DE2746253A1

DE2746253A1 - Verfahren zur herstellung von maytansinol und dessen derivaten

Info

Publication number: DE2746253A1
Application number: DE19772746253
Authority: DE
Inventors: Mitsuko Asai; Eiji Higashide; Seiichi Tanida
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1977-03-31
Filing date: 1977-10-14
Publication date: 1978-10-05
Also published as: NL7711273A; PL201539A1; AU2907377A; DE2746253C2; FR2385798A1; PT67853A; AU507869B2; PT67853B; IT1094003B; IT7821819A0; CS214881B2; JPS53121998A; IE45888L; DK143570C; PL108863B1; SU938746A3; DK143570B; AT362058B; GB1554395A; ES463206A1

Description

VON KREISLER SCHONWALD MEYER EISHOLD FUES VON KREISLER KELLER SELTING

PATENTANWÄLTE Dr.-Ing. von Kreisler ή- 1973

Dr.-Ing. K. Schönwald, Köln

Dr.-Ing. Th. Meyer, Köln

Dr.-Ing. K. W. Eishold, Bad Soden

Dr. J. F. Fues, Köln

Dipl.-Chem. Alek von Kreisler, Köln

Dipl.-Chem. Carola Keller, Köln

Dipl.-Ing. G. Selling, Köln

5 KÖLN 1 13. Okt. 1977/Fu

DEICHMANNHAUS AM HAUPTBAHNHOF

Takeda Chemical Industries, Ltd.

27, Doshomachi 2-chome, Higashi-ku, Osaka, Japan

Verfahren zur Herstellung von Maytansinol und dessen

Derivaten.

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Telefon: (0221) 234541-4 ■ Telex: 8882307 dopa d ■ Telegramm: Dompatent Köln

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Maytansinol. Maytanacin und Maytansinolpropionat, welche als Cytostatica eingesetzt v/erden sollen.
Bekanntlich besitzen unter den vorgenannten Verbindungen Maytanacin und Maytansinolpropionat starke cytostatische Wirkungen [Kupchan et al.: Journal of the American Chemical Society 9]_, 529¹J (1975)]· Andererseits besitzt Maytansinol selbst lediglich eine schwache cytostatische Wirkung (vergl. obige Literaturstelle), ist jedoch als Zwischenprodukt für die Herstellung von Maytanacin und Maytansinolpropionat und von anderen Derivaten wertvoll, weil damit eine leichte Herstellungsweise dieser Verbindungen gewährleistet wird.

Maytansinol und Maytanacin wurden gemäss obiger Literaturstelle aus der Rinde von Putterlickia verrueosa (eine Pflanze, welche zur Gattung Maytenus gehört) bei äusserst geringer Ausbeute von 0,025 mg an ersterer Verbindung und 0,36 mg an letzterer Verbindung aus 1 kg getrockneter Pflanzenrinde erhalten. Maytansinolpropionat wurde durch chemische Propionierung von Maytansinol erhalten.

Es wurden verschiedene Bodenproben und andere Proben gesammelt und die daraus isolierten Mikroorganismen gesichtet. Dabei wurde festgestellt, dass man gewisse Mikroorganismen isolieren kann und dass dieselben Maytansinol,

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Maytanacin oder Maytansinolpropionat im Züchtungsmedium anzureichern vermögen, Diese Mikroorganismen gehören zur Gattung Nocardia. Die vorgenannten Verbindungen können auch durch Züchtung von Mutanten, die sich von diesen Mikroorganismen ableiten, in einem geeigneten Nährmedium unter geeigneten Bedingungen erhalten werden.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich somit auf ein Verfahren zur Herstellung von Maytansinol, Maytanacin oder Maytansinolpropionat, wobei dieses Verfahren darin besteht, dass ein Mikroorganismus, welcher zur Gattung

.Nocardia gehört und Maytansinol, Maytanacin oder Maytansinolpropionat zu erzeugen vermag, in einem Kulturmedium unter Anreicherung von Maytansinol, Maytanacin oder Maytansinolpropionat in der Kulturbrühe gezüchtet wird, worauf die erhaltenen Substanzen isoliert werden.

Es ist bekannt, dass die oben erwähnten Verbindungen aus Pflanzen erhalten werden können, doch handelt es sich hierbei um ganz spezifische Pflanzen, deren Wachstum lange dauert. Auch das Abschneiden, das Abschälen, das Abhacken, das Trocknen und das Pulverisieren der Pflanzen ist zeitaufwendig. Hinzu kommt das Extrahieren, das Trennen und das Reinigen. Somit handelt es sich um teure, langwierige Massnahmen bei äusserst geringer Ausbeute, Demgegenüber lassen sich die erfindungsgemässen Verfahren leicht und ohne Schwierigkeiten durch Züchten

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-¹J-

des Mikroorganismus durchführen, wobei man die gewünschten Verbindungen in grossen Mengen erzeugen kann.

Die vorliegende Erfindung stellt das erste Beispiel der Herstellung dieser Verbindungen als Metabolite von Mikroorganismen dar, wobei es sich um eine ausgezeichnete Methode für die Herstellung dieser Verbindungen handelt.

Als ein Beispiel eines im vorliegenden Verfahren verwendbaren Mikroorganismus sei der Actinomycetenstamm No. C-15003 erwähnt, welcher aus dem Boden oder anderen Proben isoliert wurde.

Die mikrobiologischen Eigenschaften des Stammes No. C-15003 wurden in analoger Weise, wie dies von Schirling & Gottlieb [International Journal of Systematic Bacteriology 16, 313-3¹IO (1966)] vorgeschlagen wurde, erforscht. Die Resultate dieser Beobachtungen bei 28 ⁰C in einer Zeitspanne von 21 Tagen finden sich nachfolgend.

1) Morphologische Eigenschaften

Das vegetative Mycel dehnt sich gut aus und entwickelt sich zu Verzweigungen und dies sowohl auf Agar als auch im flüssigen Medium, Manche der Hyphen haben einen Durchmesser von 0,8 bis 1,2 ^im und können sich in gewissen Fällen unter Bildung von Bruchstücken teilen, welche Stäbchenbakterien oder verzweigten kurzen Hyphen ähneln. Der

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Stamm zeigt ein gutes V/achstum auf verschiedenen taxonomischen Medien, wobei auf dem vegetativen Mycel sich ein Luftmycel anlagert. Häufig bilden sich auch coremiaähnliche Körper (50-200 χ 200 - 1000 ^m), auf welchen weiteres Luftmycel wächst. Manche der Luftmycele sind gewunden, wobei hin und wieder auch gerade oder weite spiralähnliche Konfigurationen auftreten können. Die mikroskopische Untersuchung von älteren Kulturen zeigt, dass nur in wenigen Fällen die conidienartigen Zellen in Ketten vorliegen, während die aus den Oberflächen solcher Kulturen erhaltenen Zellsuspensionen bei der Betrachtung unter dem Mikroskop verschiedentlich verlängerte, ellipsoidale (0,8-1,2 um χ 1,8-6,8 ^m) und ellipsoidale (0,8-1,2 ^im χ 1,0-2,0 ^im) Körper, welche Arthrosporen ähneln, enthielten.

Beobachtungen unter dem Elektronenmikroskop ergaben, dass diese Körper glatte Oberflächen haben.

2) Zellenzusammensetzung

Der Stamm wurde in einem modifizierten ISP No. 1-Medium während 66 bis 90 Stunden bei 28 ⁰C unter Schütteln gezüchtet, worauf man die Zellen sammelte und spülte. Nach der Methode von B. Becker et al. [Applied Microbiology 12, 421 (196¹I)] und der Methode nach M.P, Lechevalier [Journal of Laboratory and Clinical Medicine 71, 93¹J (1968)] wurden

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die so erhaltenen, ganzen Zellen auf ihren Gehalt an Diaminopimelinsäure und Zuckerzusammensetzung untersucht. Die Säure lag in der meso-Form vor, während Stellen beobachtet werden konnten, welche auf Galactose und Arabinose deuteten.

3) Eigenschaften auf taxonomischen Medien

Der Stamm zeigte ein verhältnismässig gutes Wachstum auf verschiedenen Medien, wobei das vegetative Mycel in den Anfangsphasen der Züchtung farblos bis blassgelb und in den letzteren Phasen hellgelblich-lohfarben bis gelblichlohfarben war. Der Stamm erzeugte lösliche Pigmente, welche in verschiedenen taxonomischen Medien gelb bis gelblichlohfarben waren. Das Luftmycel war pulvrig und zeigte im allgemeinen ein massiges Wachstum bei weisser bis gelber oder hellgelblichlohfarbener Färbung. Die Eigenschaften des Stammes in verschiedenen taxonomischen Medien finden sich in der folgenden Tabelle I.

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Tabelle I

Züchtungseigenschaften des Stammes No. C-15003 auf taxonomischen Medien

(A) Saccharosenitrat-Agar:

Wachstum (G): üppig, leuchtendmelonengelb (3 ia)

bis bernsteinlohfarben (3 Ic) , Bildung von coremiaähnlichen Gebilden Luftrnycel (AM) : spärlich, weiss

Lösliches Pigment (SP): keines oder blass gelblichlohfarben

(B) Glycerinnitrat-Agar:

G : massig, hellelfenbeinfarbig (2 ca) , Bildung von

coremiaähnlichen Gebilden
AM: massig, weiss
SP: kein

(C) Glucose-Asparagin-Agar:

G : massig, hellringelblumenfarbig (3 pa) bis leuch-

tendgelb (2 pa) .
AM: spärlich, weiss
SP: leuchtendgelb (2 pa)

(D) Glycerin-Asparagin-Agar:

G : massig, hellelfenbeinfarbig (2 ca) , Bildung von

coremiaähnlichen Körpern
AM: spärlich, weiss

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SP: kein

(E) Stärkeagar:

G : massig, hellelfenbeinfarbig (2 ca) bis hellv/eizenfarbig (2 ea) , Bildung von coremiaähnlichen Körpern

AM: reichlich, elfenbeinfarbig (2 ca) SP: kein

(F) Nähragar:

G.: massig, hellelfenbeinfarbig (2 ca) bis khakigelb (2 ga) , Bildung von coremiaähnlichen Körpern

AM: spärlich, weiss SP: kein

(G) Calciummaleat-Agar:

G : massig, hellelfenbeinfarbig (2 ca) bis hellweizenfarbig (2 ea) , Bildung von coremiaähnlichen

Körpern

AM: massig, weiss bis hellelfenbeinfarbig (2 ca) SP: kein

(H) Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar: G : massig, bernsteinfarbig (3 Ic) bis leuchtend gelb

(3 la) , Bildung von coremiaähnlichen Körpern AM: massig, weiss bis hellelfenbeinfarbig (2 ca) SP: kein

(I) Hafermehl-Agar: G : massig, hellelfenbeinfarbig (2 ca) bis khakigelb

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·· 10 -

■■Κ

(2 ga) , Bildung von coremiaähnlichen Körpern AM: spärlich, weiss bis hellgelb
SP: kein

(J) Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Agar:
G : massig, khakigelb (2 ga)

AM: kein

SP: khakigelb (2 ga)*
(K) Tyrosin-Agar:

G : massig, hellelfenbeinfarbig (2 ca) bis hellmelonengelb (3 ea) , Bildung von coremiaähnlichen Kör

pern

AM: massig, weiss bis hellelfenbeinfarbig (2 ca)

y
SP: kamelfarben (3 ie)

Farbcode nach "Color Harmony Manual", ^. Auflage (Container Corporation of America, 1958)

Ό Physiologische Eigenschaften

Die physiologischen Eigenschaften des Stammes finden sich in der folgenden Tabelle II. Der Temperaturbereich für das Wachstum lag bei 12 bis 38 ⁰C. Der Temperaturbereich, in welchem ein gutes Wachstum des Luftmycel auf Agar (ISP No. 2) eintrat, lag bei 20 bis 35 ⁰C.

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Tabelle II

Die physiologischen Eigenschaften des Stammes No. C-15003 waren die folgenden:

Temperaturbereich für das Wachstum: 12 bis 38 ⁰C Temperaturbereich für das Wachstum des Luft-

mycels:

Verflüssigung von Gelatine:

Hydrolyse von Stärke:

Reduktion von Nitraten:

Peptonisierung von Milch:

Coagulierung von Milch:

Zersetzung von Casein:

Herstellung von Melanoid-Pigmenten:

Zersetzung von Tyrosin: Zersetzung von Xanthin: Zersetzung von Hypoxanthin: Toleranz in bezug auf Lysozym: Toleranz in bezug auf Natriumchlorid:

20 bis 35 ⁰C positiv positiv positiv positiv negativ positiv

negativ (Pepton-Hefeextrakt- Eisen-Agar),

positiv (Tyrosin-Agar) positiv negativ negativ positiv 2 %

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5) Verwendung von verschiedenen Kohlenstoffquellen

Die Verwendung von verschiedenen Kohlenstoffquellen wurde unter Verwendung eines Mediums, wie es in Pridham und Gottlieb [Journal of Bacteriology £6, 107 (19^8)] beschrieben ist, und eines Grundmediums gleicher Zusammensetzung plus 0,1 % Hefeextrakt untersucht. Dabei liessen sich die in der folgenden Tabelle III wiedergegebenen Werte eruieren.

Tabelle III
Verwendung von Kohlenstoffquellen durch den Stamm N0.C-I5OO3

Kohlenstoffquelle Wachstum

D-Xylose + ++

L-Arabinose + +

D-Glucose ++ ++

D-Galactose + +

D-Fructose +++ ++

L-Rhamnose + +

D-Mannose -t++ ++

Saccharose ++ ++

Lactose - -

Maltose + +

Trehalose -t ++

Grundmedium bei Zusatz von 0,1 % Hefeextrakt

Kohlenstoffquellen

Raffinose Melibiose i-Inositol D-Sorbitol D-Mannitol Glycerin lösliche Stärke Blindversuch

Wachstum

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Anmerkung: +-fc-fc; üppiges Wachstum

+-+: gutes Wachstum

+: Wachstum

+: schlechtes Wachstum

-: kein Wachstum

6) Andere Eigenschaften

Die Zellen wurden nach der weiter oben unter 2) wiedergegebenen Methode gesammelt und DNA nach einer analogen Methode jener von J. Marmur et al. [Journal of Molecular Biology, ^» ²°8> !96l] hergestellt. Der G-C(Guanin-Cytosin)-Gehalt des DNA betrug ungefähr 71 Mol-55.

Die Gramfärbung des vegetativen Mycels dieses Stammes war positiv.

Die obigen Eigenschaften des Stammes No. C-15003 wurden mit den Angaben in S.A. Waksman's "The Actinomycetes" Bd. 2 [The Williams and Wilkins Co., 1961] ; R.E. Buchanan und N.E. Gibbons, "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Ausgabe, 197V; und anderen Literaturstellen verglichen.

Es wurde angenommen, dass dieser Stamm zur Gruppe III der Gattung Nocardia gehören würde. Es konnte aber unter den bekannten Stämmen keine Art gefunden werden, welche die beschriebenen Eigenschaften aufwies. Daraus ist zu schliessen, dass dieser Stamm eine neue Art von Mikroorganismen darstellt.

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Der besagte Stamm No. C-15003 ist beim "Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology (PERM)" unter der Nummer 3992, beim "Institute for Fermentation, Osaka, (IFO)" unter der Nummer IFO 13726 und bei "The American Type Culture Collection (ATCC), Maryland, U.S.A." unter der Nummer 31281 registriert worden.

Während der Stamm No. C-15003," wie soeben erwähnt, eine neue Art der Gattung Nocardia ist, kann er, wie dies Mikroorganismen im allgemeinen tun, Variationen und Mutationen eingehen, und dies entweder spontan oder unter dem Einfluss eines Mutagens. So sollten beispielsweise die verschiedenen Varianten des Stammes, welche durch Bestrahlung mit Röntgenstrahlen, γ-Strahlen, ultraviolettem Licht usw., durch Monozellen-Isolierung, durch Züchtung auf verschiedene Chemikalien enthaltenden Medien oder durch eine beliebige andere mutagene Behandlung erhältlich sind, sowie die Mutanten, die sich spontan aus dem Stamm ableiten, im wesentlichen nicht als Vertreter einer anderen bestimmten Art betrachtet werden. Irgendwelche solche Maytansinol, Maytanacin und Maytansinolpropionat zu bilden vermögende Varianten und Mutanten lassen sich für die Zwecke der vorliegenden Erfindung als Stamm No. C-15003 verwenden. So liefert beispielsweise der Stamm No. C-15003 durch verschiedene mutagene Behandlungen Mutanten, welche sozusagen

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keine löslichen Pigmente erzeugen, Mutanten mit Substratmycelien, v/elche farblos, gelblichgrün, rötlichlohfarben oder orangerot sind, Mutanten, deren Hyphen sich leicht in bazillenartige Elemente oder verzweigte, kurze Hyphen aufteilen lassen, und Mutanten mit reichlichen, weissen Luft· mycelien oder im wesentlichen ohne Luftmycelien.

Das für die Züchtung des Stammes, welcher Maytansinol, Maytanacin oder Maytansinolpropionat zu liefern vermag, verwendete Medium (nachstehend der Kürze wegen als "herstellbarer Stamm" bezeichnet) kann ein beliebiges flüssiges oder festes Medium sein, vorausgesetzt, dass es durch den Stamm verwertbare Nährstoffe enthält. Vorzugsweise wird man aber zur Erzielung einer hohen Produktion ein flüssiges Medium verwenden. Das Medium kann Kohlenstoff- und Stick- ^■5 stoff quellen, welche durch den Stamm No. C-15003 assimiliert und digeriert werden, anorganische Stoffe, Spurennährmittel usw. enthalten. Als Beispiele von in Frage kommenden Kohlenstoffquellen kann man Glucose, Lactose, Saccharose, Maltose, Dextrin, Stärke, Glycerin, Mannitol, Sorbitol usw., Fette und OeIe, z.B. Sojabohnenöl, Specköl, Hühneröl usw., und dergl. nennen. Als Stickstoffquellen seien beispielsweise Fleischextrakt, Hefeextrakt, getrocknete Hefe, Sojabohnenmehl, Maisquellflüssigkeit, Pepton, Casein, Baumwollsamenmehl, behandelte Melassen, Harnstoff, Ammoniumsalze, z.B. Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumnitrat, Ammonium-

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acetat usw., und dergl. verwendet werden. Das Medium kann ferner Natrium'-, Kalium-, Calcium-, Magnesiumsalze usv/., Eisen-·-, Magnesium-, Zink-, Kobalt-, Nickelsalze usw., Salze der Phosphorsäure, Borsäure usw. und organische SaI-ze, z.B. Acetate und Propionate, enthalten. Ferner kann das Medium zusätzlich verschiedene Aminosäuren, wie z.B. Glutaminsäure, Asparaginsäure, Alanin, Glycin, Lysin, Methionin, Prolin etc., Peptide,z.B. Dipeptide, Tripeptide etc., Vitamine, z.B. die Vitamine B,, B„, Nicotinsäure, ^B12' ^C> ^E etc., Nucleinsäuren, z.B. Purin, Pyrimidin und Derivate davon, enthalten. Zur Einstellung des pH-Wertes des Mediums kann man auch eine anorganische oder organische Säure, ein Alkali, ein Puffermittel oder dergl. verwenden. Geeignete Mengen an Oelen, Fetten, oberflächenaktiven Mitteln usw. können ebenfalls als schaumverhindernde Mittel zugesetzt werden.

Die Züchtung kann unter beliebigen stationären Bedingungen, unter Schütteln, unter submersen aeroben Bedingungen oder unter anderen Züchtungsbedingungen erfolgen.

Um eine hohe Ausbeute zu erhalten, wird man vorzugsweise eine submerse, aerobe Züchtung vornehmen. Die Züchtungsbedingungen hängen selbstverständlich vom Zustande und von der Zusammensetzung des Mediums, des Stammes, der Züchtungsmethode und anderen Faktoren ab. Normalerweise erfolgt sie bei 20 bis 35 ⁰C bei einem anfänglichen pH-Wert von ungefähr

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7,0. Vorzugsweise wird man als Züchtungstemperatur eine solche von 23 bis 30 ⁰C bei einem anfänglichen pH-Wert von 6,5 bis 7,5 -anwenden, Auch die Inkubationsdauer schwankt:. je nach den oben erwähnten Faktoren, wobei man die Inkubation so lange fortsetzt, bis der Titer des gewünschten antibiotischen Produktes einen Maximalwert erreicht hat. Im Falle von Schüttelkulturen oder aerob submersen Kulturen in einem flüssigen Medium liegt die normalerweise erforderliche Zeitdauer bei ungefähr 48 bis lV-1 Stunden.

Das Wirkungsvermögen des Antibiotikums wurde mit Tetrahyinena pyriformis W als Testorganismus getestet. Dabei wurde der oben erwähnte Mikroorganismus auf einem Testmedium [20 g Proteose-Pepton (Difco), 1 g Hefeextrakt (Difco), 2 g Glucose, 1000 ml destilliertem Wasser und 10 ml 1-inolarer Phosphatpuffer (pH 7,0)] bei 28 ⁰C während M bis U8 Stunden wachsen gelassen, worauf man das Wirkungsvermögen des Antibiotikums durch die Reihenverdünnungsmethode unter Beobachtung der Wachstumstrübunq und durch Dünnschichtchromatographie , abgekürzt TLC, nach den weiter unten beschriebenen Angaben bestimmt.

Maytanacin, Maytansinolpropionat oder Maytansinol wurde sowohl extrazellulär als auch intrazellulär in der erzielten Kulturbrühe erhalten und angereichert.

Keine dieser Substanzen zeigt eine eindeutige antibiotische Wirkung. Die Bestimmung erfolgte daher durch TLC und parallel dazu durch Nachweis der Wirkung gegen

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den Tetrahymenastamm. Die Ferniori'" ierungsbrühe wurde somit durch Filtrieren oder Zentrifü^Lecen in Zellen und Filtrat aufgeteilt und das Filtrat mit den gleichen Volumen Aethylacetat extrahiert. Dann wurde den Zellen die gleiche Menge an 70 %-igem wässrigen Aceton wie die Menge des Filtrates zugegeben, worauf man nach 1-ständigem Rühren bei 20 ⁰C die Suspension filtrierte. Das Aceton wurde aus dem Filtrat entfernt und das erhaltene wässrige Filtrat mit Aethylacetat extrahiert Jeder dieser Extrakte wurde im Volumehverhältnis 1:103 eingeengt und über einer Kieseigel-Glasplacte (Merck, Deutsche Bundesrepublik, Kieselgel 60 F^₁-,,. 0,25 min, 20 χ 20) (Lösungsmittelsystem: Chloroform und Methanol in einem Mischungsverhältnis von 9:1) der Dünnschicbtohromatographie unterworfen. Das Wirkungsvermögen wurde; auf Grund der Intensitat der bei Bestrahlung mit ultraviolettem Licht von 2537 A beobachteten Stellen bestimmt.

Das auf diese V/eise in der Kulturbrühe erzeugte Maytanacin, Maytansinolpropiona'. ocer Maytansinol ist lipophyl und neutral. Diese Substanzen lassen sich durch bei der Gewinnung solcher mikrobiellGi Metabolite normalerweise übliche Trenn- und Reinigung^nic-ihoden isolieren. So kann man beispielsweise so arbeiten, dass man sich die Unterschiede zwischen dem Antibiotikum und den Verunreinigungen bezüglich der Löslichkeit zu nutze macht. Man kann aber auch die fraktionierte Adsorptionsaffinität verschiedener

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- ip ,-

Adsorptionsmittel, wie z.B. Aktivkohle, makroporösen, nichtionogener Harze, Kieselgel, Aluminiumoxyd usw. zur Anwendung bringen. Ferner kann man auch die Verunreinigungen mit Hilfe von Ionenaustauschharzen beseitigen. Man kann aber schliesslich auch andere Methoden oder aber die vorgenannten Methoden in geeigneter Kombination oder aber wiederholt anwenden.

Da, wie oben erwähnt, Maytanacin, Maytansinolpropionat oder Maytansinol sowohl im Filtrat als auch in den Zellen vorhanden sind, wird man die Antibiotika mit Hilfe eines solchen Adsorptionsmittels, sofern ein solches verwendet wird, entweder direkt oder nach erfolgter Extraktion mit einem Lösungsmittel im Falle eines Filtrates oder nach erfolgter Extraktion mit einem Lösungsmittel im Falle von mikrobiellen Zellen trennen und reinigen. Die Extraktion mit einem Lösungsmittel kann nach einer beliebigen folgenden Methode oder mit Hilfe einer anderen Methode, beispielsweise (1) durch Lösungsmittelextraktion aus der Kulturbrühe vor dem Abtrennen der Zellen und (2) durch Lösungsmittelextraktion der Zellen und des durch Filtrieren gewonnenen Filtrates, Zentrifugieren oder in anderer Weise, durchgeführt werden. Um das Filtrat und die Zellen unabhängig voneinander zu extrahieren, wird man mit Vorteil die folgende Methode anwenden. Für die Extraktion des Filtrates geeignete Lösungsmittel sind mit Wasser nicht mischbare,

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organische Lösungsmittel, wie z.B, Fettsäureester, wie Aethylacetat oder Amylacetat, Alkohole, wie Butanol, halogenierte Kohlenwasserstoffe, wie Chloroform, und Ketone, z.B. Methylisobutylketon. Die Extraktion erfolgt bei einem dem neutralen pH-Wert nahen pH-Wert und vorzugsweise wird die zuvor auf einen pH-Wert von 7 eingestellte Kulturflüssigkeit mittels Aethylacetat extrahiert. Der Extrakt wird mit Wasser gewaschen und unter vermindertem Drück eingeengt. Hierauf wird das Konzentrat mit einem nichtpolaren Lösungsmittel, z.B. Petroläther oder Hexan, versetzt und das rohe Produkt I, welches die wirksame Verbindung enthält, gewonnen-Da bei der Dünnschichtchromatographie eine gewisse Zahl von Stellen festgestellt wurden, welche Maytanacin, Maytansinolpropionat oder Maytansinol nicht entsprechen, wird das Produkt I anschliessend den folgenden Reinigungsverfahren unterzogen. Dabei zeigt sich, dass eine routinemässige Reinigungsmethode, insbesondere die Adsorptionschromatographie, wertvoll ist, wobei für diesen Zweck eines der üblichen Adsorptionsmittel, wie Kieselgel, Aluminiumoxyd, ein makroporöses, nichtionogenes Adsorptionsharz usw., verwendet werden kann. Zur Reinigung des rohen Produktes I ist Kieselgel besonders wertvoll. Die Entwicklung kann beispielsweise, ausgehend von Petroläther und Hexan, erfolgen, während die Eluierung durch Zugabe eines polaren Lösungsmittels, wie Aethylacetat, Aceton, Aethanol oder Me-

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thanol, erfolgt. Gemäss einem typischen Verfahren verwendet man Kieselgel (Merck, Deutsche Bundesrepublik, 0,05 bis 0,2 mm) als Trägermittel und führt die Säulenchromatographie mit einer Mischung von Hexan und Aethylacetat durch, wobei der Hexananteil nacheinander zunimmt. Das Eluat wird gesammelt und durch TLC geprüft, wobei man die die wirksamen Bestandteile enthaltenden Fraktionen sammelt und unter vermindertem Druck einengt. Hierauf versetzt man das Konzentrat mit Petroläther oder Hexan, wodurch das rohe Produkt II erhalten wird. Da dieses Produkt immer noch Verunreinigungen enthält, wird es in der nachstehend beschriebenen Weise weiter gereinigt. So kann man das Produkt II beispielsweise mit Hilfe einer zweiten Kieselgelsäule unter Verwendung eines andersartigen Lösungsmittelsystems reinigen. Das für diesen Zweck verwendete Entwicklungssystem kann aus einem halogenierten Kohlenwasserstoff, z.B. Dichlormethan oder Chloroform, bei Zugabe eines polaren Lösungsmittels, wie einem Alkohol, z.B. Aethanol oder Methanol, einem Keton, z.B. Aceton oder Methyläthylketon, oder dergl. bestehen. Auf diese Weise lässt sich Maytanacin, Maytansinolpropionat oder Maytansinol isolieren. Die Reihenfolge der Lösungssysteme für diese erste und die zweite Kieselgelsäulen kann auch umgekehrt werden, wobei man überdies nötigenfalls auch übliche organische Lösungsmittel in Verbindung mit den obigen Systemen verwenden kann.

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Verwendet man für das Reinigen des rohen Produktes II ein makroporöses Adsorptionsharz, so erfolgt die Eluierung von Maytanacin, Maytansinolpropionat oder Maytansinol mit einer Mischung von Wasser mit einem niederen Alkohol, einem niederen Keton oder einem Ester. Als niederer Alkohol kann man beispielsv/eise Methanol, Aethanol, Propanol oder Butanol und als niederes Keton beispielsweise Aceton oder Methyläthylketon verwenden. Der Ester kann beispielsweise Aethylacetat sein. Gemäss einer typischen Ar- IQ beitsweise löst man das rohe Produkt II in 60 % wässrigem Methanol und adsorbiert auf einer Säule von Diaion HP-IO (Mitsubishi Kasei K.K.). Diese Säule wird anschließend mit 70 %-igem wässrigem Methanol gewaschen und mit 90 #-igem wässrigem Methanol eluiert. Auf diese Weise wird ,,- Maytanacin, Maytansinolpropionat oder Maytansinol aus der Säule eluiert.

Bei jeder der vorgenannten Methoden werden die die gewünschten Komponenten enthaltenden Fraktionen gesammelt und unter vermindertem Druck eingeengt. Dem getrockneten Produkt wird dann das 5- bis 8-fache Volumen Äthylacetat züge setzt und das Gemisch stehengelassen, worauf sich Kristalle von Maytanacin, Maytansinolpropionat oder Maytansinol ausscheiden. Enthalten die Kristalle Maytanacin und Maytansinolpropionat, so werden sie mit Hilfe eines Adsorptionsmittels beispielsweise der oben genannten Art voneinander getrennt.

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Verwendet man somit Kieselgel oder ein makroporöses, nichtionogenes Adsorptionsharz und die oben erwähnten Lösungsmittel, so können die gewünschten Verbindungen fraktioniert eluiert werden. Verwendet man beispielsweise Kieselgel, so erfolgt die Entwicklung mittels Hexan, Aethylacetat oder einer Mischung von Chloroform und Methanol, wodurch Maytansinolpropionat und Haytanacin in der erwähnten Reihenfolge erhalten werden. Nimmt man die Bildung dieser Substanzen durch Dünnschichtchromatographie wahr, so werden die Fraktionen unter vermindertem Druck eingeengt und Aethylacetat don Konzentraten zugegeben. Auf diese V/eise erhält man die entsprechenden Verbindungen in Form von Kristallen. Verwendet man ein makroporöses, nichtionogenes Adsorptionsharz, so kann man eine stufenmässige Eluierung mit schwankenden Verhältnissen an Alkohol, Keton oder Ester in bezug auf das Wasser anwenden. Bei Anwendung der stufenweisen Eluierungsmethode unter Verwendung von 60 #-igem wässrigem Methanol und 95 %-igem wässrigem Methanol unter Zugabe von 5 % Natriumchlorid erhält man in der vorgenannten Reihenfolge Maytanacin und Maytansinolpropionat. Nachdem man durch Dünnschichtchromatographie behandelt hat, wird jede Gruppe der aktiven Fraktionen unter vermindertem Druck

eingeengt und aus Aethylacetat zum Auskristallisieren gebracht. Die isolierten Kristalle enthalten Aethylacetat als Kristallisierungslösungsmittel und zeigen nach dem Trocl·

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nen über Phosphorpentoxyd während 8 Stunden bei 70 ⁰C die nachstehenden physikalischen und chemischen Eigenschaften, (Tabelle IV)

Tabelle IV

	Maytanacin C₃₀H₃₉ClN₂O₉	Maytansinol- propionat · C₃₁H₁₁₁ClN₂O₉	Maytansinol C₂₈H₃₇ClN₂O₈
Schmelz punkt. (⁰C)	235-236°	188-190°	172,5-174°
Spezifische Drehung	[a]g²°-121°4-10^O (c=0,25, CHCl₃)	[α]2²°-ΐ27°+10^Ο (c=0,35, CHCl₃)	[α]£²°-313^Ο±10° (c=0,22, CHCl )
Analyse Gef. : (JO	C 59,62 H 6,93 N 4,28 Cl 5,7²J	59,93 6,82 4,32 5,57	59,28 6,38 5,02 6,15
Analyse Ber. : (50	C 59,85 H 6,18 N 1» ,61 Cl 5,84	59,94 6,65 4,51 5,71	59,52 6,60 4,96 6,27
Ultraviolett- absorptoons- spektrum nm(£)	233(30330) 240(Sch.28240) 252(27850) 280(5680) 288(5660)	233(30240) 24O(Sch.28400) 252(27650) 280(5740) 288(5710)	232(32750) 244(Sch.30850) 252(31650) 281(5750) 288(5700) I

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	Maytanacin C₃₀H₃₉ClN₂O₉-	Maytansinol propionat C₃₁H₁₄₁ClN₂O₉	Maytansinol C₂₈H₃₇ClN₂O₈
Infrarot- ab sorptions- spektrum (cm"¹)	1710,1730,1670, I58O	17^JIO,173O,l67O 158O	1715,1670,1580
Massenspek trum (m/e)	5i5,185,170,150	559,485,470,150	503,485,170,450
sauer, neu tral oder alkalisch	lipophile und neutrale Sub stanz	lipophile und neutrale Sub stanz	lipophile und neutrale Sub stanz
Farbreak tionen	Dragendorff- reaktion: positiv Beilstein reaktion: positiv	Dragendorff- reaktion: positiv Beilstein reaktion : positiv	Dragendorff- reaktion: positiv Beilstein reaktion: positiv

Die oben genannten Daten in bezug auf die Elementaranalysen, spezifische Drehungen, Ultraviolettspektren, Infrarotspektren, Massenspektren usw. sind in Uebereinstimmung mit den Vierten für Maytanacin, Maytansinolpropionat und Maytansinol, wie sie aus Kupchan et al. ersichtlich sind. (The Journal of American Chemical Society 97., 5291 (1975).

Die folgenden Beispiele erläutern die vorliegende Erfindung, ohne sie einzuschränken. Die Teile sind jeweils Gew.-Teile, sofern nichts anderes ausgesagt wird. Das Ver-

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hältnis zwischen den Teilen und Vol.-Teilen entspricht jenen zwischen g und ml. Der Ausdruck "#" bezieht sich auf "Gew./VoI", sofern nichts anderes ausgesagt wird.

Beispiel 1

Maytansinol, Maytanacin und Maytansinolpropionat zu erzeugen vermögender Mikroorganismus Nocardia No.C-15003 (IFO 13726; FERM 3992; ATCC 31281), welcher auf einem Medium (Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar) gezüchtet worden war, wurde verwendet, um einen 200 Vol.-Teile fassenden Fermentierbehälter, welcher 40 Vol.-Teile eines Samenkulturmediums (2 % Glucose, 3 % lösliche Stärke, 1 % rohes Sojabohnenmehl, 1 % Maisquellflüssigkeit, 0,5 % Polypepton, 0,3 % NaCl, 0,5 % CaCO,, pH 7,0) enthielt, zu beimpfen. Das geimpfte Medium wurde während 48 Stunden bei 28 ⁰C inkubiert, um ein Inokulum zu erhalten. 0,5 Vol.-Teile des so erhaltenen Inokulums wurden in einen 200 Vol.-Teile fassenden Fermentierbehälter, welcher ^O Vol.-Teile eines Fermentiermediums enthielt, welches aus 5 % Dextrin, 3 % Maisquellflüssigkeit, 0,1 % Polypepton und 0,5 % Calciumcarbonat (pH 7,0) bestand, enthielt, eingebracht und während 90 Stunden bei 28 ⁰C gezüchtet, um auf diese Weise ein Inokulum (Samenkultur) zu erhalten.

Wie nach der Reihenverdünnungsmethode unter Verwendung von Tetrahymena pyriformis W als Testorganismus

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und Maytansinolpropionat als Standardprodukt festgestellt werden konnte, wies die obige Kultur einen Titer von 25 /ig/ml auf,

Beispiel 2

10 Vol."Teile des gemäss Beispiel 1 erhaltenen Inokulums (Impfmaterial) wurden einem 2000 Vol.-Teile fassenden Fermentierbehälter zugesetzt, welcher 500 Vol.-Teile eines Samenkulturmediums gleicher Zusammensetzung wie oben enthielt, worauf man während *l8 Stunden bei 28 ⁰C brütete. 500 Vol.-Teile der so erhaltenen Kultur wurden in einen 50.000 Vol.-Teile fassenden Tank aus rostfreiem Stahl eingetragen, welcher 30.000 Vol.-Teile Samenkulturmedium enthielt, worauf man die Züchtung unter Belüftung (30.000 VoI.-Teile/Minute) bei 28 ⁰C züchtete und bei einem Innendruck von 1 kg/cm bei 280 Umdrehungen pro Minute (1/2 DT) rührte, um auf diese Weise eine Samenkultur zu erhalten. Diese Kultur wurde zum Animpfen eines 200.000 Vol.-Teile enthaltenden Tanks aus rostfreiem Stahl verwendet, welcher 100.000 Vol.-Teile eines Fermentationsmediums ähnlicher Zusammensetzung wie im obigen Beispiel 1 enthielt, wobei eine Impfrate von 10 % eingehalten wurde. Das angeimpfte Medium wurde unter Belüftung (100.000 Vol.-Teile/

Minute) bei 28 ⁰C inkubiert und bei einem

Innendruck von 1 kg/cm während 90 Stunden bei 200 Umdrehun-

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gen pro Minute (1/2 DT) gerührt. Bei der Bestimmung des Titers in gleicher Weise wie in Beispiel 1 konnte man feststellen, dass die so erhaltene Kultur einen Titer von 25 Ug/ml aufwies.
90.000 Vol.-Teile der nach den obigen Angaben

erhaltenen Kultur wurden mit 2000 Teilen Hyflo-superceP-^ (Johnes and Manville Products, U.S.A.) versetzt und das Gemisch nach gründlichem Mischen über einem Druckfilter filtriert, wobei 85.000 Vol.-Teile Filtrat und 32000 Teile feuchte Zellen erhalten wurden. Das Filtrat (85.000 VoI.-Teile.) wurde gerührt und mit 30.000 Vol.-Teilen Aethylacetat extrahiert. Diese Massnahme wurde ein weiteres Kai wiederholt. Die Aethylacetatschichten wurden gesammelt, zweimal mit jeweils 30.000 Vol.-Teilen Wasser gewaschen, durch Zugabe von 500 Teilen wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck auf 200 Vol.-Teile eingeengt. Dann wurde das Konzentrat mit Petroläther versetzt und der entstandene Niederschlag durch Filtrieren gewonnen (53 Teile). Dieses rohe Produkt I wurde mit 100 Vol.-Teilen Aethylacetat verrührt, worauf die unlöslichen Bestandteile abfiltriert l^urden. Das Filtrat wurde mit 10 Teilen Kieselgel (Merck, Deutsche Bundesrepublik, 0,05 bis 0,2 mm) gerührt und das Aethylacetat unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde oben auf eine Kieselgelsäule (*J00 Vol.-Teile) zugegeben. Dann wurde mit 500 VoI,

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Teilen Hexan, 500 Vol.-Teilen einer Mischung von Hexan und Aethylacetat (Mischungsverhältnis 3:1), 500 Vol.-Teilen einer Mischung von Hexan und Aethylacetat (Mischungsverhältnis 1:1), 500 Vol.-Teilen einer Mischung von Hexan und Aethylacetat (Mischungsverhältnis 1:3), 500 Vol.-Teilen Aethylacetat, 1000 Vol.-Teilen einer Mischung von Aethylacetat und Methanol (Mischungsverhältnis 50:1) und 1000 VoL-Teilen einer Mischung von Aethylacetat und Methanol (Mischungsverhältnis 25:1) eluiert, wobei das Eluat in Fraktionen von 100 Vol.-Teilen gesammelt wurde.

, 1 VoI,-Teil einer jeden Fraktion wurde zur Trockne eingeengt, worauf man dem Konzentrat 0,1 Vol.-Teile Äthylacetat hinzugab. Dann wurde das Gemisch auf eine 2,5 cm über dem unteren Rand einer Kieselgel-Glasplatte (Merck, Bundesrepublik Deutschland, 60 F „j., 0,25 mm, 20 χ 20) liegende Stelle aufgebracht und in einer Länge von ungefähr 17 cm mit einem Lösungsmittelsystem aus Aethylacetat und Methanol (Mischungsverhältnis 19:1) entwickelt, Nach erfolgter Entwicklung wurde mit ultraviolettem Licht (2537A*) das gewünschte Produkt festgestellt.

Die aktiven Fraktionen No. 25-30 mit Rf 0,58-0,63 und die Fraktionen No. 38"4O mit Rf 0,25-0,30 wurden gesammelt und unter vermindertem Druck jeweils auf ungefähr 20 VoI,-Teile eingeengt. Diese Konzentrate wurden jeweils roit 150 Vol.-Teilen Petroläther versetzt, wobei man 5 Teile

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eines rohen Produktes II und 2 Teile rohes Maytansinol erhielt.

In 10 Vol.'-Teilen Aethylacetat wurden 0,5 Teile des nach den obigen Angaben erhaltenen rohen Produktes II gelöst und die Lösung gründlich mit H Teilen Kieselgel (Merck, Bundesrepublik Deutschland, 0,05 bis 0,2 mm) gerührt. Das Aethylacetat wurde unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde oben auf eine Säule von 300 VoI.-Teilen Kieselgel eingeführt und die Säule zuerst mit 500 Vol.-Teilen Chloroform gev/aschen und hierauf mit 500 Vol.-Teilen einer Mischung von Chloroform und Methanol (Mischungsverhältnis 50:1), 500 VoI,-Teilen einer Mischung von Chloroform und Methanol (Mischungsverhältnis 20:1) und 500 Vol.-Teilen einer Mischung von Chloroform und Methanol (10:1) eluiert. Diese Eluate wurden in Fraktionen von 25 Vol.-Teilen gesammelt.

Jeweils 0,5 Vol.-Teile einer jeden Fraktion wurden unter vermindertem Druck eingeengt. Das Konzentrat wurde mit 0,05 Vol.-Teilen Aethylacetat versetzt und das Gemisch der Dünnschichtchromatographie (Entwicklungssystem:

Mischung von Chloroform und Methanol im Mischungsverhältnis 9:1) unterworfen.

Die Fraktionen Nr. 40 und 41 in der Zone von

RF 0,48-0,50, welche bei 2537 8 absorbierten,wurden

gesammelt und unter vermindertem Druck zur Trockne einge-

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engt. Der Rückstand wurde hierauf mit 0,5 Vol.-Teilen Aethylacetat versetzt und das Gemisch stehen gelassen, worauf man 0,05 Teile Mischkristalle, bestehend aus Maytanacin und Maytansinolpropionat, erhielt.

0,05 Teile der soeben erwähnten Mischkristalle von Maytanacin ^und Maytansinolpropionat wurden in 5 VoI.-Teilen Methanol gelöst und dann mit 0,1 Teilen Natriumchlorid und 5 Vol.-Teilen V/asser versetzt. Eine mit 200 VoI.-Teilen Diaion HP-IO (Mitsubishi Kasei K.K.) beschickte

wässrigem Säule wurde mit 600 Vol.-Teilen 50 ?-igem/Methanol,

enthaltend 5 % Natriumchlorid, gewaschen. Die so hergestellte Lösung wurde durch eine Säule geführt und eine

Gradienten-Eluierung unter Verwendung von 1.500 Vol.-Teilen 60 5&-igem wässrigem Methanol enthaltend 5 % Natriumii?.^s s Pipern chlorid, und 1.500 Vol.-Teilen 95 /S-igem/Methanol durchgeführt. Das Eluat wurde in verschiedenen Fraktionen von jeweils 15 Vol.-Teilen gesammelt und jede Fraktion durch Dünnschichtchromatographie geprüft. Die Fraktionen 130 bis 135 enthielten Maytanacin und die Fraktionen I38 bis 1*12 Maytansinolpropionat.

Jede Gruppe der Fraktionen wurde eingeengt und durch Zugabe von 30 ml Wasser und 50 ml Aethylacetat gelöst. Die Lösung wurde in einem Scheidetrichter geschüttelt und die wässrige Schicht abgetrennt. Nach zweimaligem Waschen mit jeweils 30 ml Wasser wurde die Aethylacetat-

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- 52 -

schicht über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, eingeengt und stehen gelassen. Auf diese V/eise erhielt man in jeder Gruppe der Fraktionen Kristalle. Diese Kristalle wurden durch Filtrieren gesammelt und getrocknet. Auf diese Weise erhielt man 0,013 Teile Maytanacin und 0,025 Teile Maytansinolpropionat.

0,2 Teile des nach den obigen Angaben erhaltenen, rohen Maytansinols wurden in 3 Vol.-Teilen Aethylacetat gelöst und die Lösung gründlich mit 0,5 Teilen Kiesegel

LO (Merck, Bundesrepublik Deutschland, 0,05 bis 0,2 mm) gründlich gerührt. Das Aethylacetat wurde unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde obenauf eine Säule von 80 Vol.-Teilen Kiesegel eingebracht und die Säule zuerst mit 150 Vol.-Teilen Chloroform gewaschen und hierauf mit

L5 150 Vol.-Teilen einer Mischung von Chloroform und Methanoi (Mischungsverhältnis 50:1), I50 Vol.-Teilen einer Mischung von Chloroform und Methanol (Mischungsverhältnis 20:1) und 300 Vol.-Teilen einer Mischung von Chloroform und Methanol (Mischungsverhältnis 10:1) eluiert. Das Eluat wurde dann in Fraktionen von jeweils 10 Vol.-Teilen gesammelt.

0,5 Vol.-Teile einer jeden Fraktion wurden unter vermindertem Druck eingeengt, Das Konzentrat wurde hierauf mit 0,05 Vol.-Teilen Aethylacetat versetzt und das Gemisch in Form einer Probe der Dünnschichtchromatographie (Ent-

!5 wicklungssystem: Mischung von Chloroform und Methanol im

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Mischungsverhältnis von 9:1) unterworfen.

Die Fraktionen Nr. 50 bis 52 in der Zone von

Rf 0,33-0,38, welche bei 2.537 8 absorbierten, wurden gesammelt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Der-Rückstand wurde hierauf mit 0,5 Vol.-Teilen Aethylacetat versetzt und das Gemisch stehen gelassen, worauf man 0,020 Teile Maytansinol in Form von Kristallen erhielt.

Beispiel 3

32.000 Teile der gemäss Beispiel 2 erhaltenen.

Zellen wurden unter Rühren mit 50.000 Vol.-Teilen 70 $-igem wässrigem Aceton während 3 Stunden extrahiert und hierauf auf einem Druckfilter filtriert. Die«Extraktion mittels 50.000 Vol.-Teilen 70 #-igem wässrigem Aceton und die anschliessende Filtrierung wurden einmal mehr wiederholt.

Die Filtrate wurden gesammelt und das Aceton durch Einengen unter vermindertem Druck entfernt. Das entstandene, wässrige System wurde durch eine Säule von 5.000 Vol.-Teilen Diaion HF-IO (Mitsubishi Kasei K.K.) hindurchgeleitet. Die Säule wurde mit 20.000 Vol.-Teilen Wasser und 50 i?-igem

. wässrigem Methanol gewaschen und anschliessend mit 15.000 Vol.-Teilen 90 Ji-igem wässrigem Methanol eluiert. Das Eluat wurde unter vermindertem Druck auf 3.000 Vol.-Teile eingeengt und mit 3.000 Vol.-Teilen Wasser und 3.000 Vol.-Teilen

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- 3'i -

Aethylacetat geschüttelt, Diese Arbeitsweise wurde einmal mehr wiederholt. Die Aethylacetatschichten wurden vereinigt, mit Wasser gewaschen, durch Zugabe von wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck bis auf ein Volumen von 200 Teilen eingeengt. Dann wurde Petroläther hinzugegeben und der entstandene Niederschlag durch Filtrieren gesammelt, wobei man 28OTeile rohes Produkt I erhielt. Dieses Produkt wurde mittels einer Kieselgelsäule in ähnlicher V/eise wie in Beispiel 1 gereinigt, wobei man 1 ,o Teile rohes Produkt II und 0,5 Teile rohes Maytansinol erhielt.

Beispiel ¹J

1000 Vol.-Teile der Kultur gemäss Beispiel 2 wurden in einem Tank aus rostfreiem Stahl, welcher ein Fassungsvermögen von 200.000 VoI.-Teilen aufwies und 100.000 Vol.-Teile eines Samenkulturmediums enthielt, geimpft und das angeimpfte Medium unter Belüftung (100.000 Vol.-Teile/ Minute) und unter Rühren mit 200 Umdrehungen pro Minute während 48 Stunden bei 28 ⁰C bebrütet, um eine Samenkultur zu erhalten. Diese Samenkultur wurde in einen Tank aus rostfreiem Stahl mit einem Fassungsvermögen von 2.000.000 VoI.-Teilen, welcher 1.000.000 Vol.-Teile eines Fermentiermediums gleicher Zusammensetzung wie in Beispiel 1 enthielt, bei einer Transplantationsrate von 10 % eingetragen. Die Züchtung erfolgte unter Belüftung (1.000.000 Vol.-Teile/Mi-

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nuten) bei 28 ⁰C während 90 Stunden unter Rühren bei 120 Umdrehungen pro Minute (1/3 DT) und bei einem Innendruck

von 1 kg/cm·. Die so entstandene Kultur wies beim Testen gemäss der Methode nach Beispiel 1 einen Titer von 20 μg/ml auf. 900.000 Vol.-Teile der so erhaltenen Kulturflüssigkeit wurden mit 900.000 Vol.-Teilen Aceton versetzt und nach 1-stündigem Rühren mit 20.000 Teilen Hyflo-Supercel (Johnes & Manville, U.S.A.) versetzt. Dieses Gemisch wurde weiter gerührt und in einer Druckfiltermaschine filtriert.

1.700.000 Vol.-Teile des so erhaltenen Filtrates wurden mit 500.000 Vol.-Teilen Wasser versetzt und das Gemisch in einer Podbielniak-Vorrichtung (Podbielniak, Ine._} U.S.A.) mit 1.000.000 Vol.-Teilen Aethylacetat extrahiert. Die Aethylacetatschicht wurde mit Wasser gewaschen, durch Zugabe von wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingeengt. Das Konzentrat wurde mit Petroläther versetzt und der entstandene Miederschlag durch Filtrieren gewonnen und getrocknet. Auf diese Weise erhielt man 680 Teile des rohen Produktes I. Hierauf wurde dieses rohe Produkt nach den Angaben, wie sie in den Beispielen 2 und 3 gemacht worden sind, gereinigt. Auf diese Weise erhielt man 1,1 Teile Maytanacin, 2,2 Teile Maytansinolpropionat und 0,1 Teile Maytansinol.

S09&IO/06Ö9

Claims

-X- 27A6253 Patentansprüche

1) Verfahren zur Herstellung von Maytansinol,
Maytanacin oder Maytansinolpropionat, dadurch gekennzeichnet , dass man einen der Gattung Nocardia angehörenden Mi-

kroorganismus, welcher Maytansinol, Maytanacin oder Maytansinolpropionat zu erzeugen vermag, in einem Kulturmedium,
welches assimilierbare Kohlenstoffquellen und verdaubare
Stickstoffquellen enthält, so lange züchtet, bis Maytansinol, Maytanacin oder Maytansinolpropionat stark angereichert ist, worauf man die gewünschte Verbindung isoliert.

2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das erhaltene Produkt Maytansinol ist.

3) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das erhaltene Produkt Maytanacin ist.

4) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das erhaltene Produkt Maytansinolpropionat ist.

5) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus Nocardia No. C-15003 (ATCC
31281; IFO 13726; PERM 3992) ist.

6) Arzneimittel, gekennzeichnet durch einen Gehalt an wenigstens einer der nach Ansprachen 1 bis 5 hergestellten Verbindungen.

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