JPS6010718B2 - メイタンシノ−ル，メイタナシンおよびメイタンシノ−ル・プロピオネ−トの製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は抗腫場怪物質メィタンシノール、メイタナシン
およびメイタンシノール・プロピオネートの製造法に関
する。

上記化合物の中、メィタナシンおよびメイタンシノール
・プロピオネートは強い抗腫場性を有していることが知
られている（カプチャンら：ジャーナル・オブ・ザ・ア
メリカン・ケミカル・ソサイエテイ（Ｊｏｕｍａｌｏｆ
ｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＣｈｅｍｉｃａｌＳｏｃｉｅ世
）、９７巻、５２班頁、１９７３羊）。

またメィタンシノールはそれ自身の抗腫場性は弱い（上
記文献記載）が、これら容易に抗腫蕩性を有する物質メ
イタナシンおよびメイタンシノ−ル・プロピオネートな
どの種々な誘導体を製造する中間体物質として有用な物
質である。メイタンシノール、メィタナシンは上記文敵
のカプチャンらによって公知になった物質であるが、そ
れらはプツターリキア・ベルコサ（ニシシギ料の植物）
の樹皮から採取されたもので、その収量は上記樹皮乾燥
物ｌｋ９当り前者が０．０２５の夕、後者が０．３６の
夕と極めて少量である。

またメィタンシノール・プロピオネートはメイタンシノ
ールを化学的にプロピオニル化することによって得られ
ている。本発明者らは多種類の土壌などの試料を採取し
て、それらから分離される微生物について、その生産す
る抗生物質を検索し、ある種の微生物がメイタンシノー
ル、メイタナシンまたはメイタンシノール・プロピオネ
ートをその培養物中に蓄積することを見出し、該微生物
が／カルデア属に属すること、種々の変異株を得、また
これら微生物を適宜の※養堵地および培養条件により、
これらの物質を製造、採取できることを見出しさらに研
究した結果、本発明を完成した。

すなわち本発明は、ノカルディア属に属するメイタンシ
ノール、メイタナシンまたはメイタンシノール・プロピ
オネートの生産菌の培地に培養し、培養物中にメィタン
シノール、メィタナシンまたはメィタンシノール・プロ
ピオネートを生成蓄積せしめ、これを特徴とするメィタ
ンシノ−ル、メイタナシンまたはメイタンシノール・プ
ロピオネートの製造法である。

上記物質は、公知文献によれば、植物からの製造では、
特定の植物に限られ、その植物の生育、伐採、乾燥、粉
末化、抽出「分離精製の各段階で多大の費用と設備なら
びに時間を必要とする。

しかもその収率は極めて低い。これに対し本発明によれ
ば該微生物を培養することにより、その何れもが簡単か
つ速かに行われ、任意に多量のそれらの物質を製造し、
採取することが出来る。微生物代謝産物としてこれらの
植物成分が得られたのは始めての例であり、本発明方法
は極めて優れた製造法であると言える。本発明方法に用
いることができる菌としては、たとえば本発明者らが土
壌などから分離した放線菌Ｎｏ．Ｃ−１５００３珠が挙
げられる。

風 Ｎｏ．Ｃ−１５００３朱の菌学的諸性質Ｎｏ．Ｃ−
１５００３珠の菌学的諸Ｉ性質をシヤーリングおよびゴ
ツトリーブの方法（インターナショナル・ジヤーナル・
オブ。

システマテイツク・バクテリオロジー（Ｉｎｔｅｒ佃ｔ
ｉｏＭＩＪｏｕｍａｌｏｆＳ＊ｔｅｍａｔｉｃＢａｃｔ
ｅｒｊｏｌｇｙ）、第１６巻、３１３頁〜３４０頁、１
９６８王）に準じて検討し、２８℃、２１日間にわたっ
て観察した結果は下記の通りである。０１ 形態的特徴 基生菌糸は寒天培地上および液体培地中ともによく伸長
し、分枝する。

その直径の多くは０．８〜１．２仏肌でありト時には樟
菌状または分枝したい短い菌糸状に分断することがある
。

種々の分類用塔地上でよく生育し、気菌糸は基生菌糸上
に発育するが、東状体（５０〜２００仏×２００×１０
００仏）を形成し、それらの上に発育することが多い。
気菌糸の形状の多くは屈曲状または直線状を示し、まれ
にゆるい螺旋状を示すものも見られる。成熟した培養を
検鏡すると胞子が連鎖状になっていると考えられるもの
は少なく、それらの培養表面から採取した菌懸濁液につ
いて検鏡した所、長楕円形（０．８〜１．２×４．８〜
６．８山肌）および楕円形（０．８〜１．２×１．０〜
２．０〃ｍ）の分節胞子様のものが多く観察され、電子
顕微鏡による観察ではその表面は平滑であった。｛２１
菌体組成 本菌株をＩＳＰＮｏ．１の改変塔地中で２８℃、６６〜
９畑時間振盤培養して、函体を集め、洗糠した。

上記菌体をビー・ベッカーらの方法（アプライド、マイ
クロバイオロジー（ＡｐｐｌｉｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌ
ｏｇｙ）「 １２肇、４２１頁、１９段年）およびェム
・ピー・レェヒバリェーの方法（ジャーナル・オブ・ラ
ボラトリーアンド・クリニカル・メデイシン（ＪｏｍＭ
ＩｏｆＬａｂｒａｔｏりａｎｄＣｌｉｎｉｃａｌＭｅｄ
ｉｃｉｎｅ）７１巻、９私頁、１９斑年）に従って菌体
細胞中のジアミノピメリン酸および糖絹成を検した結果
、前者はメソ体であること、後者はガラクトースおよび
アラピノースに相当するスポットの存在が認められた。
【３’分類用塔地上の諸性質 本菌株は各種塔地上で、いずれも比較的よく発育し、そ
の基生菌糸は培養初期無色ないし淡黄色で、その後、淡
黄褐色または黄褐色を示す。

また種々の分類用培地中に黄色ないし黄褐色の可溶性色
素を生成する。気菌糸は粉状で、一般には中程度に発育
し、白色ないし黄色または淡葵褐色を示す。本菌株の各
種分類用塔地上における諸性状は第１表に示した通りで
ある。第１表Ｎｏ．Ｃ−１５００３珠の分類用塔地上の
諸性質‘ィ’藤糖・硝酸塩寒天塔地生育（Ｇ）：豊富、
黄色（＄ａ）＊ ないし淡黄褐色（乳ｃ）＊、東状体形
成 気菌糸（ＡＭ）：貧弱、白色 可溶性色素（ＳＰ）：なしまたは徴黄褐 色 ‘０）グリセロール・硝酸塩※夫培地 Ｇ：中程度、淡黄色（×ａ）＊、東状体形成 ＡＭ：中程度、白色 ＳＰ：なし し一 ブドウ糖・アスパラギン寒天培地 Ｇ：中程度、淡明黄色（３ｐａ）＊ ないし明黄色（沙
ａ）＊ＡＭ：貧弱、白色 ＳＰ：明黄色（桝ａ）＊ 片 グリセロール・アスパラギン寒天培地Ｇ：中程度、
淡黄色（汝ａ）＊、東状体形成 ＡＭ：貧弱、白色 ＳＰ：なし 畑 でん粉寒天塔地 Ｇ：中程度、淡黄色（松ａ）＊ ないし淡黄褐色（次ａ
）＊、東状体形成 ＡＭ：豊富、淡黄色（沙ａ）＊ ＳＰ：なし Ｈ 栄養寒天塔地 Ｇ：中程度、淡黄色（汝ａ）＊ ないし黄色（２３）＊
、東状体形成 ＡＭ：貧弱、白色 ＳＰ：なし ‘トー リンゴ酸カルシウム寒天培地 Ｇ：中程度、淡黄色（次ａ）＊ ないし淡黄褐色（友ａ
）＊、東状体形成 ＡＭ：中程度、白色ないし淡黄色 （次ａ）＊ ＳＰ：なし 扮 酵母エキス：麦芽エキス寒天塔地 Ｇ：中程度、淡黄褐色■ｃ）＊ ないし 明褐色（乳ａ）＊、東状体形成 ＡＭ：中程度、白色ないし淡黄色 （次ａ）＊ ＳＰ：なし 肌 オートミール寒天培地 Ｇ：中程度、淡黄色（Ｚａ）＊ ないし黄色（なめ）＊
、東状体形成 ＡＭ：貧弱、白色ないし淡黄色 ＳＰ：なし 肉 べプトン・酵母エキス‘鉄寒天培地 Ｇ：中程度、黄色く２３）＊ ＡＭ：なし ＳＰ：黄色（ａＦ）＊ ０リ チロジン寒天培地 Ｇ：中程度、淡黄色（Ｚａ）＊ ないし黄色（＄ａ）＊
、東状体形成 ＡＭ：中程度、白色ないし淡黄色 （父ａ）＊ ＳＰ：黄褐色（＄ｅ）＊ ＊：カラー・ハーモニー・マニュアル、 第４版、（コンテェィナー・コーポレーション・オブ・
アメリカ、１９＄年発行）による色名記号【４’生理的
性質本菌株の生理的性質は第２表に示した通りである。

すなわち生育温度範囲は１２０ないし斑℃また寒天塔地
（ＩＳＰＮｏ．２）上で気菌糸をよく着生する温度範囲
は２０ｑｏないし３５℃である。第２表 Ｎｏ．Ｃ−１
５００３珠の生理的性状生育温度範囲：１２０〜粉。

○気菌糸着生温度２０℃〜３５℃ ゼラチン液化：腸性 でん粉加水分解：腸性 硝酸塩還元館：陽性 ミルク・ベプトン化：腸性 ミルク・凝固：陰性 カゼイン分解館：陽性 メラニン様色素形成（ベプトン・酵母エキス鉄寒天塔地
）：陰性 チロジン寒天塔地：陽性 チロジン分解：陽性 キサンチン分解館：陰性 ヒポキサンチン分解能：陰性 リゾチーム耐性：陽性 食塩耐性：２％ ■ 各種炭素源の利用性 プリーダムおよびゴットリーブの方法（ジヤーナル・オ
ブ・バクテリオロジー （Ｊｏｍ肌ｌ ｏｆＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）５６巻
、１０７頁、１９４８年‘こ記載されている培地および
それに酵母エキス（バクト）を０．１％添加した基礎塔
地を用いて、各種炭素源の利用性を検し、それらの結果
を第３表に示した。

第３表 豚Ｃ−１５００３株の炭素源利用性炭素源
生育 炭素源 生育Ｄ−キシロース 十 日※
ラフイノース 士 ±※Ｌーアラビノース
＋ ＋ メリピオース ＋ ＋Ｄ−グルコー
ス 什 什 ｉーィノシトール ー ーＤー
ガラクトース ＋ ＋ Ｄ−ソルピトールＤーフラ
クトース 州 日 Ｄ−マンニトール 日
ＨＬ−ラムノ町ス 十 十 グリセロール
− ±Ｄ−マンノース 日 日 可溶性澱粉
＋ 十シュークロース 什 什 対
照 − −ラクトースマルトース 士
十 トレハロース 十 日 ※：酵母エキス０．１％添加基礎培地 注；肘：豊富な発育 Ｈ：比較的良好な発育 ＋：発育を認める。

±：僅かに発育する。

−：発育しないｏ ■ その他の諸性質 前述【小こ示した方法で菌体を集め、これらをジェー・
マーマーらの方法（ジャーナル。

オブ・モレキユフー・／ゞイオロジー（ＪｏｍＭ１ｏｆ
Ｍｏｌｅｃ山ａｒＢｉｏｌｏ期）３巻「 ２０８頁「１
９６１年）に準じてＤＮＡを調製し、ＤＮＡのＧ−Ｃ舎
量を検すると約７１モル％であった。

本菌株の栄養菌糸をグラム染色すると陽性であった。

以上に述べたＮｏ．Ｃ−１５００３珠の諸性質をェス８
エー・ワックスマン著、ジ。

アクチノミセチノミセテス（ｍｅＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅ
ｔｅｓ）、第２巻Ｌ ザ・ウイリアムス・アンド・ウイ
ルキンスＱカンパニー発行、１９６１年アールＧィ−・
ブッフアナン・アンド・ェヌ・イー・ギボンス編、パー
ジーズ・マニュアル・オブ・デターミネーテイブ・バク
テリオロジー（母ｒ鉾ｙ′ ＭａｎｎｕａｌｏｆＤｅ
ｔｅｎｎｉ雌ｔｉｖｅ母ｃｔｅｒｉｏｌｏ鞘）「 第８
版、１９７ぷ王およびその他の文献に従って検索した。
本菌株はノカルディア（Ｎｏｃａてｄｉａ）属のグルー
プｍに属すると考えられるが、既知菌株の中には上記諸
性質を有する種は見出されず、新菌種と同定された。本
菌株Ｎｏ．Ｃ−１５００３株は、工業技術院微生物工業
技術研究所にＦＥＲＭ−Ｐ ＮＯ．３９９２として、財
団法人発酵研究所にＩＦＯ−１３７２６として、それぞ
れ寄託されている。

以上に述べた様にＮｏ．Ｃ−１５００３株はノカルデイ
ア属の新種であるが、微生物の一般的性質として自然的
または変異剤によって変異を起し得る。

たとえばＸ線、ガンマ‐線、紫外線等の放射線の照射単
胞子分離、種々の薬剤を含有する培地上での培養ｔその
他の手段で変異させて得られる多くの変異株「あるいは
自然に得られる突然変異株等であっても「上記した菌学
的性状または下記に示した様な菌学的性状との比較にお
いて実質的に別種とするに足らず、しかもメイタンシノ
ール、メイタナシンおよびメイタンシノール。プロピオ
ネートを生産する性質を有するものはすべてＮＯ．Ｃ−
１５００３珠として本発明の方法に利用し得る。すなわ
ちＮｏ．Ｃ−１５００針珠を種々の変異処理することに
より、可溶性色素をほとんど生成しないもの、基生菌糸
が無色のもの、黄緑色を示すもの、赤褐色ないし燈赤色
を示すもの、菌糸が樟菌状または分枝した短い菌糸に分
断し易いものおよび気菌糸が豊富で白色または気菌糸を
ほとんど着生しない変異株等が得られている。メイタン
シノール、メイタナシンまたはメイタンシノール・プロ
ピオネート生産菌（以下、「生産菌」と略すこともある
。

）の培養に用いられる培地は該菌株が利用し得る栄養源
を含むものなら、液状でも固状でもよいが、大量を処理
するときには液体培地を用いるのがより適当である。培
地には生産菌が同化し得る炭素源、消化し得る窒素源、
無機物質、徴量栄養素等が適宜配合される。炭素源とし
ては、たとえば、ブドウ糖、乳糖、ショ糖、麦芽糖、デ
キストリン、でん粉、グリセリン、マンニトール、ソル
ビトール、油脂類（例、大豆油、ラード油、チキン油等
）その他が、窒素源としては、たとえば肉エキス、酵母
工キス、乾燥酵母、大豆粉、コーン・スチーブ・リカー
、ベプトン、カゼイン、棉裏粉、薮糖蜜、尿素、アンモ
ニウム塩類（例、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム
、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウムなど）その他が
用いられる。さらにナトリウム、カリウム、カルシウム
、マグネシウムなどを含む塩類、鉄、マンガン、亜鉛、
コバルト、ニッケルなどの金属塩類、リン酸、ホウ酸な
どの塩類や酢酸、プロピオン酸などの有機酸の塩類が適
宜用いられる。その他、アミノ酸（例、グルタＪミン酸
、アスパラギン酸、アラニン、グリシン、リジン、メチ
オニン、プロリン等）、ベプチド（例、ジベプチド、ト
リベブチド等）、ビタミン類（例、Ｂ、Ｂ２、ニコチン
酸、Ｂ，２、ＶＣ等）、核酸類（例、プリン、ピリミジ
ンおよびその誘導体）等を含有させてもよい。もちろん
培地のｐＨを調節する目的で無機または有機の酸、アル
カリ類、緩衝剤等を加え、あるし、は消泡の目的で油脂
類、表面活性剤等の適量が添加される。培養の手段は静
暦培養でも、振濠培養あるいは通気蝿幹培養法等の手段
を用いてもよい。

大量の処理には、いわゆる深部通気蝿梓培養によるのが
望ましいことばいうまでもない。培養の条件は培地の状
態、組成、菌株の種類、培養の手段等によって一定しな
いのは当然であるが、それらは通常２ぴ○〜３ず○の温
度で、初発ｐＨを中性付近に選択するのがよい。とりわ
け、培養中期の温度は２３〜３０℃、また初発ｐＨは６
．５〜７．５の条件が望ましい。培養期間も前記の諸条
件により一定しないが、所望の抗生物質濃度が最大とな
るまで培養するのがよい。これに要する時間は液体塔地
を用いる振遼培養または通気燈梓培養の場合は２〜６日
間程度である。これら抗生物質の力価測定はテトラヒメ
ナ・ピリホルミスＷ株（ＴｅｔｒａｐｈｙｍｅｎａＰの
他ｒｍｉｓ）を試験微生物として検定培地（トリプトー
ス・ベプトン（ディフコ社製）２０夕、酵母エキス（デ
ィフコ社製）１夕、ブドウ糖２夕、蒸留水１０００のＺ
および１モル燐酸緩衝液母７．０、１０肌【）を用い、
２８℃、４独特間ないし４錨時間培養し、その生育を織
度で測定する液体稀釈度検定法および後に示す薄届クロ
マトグラフィー法（以下ＴＬＣと略す）により測定した
。

このようにして培養された培養物中にメィタナシン、メ
イタンシノール・プロピオネートまたはメイタンシノー
ルが生産蓄積され、これらは炉液および菌体抽出液のい
ずれにも含有される。

またこれらの各成分は著明は抗菌性が認められなかった
ので、テトラヒメナに対する活性と平行して設定された
ＴＬＣ法により検索された。すなわち、培養物を炉過ま
たは遠心分離で菌体と炉液とに分け、炉液はそのま）炉
液と同量の酢酸エチルで抽出する。菌体には炉液と同量
の７０％アセトン水を加えて２０午０で１時間類拝し炉
過する。炉液中のアセトソを留去し得られた水溶液を酢
酸エチルで抽出する。それぞれの抽出液の１００倍濃縮
した液をシリカゲルガラスプレート（西独メルク社、キ
ーゼルゲル６価２５４０．２５側２０×２０）を担体と
して薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）に付し（溶媒：
クロロホルム・メタノール９：１）紫外線２５３７Ａを
照射して検出される吸収像の強さから測定される。培養
物中に産生されたメィタナシン、メィタンシノール・プ
ロピオネートまたはメイタンシノールを採取するには本
物質群が中性脂潟性であるため、か）る微生物代射物を
採取するために通常用いられる分離精製の方法が適宜利
用される。

たとえば不純物との溶解度の差を利用する手段、活性炭
、マクロポーラス非イオン系樹脂、シリカゲル、アルミ
ナ等各種の吸着剤の吸着新和力の差を利用する手段、イ
オン交換樹脂による不純物の除去手段のいずれもがそれ
ぞれ単独で、また組合せて、あるいは反覆して利用され
る。前記のようにメイタナシン、メイタンシノール・プ
ロピオネ−トまたはメイタンシノールは培養炉液と菌体
の双方に含まれているのでこれらの吸着剤を用いる場合
、培養炉液では直接あるいは溶媒抽出後、菌体では溶媒
抽出後吸着剤に吸着させ分離、精製する。溶媒でまず抽
出する場合は‘１’菌体を分離しない全培養物から溶媒
抽出するか、あるいは【２１炉過または遠心分離などで
分離した菌体および培養炉液のそれぞれから溶媒抽出す
る等いずれの方法でも使用しうる。炉液と菌体を個別に
抽出する場合には、以下の方法で実施するのが有利であ
る。炉液からの抽出に適当な溶媒としては水と混じらな
い有機溶媒、たとえば酢酸エチル、酢酸アミルなどの脂
肪酸ェステル、ブタノールなどのアルコール類、クロロ
ホルムなどのハロゲン化炭化水素、メチルィソブチルケ
トンなどのケトン類が用いられる。抽出は中性附近で行
なわれ、好ましくはｐＨ７に調整された培養炉液からの
酢酸エチルを用いて行なわれる。抽出液を水洗後減圧下
に濃縮し、石油エーテル、ｎ−へキサンのような非鐘性
溶媒を加えて有効成分を含む粗物質１を採取する。この
中にはＴＬＣ上でメイタナシン、メイタンシノール・プ
ロピオネートまたはメイタンシノール以外の多数のスポ
ットが認められるため、段階的につぎの精製工程が利用
される。すなわち、通常用いられる精製法、なかでも種
々の吸着クロマトグラフィーが有効であり、吸着剤とし
ては、一般に使用される担体、たとえばシリカゲル、ア
ルミナ、マクロポーラス非イオン系吸着樹脂等が使用で
きるが、粗物質１よりの精製にはシリカゲルが最も有効
に利用され、非極性溶媒、たとえば石油エーテル、ｎ−
へキサンから展開をはじめ、酢酸エチル、アセトン、エ
タノール、メタノールのような極性溶媒を添加すること
により溶出を行う。その１例を示すとシリカゲル（西独
メルク０．０５〜０．２肋）を担体とし、ｎ−へキサン
〜酢酸エチルの混合比を順次増加しながらカラムクロマ
トグラフィーを行い、溶出液をＴＬＣでしらべて有効区
分を含有するフラクションを集め、減圧濃縮して石油エ
ーテルまたはｎーヘキサンを加え粗物質０を得る。この
中にはまだ他の不純物を含むため、つぎの精製を行う。
たとえば溶媒系をかえた第２のシリカゲルカラムにより
精製する。この場合の展開溶媒には、ジクロルメタン、
クロロホルムのような含ハロゲン炭化水素類から展開を
はじめ、エタノール、メタノールのようなアルコール類
、アセトン、メチルエチルケトンのようなケトン類等極
性溶媒を添加することによりメイタナシン、メイタンシ
ノール・プロピオネートまたはメィタンシノールを分離
採取する。第１、第２のシリカゲルカラムの溶媒系の組
み合わせは、前後を逆にしても可能であって、その他通
常用いられる有機溶媒が適宜組み合わされる。粗物質０
の精製手段として、マクロポーラス吸着性樹脂を用いる
とき、メィタナシン、メイタンシノール・プロピオネー
トまたはメイタンシノールを溶出するには、低級アルコ
ール類、あるいは低級ケトン類、ェステル類と水との混
合物を使用する。

低級アルコール類としては、たとえばメタノール、エタ
ノール、ブロバノール、プタノールなど、低級ケトン類
としては、たとえばアセトン、メチルエチルケトン、ェ
ステル類としては、酢酸エチルなどが利用できる。その
一例を示すと６０％メタノール水に粗物質０をとかし、
ダイヤイオンＨＰ−１０（三菱化成）カラムに通過させ
て吸着せしせ、７０％メタノール水で洗浄後９０％メタ
ノ−ル水で溶出すると目的物、メィタナシン、メィタン
シノール・ブロピオネートまたはメイタンシノールが分
離溶出される。いずれの方法でも、得られた目的物質画
分を減圧濃縮し、乾燥物に対して５〜８倍量の酢酸エチ
ルを加え放贋すると、メイタナシン、メィタンシノール
・ブロピオネートまたはメイタンシ／ールの結晶がそれ
ぞれ析出する。

メィタナシン、メィタンシ／−ル・プロピオネートの混
合物の場合は、上記の吸着剤を利用して分離される。す
なわち、シリカゲルまたはマクロポーラス非イオン性吸
着樹脂を用いて、それぞれ前述の溶媒により分離溶出す
ることが可能であり、たとえばシリカゲルを用いるとき
はｎーヘキサン、酢酸エチル系またはクロロホルム・メ
タノール系の溶媒で展開し、メイタンシノール・プロピ
オネート、メイタナシンの順序で溶出されるので、それ
ぞれＴＬＣにより検出後各区分を減圧濃縮し、酢酸エチ
ルを加えてそれぞれの結晶を得ることが出来る。また、
マクロポ−ラス非イオン系吸着樹脂を用いるときは、ア
ルコール類、ケトン類、ェステル類と水との混合比を変
える鏡斜漆出法、たとえば５％食塩を含む６０％メタノ
ール水と９５％メタノール水とを用いた煩斜溶出法を用
いると、メィタナシン、メィタンシノール・プロピオネ
ートの順序で溶出され、それぞれＴＬＣにより検出後減
圧濃縮し、酢酸エチルより結晶として単離採取される。
これらの結晶は酢酸エチルを結晶溶媒として含有するた
め、７０午○、減圧下で五酸化リン上で８時間乾燥後測
定をされる。これらの物理化学的性状につぎの通りであ
る（第４表）。第４表 以上の元素分析値、比旋光度、紫外線吸収スペクトル、
赤外線吸収スペクトル、マススベクトルなどは前述カプ
チャンらの報告（ジャーナル・オプ・アメリカン・ケミ
カル・ソサイテイ−、９７巻、５２９４頁、１９７３玉
）に示されるメイタナシン、メイタンシノール・プロピ
オネートおよびメイタンシノールに関する記載と全く一
致した。

実施例 １ イーストエキストラクトーマルトエキストラクト斜面寒
天塔地に培養したメィタンシノール、メイタナシンおよ
びメイタンシノール・プロピオネート生産菌ノカルディ
アＮｏ．Ｃ−１５００３株（ｍ０１３７２０ＦＥＲＭ−
Ｐ ＮＯ．３９９２）を、２００の【容三角フラスコ内
の、グルコース２％、可溶性デンプン３％、生大豆粉１
％、コーンステイープリカー１％、ポリベブトン０．５
％、ＮａＣＩ Ｏ．３％、ＣａＣ０３０．５％、ｐＨ７
．０を含む４０の‘の種培地に接種し、２８℃、４錨時
間回転振盤機上で培養し、種培養液を得た。

得られた種培養液の０．５の‘を２００のＺ客三角フラ
スコ内のデキストリン５％、コーンステイープリカー３
％、ポリベプトン０．１％、ＣａＣ０３０．５％、ＰＨ
７．０を含む４０の‘の主培地に移植し、２８ｑｏ、９
■時間回転振鰹機上で培養した。

この培養液はテトラヒメナ・ピリホルミスＷを検定菌と
し、メィタンシノール・プロピオネートを標準品として
液体希釈法で検定すると２５〃タ′私の生産力価を示し
た。実施例 ２実施例１で得た種培養液の１０の‘を種
塔地５００私を含む２〆容坂口フラスコに移植し、２ず
○、４錨時間往復振糧機上で培養した。

この培養液５００舷を種塔地３０夕を含む５０ク客ステ
ンレス・スチールタンクに移植し、２皮○、通気３０〆
／分、蝿梓２８０回転／分（１／２ＤＴ）内圧ｌｋｇ／
地の条件で４乳時間培養して種培養液を得た。得られた
種培養液を移植率１０％で実施例１に示したものと同様
の主塔地１００夕を含む２００ク客ステンレス・スチー
ルタンクに移植し、２８ｑｏ、通気１００〆／分、蝿拝
２０伍副転ノ分（１／狐Ｔ）、内圧ｌｋｇ′地の条件で
９独特間培養した。得られた培養液は実施例１の検定法
で２５ムタ／泌の生産力価を示した。得られた培養液９
０〆に／・ィフロスーパーセル（米国、ジョンズマンヴ
ィル‘プロダクト社）２ｋ９を加えよくかきまぜる。

混合物を加圧式炉過機で炉過し炉液８５夕および湿菌体
３２ｋ９を得る。炉液８５のこ酢酸エチル３０夕を加え
鷹梓抽出し、この操作を２回くり返す。酢酸エチル層を
合せて水３０そ宛で２回水洗し無水硫酸ナトリウム５０
０夕を加えて乾燥後２００の‘まで減圧濃縮し石油エー
テルを加え、析出する沈澱を炉敬する（５３多）。得ら
れた粗物質１に酢酸エチルｌｏｏ似を加えかきまぜ、不
溶物を炉去し炉液にシリカゲル（西独メルク社０．０５
〜０．２脚）１０夕を加えてかきまぜた後、酢酸エチル
を減圧下に留去しあらかじめ用意したシリカゲルカラム
（４００叫）の上端におきｎーヘキサン５００叫、ｎ−
へキサン・酢酸エチル（３：１）５００の‘、ｎーヘキ
サン・酢酸エチル（１：１）５００の‘、ｎ−へキサン
・酢酸エチル（１：３）５００舷、酢酸エチル５００の
‘、酢酸エチル・メタノール（５０：１）１夕、酢酸エ
チル・メタノール（２５：１）１〆を流し溶出液を１０
０机宛分画する。各フラクションの１叫宛を濃縮乾固し
、０．１の‘の酢酸エチルを加え、シリカゲルガラスプ
レート（西独メルク社 キ−ゼルゲル ６帆２５４０．
２５側 ２０×２０）の下端から２．５伽の位置にスポ
ツトし、展開溶媒、酢酸エチル・メタノール（１９：１
）で約１７肌展開する。展開後紫外線（２斑７Ａ）下で
吸収像をしらべ、Ｒｔｏ．５８〜０．６斑付近に吸収の
あるフラクションＮｏ．２５〜３０までおよびＲｔｏ．
２５〜０．３０附近に吸収のあるＮｏ．聡〜４０をそれ
ぞれ集め約２０の‘まで減圧濃縮する。それぞれの濃縮
液に石油エーテル１５０の‘を加え粗物質ロ５夕および
粗〆ィタンシノール２夕を得る。得られた粗物質００．
５夕を酢酸エチル１０の【に溶解し、シリカゲル（西独
メルク社 ０．０５〜０．２欄）４夕を加えよくかきま
ぜたのち、酢酸エチルを減圧で蟹去する。

あらかじめ用意したシリカゲルカラム３００の‘の上端
におきクロロホルム５００の上で洗浄後、クロロホルム
・メタノール（５０：１）５００のＺ、クロロホルム・
メタノール（２０：１）５００心、クロロホルム・メタ
ノール（１０：１）５００のＺで溶出する。溶出液は２
５泌宛分画し各フラクションの０．榊‘を減圧濃縮して
、０．０５の‘の酢酸エチルを加え、これをサンプルと
して薄層クロマトグラフィーに付す。（展開溶媒 クロ
ロホルム・メタノール９：１）Ｒｆｏ．４８〜０．５０
に２＄７Ａで吸収像を示すフラクションＮｏ．４０〜４
１を減圧濃縮乾固して酢酸エチル０．５叫を加え放置す
るとメィタナシンおよびメイタンシノール・プロピオネ
ートの混晶５０のｏが得られる。得られたメイタナシン
およびメイタンシノール・プロピオネート演晶５０柵を
メタノール５の‘にとかしこれに食塩１００の９、水５
のＺを加えて溶解する。

ダイヤイオンＨＰ−１０（三菱化成）２００の‘を直径
１．８弧のカラムにつめ５％食塩を含む５０％メタノー
ル水６００叫を流して調整する。先に用意したサンプル
溶液を流した後５％食塩を含む６０％メタノール水３０
０の【を流した後５％食塩を含む６０％メタノール水１
．５そと９５％メタノール水１．５そとの間で頃斜港出
を行う。熔出液は１５の‘宛分画し各フラクションを薄
層クロマトグラフィーに付して検出する。フラクション
１３０−１３５でメイタナシンＬフラクシヨン１３８一
１４２で・メイタンシノール・プロピオネートが溶出さ
れる。各々を集めて濃縮し水３０の‘「酢酸エチル５０
の‘を加え溶解し分液ロートに入え、ふりまぜたのち水
層を分離、水３０の‘宛で２回水洗後酢酸エチル層を若
硝で乾燥、濃縮して放置するとそれぞれの結晶が析出す
る。結晶を炉敬乾燥する。メィタナシン１３の９、メィ
タンシ／−ノレ・プロピオネート２５の９。上述の様に
して得られた粗〆ィタンシノール０．２夕を酢酸エチル
３の【に溶解し、シリカゲル（西独メルク社 ０．０５
〜０．２柵）０．５夕を加えよくかきまぜたのち酢酸エ
チルを減圧で蟹去する。

あらかじめ用意したシリカゲルカラム８０の【の上端に
おき、クロロホルム１５０泌で洗糠後、クロロホルム．
メタノール（５０：１）１５０の【、クロロホルム・メ
タノール（２０：１）１５０のＺ、クロロホルム・メタ
ノール（１０：１）３００の【で溶出する。溶出液は、
１０のＺ宛分画し各フラクションの０．５の‘を減圧濃
縮して０．０５の【の酢酸エチルを加え、これをサンプ
ルとして薄層クロマトグラフィーに附す。（展開溶媒
クロロホルム・メタノール（９：１））、Ｒｆｏ．斑〜
０．斑に２球７Ａで吸収像を示すフラクションＮｏ．５
０〜５２を減圧濃縮乾岡して酢酸エチル０．５の上を加
え放置するとメイタンシノール２０ｍｏの結晶が得られ
る。実施例 ３ 実施例２で得られた菌体３２ｋ９に７０％アセトン水５
０夕を加え３時間蝿梓抽出後、加圧式炉過機で炉過する
。

再度７０％アセトン水５０そで抽出をくり返し、同様炉
過して得られた炉液を合わせ、減圧濃縮によりアセトン
を留去する。得られた水性液をダイヤイオンＨＰ−１０
（三菱化成）５そのカラムに流し、２０その水と５０％
メタノール水で洗膝後、１５その９０％メタノール水で
溶出する。溶出液を３そまで減圧濃縮し、水３そ酢酸エ
チル３そを加えふりまぜ、この操作を２回くり返す。酢
酸エチル層を合せ水洗後無水硫酸ナトリウムを加え乾燥
後２００の【まで減圧濃縮し、石油エーテルを加えて析
出する沈澱を炉取する。（２８０の得られた粗物質１は
実施例１と同様の方法でシリカゲルカラムにより精製し
粗物質ＤＩ夕および粗〆ィタンシノール０．５夕を得る
。実施例 ４ 実施例２で示した坂口フラスコ培養液の１そを種塔地１
００そを含む２００そステンレス・スチールタンクに接
種し２８℃通気１００そ／分、縄梓２０ｍ副転／分で４
錨時間培養し、種培養液を得た。

得られた種培養液を、移植率１０％で実施例１に示した
主塔地ｌｏｏ０どを含む２０００そ客ステンレス・スチ
ールタンクに移植し、２８℃、通気１０００Ｚ／分、縄
拝１２０回転／分（１／３ＤＴ）内圧ｌｋ９′地の条件
で９畑時間培養した。得られた培養液は、実施例１の検
定法で２０ムタ′の‘の生産力価を示した。上記のよう
にして得られた培養液９００のこ９００そのアセトンを
加え１時間燈梓後、／・ィフロスーパーセル（米国 ジ
ョンズ マンヴィル社製）２０ｋ９を加えてかきまぜ加
圧式炉過機で炉過する。

得られた炉液１７００のこ水５００夕を加え酢酸エチル
１０００Ｚでポドヴイニヤック（米国、Ｐｏ地ｉｅｌｎ
ｉａｋＩＮＣ）を使って抽出する。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ ノカルデイア属に属するメイタンシノール、メイタ
   ナシンまたはメイタンシノール・プロピオネートの生産
   菌を培地に培養し、培養物中にメイタンシノール、メイ
   タナシンまたはメイタンシノール・プロピオネートを生
   成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とするメイタ
   ンシノール、メイタナシンまたはメイタンシノール・プ
   ロピオネートの製造法。