5 N водного аммиака. Элюат концентрируют выпариванием при пониженном давлении до объема 200 мл и концентрат пропускают через колонку, набитую с 800 мл Дауэкса 1X2 (OH^-). Затем колонку элюируют деионизированной водой. После удаления первых 1,5 л элюата последующий элюат фракционируют по частям объемом 20 мл. Каждую фракцию оценивают количественным анализом, описанным ниже, для определения, содержит ли она целевое соединение. Фракции 70-110, которые содержат это соединение, объединяют и концентрируют выпариванием при пониженном давлении. Остаток лиофилизируют, чтобы получить 30 мг 2-амино-4-(оксиметил)-3а, 5,6,6а-тетрагидро-4H-циклопент-[d] -оксазол- 4,5,6-триола в виде бесцветного порошка, имеющего следующие свойства:
1) цвет и вид: основный бесцветный порошок;
2) растворимость: растворим в воде, нерастворим в ацетоне и хлороформе;
3) молекулярная формула: C₇H₁₂N₂O₅;
4) молекулярная масса: 204 (определенная с помощью FAB-масс-спектрометрии);
5) удельное вращение: [α] $\binom{25}{Д}$ + 10,0^o (c = 0,51, H₂O);
6) ультрафиолетовый спектр поглощения: λ_макс нм (E $\binom{1%}{1см}$ ); ультрафиолетовый спектр поглощения определяют в воде и он не показывает никакого характерного максимума поглощения выше 210 нм;
7) инфракрасный спектр поглощения: ν_макссм^-1 (в KBr), 3358, 1668, 1528, 1398 и 1066;
8) Спектр ¹H-Ядерного магнитного резонанса: δ_м.д., Спектр ¹H-Ядерного магнитного резонанса (500 МГц) определяют в окиси дейтерия, используя ТСП (триметилсилилпропионат натрия) в качестве внутреннего стандарта, и показывает следующие сигналы:
3,73 (1H, дублет, J = 11,72 Гц);
3,82 (1H, дублет, J = 12,21 Гц);
3,97 (1H, дублет, J = 4,4 Гц);
4,23 (H, дублет дублетов, J = 4,4 и 2,44 Гц);
4,37 (1H, дублет, J = 8,79 Гц);
5,03 (1H, дублет дублетов, J = 8,79 и 2,44 Гц);
9) жидкостная хроматография высокого разрешения:
колонка для разделения: Асахи Пак E5-502C (Асахи Кемикл Индастри Ко., Лтд.);
подвижная фаза: 20 мМ ацетат аммония (pH 8,5) + 50 мМ водный хлористый натрий;
скорость течения: 1 мл/мин;
контрольная длина волны: ультрафиолетовая 210 нм,
температура: 25^oC;
время удерживания: 8,39 минут.100 g of the crude powder obtained according to the method described in example 1 and containing the prescribed amount (225 mg) of triazoline is dissolved in a mixture of 100 ml of water and 150 ml of 4 N aqueous hydrochloric acid and the pH of the resulting solution is adjusted to 2.5 by adding 4 N aqueous of hydrochloric acid. Then, 8 ml of concentrated hydrochloric acid and 72 ml of water are added to the solution to bring the total volume to 480 ml and to obtain a hydrochloric acid concentration of 0.2 N. The resulting solution is placed in a round bottom flask, and then hydrolyzed in an oil bath maintained at 100 ^o C for 6 hours. At the end of this time, the reaction mixture was mixed with water, and then concentrated to dryness by evaporation under reduced pressure. The sequence of mixing with water and evaporation to dryness is repeated to distill off hydrochloric acid. The residue was dissolved in 400 ml of water and the pH of the solution was adjusted to pH 6.0 by the addition of a 1 N aqueous solution of sodium hydroxide. Then the solution is diluted with water to a volume of 8 liters. The resulting solution was passed through a column packed with 600 ml of Amberlite CG-50 (NH $\binom{+}{4}$ ), and the column is washed with water with 6 L of deionized water, and then eluted with 0.5 N aqueous ammonia. The eluate was concentrated by evaporation under reduced pressure to a volume of 200 ml and the concentrate was passed through a column packed with 800 ml of Dowex 1X2 (OH ^- ). Then the column is eluted with deionized water. After removing the first 1.5 L of eluate, the subsequent eluate was fractionated in portions of 20 ml. Each fraction was evaluated by the quantitative analysis described below to determine if it contains the target compound. Fractions 70-110 that contain this compound are combined and concentrated by evaporation under reduced pressure. The residue was lyophilized to give 30 mg of 2-amino-4- (oxymethyl) -3a, 5,6,6a-tetrahydro-4H-cyclopent- [d] -oxazole-4,5,6-triol as a colorless powder having following properties:
1) color and appearance: the main colorless powder;
2) solubility: soluble in water, insoluble in acetone and chloroform;
3) molecular formula: C ₇ H ₁₂ N ₂ O ₅ ;
4) molecular weight: 204 (determined by FAB mass spectrometry);
5) specific rotation: [α] $\binom{25}{D}$ + 10.0 ^o (c = 0.51, H ₂ O);
6) ultraviolet absorption spectrum: λ _max nm (E $\binom{one%}{1cm}$ ); the ultraviolet absorption spectrum is determined in water and it does not show any characteristic absorption maximum above 210 nm;
7) infrared absorption spectrum: ν _max cm ^-1 (in KBr), 3358, 1668, 1528, 1398 and 1066;
8) Spectrum ¹ H-Nuclear magnetic resonance: δ _ppm Spectrum ¹ H-Nuclear Magnetic Resonance (500 MHz) is determined in deuterium oxide using TSP (sodium trimethylsilyl propionate) as the internal standard, and shows the following signals:
3.73 (1H, doublet, J = 11.72 Hz);
3.82 (1H, doublet, J = 12.21 Hz);
3.97 (1H, doublet, J = 4.4 Hz);
4.23 (H, doublet of doublets, J = 4.4 & 2.44 Hz);
4.37 (1H, doublet, J = 8.79 Hz);
5.03 (1H, doublet of doublets, J = 8.79 & 2.44 Hz);
9) high resolution liquid chromatography:
separation column: Asahi Pak E5-502C (Asahi Chemical Industry Co., Ltd.);
mobile phase: 20 mM ammonium acetate (pH 8.5) + 50 mM aqueous sodium chloride;
flow rate: 1 ml / min;
control wavelength: ultraviolet 210 nm,
temperature: 25 ^o C;
retention time: 8.39 minutes.

Количественный анализ 2-амино-4-(оксиметил)-3а,5,6,6а- тетрагидро-4H-циклопент-[d] -оксазол-4,5,6-триола, используя газовую хроматографию/масс-спектрометрию. Quantification of 2-amino-4- (oxymethyl) -3a, 5,6,6-tetrahydro-4H-cyclopent- [d] -oxazole-4,5,6-triol using gas chromatography / mass spectrometry.

Количественный анализ, на который ссылаются выше, проводят следующим образом. The quantitative analysis referred to above is carried out as follows.

Образец растворяют в растворителе (воде) известного объема жидкости. В ампулу помещают 10 мкл полученного раствора и выпаривают досуха для ацетилирования. К остатку добавляют 30 мкл уксусного ангидрида и 50 мкл пиридина и полученную смесь нагревают при 60^oC в течение 40 минут. Любой избыток реагентов удаляют продуванием тока газообразного азота через реакционную смесь. Остаток смешивают с известным количеством внутреннего стандарта (пентаацетил-1-амино-1-дезокси -β-D-глюкозы), и смесь растворяют в 100 мкл этилацетата, чтобы получить опытный образец для газо-хроматографического/масс-спектрометрического анализа. Анализ проводят, используя капиллярную колонку с плавленым кремнеземом (продукция Джи энд Ви Сайентифик Ко., ДВ-5, 15 метров) в качестве колонки для газовой хроматографии. Опытный образец (2 мкл) инъецируют и температуру колонки повышают от 60^oC до 280^oC со скоростью 25^oC/минуту. Отрицательные ионы определяют методом химической ионизации, используя газообразный метан вместе с квадрупольным масс-спектрометром Трио-1 (продукция фирмы УС). Пики отрицательных ионов при m/z 388 (соответствующий внутреннему стандарту - пентаацетильному соединению) и при m/z 413 (соответствующий пентаацетату 2-амино-4-(оксиметил)-3a,5,6,6a-тетрагидро-4H-циклопент-[d] -оксазол- 4,5,6-триола) используют для количественного анализа. Содержание 2-амино-4-(оксиметил)-3a, 5,6,6a-тетрагидро-4H-циклопент-[d] -оксазол- 4,5,6-триола вычисляют с помощью метода внутреннего стандарта.The sample is dissolved in a solvent (water) of a known volume of liquid. 10 μl of the resulting solution was placed in an ampoule and evaporated to dryness for acetylation. To the residue were added 30 μl of acetic anhydride and 50 μl of pyridine, and the resulting mixture was heated at 60 ^° C. for 40 minutes. Any excess reagents are removed by blowing a stream of nitrogen gas through the reaction mixture. The residue was mixed with a known amount of internal standard (pentaacetyl-1-amino-1-deoxy-β-D-glucose), and the mixture was dissolved in 100 μl of ethyl acetate to obtain a prototype for gas chromatographic / mass spectrometric analysis. The analysis is carried out using a capillary column with fused silica (products of G. & V. Science Co., DV-5, 15 meters) as a column for gas chromatography. A test sample (2 μl) was injected and the column temperature was raised from 60 ^° C. to 280 ^° C. at a rate of 25 ^° C./minute. Negative ions are determined by chemical ionization using methane gas together with a Trio-1 quadrupole mass spectrometer (US products). Peaks of negative ions at m / z 388 (corresponding to the internal standard - the pentaacetyl compound) and at m / z 413 (corresponding to the pentaacetate 2-amino-4- (oxymethyl) -3a, 5,6,6a-tetrahydro-4H-cyclopent- [ d] -oxazole-4,5,6-triol) is used for quantitative analysis. The content of 2-amino-4- (oxymethyl) -3a, 5,6,6a-tetrahydro-4H-cyclopent- [d] -oxazole-4,5,6-triol is calculated using the internal standard method.

Пример 3. Получение 2-амино-4-(оксиметил)-3a,5,6,6a-тетрагидро-4H-циклопент-[d]-оксазол- 4,5,6-триола
(A) Выращивание.Example 3. Obtaining 2-amino-4- (oxymethyl) -3a, 5,6,6a-tetrahydro-4H-cyclopent- [d] -oxazole-4,5,6-triol
(A) Growing.

Петлю, взятую из скошенного агара Амиколатопсиса вида SANK 60791, используют для того, чтобы инокулировать каждую из двух колб Эрленмейера объемом 500 мл, каждая снабжена отбойными перегородками и каждая содержит 80 мл Среды 1 (имеющей представленный выше в примере 1 состав), и инокулированные колбы инкубируют при 28^oC в течение 96 часов на роторной трясучке, вращающейся со скоростью 210 об/мин, чтобы получить посевной культуральный бульон.A loop taken from amicolatopsis agar slant type SANK 60791 was used to inoculate each of the two 500 ml Erlenmeyer flasks, each equipped with baffle plates and each containing 80 ml of Medium 1 (having the composition shown in Example 1 above) and inoculated flasks incubated at 28 ^o C for 96 hours on a rotary shake, rotating at a speed of 210 rpm to obtain a seed culture broth.

Два 30-литровых вибрирующих (jar) ферментера, каждый содержащий 15 л Среды 2 (имеющей состав, представленный выше в примере 1), стерилизуют при 120^oC в течение 30 минут. Затем их охлаждают до 28^oC и в каждый вибрирующийся ферментер инокулируют 75 мл посевного культурального бульона. Затем вибрирующиеся ферментеры перемешивают при 28^oC со скоростью, регулируемой в пределах от 100 до 400 об/мин (для того, чтобы поддерживать 2 м.д. растворенного кислорода) в течение 144 часов и с аэрацией при потоке воздуха 7,5 л в минуту.Two 30-liter vibrating (jar) fermenters, each containing 15 L of Medium 2 (having the composition described above in Example 1), are sterilized at 120 ^° C. for 30 minutes. They are then cooled to 28 ^° C. and 75 ml of inoculum culture broth are inoculated into each vibrating fermenter. Then the vibrating fermenters are mixed at 28 ^° C. at a speed adjustable from 100 to 400 rpm (in order to maintain 2 ppm of dissolved oxygen) for 144 hours and with aeration with an air flow of 7.5 l a minute.

(B) Выделение
К 25 л всего бульона (полученного по описанному выше в (A) способу) добавляют 1,5 кг Целита 545 в качестве помощника фильтрации, и смесь фильтруют, чтобы получить 23 л фильтрата. pH фильтрата регулируют до величины 6,0 добавлением водной соляной кислоты и раствор пропускают через колонку, набитую 3 л Амберлита IRC-50 (NH $\binom{+}{4}$ ), чтобы адсорбировать 2-амино-4-(оксиметил)-3a,5,6,6a-тетрагидро-4H-циклопент-[d]-оксазол- 4,5,6-триол. Колонку промывают 15 л деионизированной воды, а затем элюируют 0,5 N водным раствором аммиака. После того, как элюат станет щелочным, 4,5 л элюата собирают и концентрируют выпариванием при пониженном давлении до объема 200 мл. Концентрат пропускают через колонку, набитую с 450 мо Дауэкса 1Х2 (OH^-), и колонку элюируют деионизированной водой. Первые 800 мл элюата удаляют, а последующий элюат фракционируют по частям объемом 20 мл. Было определено с помощью количественного анализа, используя или жидкостную хроматографию высокого разрешения, как это описано позже, или газовую хроматографию /масс-спектрометрию, что фракции 60 - 90 содержат целевой 2-амино-4-(оксиметил)-3a, 5,6,6a-тетрагидро-4H-циклопент-[d] - оксазол-4,5,6-триол, и поэтому эти фракции объединяют и концентрируют выпариванием при пониженном давлении. Концентрат лиофилизируют, чтобы получить 16,6 мг 2-амино-4-(оксиметил)-3a, 5,6,6a-тетрагидро-4H-циклопент-[d] -оксазол- 4,5,6-триола в виде бесцветного порошка, имеющего описанные выше свойства.(B) Isolation
To 25 L of the total broth (obtained by the method described above in (A)), 1.5 kg of Celite 545 was added as a filtration aid, and the mixture was filtered to obtain 23 L of the filtrate. The pH of the filtrate was adjusted to 6.0 by the addition of aqueous hydrochloric acid and the solution was passed through a column packed with 3 L of Amberlite IRC-50 (NH $\binom{+}{4}$ ) to adsorb 2-amino-4- (oxymethyl) -3a, 5,6,6a-tetrahydro-4H-cyclopent- [d] -oxazole-4,5,6-triol. The column is washed with 15 L of deionized water and then eluted with 0.5 N aqueous ammonia. After the eluate becomes alkaline, 4.5 L of eluate is collected and concentrated by evaporation under reduced pressure to a volume of 200 ml. The concentrate was passed through a column packed with 450 mo of Dowex 1X2 (OH ^- ), and the column was eluted with deionized water. The first 800 ml of the eluate is removed, and the subsequent eluate is fractionated in portions of 20 ml. It was determined by quantitative analysis using either high-performance liquid chromatography as described later or gas chromatography / mass spectrometry that fractions 60 to 90 contain the desired 2-amino-4- (hydroxymethyl) -3a, 5,6, 6a-tetrahydro-4H-cyclopent- [d] - oxazole-4,5,6-triol, and therefore these fractions are combined and concentrated by evaporation under reduced pressure. The concentrate was lyophilized to obtain 16.6 mg of 2-amino-4- (oxymethyl) -3a, 5,6,6a-tetrahydro-4H-cyclopent- [d] -oxazole-4,5,6-triol as a colorless powder having the properties described above.

Количественный анализ с использованием жидкостной хроматографии высокого разрешения. Quantitative analysis using high performance liquid chromatography.

Колонка для разделения: Асахи Пак EC-502C (продукция Асахи Кемикл Индастри Ко., Лтд.). Separation column: Asahi Pak EC-502C (products of Asahi Chemical Industry Co., Ltd.).

Подвижная фаза: 20 мМ ацетат аммония (pH 8,5) + 50 мМ солевого раствора;
скорость течения: 1 мл/минуту;
длина волны для детектирования: 210 нм;
температура: 25^oC;
время удерживания: 8,39 минут.Mobile phase: 20 mM ammonium acetate (pH 8.5) + 50 mM saline;
flow rate: 1 ml / minute;
wavelength for detection: 210 nm;
temperature: 25 ^o C;
retention time: 8.39 minutes.

Количественный анализ с использованием газовой хроматографии/масс-спектрометрии. Quantitative analysis using gas chromatography / mass spectrometry.

Названный выше количественный анализ проводят с использованием, в основном, тех же методик, что и описанные в примере 2. The above quantitative analysis is carried out using basically the same methods as described in example 2.

Пример 4. Получение 2-амино-4-(оксиметил)-3a,5,6,6a-тетрагидро-4H-циклопент-[d]-оксазол- 4,5,6-триола. Example 4. Obtaining 2-amino-4- (oxymethyl) -3a, 5,6,6a-tetrahydro-4H-cyclopent- [d] -oxazole-4,5,6-triol.

(A) Выращивание. (A) Growing.

Скошенный агар Микромоноспоры вида SANK 62390 гомогенизируют в 10 мл физиологического солевого раствора, чтобы получить суспензию. 1 мл суспензии инокулируют в каждую из двух 2-литровых колб Эрленмейера. Каждая снабжена отбойными перегородками и каждая содержит 500 мл Среды 3 (имеющей представленный ниже состав), и инокулированные колбы инкубируют при 28^oC в течение 96 часов на роторной трясучке, вращающейся со скоростью 210 об/мин, чтобы получить первый посевной культуральный бульон.Mowed Agar SANK 62390 micromonospores are homogenized in 10 ml of physiological saline to obtain a suspension. 1 ml of the suspension is inoculated into each of two 2-liter Erlenmeyer flasks. Each is equipped with baffles and each contains 500 ml of Medium 3 (having the composition below), and the inoculated flasks are incubated at 28 ^° C. for 96 hours on a rotary shaker rotating at a speed of 210 rpm to obtain the first seed culture broth.

Среда 3
Глюкоза - 2%
Дрожжевой экстракт (Дифко) - 0,5%
Полипептон - 0,5%
CaCO₃ - 0,1%
CB-442 - 0,01%
Вода (перед стерилизацией pH 7,2) - До 100%
Проценты являются весовыми в расчете на конечный объем среды.Wednesday 3
Glucose - 2%
Yeast extract (Difco) - 0.5%
Polypeptone - 0.5%
CaCO ₃ - 0.1%
CB-442 - 0.01%
Water (before sterilization, pH 7.2) - Up to 100%
The percentages are by weight based on the final volume of the medium.

30 л Среды 3 помещают в 60-литровый вибрирующийся ферментер и стерилизуют при 120^oC в течение 30 минут. Затем ее охлаждают до 28^oC и в нее инокулируют 600 мл первого посевного культурального бульона. Ферментер перемешивают со скоростью 165 об/мин при 28^oC в течение 48 часов с аэрацией при потоке воздуха 15 л в минуту, чтобы получить второй посевной культуральный бульон.30 L of Medium 3 was placed in a 60-liter vibrating fermenter and sterilized at 120 ^° C. for 30 minutes. Then it is cooled to 28 ^° C. and 600 ml of the first seed culture broth are inoculated into it. The fermenter is stirred at a speed of 165 rpm at 28 ^° C. for 48 hours with aeration at an air flow of 15 L per minute to obtain a second seed culture broth.

600-литровый бак, содержащий 300 л Среды 4 (имеющей представленный ниже состав), стерилизуют при 120^oC в течение 35 минут. Его затем охлаждают до 28^oC и в него инокулируют 15 л второго посевного культурального бульона. Затем содержимое бака перемешивают при 28^oC со скоростью, регулируемой в пределах от 82 до 142 об/мин (для того, чтобы поддерживать 2 м.д. растворенного кислорода) в течение 144 часов, с аэрацией при потоке воздуха 150 л в минуту и при внутреннем давлении 0,5 кг/см².A 600 liter tank containing 300 L of Medium 4 (having the composition below) is sterilized at 120 ^° C. for 35 minutes. It is then cooled to 28 ^° C. and 15 L of the second seed culture broth is inoculated into it. Then the contents of the tank are stirred at 28 ^o C with a speed adjustable from 82 to 142 rpm (in order to maintain 2 ppm of dissolved oxygen) for 144 hours, with aeration at an air flow of 150 l per minute and at an internal pressure of 0.5 kg / cm ² .

Среда 4:
Глюкоза (предварительно стерилизованная при 120^oC в течение 15 минут) - 8%
Лустерген FK^* - 2%
Прессованные дрожжи - 1,8%
Мясной экстракт (Киокуто) - 1%
Полипептон - 1%
NaCl - 0,5%
CaCO₃ - 0,3%
K₂HPO₄ - 0,25%
CB-442 - 0,02%
Вода (перед стерилизацией pH 7,2) - До 100%
^* Торговое название для ржавчинного (головневого) гриба крахмала, продаваемого фирмой Nichiden KagaKu Co. Ltd.Wednesday 4:
Glucose (pre-sterilized at 120 ^o C for 15 minutes) - 8%
Lustergen FK ^* - 2%
Pressed yeast - 1.8%
Meat extract (Kyokuto) - 1%
Polypeptone - 1%
NaCl - 0.5%
CaCO ₃ - 0.3%
K ₂ HPO ₄ - 0.25%
CB-442 - 0.02%
Water (before sterilization, pH 7.2) - Up to 100%
^* Trade name for rust (smut) starch fungus sold by Nichiden KagaKu Co. Ltd.

(B) Выделение. (B) Isolation.

К 300 л всего бульона, полученного так, как описано выше, добавляют 15 кг Целита 545, как помощника фильтрации, и смесь фильтруют, чтобы получить 290 л фильтрата. pH 20 л фильтрата доводят до величины 6,0 добавлением водной соляной кислоты. Полученный раствор пропускают через колонку, набитую 3 л Амберлита IRC-50 (NH $\binom{+}{4}$ ) и целевой 2-амино-4-(оксиметил)-3a,5,6,6a-тетрагидро-4H-циклопент-[d] - оксазол-4,5,6-триол удерживается в колонке путем адсорбции. Колонку промывают 15 л деионизированной воды и элюируют 0,5 N водным раствором аммиака. После того, как элюат станет щелочным, 4,5 л элюата собирают и концентрируют выпариванием при пониженном давлении до объема 150 мл. Концентрат пропускают через колонку, набитую с 500 мл Дауэкса 1Х2 (OH^-), и элюируют деионизированной водой. Первый 1 л удаляют, а последующий элюат фракционируют по частям объемом 20 мл. Каждую фракцию исследуют количественным анализом, описанным в примере 3. Фракции 58 - 80, как было найдено, содержат активное (действующее) соединение, и эти фракции объединяют и концентрируют выпариванием при пониженном давлении. Остаток лиофилизируют, чтобы получить 9,6 мг 2-амино-4-(оксиметил)-3a,5,6,6a-тетрагидро-4H-циклопент-[d] -оксазол- 4,5,6-триола в виде неочищенного порошка. Порошок снова очищают с помощью колоночной хроматографии, используя колонку, набитую со 100 мл Дауэкса 1Х2 (OH^-), элюируют деионизированной водой, чтобы получить 4,8 мг 2-амино-4-(оксиметил)-3a,5,6,6a-тетрагидро-4H-циклопент-[d]-оксазол- 4,5,6-триола в виде бесцветного порошка, имеющего описанные выше свойства.To 300 L of the total broth obtained as described above, 15 kg of Celite 545 as a filtration aid were added, and the mixture was filtered to obtain 290 L of filtrate. A pH of 20 L of the filtrate was adjusted to 6.0 by the addition of aqueous hydrochloric acid. The resulting solution was passed through a column packed with 3 L of Amberlite IRC-50 (NH $\binom{+}{4}$ ) and the target 2-amino-4- (oxymethyl) -3a, 5,6,6a-tetrahydro-4H-cyclopent- [d] - oxazole-4,5,6-triol is retained in the column by adsorption. The column is washed with 15 L of deionized water and eluted with 0.5 N aqueous ammonia. After the eluate becomes alkaline, 4.5 L of the eluate is collected and concentrated by evaporation under reduced pressure to a volume of 150 ml. The concentrate was passed through a column packed with 500 ml of Dowex 1X2 (OH ^- ) and eluted with deionized water. The first 1 L is removed and the subsequent eluate is fractionated in portions of 20 ml. Each fraction was examined by the quantitative analysis described in Example 3. Fractions 58 to 80 were found to contain an active (active) compound, and these fractions were combined and concentrated by evaporation under reduced pressure. The residue was lyophilized to give 9.6 mg of 2-amino-4- (oxymethyl) -3a, 5,6,6a-tetrahydro-4H-cyclopent- [d] -oxazole-4,5,6-triol as a crude powder . The powder was again purified by column chromatography using a column packed with 100 ml of Dowex 1X2 (OH ^- ), eluting with deionized water to obtain 4.8 mg of 2-amino-4- (oxymethyl) -3a, 5,6,6a tetrahydro-4H-cyclopent- [d] -oxazole-4,5,6-triol in the form of a colorless powder having the properties described above.

Пример испытаний 1. Ингибирующая активность 2-амино-4-(оксиметил)-3a, 5,6,6a-тетрагидро-4H-циклопент-[d] -оксазол- 4,5,6-триола [соединение (II)] против крысиной β- фруктофуранозидазы. Test Example 1. Inhibitory activity of 2-amino-4- (oxymethyl) -3a, 5,6,6a-tetrahydro-4H-cyclopent- [d] -oxazole-4,5,6-triol [compound (II)] against rat β-fructofuranosidase.

Согласно методу Кесслера и др. [M. Kessler et al., Biochimica et Вiophisica Acta, 506, 136 - 154 (1978)], ферментный раствор базальной граничной пластинки тонкой кишки крыс получают из тонких кишок трех крыс-самцов штамма Вистар и суспендируют в 3 мл физиологического солевого раствора. According to the method of Kessler et al. [M. Kessler et al., Biochimica et Biophisica Acta, 506, 136 - 154 (1978)], an enzyme solution of the rat small intestine basal border plate is obtained from the small intestines of three Wistar male rats and suspended in 3 ml of physiological saline.

Образец 4-аминоантипирина (A 4382) приобретают из Сигма Кемиклс Ко., а образцы пероксидазы (Сорт 1) и глюкозооксидазы (Сорт 1) приобретают из Бехрингер Маннгейм Ко. Буферный раствор (pH 6,2), включающий 20 мМ лимонной кислоты и 40 мМ динатрий-фосфата, используют в качестве разбавителя в следующем эксперименте. A sample of 4-aminoantipyrine (A 4382) was purchased from Sigma Chemicals Co., and samples of peroxidase (Grade 1) and glucose oxidase (Grade 1) were purchased from Behringer Mannheim Co. A buffer solution (pH 6.2) comprising 20 mM citric acid and 40 mM disodium phosphate was used as a diluent in the following experiment.

Каждая ячейка панели микротитратора с 96-ю ячейками (продукция фирмы Фалкон Ко.) заполняется 130 мкл (во все ячейки) смеси, которая содержит 0,2 мг бычьего сывороточного альбумина (Сигма, A 7906), 3 единицы глюкозооксидазы, 0,132 единиц пероксидазы, 20 мкг 4-аминоантипирина, 40 мкг фенола, 3 микромоля сахарозы и испытуемое соединение. В ячейку добавляют 20 мкл 100-кратно разбавленного раствора ферментного раствора базальной граничной пластинки (оболочки Бруха) из тонкой кишки крыс. Смесь выделяющейся глюкозы контролируют по поглощению при 492 нм. Each 96-well microtiter panel cell (Falcon Co. products) is filled with 130 μl (in all cells) of a mixture that contains 0.2 mg of bovine serum albumin (Sigma, A 7906), 3 units of glucose oxidase, 0.132 units of peroxidase, 20 μg 4-aminoantipyrine, 40 μg phenol, 3 micromoles of sucrose and test compound. 20 μl of a 100-fold diluted solution of the enzyme solution of the basal boundary plate (Bruch membrane) from rat small intestine is added to the cell. The mixture of glucose released is controlled by absorbance at 492 nm.

Когда ферментативные реакции проводят без добавления испытуемого соединения и без добавления ферментного раствора, концентрации глюкозы принимают равными 0% и 100% ингибированию соответственно. Концентрация соединения (II), требуемая для ингибирования активности β- фруктофуранозидазы крыс на 50% (IC₅₀₎), найдена равной 18 мкг/мл.When enzymatic reactions are carried out without adding a test compound and without adding an enzyme solution, glucose concentrations are taken to be 0% and 100% inhibition, respectively. The concentration of compound (II) required to inhibit rat β-fructofuranosidase activity by 50% (IC ₅₀₎ ) was found to be 18 μg / ml.

Claims

1. The method of obtaining 2-amino-4 (hydroxymethyl) -3a, 5,6,6-tetrahydro-4H-cyclopent [d] -oxazole-4,5,6-triol, characterized in that the cultivate a microorganism belonging to the genus Micromonospora or to the genus Amycolatopsis capable of producing said 2-amino-4- (hydrocosimethyl) -3a, 5,6,6a-tetrahydro-4H-cyclopent- [d] -oxazole-4,5,6-triol, and the latter is isolated from the culture medium.

2. The method according to p. 1, characterized in that they use a strain of actinomycete Micromonospora of the form SANK 62390, FERM BP-3521.

3. The method according to p. 1, characterized in that they use a strain of actinomycete Amycolatopsis of the form SANK 60791, FERM BP-3513.

4. The strain of actinomycete Micromonospora of the form SANK 62390, FERM BP-3521, producing 2-amino-4- (hydroxymethyl) -3a, 5,6,6a-tetrahydro-4H-cyclopent [d] - oxazole-4,5,6- triol.

5. The strain of actinomycetes Amycolatopsis of the form SANK 60791, FERM BP-3513, producing 2-amino-4- (hydroxymethyl) -3a, 5,6,6a-tetrahydro-4H-cyclopent- [d] -oxazole-4,5,6 triol.