DE3048421C2

DE3048421C2 - Antibiotische Substanz, Verfahren zu deren Herstellung und antimykotisches Mittel, welches diese enthält

Info

Publication number: DE3048421C2
Application number: DE3048421A
Authority: DE
Inventors: Norio Ezaki; Shigeharu Yokohama Kanagawa Inouye; Tatsuo Isehara Kanagawa Ito; Michio Tokyo Kojima; Tomizo Yokohama Kanagawa Niwa; Takashi Shomura
Original assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Current assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Priority date: 1979-12-24
Filing date: 1980-12-22
Publication date: 1983-03-24
Also published as: FR2472611B1; DE3048421A1; GB2066816B; GB2066816A; IT8050448A0; JPS5690099A; IT8050448A1; IT1188979B; US4376778A; FR2472611A1; MX6925E; JPS6220984B2

Description

Cl

NO₂

und dadurch erhältlich, daß man Streptomyces sp. ATCC 31 673 in einem Medium, das Nährstoffe enthält, die durch bekannte Mikroorganismen assimilierbar sind, 2 bis 7 Tage bei 25 bis 34° C kultiviert, dann einerseits die filtrierte Kulturbrühe mit Ethylacetat extrahiert, andererseits die Feststoffe der Kulturbrühe mit Aceton oder Methanol extrahiert, das Aceton oder Methanol abdampft und den Rückstand mit Ethylacetat extrahiert, die Ethylacetatextrakte kombiniert, das Ethylacetat abdampft, den so erhaltenen öligen Rückstand mit n-Hexan reinigt, den gereinigten Rückstand in Methanol löst, säulenchromatographisch auftrennt, das erhaltene Isolat in Methanol löst und auskristallisiert.

2. Verfahren zur Herstellung der SF-2080A-Substanz gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces sp. ATCC 31 673 in einem Nährmedium, das Nährstoffe enthält, die durch bekannte Mikroorganismen assimilierbar sind, 2 bis 7 Tage bei 25 bis 34° C kultiviert, dann einerseits die filtrierte Kulturbrühe mit Ethylacetat extrahiert, andererseits die Feststoffe der Kulturbrühe mit Aceton oder Methanol extrahiert, das Aceton oder Methanol abdampft und den Rückstand mit Ethylacetat extrahiert, die Ethylacetatextrakte kombiniert, das Ethylacetat abdampft, den so erhaltenen öligen Rückstand mit η-Hexan reinigt, den gereinigten Rückstand in Methanol löst, säulenchromatographisch auftrennt, das erhaltene Isolat in Methanol löst und auskristallisiert

3. Antimykotisches Mittel, enthaltend als aktive Komponente die SF-2080A-Substanz gemäß Anspruch 1.

50 Es ist bekannt, daß zahlreiche Mikroorganismen, z. B. solche vom Genus Streptomyces bei der Kultivierung in einem Nährmedium mit assimilierbaren Kohlenstoff- und Stickstoffquellen Antibiotika erzeugen können. Es besteht ein ständiger Bedarf für neue und brauchbare antibiotische Substanzen.

Erfindungsgemäß wird ein neues Antibiotikum gezeigt, das als SF-2080A-Substanz bezeichnet wird, sowie ein Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung in antimykotischen Mitteln (vgl. die Patentansprüche 1,2 und 3).

F i g. 1 ist ein Ultraviolettabsorptionsspektrum der SF-2080A-Substanz, gemessen bei einer Konzentration von 10 mcg/ml (Mikrogramm/Milliliter) in (I) Methanol, (II) saurem Methanol (d.h. in 0,01 N HCl-Methanollösung) und (III) alkalischem Methanol (d.h. in 0,01 N NaOH-Methanollösung);

Fig. 2 zeigt ein Infrarotabsorptionsspektrum der SF-2080A-Substanz, gemessen auf einer Kaliumbromidtablette;

Der Stamm für die Bildung des Antibiotikums SF-2080A, wie er bei der Erfindung verwendet wird, ist Streptomyces sp. SF-2080, der aus einer Bodenprobe des Flußbettes des River Chikuma in Nagano-City, Nagano-Prefecture, Japan gesammelt wurde.

Die Eigenschaften von Streptomyces np. SF-2080 sind die folgenden:

(I) Morphologische Eigenschaften

Das Mycelsubsirat ist stark verzweigt und erstreckt sich in Wellenform. Der Durchmesser der Hyphen beträgt 0,5 bis 0,6 μπι. Im allgemeinen wird weder in Agarkulturmedium noch in einem flüssigen Medium eine Fragmentierung des Mycelsubstrats beobachtet. Bei den üblichen verwendeten Agarkulturmedium werden keine Luftmycele gebildet. Bisher sind keine Sporen, Sporangia, Zoosporen, Sclerotia, Synnemata und dergleichen beobachtet worden.

(II) Kultureigenschaften

Die Kultureigenschaften von Streptomyces sp. SF-2080 wurden untersucht nach dem Verfahren gemäß E. B. Shirling & D. Gottlieb, International Journal of Systematic Bacteriology, Bd. 16, Seiten 3Ί3-340 (1966). Die Beobachtungen wurden nach 14tätiger Kultivierung bei 28"C durchgeführt. Die Kultureigenschaften auf den verschiedenen Medien werden in Tabelle 1 gezeigt.

Tabelle 1 Kulturmedium Wachstum und Umkehrfarbe

Lufunycel

Lösliches Pigment

Saccharose-Nitrat-Agar
Glukose-Asparagin-Agar
Gl, ^jrin-Asparagin-Agar
Kalzium-Malat-Agar
Stärke- Agar
Hefe-Malz-Agar

Tyrosin-Agar
Nähragar

Hafermehl-Agar
Bennett's Agar

sehr dürftiges Wachstum, farblos sehr dürftiges Wachstum, farblos dürftiges Wachstum, farblos sehr dürftiges Wachstum, farblos sehr dürftiges Wachstum, farblos mäßiges Wachstum, in einer dünnen Hautfonn, farblos bis hellgelblichbraun

dürftiges bis mäßiges Wachstum, farblos bis hellgelbes Braun

mäßiges Wachstum, helles Gelblichbraun dürftiges bis mäßiges Wachstum, farblos

mäßiges Wachstum, farblos bis helles Gelblichbraun

keines	nicht gebildet
keines	nicht gebildet
keines	nicht gebildet
keines	nicht gebildet
keines	nicht gebildet
keines	nicht gebildet
keines	nicht gebildet
keines	nicht gebildet
keines	nicht gebildet
keines	nicht gebildet

(III) Physiologische Eigenschaften

(1) Wachstumstemperaturbereich: wächst auf Hefe-Malz-Agar im Bereich von 15 bis 45° C und wächst gut bei 25 bis 34° C.

(2) Verflüssigung von Gelatine: positiv (Kultivierung bei 20⁰C während 21 Tagen).

(3) Hydrolyse von Stärke: positiv (schwach, Kultivierung bei 28° C während 14 Tagen).

(4) Wirkung auf entrahmte Milch: es findet weder eine Peptonisierung noch Koagulation statt bei einer Kultivierung bei 28° C während 14 Tagen.

(5) Reduktion von Nitrat: positiv (Kultivierung bei 28° C während 14 Tagen).

(6) Salzbeständigkeit: Wachstum findet bei 1,5% statt, nicht jedoch bei 3,0%.

(7) Bildung von melaninähnlichen Pigmenten: negativ.

(IV) Verwertung von Kohlenstoffquellen

Zur Untersuchung der Verwertung von Kohlenstoffquellen wurde ein basisches Kulturmedium aus 0,5% Hefeextrakt, 0,1% Kalziumkarbonat und 1,5% Agar verwendet. Die Ergebnisse werden in der nachstehenden Tabelle 2 gezeigt.

Tabelle 2 Kohlenstoffquelle

Wachstum·)

D-Glukose

D-Xylose

D-Fructose

L-Arabinose

D-Mannit

i-Inosit

L-Rhamnose

Saccharose

Raffinose

*) + bedeutet verwertbar. - bedeutet nicht verwertbar.

(V) Zusammensetzung der Zellwandung

Analyse nach Becker et al, Appl. Microbiol, Bd. 13, Seite 236 (1965) bestätigt, daß die Diaminopimelinsäure in der Zellwandzusammensetzung vom LL-Typ ist

Aus den vorstehenden Charakteristika kann man schließlich das Streptomyces sp. SF-2080 zur Ordnung Actionmycetales gehört und ein Mesaphil und ein Actinomycet darstellt, bei dem keine Fragmentierung des Mycelsubstrats festgestellt wird, und das LL-Diaminopimelinsäure in der Zellwandung enthält. Es ist jedoch nicht möglich, schlüssig den Genus zu bestimmen, zu dem der SF-2080-Stamm gehört, weil die morphologischen Eigenschaften, wie Sporen, Sporangia, Zoosporen, Sclerotia und Synnemata, die zur Bestimmung des Genus von Actinomycetes erforderlich sind, bisher noch nicht sicher sind. Berücksichtigt man, daß der SF-2080-Stamm LL-Diaminopimelinsäure in der Zellwandung enthält, so erscheint es äußerst wahrscheinlich, daß der SF-2080-Stamm eine unbestimmte Spezies vom Genus Streptomyces ist, und er wurde deshalb als Streptomyces sp. SF-2080 bezeichnet. Dieser Stamm wurde beim American Type Cukure Collection (ATCC) unter der ATCC Nr. 31673 hinterlegt.

Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren wird der vorher beschriebene Stamm in einem Medium kultiviert, das Nährstoffe enthält, die durch bekannte Mikroorganismen assimilierbar sind. Solche Nährstoffe können bekannte Materialien sein, wie sie üblicherweise zur Kultivierung von Actinomycetes-Stämmen Verwendung finden. Beispiele für verwertbare Kchlenstoffquellen sind Glukose, Glyzerin, Saccharose, Stärke, Dextrin, Maltosesirup, Melasse, Sojabohnenöl und dergleichen. Beispiele für verwertbare Stickstoffquellen sind Sojabohnenmehl, Weizenmehl, Leinsamenmeh;, Fleischextrakt, Pepton, Hefeextrakt, Trockenhefe, Maismaische, Ammoniumsulfat, Natriumnitrat und dergleichen. Gewünschtenfalls können zusätzlich anorganische Salze, wie Kalziumkarbonat, Natriumchlorid, Kobaltchlorid, Phosphate und dergleichen, sowie auch organische und anorganische Materialien, welche die mikrobiologische Bildung des Antibiotikums SF-2080 A fördern, zugegeben werden.

Eine Eintauchkultivierung unter Belüftungsbedingungen ist besonders für die Kultivierung des das

50

55

60

65

Antibiotikum SF-2080 A bildenden Stammes geeignet, in Übereinstimmung mit der Bildung von bekannten Antibiotika. Der geeignete Temperaturbereich für die Kultivierung liegt bei 25 bis 34° C und vorzugsweise bei 28 bis 32° C. Die Bildung der SF-2080A-Substanz erreicht ein Maximum in 2 bis 7 Tagen, sowohl bei einer Schüttelkultur als auch bei einer Tankkultur und die SF-2080-Substanz reichert sich in der Kultivierungsbrühe an.

Die Bestimmung der antibiotischen SF-2080-Substanz kann durch eine Kombination von biologischen Untersuchungsmethoden durchgeführt werden, unter Verwendung von Sarcina lutea als Testorganismus und mittels Dünnschichtchromatografie unter Verwendung von Kieselgel.

Die SF-2080A-Substanz hat die nachfolgend beschriebenen, physikalischen und chemischen Eigenschaften. Entsprechend diesen Eigenschaften kann man sie extrahieren und reinigen. Dafür sind folgende Verfahren geeignet:

Das Filtrat, das man beim Filtrieren des Feststoffes (d. h. der Mycele) bei einer Kulturbrühe, die die gewünschten Substanzen enthält, erhält, gibt man zu einem organischen Lösungsmittel, das sich nicht mit Wasser mischt, z. B. Ethylacetat. Dann mischt man, um die gewünschten Substanzen zu extrahieren. Wenn das organische Lösungsmittel leicht mit Wasser mischbar ist, wie Aceton oder Methanol, so gibt man es zu dem

Tabelle 3

Feststoff (d.h. den Mycelien), um die gewünschten Substanzen daraus zu extrahieren. Nach dem Abdampfen des organischen Lösungsmittels kann man die gewünschten Substanzen mit einem organischen Lösungsmittel, wie Ethylacetat extrahieren. Extrakte aus dem Filtrat und dem Feststoff (den Mycelien) werden kombiniert. Das Lösungsmittel wird abgedampft, wobei man eine ölige Substanz erhält. Zu der öligen Substanz gibt man zur Extraktion der Verunreinigungen ein Lösungsmittel, wie η-Hexan. Den so erhaltenen Rückstand löst man in Methanol oder einer ähnlichen Substanz, und die erhaltene Lösung wird dann einer Säulenchromatografie unter Verwendung von Trägern, wie Kieselgel, Aluminiumoxid, Gelfilterhilfen für Molekularsiebe und dergleichen, unterworfen, wobei man die antibiotische SF-2080A-Substanz gewinnt. Die so isolierte SF-2080A-Substanz wird in einer geringen Menge Methanol gelöst und dann kristallisiert, wobei man die entsprechenden Kristalle gewinnt. Die Kristalle der SF-2080A-Substanz ergeben bei der Analyse durch Dünnschichtchromatografie unter Verwendung von verschiedenen Lösungsmittelsystemen einen einzigen Spot. Dies weist darauf hin, daß es sich um ein reines Produkt handelt.

Die physikalischen und chemischen Eigenschaften der SF-2080A-Substanz sind die folgenden, wobei die nachfolgend angegebenen Verfahren verwendet wurden:

SF-2080 A-Substanz

1. Elementaranalyse (Gew.-%)

2. Molekulargewicht

3. Molekularformel

4. Schmelzpunkt

5. Optische Drehung

6. Ultraviolettabsorptionsspektrum

7. Infrarotabsorptionsspektrum

8. Farbreaktionen

9. Aussehen und Farbe

10. elektrische Eigenschaften

11. Rf-Werte bei der Dünnschichtchromatografie (Kieselgel, 60 F₂₅₄, hergestellt von E. Merck Co.)

12. Löslichkeit

13. scheinbare Strukturformel

C 27,06, H 1,17, N 14,84, Cl 39,23
(Massenspektrum)
C₄H₂N₂O₂Cl

bis 207⁰C (Zersetzung)
[a]i⁵ = 0 (C = 0,5, Methanol)

wie in Fig. 1 gezeigt. Absorptionsmaxima sind 269 nm (£1*™ 490) und 320 nm (£j^s _cm 230) in Methanollösung; 271 nm (£"{*_m 500) und 320 nm (E\*_m 190) in 0,01 N salzsaurer Methanollösung: und nm (£J^% _cm 520) und 325 nm (£,'*„ 800) in einer 0,01 N Natriumhydroxid-Methanollösung

gemäß Fig. 2. Die Absorptionsbanden, bestimmt nach der Kaliumbromidtablettenmethode, sind: 3270, 3150, 1570, 1510, 1480, 1400, 1360, 1280, 1200, 1140, 1070, 960, 830, 820, 750 cm"¹ positiv bei der Jodreaktion und Lemieux-Reaktion; negativ bei der Ninhydrinreaktion und Ferrichloridreaktion
hellbraune bis gelbe nsidelförmige Kristalle
verhält sich bei einer Papierelektrophorese unter hoher Spannung wie eine neutrale Substanz

0,68 (Benzol/Aceton, 2 : 1 (V))

0,73 (Chloroform/Methanol, 10 : 1 (V))

leicht löslich in Methanol, Aceton;
schwach löslich in Wasser, n-Hexan

löslich in Chloroform;

Cl

-NO,

Die minimalen Inhibierungskonzentrationen von SF-2080A-Substanz gegen eine Reihe von Mikroorganismen, gemessen durch die Agar-Verdünnungsmethode, werden in der nachfolgenden Tabelle 4 gezeigt

Die akuten Toxizitäten der SF-2080A-Substanz wurden durch intraperitoneale Verabreichung an

Mäusen geprüft. Bei einer Verabreichung der SF-2080Ä-Substanz in einer Dosis von 30 mg/kg starben alle Mäuse, während bei einer Dosis von 10 mg/kg alle Mäuse überlebten. Deshalb ist die SF-2080A-Substanz als Arzneimittel, als Pestizid, als Tierarzneimittel, als Sterilisierungsmittel und dergleichen geeignet oder kann in entsprechende Mittel überführt werden.

Tabelle 4 Tabelle 6

SF-2080A-Substanz
Siethylsebacat

Pharmacopäisches
destilliertes Wasser
Ethanol bis zu

Testorganismus

Minimale Inhibierungskonzentration (mcg/ml)

SF-2080A-Substanz

Staphylococcus aureus 1,26 FDA 209P JC-I

Staphylococcus aareus Smith 3,13

Staphylococcus epidermidis 3,13 ATCC 14990

Bacillus subtilis ATCC 6633 1,56

Escherichia coli NIHJ JC-2 6,25

Escherichia coli K-12 IAM 1264 6,25

Salmonella typhi 0-901-W 6,25

Shigella dysenteriae Shigae 3,13 Klebsiella pneumoniae ATCC 27763 6,25

Proteus vulgaris OX-19 6,25

Serratia marcescens Nr. 1 6,25

Pseudomonas aeruginosa IAM 1007 6,25

Cryptococcus neoformans Cr-I 25

Trichophyton asteroides 3,12

Trichophyton interdigitale 1,56

Aspergillus fumigatus 25

Pyricularia oryzae 0,8

Diaporthe citri 0,8

Die SF-2080A-Substanz hat nicht nur eine antibakterielle Aktivität, sondern inhibiert auch das Wachstum von Fungi. Die minimale Wachstumsinhibierungskonzentration (MIC) gegen die jeweils geprüften Stämme nach der Plattenverdünnungsmethode wird nachfolgend gezeigt.

Tabelle 5

0,25 g
2,5 ml
2,5 ml

25 ml

Bei einem Test zur Behandlung der Infektion bei Meerschweinchen, die mit Trichophyton asteroides auf dem Rücken befallen waren, wurde die flüssige Zubereitung der in Tabelle 6 beschriebenen Formulierung angewendet. Dieser Versuch bestätigte, daß im Vergleich zu Pyrrolnitrin und Clotrimazol, die als Vergleichsmittel verwendet wurden, die SF-2080A-Substanz gemäß der Erfindung eine sehr gute therapeutische Wirkung hatte, die sowohl mit dem bloßen Auge festgestellt werden konnte, wie auch durch Versuche, bei denen man den geheilten, ursprünglich infizierten Stellen Kultivierungen vornahm und die Abnahme der infizierten Organismen dann beobachtete.

Ein Vergleich der physikalischen und chemischen Eigenschaften sowie der biologischen Eigenschaften von SF-2080A-Substanz mit bekannten Antibiotika zeigt, daß es sich hier um ein neues Antibiotikum handelt.

Nachfolgend wird die Erfindung beispielhaft beschrieben.

Geprüfter Stamm	MIC
	(mcg/ml)
Candida albicans C-A-24	100
Cryptococcus neoformans Cr-I	25
Trichophyton asteroides	3,12
Trichophyton interdigitale	1,56
Aspergillus fumigatus	25

Beispiel 1

Dies zeigt, daß die SF-2080A-Substanz auch ein wirksames antimycotisches Mittel ist

Die SF-2080A-Substanz kann auf die befallenen Flächen aufgebracht werden, z. B. in Form einer Salbe oder Lösung. Ein Beispiel für eine Formulierung einer flüssigen Zubereitung mit einem zugegebenen Hauteindringungsmittel wird in Tabelle 6 gezeigt

Ein flüssiges Medium einer Zusammensetzung aus 1 Gew.-% löslicher Stärke, 1 Gew.-% Glukose, 0,5 Gew.-% Pepton, 03 Gew.-% Hefeextrakt, 0,2 Gew.-% Sojabohnenmehl, 0,2 Gew.-% Fleischextrakt und 0,1 Gew.-°/o Kalziumkarbonat wurde hergestellt. Dann wurden 20 ml des so hergestellten flüssigen Mediums getrennt in einen 100 ml Erlenmeyer-Kolben gegeben und sterilisiert Das flüssige Medium wurde mit Streptomyces sp. ATCC 31 763 inokuliert und das flüssige Medium wurde auf einem Schüttler 5 Tage bei 28°C unter Ausbildung einer ersten Saatkultur inkubiert Das gleiche Verfahren wurde wiederholt, wobei das Volumen allmählich vergrößert wurde und man eine zweite Saatkultur erhielt (d.h. die erste Saatkultur wurde in 80 ml eines flüssigen Mediums, das in einen 500 ml-Erlenmeyer-Kolben eingeführt worden war, inokuliert und dann 2 Tage bei 28° C inkubiert unter Ausbildung der zweiten Saatkultur). Dann wurde eine

so dritte Saatkultur hergestellt (indem man die zweite Saatkultur in 800 ml eines flüssigen Mediums, das in einen 51-Erlenmeyer-Kolben eingeführt worden war, inokulierte und dann 2 Tage bei 28° C unter Ausbildung der dritten Saatkultur inkubierte).

Anschließend wurden 351 des Kulturmediums mit folgender Zusammensetzung: 2 Gew.-°/o Maltosesirup, 0,15 Gew.-% Sojabohnenöl, 1 Gew.-% Sojabohnenmehl, 0,25 Gew.-% Schlampe, 0,5 Gew.-% Fermamedia, 0,0005 Gew.-% Eisen(I!)-sulfat, 0,00005 Gew.-o/o Nikkelchlorid, 0,00005 Gew.-% Kobaltchlorid und 0,1 Gew.-% Kalziumkarbonat in einen 501-Fermentationstank aus rostfreiem Stahl gegeben, sterilisiert und dann mit 80 ml der dritten Saatkultur inokuliert Die Kultivierung wurde bei 28° C unter Belüftung und Rühren durchgeführt. Die Belüftungsmenge betrug 35 l/min und die Anzahl der Umdrehungen 300 pm.

Nach 120 Stunden wurde die Kultivierung abgebrochen und die Kultur durch Filtrieren in eine feste

Fraktion und ein Filtrat getrennt. Zu 251 des Filtrats wurden 201 Ethylacetat gegeben und zur Extraktion der wirksamen Komponente gerührt. Die Ethylacetatschicht wurde isoliert. Außerdem wurden 101 einer 50%igen wäßrigen Lösung von Aceton zu der festen Fraktion gegeben und gerührt und die effektive Komponente extrahiert. Die feste Fraktion wurde filtriert. Anschließend wurde das Filtrat unter vermindertem Druck zur Verdampfung des Acetons konzentriert und dann wurden 2,51 Ethylacetat zugegeben und zur Extraktion der wirksamen Komponente gerührt. Anschließend wurde die Ethylacetatschicht isoliert und mit der aus dem Filtrat gewonnenen Ethylacetatextraktionsschicht kombiniert. Beim Konzentrieren der erhaltenen Mischung unter vermindertem Druck erhielt 'S man 30 ml einer teerigen Substanz.

Nach Zugabe von η-Hexan zu der teerigen Substanz waren die gewünschten Substanzen praktisch unlöslich in η-Hexan und blieben als Niederschlag übrig. Nach Entfernung der überstehenden Flüssigkeit wurde der Niederschlag auf 700 ml einer Wako-Gel C-100 Säule, die zuvor mit Chloroform gepackt worden war, gegeben und dann mit Chloroform eluiert, wobei man aktive Fraktionen erhielt. Die aktiven Fraktionen wurden konzentriert, wobei man 800 mg eines öligen Produktes erhielt.

Das so erhaltene ölige Produkt wurde in 5 ml Methanol gelöst, über einer 600 ml Säule aus Sephadex LH-20 mit Methanol eluiert, wobei man 30-ml-Fraktionen abtrennte. Die SF-2080A-Substanz wurde in den Fraktionen 18 bis 21 und eine SF-2080B-Substanz in den Fraktionen 25 bis 30 eluiert. In den Fraktionen 22 bis 24 wurde eine Mischung aus der SF-2080A-Substanz und SF-2080B-Substanz eluiert Die Fraktionen 22 bis 24 wurden vereint, konzentriert und nochmals chromatisch unter Verwendung von Sephadex LH-20 getrennt.

Man erhielt 230 mg der SF-2080A-Substanz. Diese wurden in jeweils einer geringen Menge Methanol gelöst und als Kristalle ausgefällt, wobei man 90 mg SF-2080A-Substanz erhielt

Beispiel 2

Von einem weißen Hartly-Meerschweinchen (jeweils 4 Meerschweinchen in einer Gruppe) wurden von 4 Stellen auf dem Rücken (zwei Stellen hatten eine Größe von 4x6 cm) Haar ausgerissen und dann wurde eine Trichophyton asteroides enthaltende Lösung (Flüssigkeit Sabouraud'sches Kulturmedium, Anzahl der lebenden Zellen 2 χ 10-⁷/ml) mit einer Bürste in einer Menge von 0,5 ml pro Fläche zur infizierung aufgetragen. 2 Tage nach der Infizierung wurden 0,25 ml einer l°/oigen Lösung von SF-2080A-Substanz (siehe Tabelle 6) auf eine Fläche auf einer Seite aufgetragen, und zwar lmal täglich und fortlaufend während 8 Tagen.

Das gleiche Verfahren wie oben wurde durchgeführt, mit der Ausnahme, daß eine l%ige Lösung von Pyrollnitrin bzw. eine l%ige Lösung von Clotrimazol verwendet wurde. Die so behandelten Meerschweinchen wurden dann mit solchen verglichen, die nicht behandelt worden waren.

Mit dem bloßen Auge konnte die Bestimmung durchgeführt werden, wie in Tabelle 7 gezeigt wird. Es stellte sich heraus, daß die SF-2080A-Substanz die besten Ergebnisse hinsichtlich der Verdickung der infizierten Haut, der Rötung und der Abschuppung ergab.

Tabelle 7

Wirkung

SF-2080A-Substanz

Pyrrolnitrin·)

Clotrimazol·*)

Verdickung

Rötung

Abschuppung

merklich wirksam
merklich wirksam
merklich wirksam bis wirksam

wirksam	wirksam
unwirksam	unwirksam
unwirksam	unwirksam

*) Pyrrolnitrin

Cl NO₂

Nach 8tägiger Behandlung wurden drei Hautstücke von den infizierten Flächen gesammelt und auf einer Sabouraud'schen Agarplatte 7 Tage kultiviert zur Bestimmung des »infected organism cultivation positive ratio«.

Bei der Gruppe, die mit der SF-2080A-Substanz

Tabelle 8

behandelt worden war, wurde, im Vergleich zu der mit Pyrollnitrin behandelten Gruppe und der mit Clotrimazol behandelten Gruppe und der Gruppe, die keine Behandlung erfuhr, eine deutliche Abnahme im »cultivation positive ratio« festgestellt (siehe Tabelle 8).

Tage der	SF-2O8OA-	Pyrrolnitrin	Clotrimazo	1 Keine
Kultivierung	Substanz	W	,*,	Behandlung
3	25	62	75	100
5	37	87	96	100
7	37	87	96	100
		Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. SF-2080A-Substanz mit den folgenden Eigenschaften:

Elementaranalyse (Gtw.-%):

C 27,06, H 1,17, N 14,84, CI 39,23;

Molekulargewicht:

181 (nach dem Massenspektrum); to

Molekularformel:
C4H2N2O2CI2;

Schmelzpunkt:

205 bis 207° C (unter Zersetzung);

Optische Drehung: is

[«]» =0 (C= OA Methanol);

Ultraviolettabsorptionsspektrum:

Absorptionsmaxima sind 269 und 520 nm in Methanollösung, 271 und 320 nm in einer 0,01 N chlorwasserstoffsauren Methanollösung, und 220 und 325 nm in einer 0,01 N Natriumhydroxid-Methanollösung;

infrarotabsorptionsspektrum:

die Absorptionsbanden, bestimmt nach der Kaliumbromidtablettenmethode, sind 3270, 3150, 1570, 1510, 1480, 1400, 1360, 1280, 1200, 1140,1070,960,830,820,750 cm -';

Farbreaktion:

positiv für die Jodreaktion und Lemieux-Reaktion und negativ bei der Ninhydrinreaktion und der Ferrichloridreaktion;

Aussehen und Farbe:

hellbraune bis gelbe, nadeiförmige Kristalle;

elektrische Eigenschaften:

verhält sich bei einer Papierelektrophorese bei hoher Spannung wie eine neutrale Substanz;

Rf-Werte bei

Dünnschichtchromatografie (Kieselgel): 0,68 (Benzol/Aceton = 2 :1 (Volumen)), 0,73 (Chloroform/Methanol = 10:1 «o

(Volumen));

Löslichkeit:

leicht löslich in Methanol und Aceton, löslich in Chloroform und schwach löslich in Wasser und η-Hexan; ⁴*

scheinbare Strukturformel: