DE2754326C2

DE2754326C2 - Antibiotikum AM 2282, seine Herstellung und Arzneimittel

Info

Publication number: DE2754326C2
Application number: DE2754326A
Authority: DE
Inventors: Atsushi Hasuda Saitama Hiramo; Yuzuru Narita Chiaba Iwai; Satoshi Tokio Omura
Original assignee: KITASATO INSTITUTE TOKYO JP
Current assignee: KITASATO INSTITUTE TOKYO JP
Priority date: 1976-12-11
Filing date: 1977-12-06
Publication date: 1982-10-21
Also published as: CH634103A5; FR2373556A1; GB1542995A; JPS5753076B2; FR2373556B1; DE2754326A1; US4107297A; JPS5373501A

Description

Tabelle I

Dünnschichtchromatographie an Kieselgel und mit dem System Chloroform-Methanol (10:1 V/V) einen Wert von 0,55 ergeben, vereinigt und unter vermindertem Druck eindampft und das erhaltene Pulver aus einem Gemisch von Chloroform und Methanol (100 :2 V/V) umkristallisiert

3. Arzneimittel, gekennzeichnet durch einen Gehalt an dem Antibiotikum nach Anspruch 1.

10

Die Erfindung betrifft den in den Patentansprüchen

jeweils gekennzeichneten Gegenstand.

Das Antibiotikum AM-2282 zeigt antibiotische Wirkung gegenüber Hefen und Pilzen sowie überraschenderweise auch eine hypotensive Wirkung. Die Verbindung kann somit zur Bekämpfung verschiedener, durch Hefen und Pilze hervorgerufener Infektionen und zur Behandlung von Hochdruck eingesetzt werden. Die Eigenschaften des Antibiotikums AM-2282 sind verschieden von denen bekannter Antibiotika, wie Oxamicetin und U-24 544 und den Antibiotika der Ansamycin- gruppe.

Unter den verschiedenen, in Anspruch 1 aufgeführten Parametern wird das UV-Absorptionsspektrum in erster Linie zur Identifizierung der Verbindung verwendet. Verschiedene bekannte Antibiotika mit ähnlichen Eigenschaften, wie Oxamicetin (J. Antibiotics, Bd. 26 (1973), S. 752, 757 und 765) und U-24 544 (Appl. MicrobioL, Bd. 15(1967).S. 1142) haben ein UV-Absorptionsmaximum bei 280 bis 310 nm. Das UV-Maximum von Oxamicetin bei 305 nm liegt im alkalischen pH-Bereich bei 322 nm und im sauren pH-Bereich bei 316 nm. Außer dem Maximum bei 322 nm hat Oxamicetin im alkalischen pH-Bereich ein weiteres Maximum bei 265 nm. U-24 544 hat ein Absorptionsmaximum bei 303 nm, das im alkalischen pH-Bereich bei 331 nm liegt.

Das IR-Absorptionsspektrum von AM-2282 ist verschieden von dem des Oxamicetins und U-24 544. Daraus folgt, daß Oxamicetin und U-24 544 nicht identisch mit dem Antibiotikum AM-2282 sind.

Die Summenformel CmHmN₄O₃ für das Antibiotikum AM-2282 ergibt sich aus dem gefundenen Wert für das Massenspektrum m/e = 466,199 (ber. 466,200), ferner aus der Zahl von 25—27 Protonen im NMR-Spektrum und der Zahl von 26—28 Kohlenstoffatomen im ^l3C-NMR-Spektrum sowie den Werten der Elementaranalyse.

Das NMR-Spektrum des Antibiotikums AM-2282 zeigt bei 100 MHz in Dimethylsulfoxid-de Signale bei δ 1,55,2,30,3,23,2,9 ~ 3,3 und 7,5 - 8,5 ppm.

In Tabelle I ist die minimale Hemmkonzentration (MHK) des Antibiotikums AM-2282 gegenüber verschiedenen Bakterien und Pilzen zusammengestellt. Die Werte wurden nach der Agar-Verdünnungsmethode bestimmt.

Testkeim

MHK, γ/ml

Medium*)

Staphylococcus aureus FDA 209P >200 Bacillus subtilis PCI 219 >200 Sarcina lutea PCI 1001 Mycobacterium smegmatis ATCC 607

N N N N

l-orlset/unii

Testkeim

MHK, γ/ml

Medium*)

Escherichia coli N]JH
Pseudomonas aeruginosa P-3
Proteus vulgaris IFO 3167
Xanthomonas oryzae
Candida albicans
Candida pseudotropicalis
Saccharomyces sake
Aspergillus niger
Aspergillus brevipus
Aspergillus fumigalus
Trichophyton rubrum
Trichophyton mentagrophytes
Cryptococcus neoformans
Microsporum gipseum
Sclerotinia cinerea
Piricularia oryzae

>200
>200
>200
200
6,25
3,12
3,12
25
3,12
12,5
6.25
25
50

>100
0,78
0,78

N
N
N
N
P
P
P
P
P
P
P
P
P
P
P
P

*) N: Pepton 0,5% Gew./Vcl., Fleischextrakt 0,5% Gew./Vol.. Agar 1.2% Gew./Vol., pH 7,0. P: Kartoffelextrakt mil 1.0% Gew./Vol. Glucose und 1.2% Gew./Vol. Agar. pH 6,8.

Das Antibiotikum AM-2282 hat eine stärkere Wirkung gegenüber Pilzen als Tolypomycin Y; vgl. T. Kishi et al, The Journal of Antibiotics, Bd. 25 (1972), 11, insbes. Tab. 1. Seine Wirkung gegenüber verschiedenen Pilzen liegt in der gleichen Größenordnung wie bei Amphotericin A und B.

Die Bestimmung der blutdrucksenkenden Wirkung wurde folgendermaßen durchgeführt:

Weiblichen Ratten mit einem Körpergewicht von 200 bis 250 g, die zur Erzeugung von spontanem Hochdruck unter bestimmten Bedingungen gezüchtet wurden, wird das Hydrochlorid von AM-2282 oral in den in Tabelle Il angegebenen Dosen gegeben. Im Verlauf von 1,3 und 5 Stunden nach Verabreichung der Verbindung wird in der Schwanzarterie der systolische Blutdruck bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle Il zusammengefaßt.

Tabelle II	Dosis,	Ausmaß des	Hochdrucks	(%) nach
	mg/kg	1 Std.	3 Std.	5 Std.
	r0,16 ^L0.16	-2 2	1 2	1 2
	1-0,3 ^L0,3	6	13	12
	rO,63	17	23	11
Hydrochiorid	L0.63	13	13	25
von AM-2282	[-1.25	17	24	24
	Ll,25	15	23	31
	100	18	25	39
		7	13	13
a-Methyl-DOPA

Aus der Tabelle ist ersichtlich, daß bei einer Dosis von mg/kg eine hypotensive Wirkung eintritt.

Weitere Versuche an Ratten haben ergeben, daß die Verbindung zur Bekämpfung von Ödemen und Ulcus geeignet ist. Die minimale wirksame Konzentration beträgt 1,0 mg/kg.

Die akute Toxizität von AM-2282 bei intraperitonealer Verabreichung an Mäuse, berechnet nach der Methode von Behrens und Kärber, beträgt 6,6 mg/kg.

Das Antibiotikum AM-2282 wird erfindungsgemäß durch aerobe Züchtung von Streptomyces sp. FERM-P 3725 gebildet und unter bestimmten Bedingungen aus der Gärmaische gewonnen (vgl. Patentanspruch 2). Dieser Mikroorganismus gehört zur Art Streptomyces staurosporeus. Dieser Stamm hat folgende Eigenschaften:

1. Morphologische Eigenschaften

Auf Malzagar-Medium bildet sich Substi atmycel mit einfacher Verzweigung. Auf Malzagar-Medium, ausgenommen verschiedene synthetische Medien, bildet sich ein Luftmycel. Die Sporenkettenmorphologie wird zur Sektion Rechiflexibiles gerechnet. Sporangien und begeiselte Sporen werden nicht beobachtet. Die Sporen sind zylindrisch oder länglich mit den Abmessungen 0,4 bis 0,6 μπι · 1,8 bis 2,4 μιη, mit glatter Oberfläche. Auf einigen organischen Agarmedien, wie Hefe-Malzagar, werden sclerotische Granulate gebildet, deren Durchmesser 10 bis 30 μπι beträgt.

2. Kulturcharakteristika in verschiedenen Medien

In Tabelle 111 sind die Kulturcharakteristika nach 10-bis 14tägiger Züchtung bei 27^CC zusammengestellt. Die Farbwerte wurden durch Vergleich mit dem Color

Harmony Manual (Container Corporation of America, Chicago, 1958) bestimmt. Tabelle III

Nährmedium

Wachst u in

Unterseite Luftmyccl

Bildung von löslichem Pigment

Sucrose-Nitrat-Agar
Glucose-Nitrat-Agar

Glycerin-Calciummalat-Agar
Glucosa-Asparagin-Agar (ISP)
Glycerin-Asparagin-Agar (ISP)
anorganische Salze-Stärke-Agar (ISP)
Tyrosin-Agar (ISP)

Nähragar

Glucose-Peton-Agar

Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar (ISP)

Hafermehl-Agar
(ISP)

Pepton-Hefe-Extrakt-Eisen-Agar (ISP)
Trypton-Hefe-Extraktbrühe (ISP)

gut,

melonengelb (3ga) gut, gerunzelt, melonengelb (3ga)

gut, hellmelonen-

gelb (3ea)

gut, aprikosen-

farben (4ga)

gut, hellmelonen-

gelb (3ea)

gut, hellmelonen-

gelb (3ea)

gut, hellmelonen-

gelb (3ea)

gut, bambusfarben

(2fb)

mäßig, gerunzelt, hellmaisgelb (2ea) gut, bernsteinfarben (3pc)

gut, hellmelonengelb (3ea) gut, elfenbeinfarben (2db) Oberflächenwachstum hellelfenbein (2ca)

hellmelonengelb

(3ea)

hellmelonengelb

(3ea)

rosa (3ca)

hellaprikosenfarben (4ea) hellmelonengelb (3ea)

rosa bis hellgelb (3gc)

hellelfenbeinfarben (2ca) maisgelb (2hb)

melonengelb (3ga)

melonengelb (3ia)

hellmelonengelb (3ea) maisgelb (2hb) schlecht, samtartig, hellmelonengelb (3ea) schlecht, samtartig, hellmelonengelb (3ea) mäßig, samtartig, rosa (3ca)
mäßig, samtartig, rosa (4ca)
mäßig, samtartig, weiß

kräftig, samtartig, weiß bis rosa (3ca) mäßig, samtartig, rosa (3ca)
gering, samtartig, elfenbeinfarben (2cb) bis rosa (3ca) mäßig, samtartig, rosa (4ca)
mäßig, samtartig, weiß bis perlfarben (3ba)

mäßig, samtartig, weiß bis rosa (3ca)

hellelfenbeinfarben (2ca)

hellmelonengelb (3ea) hellmelonengelb (3ea)

bambusfarben (2fb)

gelb (2ga)

ISP: Vom International Streptomyces if oject empfohlenes Nährmedium.

3. Physiologische Eigenschaften

1) Wachstumstemperaturbereich:

2) Bildung von melanoiden Pigmenten:

3) Gelatineverflüssigung:

4) Stärkehydrolyse:

5) Coagulierung von Magermilch:

6) Peptonisierung von Magermilch:

7) Schwefelwasserstoffbildung: S) Bildung voii Sälpcir

9) Hydrolyse von Cellulose:

■Mger Säure:

4. Verwertung von Kohlenstoffquellen im Pridham-Gottlief-Medium

Verwertbar:

D-Glucose, L-Arabinose, Saccharose, L-Inosit und

D-Mannit;
Mehr oder weniger verwertbar:

D-Fructose, D-Xylose, L-Rhamnose und Cellulose.

Die morphologischen und physiologischen Eigenschaften des Stammes FERM-P 3725 lassen sich wie folgt zusammenfassen:
Die Kultur ist von braunstichig-weißer bis hellgelbstibis 40⁰C (Hefeextrakt-Malzagar-Medium) negativ (Trypton-Hefeextrakt, Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Agar, Tyrosin-Agar) positiv

positiv

vermutlich positiv

positiv

negativ

vermutlich positiv.

chig-oranger oder rotstichig-gelber Farbe. Die Farbe des Luftmycels ist je nach den Agarmedien weiß, gelb oder rosa. Auf Pepton-Hefe-Eisen-Agar, Tyrosin-Agar ■ und Trypton-Hefebrühe werden keine melanoiden Pigmente gebildet Beim Vergleich dieser Eigenschaften mit denen der bekannten Stämme von Streptomyces, die in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Auflage und in anderen Veröffentlichungen beschrieben sind, besteht Obereinstimmung mit folgenden fünf Arten:

Streptomyces Toseofulvus Pridham et aL 1958, Streptomyces pluricolorescens Okami ans Umezawa 1961,

Streptomyces moderatur Reusser 1967, Streptomyces baarnensis Pridham et al. 1958 und Streptomyces tolypophorus Shibata et al. 1971.

Diese Stämme unterscheiden sich jedoch vom Stamm AM-2282 hinsichtlich folgender morphologischer und physiologischer Eigenschaften.

Die Sporen von S. roseofulvus haben eine Größe von etwa 1 Mikron und in Hefeextrakt-Malzextrakl-Agar, Hafermehl-Agar und anorganische Salze-Stärke-Agar wird ein hellgraustichig-gelbes oder hellbraunstichiggraues Pigment gebildet. Dieser Stamm verwertet D-Xylose, D-Fructose und Rhamnose. Die Sporen von S. pluricolorescens sind ebenfalls kurz (etwa 1 Mikron) und die Unterseite der Kolonie ist von graustichig-gelber oder gelbstichig-brauner Farbe auf Hefe-Malz-Agar, Hafermehl·Agar, anorganische Salz-Stärke-Agar und Glycerin-Asparagin-Agar. Das Luftmycel von S. moderatus ist auf Hefe-Malz-Agar, Hafermehl-Agar und anorganische Salze-Stärke-Agar graustichig-gelbrosa, und es bildet ein purpurfarbenes lösliches Pigment. S. baarnensis und S. tolypophorus haben ähnlich wie Streptomyces sp. FERM-P 3725 lange Sporen. S. baarnensis bildet jedoch ein spärliches Luftmycel, seine Farbe ist auf verschiedenen organischen Medien weiß bis grau und die Unterseite der Kolonie ist hellelfenbeinfarben. S. tolypophorus bildet spärliches Luftmycel von weißer Farbe, und die Unterseite der Kolonie bildet kein erkennbares Pigment auf anorganische Salze-Stärke-Agar und es bildet ein orange-gelbes Pigment auf Glycerin-Calciummalat-Agar. Der Stamm verwertet Fructose, Xylose und Rhamnose als Kohlenstoff quelle.

Aufgrund der vorstehend angegebenen Eigenschaften kann man schließen, daß der Stamm FERM-P 3725 eine neue Art von Streptomyces ist, für die der Name Streptomyces staurosporeus nov. sp. vorgeschlagen wird. Der Stamm wurde als Streptomyces sp. beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Chiba-ken, Japan, unter der Hinterlegungsbezeichnung FERM-P 3725 hinterlegt. Der Stamm FERM-P 3725 bildet das Antibiotikum AM-2282 sowohl intraceiluiär als auch extracellular.

Im erfindungsgemäßen Verfahren kann jedes synthetische oder organische Nährmedium verwendet werden, das Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie anorganische Salze enthält Gegebenenfalls können dem Nährmedium noch andere übliche Nährstoffe zur Züchtung von Mikroorganismen der Gattung Streptomyces einverleibt werden.

Als Kohlenstoffquelle kommen verschiedene Substanzen in Frage, die assimilierbaren Kohlenstoff enthalten. Günstige Kohlenstoffqueüen sind Glucose, Maltose, Lactose, Saccharose, Stärke, Extrin, Glycerin und Melasse.

Als Stickstoffquellen kommen verschiedene Substanzen in Frage, die assimilierbaren Stickstoff enthalten. Zweckmäßige Stickstoffquellen sind Sojabohnenmehl, Maisquellwasser, Baumwollsamenkuchen, Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Hefe, Caseinhydrolysat, Ammoniumsalze und Salze der Salpetersäure.

Beispiele für verwendbare anorganische Salze sind Phosphate und Sulfate von Calcium, Natrium, Eisen und Mangan.

Zur Produktion großer Mengen an Antibiotikum AM-2282 wird die Züchtung am besten in einem flüssigen Nährboden durchgeführt, doch können auch feste Nährböden verwendet werden. Vorzugsweise hat das Einsaatmedium die gleiche Zusammensetzung wie das Hauptfermentationsmedium. Die Einsaatkultur wird zweckmäßig durch 24- bis 48stündige Züchtung unter aeroben Bedingungen bei Temperaturen von etwa 27⁰C unter Verwendung eines Sakaguchi-Kolbens hergestellt. Die Hauptfermentation wird am besten 50 bis 120 Stunden unter aeroben Bedingungen und unter Schütteln bei Temperaturen von 15 bis 4O⁰C, insbesondere 25 bis 30⁰C, und bei einem pH-Wert von 6 bis 10, insbesondere 6 bis 7, durchgeführt. Nach beendeter

ίο Züchtung hat sich eine große Menge Antibiotikum AM-2282 in der Gärmaische und den Zellen angesammelt. Das Antibiotikum wird in an sich bekannter Weise aus der Gärmaische und den Zellen isoliert. Beispielsweise werden die Zellen von der Flüssigkeit durch Filtration getrennt. Das Antibiotikum kann auch unmittelbar aus der Gärmaische isoliert werden, da es lipoidlöslich ist. Zu diesem Zweck wird die Gärmaische einer Lösungsmittelextration unterworfen.

Ein bevorzugtes Verfahren zur Isolierung und Reinigung des Antibiotikums aus der Gärmaische wird nachstehend erläutert.

Die Gärmaische wird mit wäßriger Ammoniaklösung auf einen pH-Wert von etwa 10 eingestellt und sodann mit n-Butylacetat, extrahiert. Der erhaltene Extrakt wird unter vermindertem Druck stark eingeengt und sodann mit 0,1 η-Salzsäure versetzt Die wäßrige Phase wird hierauf mit wäßriger Ammoniaklösung auf einen pH-Wert von 10 eingestellt und mit Äthylacetat extrahiert Der erhaltene Extrakt wird unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Sodann wird der Rückstand an Kieselgel mit einem Gemisch von Chloroform und Methanol (60 :1 V/V) Chromatographien. Die das Antibiotikum enthaltenden Fraktionen, die eine positive Dragendorff-Reaktion zeigen, und deren RrWert bei der Dünnschichtchromatographie an Kieselgel und mit dem System Chloroform-Methanol (10:1 V/V) einen Wert von 0,55 ergeben, werden vereinigt und unter vermindertem Druck eingedampft. Das erhaltene gelbliche Pulver wird aus einem Gemisch von Chloroform und Methanol (100 :2 V/V) umkristallisiert Das Antibiotikum AM-2282 kristallisiert in hellgelben Nadeln aus.

Die Bestimmung des Antibiotikums erfolgt durch den Präcipitationstest mit Dragendorff-Reagens und die Messung der Absorption bei 292 nm.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

so In einen Sakaguchi-Kolben werden 500 ml eines Nährmediums (pH 7,0) mit 2,0 Gewichtsprozent/Volumen Glucose, 0,5 Gewichtsprozent/Volumen Pepton, 0,5 Gewichtsprozent/Volumen Fleischextrakt, 0,3 Gewichtsprozent/Volumen Trockenhefe, 0,5 Gewichtsprozent/Volumen Natriumchlorid und 03 Gewichtsprozent/Volumen Calciumcarbonat vorgelegt Das Nährmedium wird 15 Minuten bei 120⁰C sterilisiert Sodann wird aus einer Schrägkultur mit einer Platinöse Streptomyces sp. FERM-P 3725 in das Nährmedium überimpft und 48 Stunden auf einer Drehschüttelmaschine bei 110 U/min und 27° C gezüchtet

Die erhaltene Einsaatkultur wird in 20 Liter eines Produktionsmediums (pH 7,0), das 2,0 Gewichtsprozent/ Volumen Stärke, 1,0 Gewichtsprozent/Volumen Glucose, 0,5 Gewichtsprozent/Volumen Pepton, 0,5 Gewichtsprozent/Volumen Hefeextrakt und 0,4 Gewichtsprozent/Volumen Calciumcarbonat enthält, in einen 30 Liter fassenden Fermenter überimpft Die Fermentation

230242/399

wird 75 Stunden unter Schütteln (250 U/min) bei 27"C und einer Belüftungsgeschwindigkeit von 10 Liter/min durchgeführt. Nach beendeter Züchtung wird die Gärmaische (17 Liter) mit wäßriger Ammoniaklösung auf einen pH-Wert von 10 eingestellt, mit 8 Liter n-Butylacetat versetzt und 30 bis 60 Minuten bei Raumtemperatur ausgeschüttelt. Sodann wird der n-Butylacetatextrakt abgetrennt und in 2 Liter 1 η-Salzsäure gegossen. Die wäßrige Phase wird abgetrennt, mit 28prozentiger wäßriger Ammoniaklösung auf einen pH-Wert von 10 eingestellt und zweimal mit jeweils 1 Liter Ethylacetat extrahiert. Der Ethylacetatextrakt wird unter vermindertem Druck eingedampft. Es hinterbleiben etwa 1,3 g eines bräunlich gefärbten Rückstands, der mit 50 ml Diethylether zur Abtrennung fettartiger Verunreinigungen gewaschen wird. Die getrocknete Substanz wird sodann auf eine mit 12 g Kieselgel 60 gefüllte Säule aufgesetzt und mit 400 ml eines Gemisches von Chloroform und Methanol (60:1 V/V) entwickelt. Das Eluat wird in Fraktionen von jeweils 2,5 ml unterteilt. Jede Fraktion wird mittels Dragendorff-Reagens und dünnschichtchromatographisch an 0,3 mm Kieselgel G mit dem Lösungmittelsystem Chloroform-Methanol (10:1 V/V) untersucht. Die Fraktionen Nr. 61 bis 140 werden als aktive Fraktionen vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Es hinterbleiben 170 mg eines gelben Pulvers. Das Pulver wird in 7 ml eines Gemisches von Chloroform und Methanol (98:2 V/V) gelöst und 15 Stunden im Kühlschrank stehengelassen. Die Kristalle werden abfiltriert. Es werden 110 mg hellgelbe Nadeln in einer Reinheit von oberhalb 99% erhalten. Diese Nadeln haben die vorstehend angegebenen Eigenschaften.

50 mg der erhaltenen hellgelben Nadeln werden in Chloroform gelöst. In die Chloroformlösung wird gasförmiger Chlorwasserstoff eingeleitet. Nach dem Aufarbeiten werden 42 mg des Antibiotikums AM-2282

10

Beispiel 2

Gemäß Beispiel 1 wird eine Einsaatkultur von Streptomyces sp. FERM-P 3725 hergestellt. 600 ml der

erhaltenen Einsaatkultur werden gemäß Beispiel 1 in 70 Liter eines Produktionsmediums in einen 100 Liter fassenden Fermenter überimpft. Die Fermentation wird 68 Stunden bei 27°C unter Schütteln (200 U/min) und einer Belüftungsgeschwindigkeit von 30 Liter/min

to durchgeführt Nach beendeter Fermentation wird die Gärmaische (63 Liter) mit 28prozentiger wäßriger Ammoniaklösung auf einen pH-Wert von 10 eingestellt und mit 30 Liter n-Butylacetat extrahiert. Der n-Butylacetatextrakt wird abgetrennt und in 8 Liter 0,1 η-Salzsäure gegossen. Die wäßrige Phase wird mit 28prozentiger wäßriger Ammoniaklösung auf einen pH-Wert von 10 eingestellt und erneut zweimal mit jeweils 4 Liter Ethylacetat extrahiert.

Der Ethylacetatextrakt wird unter vermindertem Druck eingedampft. Es werden 1,4 g eines bräunlichen Rückstandes erhalten, der mit 100 ml Diethylether zur Abtrennung fettartiger Verunreinigungen gewaschen wird. Die getrocknete Substanz wird gemäß Beispiel 1 chromatographisch gereinigt. Es werden Fraktionen von jeweils 15 ml aufgefangen. Die Fraktionen 41 bis 80 enthalten das Antibiotikum, und sie ergeben eine positive Dragendorff-Reaktion und bei der Dünnschichtchromatographie gemäß Beispiel 1 wird ein RrWert von 0,55 erhalten.

Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und unter vermindertem Druck eingedampft. Es werden 520 mg eines gelben Pulvers erhalten, das in einer geringen Menge Chloroform gelöst und 15 Stunden im Kühlschrank stehengelassen wird. Die entstandenen Kristal-Ie werden abfiltriert. Es werden 370 mg des Antibiotikums AM-2282 in hellgelben Nadeln und mit einer Reinheit von mehr als 99% erhalten. Das Produkt hat die gleichen Eigenschaften wie das in Beispiel 1 hergestellte Produkt

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansorüche:

1. Antibiotikum AM-2282, gekennzeichnet durch folgende Parameter:

a) Elementaranalyse gef.: C 70,03%, H 6,03%, N 11,21%;

b) Molekulargewicht, bestimmt durch Massenspektroskopie (m/e): 466;

c) Summenformel: CmH₂SN₄O₃;

d) spezifischer Drehwert: [λ] I⁵= +35,0 (c = 1,0 in Methanol);

e) Schmelzpunkt: kein scharfer Schmelzpunkt die Verbindung färbt sich bei 208⁰C braun und verwandelt sich bei 260⁰C in ein teeriges Produkt;

f) UV-Absorptionsspektrum _vFig. 1):

λ™,^3θΗΐ"" (EIL): 243 (537), 267 (Schulter 552), 292 (1228), 322 (Schulter 537), 335 (313), 356 (220), 372 (254); die Maxima werden weder im alkalischen noch im sauren pH-Bereich verschoben;

g) IR-Absorptionsspektrum (Fig.2) als Kaliumbromid-Preßling: 3450 cm-' (Amin- und Hydroxy-Gruppen), 2960 cm-' (Methyl- und Methylengruppen), 1675 cm-' (Carbonyl- und Doppelbindungs-Gruppen), 1588, 1460, 1356, 1322, 1285,1230,1123 und 752 cm- ·;

h) Farbreaktionen: positive Dragendorff-, Molisch-, Rydon-Smith- und Ninhydrin-Reaktion; negative Beilstein-, Eisen(l I I)-chlorid- und Anilinphthalat-Reaktion;

i) Löslichkeit in verschiedenen Lösungsmitteln: löslich in Dimethylsulfoxid und Dimethylformamid; schwer, löslich in Chloroform, Äthylacetat, n-Butylacetat und Methanol; unlöslich in Petroläiher, η Hexan und Wasser;

k) RrWerte bei der Dünnschichtchromatographie an Kieselgel (Kieselgel G, 0,3 mm): Chloroform-Methanol (10:1 V/V)O,55 Benzol-Aceton (1:2 V/V)0,43 n-Butanol-Essigsäure-Wasser (8:1: 0,5 V/V)O,24.

2. Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces sp. FERM-P 3725 unter aeroben Bedingungen züchtet, aus der Gärmaische das Antibiotikum bei einem pH-Wert von etwa 10 mit n-Butylacetat extrahiert, den erhaltenen Extrakt stark einengt und sodann mit 0,1 n-Salzsäure versetzt, die wäßrige Phase hierauf mit wäßriger Ammoniaklösung auf den pH-Wert 10 einstellt und mit Äthylacetat extrahiert, den erhaltenen Extrakt unter vermindertem Druck zur Trockene eindampft, den Rückstand an Kieselgel mit einem Gemisch von Chloroform und Methanol (60 :1 V/V) chromatographiert, die Fraktionen, die eine positive Dragendorff-Reaktion zeigen und deren R/-Wert bei der