DE3048421A1

DE3048421A1 - Antibiotische substanz und verfahren zu deren herstellung

Info

Publication number: DE3048421A1
Application number: DE19803048421
Authority: DE
Inventors: Norio Ezaki; Shigeharu Yokohama Kanagawa Inouye; Tatsuo Isehara Kanagawa Ito; Michio Tokyo Kojima; Tomizo Yokohama Kanagawa Niwa; Takashi Shomura
Original assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Current assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Priority date: 1979-12-24
Filing date: 1980-12-22
Publication date: 1981-10-15
Also published as: US4376778A; JPS6220984B2; IT8050448A0; IT8050448A1; FR2472611A1; GB2066816B; IT1188979B; JPS5690099A; DE3048421C2; MX6925E; FR2472611B1; GB2066816A

Description

Die Erfindung betrifft neue Antibiotika und Verfahren zu deren Herstellung. Sie betrifft insbesondere die neuen Antibiotika SF-2O8OA und/oder SF-2O8OB, die durch Kultivieren von SF-2080-Substanz produzierenden Stämmen vom Genus Streptomyces in einem Nährmedium und Gewinnung der so erhaltenen SF-2080-Substanzen aus der Kultur erhalten werden, und ein Verfahren zur Herstellung der antibiotischen SF-2O8OA-Substanz und/oder SF-2O8OB-Substanz.

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Es ist bekannt, dass zahlreiche mikrobische Spezies, z.B. solche vom Genus Streptomyces bei der Kultivierung in einem Nährmedium mit assimilierbaren Kohlenstoff- und Stickstoffquellen Antibiotika erzeugen können. Es besteht ein ständiger Bedarf für neue und brauchbare antibiotische Substanzen.

Erfindungsgemäss werden neue Antibiotika gezeigt, die als SF-2O8OA-Substanz bzw. SF-2O8OB-Substanz bezeichnet werden, sowie ein Verfahren zur Herstellung der SF-2O8OA-Substanz und der SF-2O8OB-Substanz durch Kultivieren eines SF-2080-Substanz produzierenden Stammes vom Genus Streptomyces in einem Nährmedium.

Fig. 1 ist ein Ultraviolettabsorptionsspektrum der SF-2O8OA-Substanz, gemessen bei einer Konzentration von 10 mcg/ml (Mikrogramm/Milliliter) in (I) Methanol, (II) saurem Methanol (d.h. in 0-,01 N HCl-Methanollösung) und (III) alkalischem Methanol (d.h. in 0,01 N NaOH-Methanollösung);

Fig. 2 zeigt ein Infrarotabsorptionsspektrum der SF-2O8OA-Substanz, gemessen auf einer Kaliumbromidtablette;

Fig. 3 zeigt ein Ultraviolettabsorptionsspektrum der SF-2O8OB-Substanz, gemessen bei einer Konzentration von 10 mcg/ml in (I) Methanol, (II) saurem Methanol (d.h..

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in 0,01 N HCl-Methanollösung) und (III) alkalischem Methanol (d.h. in 0,01 N NaOH-Methanollösung); und

Fig. 4 zeigt ein Infrarotabsorptionsspektrum

der SF-2O8OB-Substanz, gemessen auf einer Kaliumbromidtablette.

Als Stamm für die Bildung des Antibiotikums SF-2O8O, wie er bei der Erfindung verwendet wird (der Ausdruck "Antibiotikum SF-2O8O" schliesst sowohl SF-2O8OA-Substanz als auch SF-2O8OB-Substanz ein) ist jeder Stamm geeignet, der Antibiotikum SF-2080-Substanz in einer ausreichenden Menge, die aus einer Fermentationsbrühe gewonnen werden kann, bildet. Ein Beispiel für einen solchen Stamm ist S tr eptomyc e s sp. SF-2O8O, der aus einer Bodenprobe des Flussbettes des River Chikuma in Nagano-City, Nagano-Prefecture, Japan, gesammelt wurde.

Die Eigenschaften von Streptomyces sp. SF-2O8O sind die folgenden:

(I) Morphologische Eigenschaften;

Das Mycelsubstrat ist stark verzweigt und erstreckt sich in Wellenform. Der Durchmesser der Hyphen beträgt 0,5 bis 0,6 um. Im allgemeinen wird weder in Agarkulturmedium noch in einem flüssigen Medium eine Fragmentierung des Mycelsubstrats beobachtet. Bei den üblichen verwendeten Agarkulturmedien werden keine Luftmycele gebildet. Bisher sind keine -Sporen, Sporangia, Zoosporen, Sclerotia, Synnemata und dergleichen beobachtet worden.

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(II) Kultureigenschaften:

Die Kultureigenschaften von Streptomyces sp. SF-2O8O wurden untersucht nach dem Verfahren gemäss E.B. Shirling & D. Gottlieb, International Journal of Systematic Bacteriology, Bd. 16, Seiten 313-340 (1966) Die Beobachtungen wurden nach 14-tägiger Kultivierung bei 28°C durchgeführt. Die Kultureigenschaften auf den verschiedenen Medien werden in Tabelle 1 gezeigt.

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Tabelle 1

PO "ν O cn- CD

Kulturmedium	Wachstum und Umkehrfarbe	Luft- mycel	lösliches Pig ment
Saccharose-Nitrat-Agar	sehr dürftiges Wachstum, farb los	keines	nicht gebildet
Glukose-Asparagin-Agar	sehr dürftiges Wachstum, farb los	keines	nicht gebildet
Glyzerin-Asparagin-Agar	dürftiges Wachstum, farblos	keines	nicht gebildet
KaIz ium-Malat-Agar	sehr dürftiges Wachstum, farb los	keines	nicht gebildet
Stärke-Agar	sehr dürftiges Wachstum, farb los	keines	nicht gebildet
Hefe-Malz-Agar	massiges Wachstum, in einer dünnen Hautform, farblos bis hell-gelblich-braun	keines	nicht gebildet
Tyrosin-Agar	dürftiges bis massiges Wachstum, farblos bis hellgelbes Braun	keines	nicht gebildet
Nähragar	massiges Wachstum, helles gelb lich Braun	keines	nicht gebildet
Hafermehl-Agar	dürftiges bis massiges Wachstum, farblos	keines	nicht gebildet
Bennett¹s Agar	massiges Wachstum, farblos bis helles gelblich Braun	keines	nicht gebildet

O I

CO

CD

OO

(III) Physiologische Eigenschaften;

(1) Wachstumstemperaturbereich: wächst auf Hefe-Malz-Agar im Bereich von 15 wächst gut bei 25 bis 34°C.

Malz-Agar im Bereich von 15 bis 45°C und

(2) Verflüssigung von Gelatine: positiv (Kultivierung bei 2O°C während 21 Tagen).

(3) Hydrolyse von Stärke: positiv (schwach, Kultivierung bei 28°C während 14 Tagen).

(4) Wirkung auf entrahmte Milch: es findet weder

eine Peptonisierung noch Koagulation statt bei e:
Tagen.

bei einer Kultivierung bei 28°C während 14

(5) Reduktion von Nitrat: positiv (Kultivierung bei 2 8 ⁰C während 14 Tagen).

(6) Salzbeständigkeit: Wachstum findet bei 1,5 \ statt, nicht jedoch bei 3,0 %.

(7) Bildung von melaninähnlichen Pigmenten: negativ.

(IV) Verwertung von Kohlenstoffquellen:

Zur Untersuchung der Verwertung von Kohlenstoffquellen wurde ein basisches Kulturmedium aus 0,5 % Hefeextrakt (Difco), 0,1 % Kalziumkarbonat und 1,5 % Agar (Difco)

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verwendet. Die Ergebnisse werden in der nachstehenden Tabelle 2 gezeigt.

Tabelle 2

Kohlenstoffquelle	Wachstum*
D-Glukose	+
D-Xylose	+
D-Fructose	-
L-Arabinose	-
D-Mannit	-
i-Inosit	-
L-Rhamnose	+
Saccharose	-
Raffinose	—

+ bedeutet verwertbar

- bedeutet nicht verwertbar

Zusammensetzung der Zellwandung:

Analyse nach Becker et al, Appl. Microbiol., Bd. 13, Seite 236 (1965) bestätigt, dass die Diaminopimelinsäure in der Zellwandzusammensetzung vom LL-Typ ist.

Aus den vorstehenden Charakteristika kann man schliessen, dass Streptomyces sp. SF-2O8O zur Ordnung Actionmycetales gehört und ein Mesaphil und ein Actinomycet darstellt, bei dem keine Fragmentierung des Mycelsubstrats

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festgestellt wird, und das LL-Diaminopimelinsäure in der Zellwandung enthält.

Es ist derzeit jedoch nicht möglich, schlüssig den Genus zu bestimmen", zu dem der SF-2O8O-Stamm gehört, weil die morphologischen Eigenschaften, wie Sporen, Sporangia, Zoosporen, Sclerotia und Synnemata, die zur Bestimmung des Genus von Actinomycetes erforderlich sind, bisher noch nicht sicher sind. Berücksichtigt man, dass der SF-2080-Stamm LL-Diaminopimelinsäure in der Zellwandung enthält, so erscheint es äusserst wahrscheinlich, dass der SF-2080-Stamm eine unbestimmte Spezies vom Genus Streptomyces ist und er wurde des.halb als Streptomyces sp. SF-2O8O bezeichnet.

Dieser Stamm wurde als Streptomyces sp. SF-2O8O beim Fermentation Research Institut, Agency of the Industrial Science and Technology,, Ministry of International Trade and Industry of Japan unter der Hinterlegungsnummer FERM-P Nr. 5072 (am 4. Juli 1979) und beim American Type Culture Collection (ATCC) unter der ATCC Nr. 31673 (am 28. Juli 1980) hinterlegt.

Der SF-2080-Stamm ist hinsichtlich seiner Eigenschaften leicht variabel, wie dies bei anderen Actinomycetes-Stämmen der Fall ist. Solche Variationen können künstlich durch Bestrahlung mit beispielsweise ultravioletten Strahlen, Röntgenstrahlen, Hochfrequenzwellen oder radioaktiven Strahlen oder durch Chemikalien hervorgerufen werden. Alle Varianten und Mutanten können beim erfindungsgemässen Verfahren verwendet werden, solange sie die Fähigkeit haben, die SF-2O8OA-Substanz

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und/oder SF-2O8OB-Substanz zu bilden.

Gemäss dem erfindungsgemässen Verfahren wird der vorher beschriebene Stamm in einem Medium kultiviert, das Nährstoffe enthält, die durch bekannte Mikroorganismen assimilierbar sind. Solche Nährstoffe können bekannte Materialien sein, wie sie üblicherweise zur Kultivierung von Actinomycetes-Stämmen Verwendung finden. Beispiele für verwertbare Kohlenstoffquellen sind Glukose, Glyzerin, Saccharose, Stärke, Dextrin, Maltosesirup, Melasse, Sojabohnenöl und dergleichen. Beispiele für verwertbare Stickstoffquellen sind Sojabohnenmehl, Weizenmehl, Leinsamenmehl, Fleischextrakt, Pepton, Hefeextrakt, Trockenhefe, Maismeische, Ammoniumsulfat, Natriumnitrat und dergleichen. Gewünschtenfalls können zusätzlich anorganische Salze, wie Kalziumkarbonat, Natriumchlorid, Kobaltchlorid, Phosphate und dergleichen, sowie auch organische und anorganische Materialien, welche die mikrobiologische Bildung des Antibiotiukums SF-2O8O fördern, zugegeben werden.

Eine Eintauchkultivierung unter Belüftungsbedingungen ist besonders für die Kultivierung des das Antibiotikum SF-2O8O bildenden Stammes geeignet, in Übereinstimmung mit der Bildung von bekannten Antibiotika. Der geeignete Temperaturbereich für die Kultivierung liegt bei 2 5 bis 34°C und vorzugsweise bei 28 bis 32°C. Die Bildung der SF-2080-Substanzen erreicht ein Maximum in 2 bis 7 Tagen, sowohl bei einer Schüttelkultur als auch bei einer Tankkultur und die SF-2080-Substanz reichert sich in der Kultivierungsbrühe an.

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Die Bestimmung der antibiotischen SF-2080-Substanz kann durch eine Kombination von biologischen Untersuchungsmethoden durchgeführt werden, unter Verwendung von Sarcina lutea als Testorganismus und mittels Dünnschichtchromatografie unter Verwendung von Kieselgel.

Die SF-2O8OA-Substanz und SF-2O8OB-Substanz haben die nachfolgend beschriebenen, jeweiligen physikalischen und chemischen Eigenschaften. Entsprechend diesen Eigenschaften kann man sie extrahieren und reinigen. Dafür sind folgende Verfahren geeignet:

Das Filtrat, das man beim Filtrieren des Feststoffes (d.h. der Mycele) bei einer Kulturbrühe, die die gewünschten Substanzen enthält, erhält, gibt man zu einem organischen Lösungsmittel, das sich nicht mit Wasser mischt, z.b. Ethylacetat. Dann mischt man, um die gewünschten Substanzen zu extrahieren. Wenn das organische Lösungsmittel leicht mit Wasser mischbar ist, wie Aceton oder Methanol, so gibt man es zu dem Feststoff (d.h. den Mycelen), um die gewünschten Substanzen daraus zu extrahieren. Nach dem Abdampfen des organischen Lösungsmittels kann man die gewünschten Substanzen mit einem organischen Lösungsmittel, wie Ethylacetat extrahieren. Extrakte aus dem Filtrat und dem Feststoff (den Mycelen) werden kombiniert. Das Lösungsmittel wird abgedampft, wobei man eine ölige Substanz erhält. Zu der öligen Substanz gibt man zur Extraktion der Verunreinigungen ein Lösungsmittel, wie η-Hexan. Den so erhaltenen Rückstand löst man in Methanol oder einer ähnlichen Substanz und die erhal-" tene Lösung wird dann einer Säulenchromatografie

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unter Verwendung von Trägern, wie Kieselgel, Aluminiumoxid, Gelfilterhilfen für Molekularsiebe und dergleichen, unterworfen, wobei man die antibiotische SF-2O8OA-Substanz und/oder SF-2O8OB-Substanz gewinnt. Die so isolierte SF-2O8OA-Substanz und/oder SF-2O8OB-Substanz wird in einer geringen Menge Methanol gelöst und dann kristallisiert, wobei man die entsprechenden Kristalle gewinnt. Die Kristalle der SF-2O8OA-Substanz und/oder SF-2O8OB-Substanz ergeben bei der Analyse durch Dünnschichtchromatografie unter Verwendung von verschiedenen Lösungsmittelsystemen einen einzigen Spot. Dies weist darauf hin, dass es sich um ein reines Produkt handelt.

Die physikalischen und chemischen Eigenschaften der SF-2O8OA-Substanz bzw. der SF-2O8OB-Substanz sind die folgenden, wobei die nachfolgend angegebenen Verfahren verwendet wurden:

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Tabelle 3

-P-Ν> -^ O (Jl

00 I

	SF-2O8OA-Substanz	SF-2O8OB-Substanz
1. Elementarana- lyse (Gew.%) 2. Molekularge wicht 3. Molekularformel 4. Schmelzpunkt 5. Optische Dre hung 6. Ultraviolett absorptions spektrum	C 27,06, H 1 ,17, N 14,84, Cl 39,23 181 (Massenspektrum) C₄H₂N₂O₂Cl 205 bis 2O7°C (Zersetzung) iSL/* d ° ^{c=0'⁵' Methanol) wie in Fig. 1 gezeigt. Ab- sorptionsmaxima sind 269 nm (E^*_m49O)und 320 nm(E]\| _cm23O) in Methanollösung; 271 nm (E^j_cm500)und 320 nm(E^_cm190) in 0,01N salzsaurer Methanol lösung; und 220 nm(EP_52O) 1 % und 325 ran(E' 800) in einer 0,01N Natriumhydroxid-Metha nollösung	C 36,79, H 1 ,67, N 7,95, Cl 39,89 356 (Massenspektrum) ^C11^H6^N2°3^C1 202 bis 211°C (Zersetzung) lÖLj Q⁵ = 0 (C=O,5, Methanol) wie in Fig. 3 gezeigt. Ab- sorptionsmaxima sind 276 nm (E]*_m300)und 328 nm(E^_m170) in Methanollösung; 277 nm ^(E1cm^{310)und 335} ^^Icm^{1 50)} in 0,01N salzsaurer Methanol- 1 % lösung; und 245 ran(E₁ 570) und 313 nm(E' 570) in einer 1 cm 0,01N Natriumhydroxid-Metha nollösung

CO

hO

Portsetzung Tabelle 3

cn CO

	SF-2O8OA-Substanz	SF-2O8OB-Substanz
7. Infrarotab sorptions spektrum 8. Farbreaktionen 9. Aussehen und Farbe 10. elektrische Eigenschaften	gemäss Fig. 2. Die Absorp tionsbanden, bestimmt nach der Kaliumbromidtabletten- methode, sind: 3270, 3150, 1570, 1510, 1480, 1400, 1360, 1280, 1200, 1140, 1070, 960, 830, 820, 750cm . positiv bei der Jodreaktion und Lemieux-Reaktion; nega tiv bei der Ninhydrinreaktion und Ferrichloridreaktion hellbraune bis gelbe nadei förmige Kristalle verhält sich bei einer Papier- elektrophorese unter hoher Spannung wie eine neutrale Substanz	gemäss Fig. 4. Die Absorp tionsbanden, bestimmt nach der Kaliumbromidtabletten- methode, sind: 33 60, 1580, 1510, 1.490, 1480, 1440, 1420, 1360, 1310, 1290, 1240, 1210, 1160, 1110, 930, 890, 860, 800, 770, 740 cm~¹. positiv bei der Jodreaktion und Lemieux-Reaktion; nega tiv bei der Ninhydrinreaktion und Ferrichloridreaktion gelbe, nadeiförmige Kri stalle verhält sich bei einer Papier- elektrophorese unter hoher Spannung wie eine neutrale Substanz

OO I

CO CD

OO

Fortsetzung Tabelle

*■» to S O OT

11. Rf-Werte bei der Dünnschichtchromatografie (Kieselgel, 6OF254, hergestellt von E. Merck Co.)

12. Löslichkeit

13. scheinbare

Strukturformel

SF-2O8OA-Substanz

0,68 (Benzol/Aceton, 2:1 (V))

0,73 (Chloroform/Methanol, 10:1 (V))

leicht löslich in Methanol, Aceton; löslich in Chloroform; schwach löslich in Wasser, n-Hexan

SF-2O8OB-Substanz

0,73 (Benzol/Aceton, 2:1 (V)) 0,80 (Chloroform/Methanol, 10:1 (V))

OH Cl

O ι

Die minimalen Inhibierungskonzentrationen von SF-2O8OA-Substanz bzw. SF-2O8OB-Substanz gegen eine Reihe von Mikroorganismen, gemessen durch die Agar-Verdünnungsmethode, werden in der nachfolgenden Tabelle 4 gezeigt. Die SF-2O8OA-Substanz ist im allgemeinen wirksam gegen alle geprüften Bakterienstämme, wogegen SF-2O8OB-Substanz sehr wirksam gegen eine begrenzte Zahl von Stämmen ist, aber weniger aktiv, oder gar nicht aktiv gegenüber anderen Stämmen.

Die akuten Toxizitäten der SF-2O8OA-Substanz bzw. der SF-2O8OB-Substanz wurden durch intraperitoneale Verabreichung an Mäuse geprüft. Bei einer Verabreichung der SF-2O8OA-Substanz in einer Dosis von 30 mg/kg starben alle Mäuse, während bei einer Dosis von 10 mg/kg alle Mäuse überlebten. Bei einer Verabreichung der SF-2O8OB-Substanz bei einer Dosis von 100 mg/kg überlebten zwoi Drittel der Mäuse. Deshalb sind die SF-2O8OA-Substanz bzw. SF-2O8OB-Substanz als Arzneimittel, als Pestizide, als Tierarzneimittel, als Sterilisierungsmittel und dergleichen geeignet oder können in entsprechende Mittel überführt werden.

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Tabelle 4

Testorganismus	Minimale Inhibie- rungskonzentration (mcg^ml)	1 ,56	SF-2O8OB Substanz
Staphylococcus aureus FDA 2O9P JC-1	SF-2O8OA Substanz	6,25	0,20
Staphylococcus aureus Smith	1 ,26	6,25	0,20
3,13	6,25	0,10
Staphylococcus epidermidis ATCC 14990 3,13	3,13	0,10
Bacillus subtilis ATCC 6633	6,25	100
Escherichia coli NIHJ JC-2	6,25	100
Escherichia coli K-12 IAM 1264	6,25	50
Salmonella typhi 0-901-W	6,25	50
Shigella dysenteriae Shigae	25 ■	>100
Klebsiella pneumoniae ATCC 27763	3,12	0,78
Proteus vulgaris OX-1§	1 ,56	>100
Serratia marcescens Nr. 1	25	>100
Pseudomonas aeruginosa IAM 1007	0,8 0,8	>1OO
Cryptococcus neoformans Cr-1	>100
Trichophyton asteroides	100
Trichophyton interdigitale	yioo
Aspergillus fumigatus	3,13 0,4
Pyricularia oryzae Diaporthe citri

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Die SF-2O8OA-Subtanz hat nicht nur eine antibakterielle Aktivität, sondern inhibiert auch das Wachstum von Fungi. Die minimale Wachstumsinhibierungskonzentration (MIC) gegen die jeweils geprüften Stämme nach der Plattenverdünnungsmethode wird nachfolgend gezeigt.

Tabelle 5

Geprüfter Stamm	MIC (mcg/ml)
Candida albicans C-A-24	100 25 3,12 1 ,56 25
Cryptococcus neoformans Cr-1
Trichophyton asteroides
Trichophyton interdigitale
Aspergillus fumigatus

Dies zeigt, dass die SF-2O8OA-Substanz auch ein wirksames antimycotisches Mittel ist.

Die SF-2O8OA-Substanz kann auf die befallenen Flächen aufgebracht werden, z.B. in Form einer Salbe oder Lösung. Ein Beispiel für eine Formulierung einer flüssigen Zubereitung mit einem zugegebenen Hauteindringungsmittel wird in Tabelle 6 gezeigt.

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Tabelle 6

SF-2O8OA-Substanz	O,	25	g
Siethylsebacat	2,	5	ml
Pharraacopäisches destilliertes
Wasser	2,	5	ml
Ethanol bis zu	25		ml

Bei einem Test zur Behandlung der Infektion bei Meerschweinchen, die mit dem Stamm Trichophyton asteroides auf dem Rücken befallen waren, wurde die flüssige Zubereitung der in Tabelle 6 beschriebenen Formulierung angewendet. Dieser Versuch bestätigte, dass im Vergleich zu Pyrrolnitrin und Clotrimazol, die als Vergleichsmittel verwendet wurden, die SF-2O8OA-Substanz gemäss der Erfindung eine sehr gute therapeutische Wirkung hatte, die sowohl mit dem blossen Auge festgestellt werden konnte, wie auch durch Versuche, bei denen man an den geheilten, ursprünglich infizierten Stellen Kultivierungen vornahm und die Abnahme der infizierten Organismen dann beobachtete.

Ein Vergleich der physikalischen und chemischen Eigenschaften sowie der biologischen Eigenschaften von SF-2O8OA-Substanz und SF-2O8OB-Substanz mit bekannten Antibiotika zeigt, dass es sich hier um neue Antibiotika handelt.

Die nachfolgenden Beispiele beschreiben die Erfindung

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ausführlich. Natürlich sind zahlreiche Modifizierungen und Veränderungen möglich, ohne vom Umfang der Erfindung abzuweichen.

Beispiel 1

Ein flüssiges Medium einer Zusammensetzung aus 1 Gew.% löslicher Stärke, 1 Gew.% Glukose, 0,5 Gew.% Pepton, 0,3 Gew.% Hefeextrakt, 0,2 Gew.% Sojabohnenmehl, 0,2 Gew.% Fleischextrakt und 0,1 Gew.% Kalziumkarbonat wurde hergestellt. Dann wurden 2O ml des so hergestellten flüssigen Mediums getrennt in einen 100 ml Erlenmeyer-Kolben gegeben und sterilisiert. Das flüssige Medium wurde mit Streptomyces SF-2O8O (FERM-P Nr. 5072, ATCC-Nr. 31673) inokuliert und das flüssige Medium wurde auf einem Schüttler 5 Tage bei 28 C unter Ausbildung einer ersten Saatkultur inkubiert. Das gleiche Verfahren wurde wiederholt, wobei das Volumen allmählich vergrössert wurde und man eine zweite Saatkultur erhielt (d.h. die erste Saatkultur wurde in 80 ml eines flüssigen Mediums, das in einen 500 ml Erlenmeyer-Kolben eingeführt worden war, inokuliert und dann 2 Tage bei 28 C inkubiert unter Ausbildung der zweiten Saatkultur). Dann wurde eine dritte Saatkultur hergestellt (indem man die zweite Saatkultur in 8OO ml eines flüssigen Mediums, das in einen 5 1 Erlenmeyer-Kolben eingeführt worden war, inokulierte und dann 2 Tage bei 28°C unter Ausbildung der dritten Saatkultur inkubierte).

Anschliessend wurden 3 5 1 des Kulturmediums mit folgender

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Zusammensetzung: 2 Gew.% Maltosesirup, 0,15 Gew.% Sojabohnenöl, 1 Gew.% Sojabohnenmehl, 0,25 Gew.% Schlampe, 0,5 Gew.% Fermamedia (Handelsprodukt der Traders Oil Mill Co., Texas), 0,0005 Gew.% Eisen(II)-sulfat, 0,00005 Gew.% Nickelchlorid, 0,00005 Kobaltchlorid und O,1 Gew.% Kalziumkarbonat in einen 50 1 Fermentationstank aus rostfreiem Stahl gegeben, sterilisiert und dann mit 800 ml der dritten Saatkultur inokuliert. Die Kultivierung wurde bei 28°C unter Belüftung und Rühren durchgeführt. Die Belüftungsmenge betrug 3 5 l/min und die Anzahl der Umdrehungen 300 Upm.

Nach 120 Stunden wurde die Kultivierung abgebrochen und die Kultur durch Filtrieren in eine feste Fraktion und ein Filtrat getrennt. Zu 25 1 des Filtrats wurden 20 1 Ethylacetat gegeben und zur Extraktion der wirksamen Komponente gerührt. Die Ethylacetatschxcht wurde isoliert. Ausserdem wurden 10 1 einer 50 %-igen wässrigen Lösung von Aceton zu der festen Fraktion gegeben und gerührt und die effektive Komponente extrahiert. Die fest Fraktion wurde filtriert. Anschliessend wurde das Filtrat unter vermindertem Druck zur Verdampfung des Acetons konzentriert und dann wurden 2,5 Ethylacetat zugegeben und zur Extraktion der wirksamen Komponente gerührt. Anschliessend wurde die Ethylacetatschicht isoliert und mit der aus dem Filtrat gewonnenen Ethylacetatextraktionsschicht kombiniert. Beim Konzentrieren der erhaltenen Mischung unter vermindertem Druck erhielt man 30 ml einer teerigen Substanz.

Nach Zugabe von η-Hexan zu der teerigen Substanz waren

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die gewünschten Substanzen praktisch unlöslich in η-Hexan und blieben als Niederschalg übrig. Nach Entfernung der überstehenden Flüssigkeit wurde der Niederschlag auf 700 ml einer Wako-Gel C-100 Säule (hergestellt von der Wako Pure Chemical Industries Ltd.), die zuvor mit Chloroform gepackt worden war, gegeben und dann mit Chloroform eluiert, wobei man aktive Fraktionen erhielt. Die aktiven Fraktionen wurden konzentriert, wobei man 800 mg eines öligen Produktes erhielt.

Das so erhaltene ölige Produkt wurde in 5 ml Methanol gelöst, über einer 600 ml Säule aus Sephadex LH-20 (Produkt der Pharmacia Co., Schweden) mit Methanol eluiert, wobei man 30 ml-Fraktionen abtrennte. Die SF-2O8OA-Substanz wurde in den Fraktionen 18 bis 21 und die SF-2O8OB-Substanz in den Fraktionen 25 bis 30 eluiert. In den Fraktionen 22 bis 24 wurde eine Mischung aus der SF-2O8OA-Substanz und SF-2O8OB-Substanz eluiert. Die Fraktionen 22 bis 24 wurden vereint, konzentriert und nochmals chromatisch unter Verwendung von Sephadex LH-20 getrennt.

Man erhielt 230 mg der SF-2O8OA-Substanz und 200 mg der SF-2O8OB-Substanz. Diese wurden in jeweils einer geringen Menge Methanol gelöst und als Kristalle ausgefällt, wobei man 90 mg SF-2O8OA-Substanz und 80 mg SF-2O8OB-Substanz erhielt.

Beispiel 2

Von einem weissen Hartly-Meerschweinchen (jeweils 4

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Meerschweinchen in einer Gruppe) wurden von 4 Stellen auf dem Rücken (zwei Stellen hatten eine Grosse von 4x6 cm) Haar ausgerissen und dann wurde eine Trichophyton asteroides enthaltende Lösung (Flüssigkeit Sabouraud'sches Kulturmedium, Anzahl der lebenden Zellen 2 χ 10 /ml) mit einer Bürste in einer Menge von 0,5 ml pro Fläche zur Infizierung aufgetragen. 2 Tage nach der Infizierung wurden 0,25 ml einer 1 %-igen Lösung von SF-2O8OA-Substanz (siehe Tabelle 6) auf eine Fläche auf einer Seite aufgetragen und zwar 1 mal täglich und fortlaufend während 8 Tagen.

Das gleiche Verfahren wie oben wurde durchgeführt, mit der Ausnahme, dass eine 1 %-ige Lösung von Pyrrolnitrin bzw. eine 1 %-ige Lösung von Clotrimazol verwendet wurde. Die so behandelten Meerschweinchen wurden dann mit solchen verglichen, die nicht behandelt worden waren.

Mit dem blossen Auge konnte die Bestimmung durchgeführt werden, wie in Tabelle 7 gezeigt wird. Es stellte sich heraus, dass die SF-2O8OA-Substanz die besten Ergebnisse hinsichtlich der Verdickung der infizierten Haut, der Rötung und der Abschuppung ergab.

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Tabelle 7

Wirkung	SF-2O8OA- Substanz	Pyrrol nitrin *	Clotrima zol **
Verdickung	merklich wirksam	wirksam	wirksam
Rötung	merklich wirksam	unwirksam	unwirksam
Abschup pung	merklich wirksam bis wirksam	unwirksam	unwirksam

fPyrrolnitrin

Cl NO₀

** Clotrimazol

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Nach 8-tägiger Behandlung wurden drei Hautstücke von den infizierten Flächen gesammelt und auf einer Sabouraud¹sehen Agarplatte 7 Tage kultiviert zur Bestimmung des "infected organism cultivation positive ratio".

Bei der Gruppe, die mit der SF-2O8OA-Substanz behandelt worden war, wurde, im Vergleich zu der mit Pyrrolnitrin behandelten Gruppe und der mit Clotrimazol behandelten Gruppe und der Gruppe, die keine Behandlung erfuhr, eine deutliche Abnahme im "cultivation positive ratio" festgestellt (siehe Tabelle 8)

Tabelle 8

Tage der Kultivierung	SF-2O8OA- Substanz (%)	Pyrrol- nitrin (%)	Clotri mazol (%)	keine Be handlung (%)
3 5 7	25 37 37	62 87 87	75 96 96	100 100 100

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Claims

PATENTANSPRÜCHE

1. SF-2O8OA-Substanz mit den folgenden Eigenschaften:

Elementaranalyse (Gew.%): C 27,06, H 1,17, N 14,84, Cl 39,23;

Molekulargewicht: 181 (nach dem Massenspektrum); Molekularformel: C₄H₂N₂O₂Cl₂;

Schmelzpunkt: 205 bis 2O7°C (unter Zersetzung);

— —25
Optische Drehung: 1&±/Z -0 (C=O,5, Methanol);

±/Z

Ultraviolettabsorptionsspektrum: gemäss Fig. 1, Absorptionsmaxima sind 269 und 320 nm in Methanollösung, 271 und 320 nm in einer 0,01 N chlorwasser stoff sauren Methanollösung, und 220 and 325 nm in einer 0,01 N Natriumhydroxid-Methanollösung;

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ORIGINAL INS££CTE§

Infrarotabsorptionsspektrum: gemäss Fig. 2, die Absorptionsbanden, bestimmt nach der Kaliumbromidtablettenmethode, sind 3270, 3150, 1570, 1510, 1480, 1400, 1360, 1280, 1200, 1140, 1070, 960, 830; 820, 750 cm"¹;

Farbreaktion: positiv für die Jodreaktion und Lemieux-Reaktion und negativ bei der Ninhydrinreaktion und der Ferrichloridreaktion;

Aussehen und Farbe: hellbraune bis gelbe, nadeiförmige Kristalle;

elektrische Eigenschaften: verhält sich bei einer Papierelektrophorese bei hoher Spannung wie eine neutrale Substanz;

Rf-Werte bei Dünnschichtchromatografie (Kieselgel):

0,68 (Benzol/Aceton = 2:1 (Volumen)),

0,73 (Chloroform/Methanol = 10:1 (Volumen));

Löslichkeit: leicht löslich in Methanol und Aceton, löslich in Chloroform und schwach löslich in Wasser und n-Hexan;

scheinbare Strukturformel:

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2. Antimykotisches Mittel, enthaltend als aktive Komponente SF-2O8OA-Substanz der allgemeinen Formel

Cl NO₂

C]

N H

3. SF-2O8OB-Substanz mit folgenden Eigenschaften:

Elementaranalyse (Gew.%): C 36,79, H 1,67, N 7,95, Cl 39,89;

Molekulargewicht: 356 (nach dem Massenspektrum); Molekularformel: C₁₁HgN₂O₃Cl₄;

Schmelzpunkt: 202 bis 211°C (unter Zersetzung);

— —25
Optische Drehung: ΙοΟ_/_Ώ =0 (C=O,5, Methanol);

Ultraviolettabsorptionsspektrum: gemäss Fig. 3, die Absorptionsmaxima sind 276 und 328 nm in methanolischer Lösung, 277 und 335 nm in einer 0,01 N salzsauren Methanollösung und 245 und 313 nm in einer 0,01 N Natriumhydroxid-Methanollösung;

Infrarotabsorptionsspektrum: gemäss Fig. 4, die Absorptionsbanden, bestimmt nach der Kaliumbromidtablettenmethode sind 3360, 1580, 1510, 1490, 1480, 1440, 1420, 1360, 1310, 1290, 1240, 1210, 1160, 1110, 930, 890, 860, 800, 770, 740 cm~¹;

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Farbreaktion: positiv bei der Jodreaktion und Lemieux-Reaktion, und negativ bei der Ninhydrinreaktion und Ferrichloridreaktion;

Aussehen und Farbe: gelbe nadeiförmige Kristalle;

elektrische Eigenschaften: verhält sich bei einer Papierelektrophorese unter hoher Spannung wie eine neutrale Substanz;

Rf-Werte bei der Dünnschichtchromatografie (Kieselgel) : 0,73 (Benzol/Aceton = 2:1 (Volumen)), 0,80 (Chloroform/Methanol = 10:1 (Volumen));

scheinbare Strukturformel:

4. Verfahren zur Herstellung der antibiotischen SF~2O8OA-Substanz, dadurch gekennzeich net, dass man einen SF-2O8OA-Substanz produzierenden Stamm vom Genus Streptomyces in einem Nährmedium kultiviert und aus der Kultur das Antibiotikum SF-2O8OA gewinnt.

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5. Verfahren zur Herstellung einer antibiotischen SF-2O8OB-Substanz, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Antibiotikum SF-2O8OB-Substanz produzierenden Stamm vom Genus Streptomyces in einem Nährmedium kultiviert und aus der Kultur des Antibiotikum SF-2O8OB gewinnt.

6. Verfahren gemäss Ansprüchen 4 oder 5, dadurch gekennz e ichnet , dass der Stamm vom Genus Streptomyces Streptomyces sp. SF-2O8O (FERM-P Nr. 5072, ATCC Nr. 31673) ist.

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