DE3003359C2

DE3003359C2 -

Info

Publication number: DE3003359C2
Application number: DE3003359A
Authority: DE
Inventors: Eiji Takarazuka Hyogo Jp Higashide; Seiichi Nagaokakyo Kyoto Jp Tanida; Masayuki Suita Osaka Jp Muroi; Mitsuko Takatsuki Osaka Jp Asai
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1979-02-02
Filing date: 1980-01-31
Publication date: 1987-10-01
Also published as: US4292309A; CA1152915A; IT1133059B; ES488171A0; GB2042502A; NL8000627A; JPS55104297A; IT8067162A0; GB2042502B; FR2447932B1; FR2447932A1; ES8107303A1; DE3003359A1; JPS6225156B2

Description

Die Erfindung betrifft neue Antibiotika mit der Bezeichnung C-14 482 B₁, B₂ und B₃ und ein Verfahren zu ihrer Herstellung.

Von der Anmelderin wurden Proben aus der Natur einschließlich der verschiedensten Boden- und Pflanzenproben entnommen, und die von diesen Proben isolierten Mikroorganismen und ihre künstlichen Mutanten wurden einer Auswahluntersuchung bezüglich der von ihnen gebildeten Antibiotika unterworfen. Die Untersuchungsarbeit führte zu der Feststellung, daß ein bestimmter Mikroorganismus neue Antibiotika zu bilden vermag, daß dieser Mikroorganismus zur Gattung Nocardia gehört und daß durch Kultivieren dieses Mikroorganismus in einem geeigneten Nährmedium unter geregelten Fermentationsbedingungen diese Antibiotika im Kulturmedium angereichert werden. Auf diese Feststellungen folgte weitere Forschungsarbeit, die in der vorliegenden Erfindung gipfelte.

Die Erfindung umfaßt daher
die Antibiotika C-14482 B₁, B₂, B₃ und ihre Salze gemäß den Merkmalen des Patentanspruches 1, sowie
die Herstellung der Antibiotika C-14482 B₁, B₂ und/oder B₃ nach einem Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Nocardia IFO 13 725 oder Nocardia IFO 13 887 in einem Nährmedium züchtet und die Antibiotika C-14 482 B₁, B₂ und/oder B₃ im Kulturmedium anreichert und isoliert.

In dieser Beschreibung sind die Antibiotika C-14 482 B₁, B₂ und B₃ zuweilen kurz als "C-14 482 B₁", "C-14 482 B₂" bzw. "C-14 482 B₃" bezeichnet.

Die für die Zwecke der Erfindung geeigneten Mikroorganismen sind Nocardia sp. Nr. C-14 482 , Stamm IFO 13 725 (nachstehend zuweilen kurz als "Stamm IFO 13 725" bezeichnet) , ein Actinomycet, der von der Anmelderin im Verlauf ihrer Suche nach antibiotikabildenden Mikroorganismen isoliert wurde, und Nocardia sp. Nr. 14 482, Stamm IFO 13 887 (nachstehend zuweilen kur als "Stamm IFO 13 887" bezeichnet), ein Mutantenstamm, der aus dem vorstehend genannten Ursprungsstamm durch übliche Mutationsmethoden gewonnen wurde. Diese Stämme sind neue Spezies von Mikroorganismen, die zu einem neuen Typ der Gattung Nocardia gehören, wie die folgende Beschreibung zeigt.

Die mikrobiologischen Eigenschaften des Stamms IFO 13 725 wurden nach der Methode von Schirling und Gottlieb (International Journal of Systematic Bacteriology 16 [1966], 313-340) untersucht. Die Beobachtungsergebnisse, die mit Kulturen der Mikroorganismen bei 28°C für 21 Tage erhalten wurden, sind nachstehend genannt.

1) Morphologische Eigenschaften

Das vegetative Mycel ist farblos bis blaßgelb oder orangegelb und entwickelt sich gut mit Verzweigungen sowohl auf Agar als auch in flüssigen Medien. Das vegetative Mycel hat zum größten Teil einen Durchmesser von 0,5 bis 1,2 µm und teilt sich in den späten Phasen der Kultivierung in Fragmente, die stäbchenförmigen Bakterien, langgestreckten stäbchenförmigen Bakterien oder verzweigten Hyphen ähneln. Dieser Stamm zeigt gutes Wachstum auf verschiedenen Medien. Während das Luftmycel sich auf dem vegetativen Mycel gut entwickelt, zeigt es in vielen Fällen ein Aussehen, als wäre es auf einer großen Zahl von coremia-artigen Körpern (50 bis 180 µm×400 bis 1500 µm) gewachsen. Ein großer Teil der Lufthyphen ist gewunden oder gerade, wobei in wenigen seltenen Fällen eine lose spiralförmige Gestalt festzustellen ist. Die Untersuchung gealteter Kulturen unter dem Mikroskop zeigt, daß die Sporen nur in wenigen Fällen in Ketten auftreten und nur wenig sog. Konidien oder Sporen vorhanden sind. Die Untersuchung von Zellen, die von der Oberfläche einer solchen Kultur entnommen wurden, unter dem Mikroskop zeigte die Anwesenheit vieler langgestreckter elliptischer Zellen (0,5 bis 1,2 µm×4,8 bis 6,8 µm) und elliptischer Zellen (0,8 bis 1,2 µm×1,5 bis 4 µm), die wie fragmentierte Zellen oder Arthrosporen aussahen und deren Oberflächen bei Untersuchung durch Elektronenmikroskopie glatt waren. Das Luftmycel ist im allgemeinen spärlich. Zwar wird ziemlich gutes Wachstum auf vielen Medien während einer Inkubation für 3 bis 7 Tage festgestellt, jedoch verschwindet es zuweilen, wenn die Kultivierung mehr als 10 Tage durchgeführt wird.

Bei der Kultivierung in flüssigen Medien zeigt der Mikroorganismus Mobilität in einer Wachstumsphase, wenn das Mycel Polymorphismus, d. h. die Form von Stäbchen, verzweigten Zellen der Stäbchen oder langgestreckten Stäbchen, die entweder unabhängig als solche, in Ketten oder verzweigt vorliegen, zeigt. Die Untersuchung im Elektronenmikroskop ergibt eine große Zahl von langgestreckten Geißeln rings um die Zellen.

2) Bestandteile der Zellen

Der Stamm wurde in modifiziertem ISP-Medium Nr. 1 66 bis 90 Stunden in der Schüttelkultur bei 28°C kultiviert. In der stationären Phase guten Wachstums wurden die Zellen abgetrennt und gespült. Sie wurden nach der Methode von B. Becker und Mitarbeitern (Applied Microbiology 12 [1964], 421) und nach der Methode von M. P. Lechevalier (Journal of Laboratory und Clinical Medicine 71 [1968], 934) auf Diaminopimelinsäure und Zuckerzusammensetzung untersucht. Es wurde festgestellt, daß die erstere in der meso-Form vorlag, während hinsichtlich der letzteren örtlich begrenzte Stellen, die Galactose und Arabinose entsprachen, festgestellt wurden. Nach der Methode von B. Becker und Mitarbeitern (Applied Microbiology 17 [1965], 236) wurden Zellwände isoliert und auf Diaminopimelinsäure, Zucker und Aminosäuren analysiert. Die Diaminopimelinsäure wurde in ihrer meso-Form festgestellt. Während jedoch eine große Menge Galactose als Zuckerbestandteil nachgewiesen wurde, wurde Arabinose nicht nachgewiesen. Als Aminosäuren wurden Glutaminsäure und Alanin eindeutig nachgewiesen, während Lysin und Glycin nur in Spuren gefunden werden konnten.

3) Kulturmerkmale

Der Stamm zeigt stets verhältnismäßig gutes Wachstum auf verschiedenen Medien, wobei das vegetative Mycel in den Anfangsphasen der Kultur farblos bis blaßgelb und in den späteren Phasen blaßgelblich braun bis gelbbraun ist. Der Mikroorganismus bildet in den meisten taxonomischen Medien keine löslichen Pigmente, jedoch in einigen wenigen Medien schwachbraune lösliche Pigmente. Das Luftmycel ist mehlähnlich, wächst im allgemeinen mäßig und zeigt eine weiße bis gelbe oder blaßgelblichbraune Farbe. Auf vielen Medien verschwindet das Luftmycel bei längerer Kultivierung (etwa 2 Wochen oder länger), wobei die Oberfläche des vegetativen Mycels glänzend zu werden beginnt. Die Kulturmerkmale dieses speziellen Stammes sind nachstehend in Tabelle 1 genannt.
Wachstum (W):schlecht, dünn, farblos Luftmycel (LM):spärlich, weiß Lösliches Pigment (LP):nicht vorhanden

B) Glucosenitratagar

W:schlecht, dünn, farblos LM:sehr spärlich, weiß LP:nicht vorhanden

C) Glycerinnitratagar

W:mäßig, farblos bis Lt Melon Yellow oder Colonial Yellow Maize (3 ea oder 2 ga)*) oder Brite Melon Yellow (3 ia)*); Bildung von coremiaartigen Körpern. LM:sehr spärlich, weiß bis Lt Melon Yellow (3 ea)*) LP:nicht vorhanden.

D) Glucose-Asparaginagar

W:mäßig, farblos bis Melon Yellow (3 ga)*) LM:spärlich, Lt Melon Yellow (3 ea)*) LP:nicht vorhanden.

E) Glycerin-Asparaginagar

W:mäßig, farblos bis Melon Yellow (3 ga)*) LM:mäßig, weil bis Lt Wheat (3 ea)*) LP:nicht vorhanden.

F) Nähragar

W:mäßig, farblos bis Lt Ivory (2 ca)*) oder Melon Yellow (3 ga)*) LM:nicht vorhanden. LP:nicht vorhanden.

G) Calciummalatagar

W:mäßig, farblos bis Melon Yellow (3 ga)*) oder Brite Marigold (3 pa)*); Bildung von coremia-artigen Körpern LM:mäßig, weil LP:nicht vorhanden.

H) Hefeextrakt-Malzextraktagar

W:üppig, farblos bis Melon Yellow (3 ga)*) oder Brite Maize (3 la)*); Bildung von coremia-artigen Körpern LM:mäßig, weiß bis Pearl Pink (3 ca)*) oder Lt Melon Yellow (3 ea)*) LP:blaßgeblichbraun

I) Hafermehl-Agar

W:mäßig, farblos bis Melon Yellow (3 ga)*) oder Lt Ivory (2 ca)*) LM:mäßig, weiß bis Lt Melon Yellow (3 ea)*) oder Pearl Pink (3 ca)*) LP:nicht vorhanden oder blaßgelblichbraun

J) Stärkeagar

W:mäßig, farblos bis Melon Yellow oder Colonial Yellow Maize (3 ga oder 2 ga)*) LM:spärlich, weiß bis Lt Melon Yellow (3 ea)*) LP:nicht vorhanden

K) Pepton-Hefeextrakt-Eisenagar

W:mäßig, farblos bis Beige Brown (3 ig)*) oder Brite Maize (3 la)*) LM:nicht vorhanden oder spärlich, weiß LP:blaßgelblichbraun

L) Tyrosin-Agar

W:mäßig, farblos bis Beige Brown (3 ig)*) oder Brite Maize (3 la)*); Bildung von coremia-artigen Körpern LM:spärlich, Pearl Pinkt (3 ca)*) oder Brite Maize (3 la)*) LP:hellgelblichbraun (mit einem Hauch von Purpur)

*) Die Farbbezeichnungen entsprechen dem Color Harmony Manual, 4. Auflage (Container Corporation of America 1958).

4) Physiologische Eigenschaften

Die physiologischen Eigenschaften des Stamms sind in Tabelle 2 genannt. Temperaturbereich für das Wachstum: 12° bis 38°C. Der Temperaturbereich, in dem Wachstum des Luftmycels auf Agar (ISP Nr. 2) stattfindet, ist 20 bis 35°C.
Wachstumstemperaturbereich12 bis 38°C Temperaturbereich für das Wachstum des Luftmycels20 bis 35°C Verlüssigung von Gelatinesehr schwach Hydrolyse von Stärkepositiv Reduktion von Nitratenpositiv Peptonisierung von Milchpositiv Gerinnung von Milchnegativ Zersetzung von Caseinpositiv Bildung von schwarzen Pigmenten:

Pepton-Hefeextrakt-Eisenagarnegativ Tyrosinagarnegativ Zersetzung von Tyrosinpositiv Zersetzung von Xanthinnegativ Zersetzung von Hypoxanthinnegativ Verträglichkeit mit Lysozympositiv Verträglichkeit mit Natriumchlorid2%

5) Verwertung verschiedener Kohlenstoffquellen

Die Verwertung verschiedener Kohlenstoffquellen wurde nach der Methode von Pridham und Gottlieb (Journal of Bacteriology 56 [1948], 107) mit einem Basalmedium der gleichen Zusammensetzung, ergänzt mit 0,1% Hefeextrakt (Difco Co.), untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 genannt.

Tabelle 3

Verwertung von Kohlenstoffquellen durch den Stamm IFO 13 725

6) Andere Merkmale

Die Zellen wurden auf die unter (2) "Bestandteile der Zellen" beschriebene Weise isoliert und einer Behandlung zur Herstellung von DNA nach dem Verfahren von J. Murmar et al. (Journal of Molecular Biology 3 [1961], 208) unterworfen. Der G-C-Gehalt (Guanin-Cytosin) des DNA wurde mit etwa 71 Mol.-% ermittelt.

Die Gram-Färbung des vegetativen Mycels dieses Stamms war positiv.

Die vorstehenden Merkmale des Stamms IFO 13 725 wurden mit den Beschreibungen in "The Actinomycetes", Band 2 von S. A. Waksman (The Williams and Wilkins Co. 1961), R. E. Buchanan und N. E. Gibbons in "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology", 8. Auflage 1974 und anderen Literaturstellen verglichen.

Die vorstehend genannten Beobachtungen, daß 1) der Stamm in den späteren Phasen der Kultivierung in die Form von Stäbchen oder langgestreckten Stäbchen oder deren verzweigte Zellen zerfällt, 2) wenig wohldefinierte Konidien oder Sporen bildet, 3) die Oberflächen seiner Kolonien auf Agar lederartig und in vielen Fällen glänzend wie Bakterienkolonien sind und 4) der G-C-Gehalt des Mycels etwa 71 Mol-% beträgt, lassen zusammen mit den anderen Merkmalen darauf schließen, daß der Stamm zur Gruppe III der Gattung Nocardia gehört. Da es jedoch der Anmelderin unmöglich war, irgendwelche bekannten Stämme von Mikroorganismen zu finden, die alle vorstehend genannten Kulturmerkmale, physiologische Merkmale, Zellmotilität, Zellwandzusammensetzung usw. mit dem Stamm gemäß der Erfindung teilen, identifzierte die Anmelderin diesen Stamm als neue Spezies.

Der Stamm IFO 13 725 wurde bei der folgenden Kultursammelstelle mit der genannten Zugangsnummer hinterlegt: Institute for Fermentation, Osaka, Japan, IFO 13 725.

Eine übliche Mutagenese des Stamms IFO 13 725 als Ursprungsstamm ergibt den Stamm IFO 13 887, eine Variante, die vorteilhaft das Antibiotikum C-14 482 B zu bilden vermag. Dieser Stamm hat die Fähigkeit, C-14 482 B in erhöhten Mengen im Vergleich zu seinem Ursprungsstamm zu bilden, und ist dem Ursprungsstamm in den taxonomischen Eigenschaften mit Ausnahme der in Tabelle 4 genannten physiologischen Eigenschaften gleich.

Tabelle 4

Empfindlichkeit für Antibiotika (Mindesthemmkonzentration in µg/ml)

Der Stamm IFO 13 887 wurde bei der folgenden Kultursammelstelle mit der genannten Zugangsnummer hinterlegt: Institute for Fermentation, Osaka, Japan, IFO 13 887.

Das spezielle Verfahren zur Gewinnung des Stamms IFO 13 887 kann beispielsweise wie folgt durchgeführt werden: Man kultiviert den Ursprungsstamm IFO 13 725 auf einer Platte, die Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar (ISP-2) enthält, 4 Tage bei 32°C, isoliert die gewachsenen Hyphen, suspendiert sie in 0,05molarem Kaliumphosphatpuffer, filtriert die Suspension mit Filterpapier und nimmt die die Mutation auslösende Behandlung wie folgt vor: Beispielsweise wird das erhaltene Filtrat mit Ultraviolettlicht so behandelt, daß die Zahl lebensfähiger Zellen im Bereich von 2% liegt, und bringt die Zellen unmittelbar auf eine Hefeextrakt-Malzextrakt-Agarplatte auf, die 10 µg/ml Lincomycin enthält, worauf die Kultur 6 Tage bei 32°C inkubiert wird. In dieser Weise kann der Stamm IFO 13 887 von den gebildeten Kolonien gewonnen werden.

Der erhaltene Variantenstamm wird für die Kultivierung zur Erzeugung von Antibiotika in ein Nährmedium geimpft. Hierbei wird festgestellt, daß die gebildeten Mengen der Antibiotika C-14 482 B₁, B₂ und B₃ im Kulturmedium höher sind als bei der Kultivierung des Ursprungsstamms.

Die neue Spezies Nocardia sp. C-14 482 hat beispielsweise die folgenden Merkmale:

1) grampositiv
2) das vegetative Mycel hat einen Durchmesser von 0,5 bis 1,2 µm und entwickelt sich gut. Es teilt sich in Fragmente, die stäbchenförmigen Bakterien oder langgestreckten stäbchenförmigen Bakterien ähneln, und zeigt Motilität. (Von den Varianten teilen sich jedoch einige weniger stark und andere stärker in Fragmente.)
3) Die Haftung oder Adhäsion des Luftmycels ändert sich mit den Eigenschaften des Stamms. Normalerweise haftet das weiße bis gelbe Luftmycel, während es bei den Variantenstämmen kaum haftet.
4) Das Luftmycel läßt man auf einem flüssigen Medium schwimmen und hält es etwa 30 Minuten bei einer geeigneten Temperatur, wobei bewegliche Zellen beobachtet werden.
5) Mesodiaminopimelinsäure und Galactose sind in den Zellwänden enthalten.

Das für die Kultivierung des C-14 482 B bildenden Mikroorganismus verwendete Nährmedium kann flüssig oder fest sein, vorausgesetzt, daß es die vom Mikroorganismus verwertbaren Nährstoffe enthält, jedoch wird ein flüssiges Nährmedium für die Großherstellung bevorzugt. Das Nährmedium enthält in geeigneter Form die Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, die der C-14 482 B bildende Mikroorganismus assimilieren und digerieren kann, anorganische Stoffe, Spurennährstoffe usw. Als Kohlenstoffquellen eignen sich beispielsweise Glucose, Lactose, Saccharose, Maltose, Dextrin, Stärke, Glycerin, Mannit, Sorbit, Fette und Öle (z. B. Sojabohnenöl, Schmalzöl, Hühneröl usw.) und n-Paraffine. Als Stickstoffquellen eignen sich beispielsweise Fleischextrakt, Hefeextrakt, Trockenhefe, Sojabohnenmehl, Maisquellwasser, Pepton, Baumwollsaatmehl, ausgebrauchte Melasse, Harnstoff, Ammoniumsalze (z. B. Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumnitrat und Ammoniumacetat) usw. Das Medium kann ferner Salze von Natrium, Kalium, Calcium, Magnesium usw., Salze von Eisen, Mangan, Zink, Kobalt, Nickel usw., Salze von Phosphorsäure und Borsäure sowie Salze von organischen Säuren, z. B. Essigsäure und Propionsäure, enthalten. Ferner können dem Medium verschiedene Aminosäuren (z. B. Glutaminsäure, Asparaginsäure, Alanin, Lysin, Methionin und Prolin), Peptide (z. B. Dipeptide und Tripeptide), Vitamine (z. B. B₁, B₂, Nicotinsäure, B₁₂ und Vitamin C), Nucleinsäuren (z. B. Purin, Pyrimidin und die entsprechenden Derivate) zugesetzt werden. Zur Einstellung des pH- Werts des Mediums können anorganische oder organische Säuren, Alkali, Puffer oder dgl. zugesetzt werden. Öle und Fette, oberflächenaktive Mittel usw. können ebenfalls in geeigneten Mengen zur Schaumverhütung zugesetzt werden.

Die Kultivierung kann in stationärer Kultur, Schüttelkultur, aerober Submerskultur und nach anderen Züchtungsverfahren durchgeführt werden. Für die Großherstellung wird natürlich die aerobe Submerskultur bevorzugt. Die Kultivierungsbedingungen hängen natürlich vom Zustand und von der Zusammensetzung des Mediums, vom Stamm, der Kultivierungsmethode und andere Faktoren ab, jedoch wird vorzugsweise bei 20 bis 32°C und einem Anfangs-pH-Wert beim Neutralpunkt gearbeitet. Besonders zweckmäßig ist eine Temperatur von 25° bis 28°C in einer Zwischenstufe der Kultivierung bei einem Anfangs-pH-Wert von 6,5 bis 7,5. Die Dauer der Kultivierung hängt ebenfalls von den vorstehend genannten Faktoren ab, jedoch ist es zweckmäßig, die Kultivierung durchzuführen, bis der Titer des gewünschten Antibiotikums maximal wird. Im Falle der Schüttelkultur oder aeroben Submerskultur im flüssigen Medium liegt die erforderliche Zeit normalerweise im Bereich von etwa 3 bis 8 Tagen.

Aus dem in der vorstehend beschriebenen Weise erhaltenen Kulturmedium kann das Antibiotikum C-14 482 B vorteilhaft durch Verfahren, die normalerweise zur Isolierung von Metaboliten aus Mikrobeinkulturen angewendet werden, isoliert werden. Da das Antibiotikum C-14 482 B schwach basisch und in halogenierten Kohlenwasserstoffen und Alkoholen ziemlich leicht löslich ist, kann es beispielsweise mit Hilfe einer geeigneten Kombination von Verfahren, bei denen diese Eigenschaften ausgenutzt werden, isoliert werden.

Da das Antibiotikum C-14 482 B in erster Linie im Filtrat des Kulturmediums vorliegt und in saurem Wasser löslicher und im sauren Bereich stabiler ist, wird das Kulturmedium mit einer anorganischen Säure, z. B. Salzsäure und Schwefelsäure, oder einer organischen Säure, z. B. Oxalsäure und Essigsäure, angesäuert und filtriert, um die Mikrobienzellen zu entfernen, worauf das erhaltene Filtrat der Kultur neutralisiert oder schwach basisch eingestellt wird, um das Antibiotikum unter Verwendung eines mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittels zu isolieren und zu gewinnen. Als organische Lösungsmittel eignen sich für die Extraktion beispielsweise Alkohole (z. B. n-Butanol und Isobutanol) und halogenierte Kohlenwasserstoffe (z. B. Chloroform und Methylenchlorid). Außerdem sind Ester von Fettsäuren (z. B. Äthylacetat und Butylacetat), Ketone (z. B. Methylisobutylketon) und dgl. zur Gewinnung des Antibiotikum C-14 482 B gut geeignet, wenn diese Lösungsmittel für die Extraktion verwendet werden, während mit Natriumchlorid, Ammoniumsulfat usw. ausgesalzt wird.

Das in dieser Weise im organischen Lösungsmittel extrahierte Antibiotikum C-14 482 B gemäß der Erfindung kann dann mit Hilfe einer verdünnten wäßrigen Mineralsäure, einer verdünnten wäßrigen organischen Säure oder einer sauren Pufferlösung in eine wäßrige Phase überführt und hierbei gereinigt werden.

Das in den Zellen vorhandene Antibiotikum C-14 482 B kann aus den Zellen mit einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel, einer verdünnten wäßrigen Mineralsäure oder einem Gemisch dieser Lösungsmittel extrahiert werden.

In gewissen Fällen kann das die Zellen enthaltende Kulturmedium als solches schwach sauer eingestellt und mit einem zugesetzten, mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel, z. B. Aceton und Methanol, gerührt, anschließend extrahiert und filtriert und das filtrat unter vermindertem Druck eingeengt werden. Das erhaltene Konzentrat wird in der gleichen Weise, wie im Zusammenhang mit dem Filtrat und dem Kulturmedium beschrieben, behandelt.

Nach einem anderen Verfahren zur Isolierung des Antibiotikum C-14 482 B aus dem Filtrat des Kulturmediums wird die aktive Substanz mit einem Adsorptionsmittel adsorbiert und mit einem geeigneten Lösungsmittel eluiert. Als Adsorptionsmittel eignen sich beispielsweise Aktivkohle und nichtionische poröse Ionenaustauscherharze. Als Elutionsmittel werden beispielsweise wäßrige Alkohole (z. B. wäßriges Methanol, wäßriges n-Propanol oder wäßriges Isobutanol), wäßriges Aceton oder wäßrige Medien, die vorher durch Zusatz einer verdünnten Mineralsäure oder dgl. angesäuert worden sind, bevorzugt, jedoch kann das Antibiotikum C-14 482 B auch mit einem organischen Lösungsmittel, z. B. Äthylacetat, Chloroform oder einem Gemisch dieser Lösungsmittel mit Wasser (mit Wasser gesättigtes Äthylacetat oder mit Äthylacetat gesättigtes Wasser) eluiert werden.

Es ist auch möglich, das Antibiotikum C-14 482 B unter Ausnutzung seiner schwach basischen Natur durch Adsorption an einem Kationenaustauscher, z. B. einem Kationenaustauscher, Kationenaustauschercellulose und dem Kationenaustauscher Sephadex® zu adsorbieren und mit verschiedenen Elutionsmitteln zu desorbieren.

Zur Elution der aktiven Substanz vom Ionenaustauscher kann eine verdünnte wäßrige Lösung einer Mineralsäure, z. B. verdünnte Salzsäure, eine wäßrige Lösung eines Salzes wie Natriumchlorid, Ammoniumformiat und Ammoniumacetat, eine basische wäßrige Lösung, z. B. verdünntes wäßriges Ammoniak und verdünntes wäßriges Pyridin, oder ein Gemisch dieser Lösungsmittel mit wasserlöslichen organischen Lösungsmitteln, z. B. Methanol und Aceton, verwendet werden.

Durch eine geeignete Kombination der vorstehend beschriebenen Reinigungsverfahren, die vom Gehalt an aktiven Komponenten und Verunreinigungen im Kulturmedium und dessen Zusammensetzung abhängt, kann die gewünschte antibiotische Komponente mit hohem Reinheitsgrad erhalten werden. Zur Gewinnung eines Produkts von höherer Reinheit können Adsorptionsmittel wie Kieselgel, Aluminiumoxid oder Dextrangel in nicht-wäßrigen Lösungsmitteln, z. B. das Produkt Sephadex®LH-20, verwendet werden.

Als Entwicklerlösungsmittel eignen sich bei Verwendung von Kieselgel als Adsorptionsmittel die normalerweise für die Abtrennung von organischen Verbindungen verwendeten Lösungsmittel, z. B. halogenierte Lösungsmittel (Chloroform und Methylenchlorid), Alkohole (z. B. Methanol und Äthanol), Gemische dieser Lösungsmittel, z. B. ein Gemisch von Chloroform und Methanol, und Gemische von Estern (z. B. Äthylacetat) mit Alkoholen.

Für die weitere Reinigung eignen sich beispielsweise Methoden, bei denen die Unterschiede im Verteilungskoeffizienten ausgenutzt werden, und Verfahren, bei denen gewisse Adsorptionsmittel verwendet werden.

Häufig werden in einer Kultur des Stamms IFO 13 725, eines der C-14 482 B bildenden Mikroorganismen, gleichzeitig mehrere aktive Substanzen mit ähnlichen Eigenschaften gebildet. Hiervon sind C-14 482 A₁ (DE-OS 28 33 689), C-14 482 B₁, B₂ und B₃ zu erwähnen. Um diese aktiven Substanzen voneinander zu trennen, können die nachstehend genannten Verfahren zur Trennung und Reinigung angewendet werden. Zu den Verfahren, bei denen Unterschiede im Verteilungskoeffizienten ausgenutzt werden, gehören beispielsweise das Verteilungsverfahren, das auf Unterschieden in den Verteilungskoeffizienten verschiedener Komponenten zwischen zwei Lösungsmitteln, die zwei nicht mischbare Phasen bilden, beruht, das Gegenstromverteilungsverfahren und die Teilungschromatographie unter Verwendung von Cellulosepulver als Trägermaterial.

Bei der Aufteilung zwischen Chloroform und Wasser bei pH 8,0 zeigen beispielsweise C-14 482 B₁ und B₂ in der Chloroformschicht höhere Löslichkeit, jedoch einen niedrigeren Verteilungskoeffizienten im Vergleich zu C-14 482 A₁. Im Gegensatz hierzu wandern bei Aufteilung zwischen Chloroform und Wasser bei pH 5 die Antibiotika C-14 482 B₁ und B₂ in die Wasserschicht, während C-14 482 A₁ weitgehend in der Chloroformschicht bleibt.

Bei Anwendung des Adsorptionsverfahrens unter Verwendung von beispielsweise Kieselgel als Adsorptionsmittel wird das Gemisch von C-14 482 B₁, B₂ und B₃ an einer Säule oder Dünnschicht aus Kieselgel chromatographiert, worauf beispielsweise mit einem Lösungsmittelgemisch aus Chloroform und Methanol entwickelt wird, wodurch eine Trennung in C-14 482 A₁ und C-14 482 B₁, B₂ und B₃ erfolgt.

Wenn C-14 482 A₁ und C-14 482 B₁, B₂ und B₃ an einer Säule des Ionenaustauschers Amberlite®XAD-2 chromatographiert werden, weisen sie einen Unterschied in der Adsorptionsfähigkeit im sauren Zustand auf und können unter Ausnutzung dieses Unterschiedes voneinander getrennt werden.

Wenn C-14 482 B₁, B₂ und B₃ an einer Kieselgel-Dünnschicht unter Verwendung eines Lösungsmittelgemisches aus Äthylacetat und Methanol usw. chromatographiert werden, werden sie voneinander getrennt, wobei die gereinigten Produkte B₁, B₂ und B₃ erhalten werden. Wenn insbesondere C-14 482 B₁ als Hauptkomponente in ziemlich großen Mengen im Kulturmedium vorhanden ist, können die Dünnschichtchromatographie an Kieselgel, die Trennung von C-14 482 B₁, B₂ und B₃ voneinander, die Säulenchromatographie an Kieselgel oder einem nicht-ionischen Austauscherharz, die Maßnahme der Abtrennung von C-14 482 A₁ und andere Stufen weggelassen werden. Statt dessen wird lediglich ein rohes Produkt aus Chloroform oder Aceton-Hexan usw. umkristallisiert, wodurch C-14 482 B₁ isoliert wird.

Von den in dieser Weise gereinigten und getrennten Antibiotika C-14 482 B₁, B₂ und B₃ wird C-14 482 B₁ in Form von rötlichbraunen Kristallen aus Aceton-Hexan oder Chloroform erhalten, wobei die aus Chloroform erhaltenen Kristalle normalerweise etwa 1 Mol Chloroform als Kristallisationslösungsmittel enthalten. C-14 482 B₂ und B₃ stellen Spurenkomponenten dar und werden normalerweise als rötlichbraunes, amorphes Pulver, jedoch nicht in Form von Kristallen erhalten.

C-14 482 B₂ unterliegt während des Reinigungsvorgangs der Umwandlung in C-14 482 B₁ usw. und ist schwierig in Form von Kristallen zu isolieren, auch wenn die Reinigung vorsichtig bei niedriger Temperatur durchgeführt wird. Aus der Tatsache, daß die Substanz in einer Lösung sich leicht in B₁ usw. umwandelt, ist zu schließen, daß sie der Substanz B₁ ähnlich ist, obwohl die chemische Strukturbeziehung zwischen den Substanzen nicht geklärt ist.

Dennoch wird ein deutlicher Unterschied zwischen C-14 482 B₂ und C-14 482 B₁ auf den Dünnschichtchromatogrammen mit Kieselgel festgestellt: bei Verwendung des Lösungsmittelsystems (1) beträgt der Rf-Wert 0,37 für C-14 482 B₁, jedoch 0,43 für C-14 482 B₂. Im Lösungsmittelsystem (2) beträgt der Rf-Wert 0,31 für C-14 482 B₁, jedoch 0,23 für C-14 482 B₂.

Die Kristalle von C-14 482 B₁ (aus Aceton-Hexan umkristallisiert) sowie von C-14 482 B₂ und B₃, die gemäß den später folgenden Beispielen 1 bis 4 hergestellt wurden, haben die folgenden Kennzahlen:

a) C-14 482 B₁

(I) Elementaranalyse (%) (aus Aceton-Hexan umkristallisiert und 30 Stunden oder länger unter vermindertem Druck bei Raumtemperatur getrocknet):
C 55,61±1,0; H 6,31±0,5; N 13,64±1,0.
(II) Schmelzpunkt nicht unter 300°C.
(III) Spezifische Drehung : nicht meßbar (in Äthanol).
(IV) Absorptionsspektren im UV-Bereich und sichtbaren Bereich:
Die in Methanol und sichtbaren Bereich sind in Fig. 1 dargestellt.
V) Infrarotabsorptionsspektrum: Das Infrarotabsorptionsspektrum, aufgenommen nach der KBr-Scheibenmethode, ist in Fig. 2 dargestellt. Es zeigt die folgenden Hauptpeaks (Wellenzahlen):
3580, 3420, 3175, 2950, 2900, 2840, 1685, 1650, 1610, 1455, 1395, 1345, 1330, 1250, 1230, 1175, 1110, 1075, 1025, 1000, 965, 940, 915, 855, 825, 780, 760 cm^-1.
(VI) Löslichkeit:
unlöslich in Hexan und Petroläther,
schwerlöslich in Äthylacetat, Chloroform, Methylenchlorid, Diäthyläther und Wasser,
löslich in Äthanol,
leicht löslich in Methanol und Dimethylsulfoxid.
(VII) Farbreaktionen:
Negativ: Ninhydrin-Reaktion, Sakaguchi-Reaktion
Positiv: Dragendorff-Reaktion, Barton-Reaktion (wird allmählich blau). Kaliumpermanganat wird entfärbt.
(VIII) Acidität, Neutralität oder Basicität:
schwach basisch.
(IX) Farbe: dunkelrot oder rötlichbraun.
X) Stabilität bei Erhitzen für 1 Stunde bei 80°C:
bei pH 3, 4 und 5 leicht instabil; bei pH 6 ziemlich instabil; bei pH 7 und 8 instabil.
(XI) Dünnschichtchromatographie an Kieselgel (Spot Film f):
1) Chloroform-Methanol (9:1) Rf 0,37,
2) Äthylacetat-Methanol (1 : 1) Rf 0,31.
XII) Bildung von Salzen:
Da C-14 482 B₁ eine schwach basische Substanz ist, bildet es wasserlösliche Salze mit anorganischen Säuren wie Salzsäure, Schwefelsäure und Phosphorsäure und organischen Säuren wie Ameisensäure, Essigsäure, Bernsteinsäure, Malonsäure, Weinsäure, Citronensäure, Maleinsäure, Glucuronsäure, Ascorbinsäure, Lactobionsäure, Glucoheptonsäure, Glutaminsäure, Asparaginsäure und Methansulfonsäure. Es bildet ferner in Wasser schwerlösliche Salze mit Picrinsäure, Picrolonsäure, Stearinsäure usw. Diese Salze können durch direkte Zugabe eines Äquivalents der Säuren zu einer freien Base von C-14 482 B und ferner unter Verwendung von Ionenaustauschharzen hergestellt werden, wie in Beispiel 2 beschrieben. Beispielsweise eignen sich für die Herstellung der Salze die Salzformen, beispielsweise die Cl-Form, Phosphorsäureform und Essigsäureform, von Anionenaustauschharzen. Als Alternative können diese Salze in einem organischen Lösungsmittel durch Durchleiten beispielsweise durch eine Säule der Salzform, z. B. der Cl-Form und Essigsäureform, eines Ionenaustauscherharzes für nicht-wäßrige Lösungen, z. B. Amberlite®A-21 hergestellt werden.
Insbesondere können die wasserlöslichen Salze als Arzneimittelzubereitungen für die Injektion, die intravenös, intramuskulär und subkutan erfolgt, verwendet werden. Außerdem sind sie stabiler als die Basenform und werden für die Verwendung als Arzneimittel bevorzugt.

b) C-14 482 B₂

(I) Elementaranalyse (%) (30 Stunden oder länger unter verindertem Druck bei Raumtemperatur getrocknet):
C 57,40±1,0; H 6,51±0,5; N 13,44±1,0.
(II) Schmelzpunkt nicht unter 300°C.
(III) Absorptionsspektren im UV-Bereich und sichtbarem Bereich:
(IV) Infrarotabsorptionsspektrum: (KBr-Scheibe) (Fig. 3); Hauptpeaks (cm^-1):
3430, 2940, 2890, 1680, 1650, 1625, 1590, 1480, 1450, 1390, 1340, 1250, 1175, 1110, 1075, 1055, 1025, 995, 960, 940, 905, 855, 825.
(V) Löslichkeit:
unlöslich in Hexan und Petroläther,
schwerlöslich in Äthylacetat, Diäthyläther und Wasser,
löslich in Äthanol und Chloroform,
leicht löslich in Methanol und Dimethylsulfoxid.
(VI) Farbreaktionen:
negativ: Ninhydrin-Reaktion, Sakaguchi-Reaktion
positiv: Dragendorff-Reaktion, Barton-Reaktion (wird allmählich blau). Kaliumpermanganatreagenz wird entfärbt.
(VII) Acidität, Neutralität oder Basicität: schwach basisch.
(VIII) Farbe: dunkelrot bis rötlichbraun.
(IX) Dünnschichtchromatographie an Kieselgel (Spot Film f):
1) Chloroform-Methanol (9:1) Rf 0,43,
2) Äthylacetat-Methanol (1 : 1) Rf 0,23.
X) Bildung von Salzen:
C-14 482 B₂ bildet Salze mit den gleichen anorganischen und organischen Säuren, die mit C-14 482 B₁ reagieren.

c) C-14 482 B₃

(I) Elementaranalyse (%) (30 Stunden oder länger unter vermindertem Druck bei Raumtemperatur getrocknet):
C 58,74±1%; H 6,64±0,5%; N 14,31±1,0%.
(II) Schmelzpunkt nicht unter 300°C.
(III) Absorptionsspektren im UV-Bereich und sichtbaren Bereich:
(IV) Infrarotabsorptionsspektrum: (KBr-Scheibe) (Fig. 4), Hauptpeaks (cm^-1):
3430, 2940, 2890, 1680, 1650, 1630, 1595, 1450, 1390, 1340, 1320, 1250, 1175, 1105, 1075, 1020, 995, 935, 905, 825.
(V) Löslichkeit:
unlöslich in Hexan und Petroläther,
schwerlöslich in Äthylacetat, Diäthyläther und Wasser,
löslich in Äthanol und Chloroform,
leicht löslich in Methanol und Dimethylsulfoxid.
(VI) Farbreaktionen:
negativ: Ninhydrin-Reaktion, Sakaguchi-Reaktion
positiv: Dragendorff-Reaktion, Barton-Reaktion (wird allmählich blau). Kaliumpermanganat-Reagenz wird entfärbt.
(VII) Acidität, Neutralität oder Basicität: schwachbasisch.
(VIII) Farbe: dunkelrot bis rötlichbraun.
(IX) Dünnschichtchromatographie an Kieselgel (Spot Film f):
1) Chloroform-Methanol (9:1) Rf 0,20,
2) Äthylacetat-Methanol (1 : 1) Rf 0,18.
(X) Bildung von Salzen:
C-14 482 B₃ bildet Salze mit den gleichen anorganischen und organischen Säuren wie C-14 482 B₁.

Nachstehend sind die biologischen Aktivitäten des gemäß den Beispielen 1 bis 4 hergestellten Antibiotikums 14 482 B genannt.

Tabelle 5

Antimikrobielles Spektrum von Antibiotikum C-14 482 B₁

Tabelle 6

Wachstumshemmende Wirkung gegen Mikroorganismen

Die vorstehend genannte wachstumshemmende Wirkung gegen Mikroorganismen wurde nach der Papierscheibenmethode unter Verwendung von Antibiotikum-Medium 3 (Difco), das 1,2% Agar enthielt, als Testmedium bestimmt. Die Arzneimittelzubereitungen wurden in Form einer Methanollösung einer Konzentration von 20 µg/ml verwendet.

Bei einem Test an Mäusen (CF Nr. 1 männlich, 4 Wochen alt) zur Bestimmung der akuten Toxizität wurde eine Lösung von C-14 482 B₁ in physiologischer Kochsalzlösung intravenös verabreicht. Die ermittelte LD₅₀ des Antibiotikums betrug etwa 0,625 bis 1,25 mg/kg.

Wie vorstehend dargelegt, hat das Antibiotikum C-14 482 B gemäß der Erfindung eine starke hemmende Wirkung gegen gramnegative, grampositive und säurefeste Bakterien.

Das Antibiotikum ist daher wertvoll als antibakterielles Mittel gegen die in den Tabellen 5 und 6 genannten Bakterien. Ferner wird erwartet, daß diese Substanz angesichts ihrer Wirkung als Mittel zur Eliminierung von R-Plasmiden sowie ihrer Möglichkeit, als starker Inhibitor der Nucleinsäuresynthese zu dienen, als Antitumormittel geeignet ist.

Das Antibiotikum C-14 482 B kann als keimtötendes Mittel, Desinfektionsmittel oder Arzneimittel zur äußeren Anwendung, beispielsweise zur Desinfektion von Geschirr, chirurgischen Instrumenten, Vogelkäfigen, Händen usw. verwendet werden. Bei Verwendung des Antibiotikums als Bakterizid oder Desinfektionsmittel gegen Bakterien, beispielsweise die in Tabelle 5 und 6 genannten Bakterien, kann es als flüssige Zubereitung, die durch Auflösung von 1 mg Antibiotikum in 1000 bis 2000 ml Wasser hergestellt wird, angewendet werden. In diese Lösung werden die Gegenstände etwa 10 Minuten getaucht. Für die Verwendung dieses Antibiotikums als Arzneimittel zur äußeren Anwendung kann es zu einer Salbe beispielsweise durch gleichmäßiges Vermischen von 0,05 mg C-14 482 B mit 10 g weißem Petrolatum formuliert werden. Die erhaltene Salbe kann zur Behandlung oder Verhinderung der Eiterung von Wunden, die durch Staphylococcus aureus verursacht wird, aufgetragen werden. Außerdem kann diese Salbe viermal täglich in einer Menge von 0,02 bis 0,2 g zur Behandlung der durch die in Tabelle 5 und 6 genannten Mikroorganismen verursachten Eiterung an Händen aufgetragen werden.

Die Antibiotika C-14 482 B₁, B₂ und B₃ weisen ihre spezifischen, physikalisch-chemischen und biologischen Eigenschaften auf, und unter den bekannten Metaboliten und Antibiotika, die durch Actinomycetes der Gattung Streptomyces, Nocardia, Micromonospora usw., Bakterien, Pilze und dgl. gebildet werden, ist keine entsprechende Substanz mit ähnlichen Eigenschaften zu finden. Eine Ausnahme bildet das Antibiotikum C-14 482 A₁, das in der DE-OS 28 33 689 beschrieben wird und starke Ähnlichkeit mit den vorstehend beschriebenen Antibiotika hinsichtlich gewisser Eigenschaften, z. B. in den Absorptionsspektren im UV- Bereich und sichtbaren Bereich, und hinsichtlich der biologischen Eigenschaften aufweist. Da jedoch ein deutlicher Unterschied zum Antibiotikum C-14 482 A₁ in anderen Eigenschaften, z. B. im Rf-Wert der Dünnschichtchromatographie, in der Elementaranalyse und im Infrarot-Absorptionsspektrum, besteht, sind C-14 482 B₁, B₂ und B₂ als neue Antibiotika anzusehen.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert. In diesen Beispielen beziehen sich die Prozentsätze auf Gewicht/Volumen, falls nicht anders angegeben.

Als Adsorptionsmittel wurden bei den in den Beispielen beschriebenen Versuchen die folgenden Handelsprodukte verwendet:

Amberlite®XAD-2 (nicht-ionisches Austauscherharz),
Amberlite®IRC-50 (Kationenaustauscherharz),
Amberlite®A-21 (Anionenaustauscherharz für nichtwäßrige Lösungsmittel),
Diaion®HP-10 (nicht-ionisches Adsorptionsharz),
Sephadex®LH-20 (Dextrangel) und
E. Merck HF₁₅₄ (Kieselgel für Dünnschichtchromatographie).

Beispiel 1

Eine Kultur des das Antibiotikum C-14 482 B bildenden Stamms Nocardia sp. C-14 482 IFO 13 887 im Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar-Schrägröhrchen wurde zum Beimpfen eines konischen Kolbens verwendet, der ein Fassungsvermögen von 200 ml hatte und 40 ml eines Impfkulturmediums (pH 7,0) enthielt, das aus 2% Glucose, 3% löslicher Stärke, 1% Sojabohnenmehl, 1% Maisquellwasser, 0,5%-Polypepton, 0,3% NaCl und 0,5% CaCO₃ bestand, worauf 48 Stunden bei 28°C auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung bebrütet wurde. Hierbei wurde eine Impfkultur erhalten.

Ein Teil von 0,5 ml dieser Impfkultur wurde in einen konischen 200-ml-Kolben überführt, der 40 ml eines Nährmediums (pH 7,0) aus 5% Dextrin, 3% Maisquellwasser, 0,1% Polypepton, 1% CaCl₂ und 0,5% CaCO₃ enthielt, worauf 66 Stunden auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung bei 28°C inkubiert wurde. Das erhaltene Kulturmedium wurde nach der Agar-Verdünnungsmethode gegen Escherichia coli K-12 IFO 3301 und Proteus mirabilis IFO 3849 als Testmikroorganismen unter Verwendung von C-14 482 B₁ als Standard getestet. Hierbei wurde ein Titer von 10 µg/ml gefunden.

Beispiel 2

Ein Teil von 10 ml der gemäß Beispiel 1 hergestellten Impfkultur wurde in einen 2 · l-Sakaguchi-Kolben überführt, der 500 ml eines Impfkulturmediums enthielt. Das beimpfte Medium wurde 48 Stunden bei 28°C auf einer hin- und hergehenden Schüttelvorrichtung kultiviert. Mit 1 l des Kulturmediums wurde ein 200-l-Tank aus nichtrostendem Stahl beimpft, der 100 l des Impfkulturmediums enthielt, worauf 48 Stunden bei 28°C unter Belüftung mit einer Rate von 100 l/Minute und unter Rühren mit 200 UpM inkubiert wurde, wobei eine Impfkultur erhalten wurde. Diese Impfkultur wurde in einen 2000-l-Tank aus nichtrostendem Stahl, der 1000 l des in Beispiel 1 genannten Fermentationsmediums enthielt, überführt. Die verwendete Größe des Inokulums betrug 10%. Die Kultivierung wurde 90 Stunden bei 28°C bei einer Belüftungsrate von 1000 l/Minute, einer Rührgeschwindigkeit von 150 UpM (¹/₃ DT) und einem Innendruck von 0,98 bar durchgeführt. Das erhaltene Kulturmedium hatte einen Titer von 5 µg/ml, bestimmt in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise.

Beispiel 3

Das gemäß Beispiel 2 erhaltene Kulturmedium in einer Menge von 1160 l wurde mit verdünnter Schwefelsäure auf pH 5,0 eingestellt und nach Zusatz von 35 g des Filterhilfsmittels "Hyflo-Supercel" filtriert. 1180 l des erhaltenen Filtrats wurden auf pH 6,0 eingestellt und durch eine Säule von 100 l des Ionenaustauschers Diaion®HP-10 geleitet. Die Säule wurde mit 300 l Wasser gewaschen und dann mit 400 l 80volumenprozentigem wäßrigem Methanol eluiert.

Das Eluat wurde nach Einstellung auf pH 4,5 unter vermindertem Druck eingeengt, wobei das Methanol abdestilliert wurde. 60 l des Konzentrats wurden auf pH 8,0 eingestellt und dann dreimal mit je 20 l Isobutanol extrahiert. Die Extrakte der Isobutanolschichten wurden zusammengegossen und zweimal mit je 35 l N/200-Salzsäure ausgeschüttelt. Die wäßrigen Schichten wurden zusammengegossen, auf pH 6,0 eingestellt und unter vermindertem Druck eingeengt, um das Isobutanol abzudestillieren. 40 l der als Rückstand verbleibenden wäßrigen Lösung wurden auf pH 6,0 eingestellt und an einer 25-l-Säule des Ionenaustauschers Diaion®HP-10 adsorbiert.

Die Säule wird mit 75 l Wasser gewaschen und dann mit 100 l 80volumenprozentigem Methanol eluiert. Das Eluat wurde auf pH 4,5 eingestellt und unter vermindertem Druck eingeengt. Zwei Liter des erhaltenen Konzentrats wurden auf pH 8,0 eingestellt und fünfmal mit je 0,7 l Chloroform extrahiert. Die Extrakte wurden zusammengegossen und unter vermindertem Druck auf 1 l eingeengt. Die aktiven Substanzen wurden zweimal mit je 0,5 l N/50-Salzsäure in eine wäßrige Schicht überführt. 1 Liter der wäßrigen Salzsäureschicht wurde auf pH 8,0 eingestellt und erneut fünfmal mit 0,5 ml Chloroform extrahiert. Die Chloroformschicht wurde dann über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck bei niedriger Temperatur eingeengt. In dieser Weise wurden 7,7 g eines rohen Produkts (I) erhalten.

7,7 g des rohen Produkts werden in 13 ml Methanol gelöst. Die Lösung wird mit 80 ml 0,1 N-Salzsäure und 160 ml Wasser gemischt. Das Gemisch wird filtriert. Das Filtrat wird nach Zusatz von Wasser auf pH 6,0 eingestellt und durch eine 500-ml-Säule des Ionenaustauschers Amberlite® XAD-2 geleitet. Diese Säule wird mit 1,5 l 5%igem wäßrigem Methanol entwickelt. 700 ml der zuerst eluierten aktiven Fraktion wurden auf pH 8,0 eingestellt und dann fünfmal mit je 300 ml Chloroform extrahiert. Die Extrakte werden über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingeengt. Die hierbei abgeschiedene kristalline Substanz wird abfiltriert und getrocknet, wobei 849 mg rohe Kristalle von C-14 482 B₁ erhalten werden. Durch Umkristallisation von 700 mg des rohen C-14 482 B₁ aus Aceton-n-Hexan werden 360 mg gereinigte Kristalle von C-14 482 B₁ erhalten. Außerdem werden aus der erhaltenen Mutterlauge 60 mg Kristalle von C-14 482 B₁ gewonnen.

Aus der Mutterlauge wurden bei der Gewinnung der rohen Kristalle von C-14 482 B₁ außerdem 1,6 g eines Gemisches, das aktive Substanzen wie C-14 482 B₁, B₂ und B₃ enthielt, erhalten.

Getrennt hiervon wurde das Konzentrat (60 l) der von der ersten Säule des Adsorptionsharzes Diaion®HP-10 eluierten aktivenFraktion (400 l) mit Isobutanol extrahiert. Die restliche wäßrige Schicht wurde durch Abdestillieren von Isobutanol weiter eingeengt und durch eine 10-l-Säule des Ionenaustauschers Amberlite®IRC-50 (H-Form) geleitet. Die Säule wurde anschließend mit Wasser gewaschen und mit 120 l 0,2 N-Salzsäure eluiert.

Das Eluat wurde auf pH 6,0 eingestellt und an einer 25-l-Säule des Adsorptionsharzes Diaion®HP-10 adsorbiert.

Die Säule wurde mit 75 l Wasser gewaschen und mit 100 l 80 vol.-%igem Methanol eluiert. Das Eluat wurde auf pH 4,5 eingestellt und unter vermindertem Druck auf 1,6 l eingeengt. Das Konzentrat wurde auf pH 8,0 eingestellt und fünfmal mit je 0,8 l Chloroform extrahiert. Die Extrakte wurden vereinigt, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingeengt, wobei 2,5 g eines rohen Produkts (II), das C-14 482 B₁ enthielt, erhalten wurden.

Aus dem rohen Produkt (II) wurden ferner durch Reinigen mit einer Säule des Ionenaustauschers Amberlite®XAD-2 in der vorstehend beschriebenen Weise kristallines C-14 482 B₁ und ein Gemisch, das C-14 482 B₁, B₂ und B₃ enthielt, erhalten.

Zur Gewinnung von C-14 482 B₂ wurde die Mutterlauge im Falle der Gewinnung der aus dem vorstehend genannten rohen Produkt (I) erhaltenen gereinigten Kristalle von C-14 482 B₁ zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wurde mit einer geringen Menge Chloroform extrahiert und der lösliche Teil erneut zur Trockene eingedampft. Das erhaltene Gemisch, das C-14 482 B₁ und B₂ enthielt, wurde der Dünnschichtchromatographie an Kieselgel (HF₂₅₄) bei niedriger Temperatur unterworfen (Lösungsmittelsystem: Äthylacetat zu Methanol=3 : 2). Die Kieselgelbande, die C-14 482 B₂ entsprach, wurde abgeschabt und mit Äthanol extrahiert. Der Extrakt wurde eingeengt und an einer Säule des Ionenaustauschers Sephadex®LH-20 bei einer Temperatur von nicht mehr als 10°C chromatographiert, wobei mit Äthanol eluiert wurde. Die dem Antibiotikum C-14 482 B₂ entsprechenden Fraktionen wurden zusammengegossen und eingeengt, wobei 10 mg C-14 482 B₂ als gereinigtes Produkt erhalten wurden.

Ferner wurden 1,6 g der nach Abtrennung der rohen Kristalle von C-14 482 B₁ erhaltenen Mutterlauge mehrmals der Dünnschichtchromatographie an Kieselgel (HF₂₅₄) unter Verwendung von Chloroform zu Methanol (9 : 1) und Äthylacetat : Methanol (3 : 2) und anschließend der Säulenchromatographie am Ionenaustauscher Sephadex®LH-20 unterworfen. In dieser Weise wurden 10 mg C-14 482 B₂ und 4 mg C-14 482 B₃ als gereinigte Produkte erhalten.

Beispiel 4

In 2 ml Methanol wurden 40 mg des gemäß Beispiel 3 hergestellten kristallinen C-14 482 B₁ gelöst. Die Lösung wurde durch eine 6,5-ml-Säule des Ionenaustauschers Amberlite®A-21 (Cl-Form) geleitet. Die roten aktiven Fraktionen wurden zusammengegossen, eingeengt und zur Gefriertrocknung mit Wasser verdrängt, wobei 39 mg des Hydrochlorids von C-14 482 B₁ in Pulverform erhalten wurden.

UV-Absorptionsspektrum:

Elementaranalyse (bei Raumtemperatur getrocknet):
gefunden: C 50,27, 50,63; H 6,14, 6,27; N 12,06, 11,49; Cl 7,07, 7,26.

Beispiel 5

Eine Kultur des Stamms Nocardia sp. C-14 482 IFO 13 725, des das Antibiotikum C-14 482 B bildenden Mikroorganismus, auf Hefeextrakt-Malzextrakt- Agar-Schrägröhrchen wurde auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise inkubiert. Das hierbei erhaltene Kulturmedium wurde auf die in Beispiel 1 berschriebene Weise getestet, wobei ein Titer von 0,5 µg/ml als Gemisch von C-14 482 B₁, B₂ und B₃ ermittelt wurde.

Claims

1. Antibiotika C-14482 B₁, B₂ und B₃ und ihre Salze mit folgenden Merkmalen:

a) Antibiotikum C-14482 B₁:
- (1) Elementaranalyse (%) (aus Aceton-Hexan umkristallisiert und 30 Stunden oder länger bei Raumtemperatur unter vermindertem Druck getrocknet):
  C 55,61±1,0; H 6,31±0,5; N 13,64±1,0.
- (2) Schmelzpunkt nicht unter 300°C.
- (3) Absorptionsspektren im UV-Bereich und sichtbaren Bereich:
- (4) Infrarot-Absorptionsspektrum (KBr-Scheibe), Hauptpeaks (cm^-1):
  3580, 3420, 3175, 2950, 2900, 2840, 1685, 1650, 1610, 1455, 1395, 1345, 1330, 1250, 1230, 1175, 1110, 1075, 1025, 1000, 965, 940, 915, 855, 825, 780, 760.
- (5) Löslichkeit:
  unlöslich in Hexan und Petroläther,
  schwerlöslich in Äthylacetat, Chloroform, Methylenchlorid, Diäthyläther und Wasser,
  löslich in Äthanol,
  leichtlöslich in Methanol und Dimethylsulfoxid.
- (6) Farbreaktionen:
  Ninhydrin-Reaktion und Sakaguchi-Reaktion negativ,
  Dragendorff-Reaktion und Barton-Reaktion positiv; Kaliumpermanganat-Reagenz wird entfärbt.
- (7) Acidität, Neutralität oder Basicität:
  schwach basisch.
- (8) Farbe: dunkelrot oder rötlich braun.
- (9) Dünnschichtchromatographie an Kieselgel (Spot Film f):
  I. Chloroform-Methanol (9:1) Rf 0,37,
  II. Äthylacetat-Methanol (1 : 1) Rf 0,31.
a) Antibiotikum C-14482 B₂:
- (1) Elementaranalyse (%) (30 Stunden oder länger bei Raumtemperatur unter verindertem Druck getrocknet):
  C 57,40±1,0; H 6,51±0,5; N 13,44±1,0.
- (2) Schmelzpunkt nicht unter 300°C.
- (3) Absorptionsspektren im UV-Bereich und sichtbaren Bereich:
- (4) Infrarot-Absorptionsspektrum (KBr-Scheibe), Hauptpeaks (cm^-1):
  3430, 2940, 2890, 1680, 1650, 1625, 1590, 1480, 1450, 1390, 1340, 1250, 1175, 1110, 1075, 1055, 1025, 995, 960, 940, 905, 855, 825.
- (5) Löslichkeit:
  unlöslich in Hexan und Petroläther,
  schwerlöslich in Äthylacetat, Diäthyläther und Wasser,
  löslich in Äthanol und Chloroform,
  leichtlöslich in Methanol und Dimethylsulfoxid.
- (6) Farbreaktionen:
  Ninhydrin-Reaktion und Sakaguchi-Reaktion negativ,
  Dragendorff-Reaktion und Barton-Reaktion positiv; Kaliumpermanganat-Reagenz wird entfärbt.
- (7) Acidität, Neutralität oder Basicität:
  schwach basisch.
- (8) Farbe: dunkelrot oder rötlich braun.
- (9) Dünnschichtchromatographie an Kieselgel (Spot Film f):
  I. Chloroform-Methanol (9:1) Rf 0,43,
  II. Äthylacetat-Methanol (1 : 1) Rf 0,23.
a) Antibiotikum C-14482 B₃:
- (1) Elementaranalyse (%) (30 Stunden oder länger bei Raumtemperatur unter vermindertem Druck getrocknet):
  C 58,74±1,0; H 6,64±0,5; N 14,31±1,0.
- (2) Schmelzpunkt nicht unter 300°C.
- (3) Absorptionsspektren im UV-Bereich und sichtbaren Bereich:
- (4) Infrarot-Absorptionsspektrum (KBr-Scheibe), Hauptpeaks (cm^-1):
  3430, 2940, 2890, 1680, 1650, 1630, 1595, 1450, 1390, 1340, 1320, 1250, 1175, 1105, 1075, 1020, 995, 935, 905, 825.
- (5) Löslichkeit:
  unlöslich in Hexan und Petroläther,
  schwerlöslich in Äthylacetat, Diäthyläther und Wasser,
  löslich in Äthanol und Chloroform,
  leichtlöslich in Methanol und Dimethylsulfoxid.
- (6) Farbreaktionen:
  Ninhydrin- und Sakaguchi-Reaktion negativ,
  Dragendorff-Reaktion und Barton-Reaktion positiv; Kaliumpermanganat-Reagenz wird entfärbt.
- (7) Acidität, Neutralität oder Basicität:
  schwach basisch.
- (8) Farbe: dunkelrot oder rötlich braun.
- (9) Dünnschichtchromatographie an Kieselgel (Spot Film f):
  I. Chloroform-Methanol (9:1) Rf 0,20,
  II. Äthylacetat-Methanol (1 : 1) Rf 0,18.

2. Verfahren zur Herstellung der Antibiotika C-14482 B₁, B₂ und/oder B₃, dadurch gekennzeichnet, daß man Nocardia IFO 13 725 oder Nocardia IFO 13 887 in einem Nährmedium züchtet und die Antibiotika C-14 482 B₁, B₂ und/oder B₃ im Kulturmedium anreichert und isoliert.