DE2554636A1 - Desacyl-pepsidin, verfahren zu seiner herstellung und arzneimittelpraeparate - Google Patents
Desacyl-pepsidin, verfahren zu seiner herstellung und arzneimittelpraeparateInfo
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Description
27 "
EISAI CO., LTD.,Tokyo/Japan
Desacyl-pepsidin, Verfahren zu seiner Herstellung und Arzneipräparate
Die Erfindung betrifft Desacyl-pepsidin (im folgenden als DA-Pepsidin
bezeichnet). E
Unter DA-Pepsidin ist das Pentapeptid Valyl-valyl-4-amino-3-hydroxy-ö-methyl-heptanoyl-alanyl^-amino^-hydroxy-ö-methylheptansäure
der Formel· Σ zu verstehen:
H3Q DH, H3C X/H3 .
H3Oy)H3H3O^H3 CH ·· OH
CH CH CH0 OH CH, CH0 OH
I I I2I I3I2I.
H2N-CH-CO-HH-CH-CO-MH-CH-OH-O-H2-OO-MH-CH-CO-HH-OH-OH-CH2-COOh
6UU 824/1074
Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von DA-Pepsidin, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man ein N-Acylpentapeptid
der allgemeinen Formel II .
3 H3\/H3
r3°wGH3 H3°V/H3 f ... f
CH CH CH0 OH CH- CHp OH ^11)
I I I2I P I2I
R-FH-CH-CO-ITH-CH-CO-IH-CH-CH-CH2-CO-ITH-CH-CO-IiH-CH-GH-CH2-COOH
in der R einen Acylrest bedeutet, mit einem Bakterium der Art
Bacillus pumilus umsetzt.
DA-Pepsidin weist eine starke pepsinhemmende Wirkung auf. Es eignet sich deshalb als Wirkstoff zur Behandlung von Magengeschwüren.
Die Erfindung betrifft somit auch Arzneipräparate, gekennzeichnet
durch einen Gehalt an DA-Pepsidin. .
Das F-Acylpentapeptid der allgemeinen Formel II läßt sich nach
der Aminosäurenomenklatur folgendermaßen bezeichnen: M-Aeyl-valylvalyl-4-amino-3-hydroxy-6-metliylheptanoyl-alanyl-4--aniino-3~liydroxy-6-methylheptansäure.
Es sind bisher mehr als zehn-N-Acylpentapeptide der allgemeinen
Formel II bekannt. Die Verbindung der allgemeinen Fromel II, in
der R die Acetylgruppe bedeutet, ist in der US-PS 3 819 486 und
der Japan.Patentveröffentlichung 39446/73 beschrieben und dort als
S-PI oder Pepsidin C bezeichnet. In der US-PS 3 878 185 sind ferner
Verbindungen der allgemeinen Formel II beschrieben, in der R die Butyryl- oder. Propionylgruppe bedeutet. Diese Verbindungen sind dort
als Pepsidin A bzw. Pepsidin B bezeichnet.
Ferner sind N-Acylpentapeptide der allgemeinen Formel II bekannt,
in der R die Isovalerylgruppe oder einen geradkettigen oder verzweigten aliphatischen Acylrest mit 5 bis 16 Kohlenstoffatomen
• vgl. ' "
bedeutet bekannt;/japanische Patentveröffentlichung 8996/72 und
JA-OSen 29 582/72 und 41 590/74. Diese Verbindungen sind dort als Pepstatin bezeichnet.
Es ist bekannt» daß diese N-Acylpentapeptide eine starke pepsinhemmende
Wirkung aufweisen.
Die N-Acylpentapeptide der' allgemeinen Formel II lassen sich durch
Züchtung verschiedener Actinomyceten herstellen. Die vorgenannten
Pepsidine werden beispielsweise durch Züchtung des Stammes Strepto.-myces
naniwaensis EP 44-201 hergestellt. Die vorgenannten Pepstatine lassen sich durch Züchtung von Streptomyces testaceus herstellen.
Jedoch haben die durch Züchtung dieser Actinomyceten hergestellten
N-Acylpentapeptide den Nachteil, daß sie im allgemeinen nicht homogen sind, sondern aus einem Gemisch von mehreren, d.h. bis zu
mehr als zehn, N-Acylpentapeptiden mit verschiedenen Acylr.esten *
(R) und ähnlichen Eigenschaften bestehen. Um aber zu einem bestimmten
N-Acylpentapeptid zu gelangen, sind schwierige Trennverfahren erforderlich, was die Ausbeute an dem gewünschten Produkt
beträchtlich vermindert.
Das erfindungsgemäße DA-Pepsidin weist demgegenüber den Vorteil auf, daß kein N-endständiger Substituent vorhanden ist und daß
es aber andererseits mit den vorgenannten N-Acylpentapeptiden die Grundstruktur gemeinsam hat.
Stellt man also zuerst -nach dem erfindungsgemäßen Verfahren DA-Pepsidin
unter Verwendung eines Gemisches aus verschiedenen N-Acylpentapeptiden durch Züchtung eines entsprechenden Stammes
von Streptomyces her und acyliert dann das -erhaltene DA-Pepsidin mit Hilfe eines entsprechenden Acylierungsmittels, so&erhält man
auf einfache Weise das gewünschte, reine N-Acylpentapeptid.
ORlQJNAL INSPECTEC
Ferner ist DA-Pepsidin ein wertvolles Zwischenprodukt zur Herstellung
von bisher nicht bekannten N-Acylpentapeptiden,
Im erfindungsgemäßen Verfahren wird vorzugsweise der Bacillusstamm
EF 49-210 (nov. sp.) verwendet, der aus Bodenproben in Kawaguchiko machi, Yamanashi, Japan, isoliert wurde. Dieser Stamm
weist folgende mikrobiologische Eigenschaften auf:
1. Morphologie: Stäbchen mit abgerundeten Enden, die einzeln oder,
paarweise· und selten in einer Dreierkombination auftreten.
2. Größe: 0,4 bis 0,7 mal 1,0 bis 4,0 μ, .
3· Beweglichkeit: Beweglich
4. Flagella: Peritrich
5. Sporen: Werden gebildet
6. Gramfärbung; Positiv
7. Säurefeste Färbung: Negativ
1. Schräggestelltes Bouillon-Agar-Medium (eintägige Züchtung bei
3O0C): Fiaches, ausgebreitetes Wachstum, milchig gelblich bis
leicht gelblich und schwach glänzend. Keine Farbänderung im Nährmedium.
2. Flachgestelltes Bouillon-Agar-Medium (ein- bis siebentägige
Züchtung bei 300C): Flaches, ausgebreitetes Wachstum, dendroid,
milchig gelblich; leicht gelbliche, glatte Kolonien, schwach glänzend und durchscHeinend bis'opak; köin lösliches Pigment.
3. Nährbrühe (zwei Tage bei 300C): Häutchenbildung auf der*Oberfläche
; schwache und gleichmäßige Trübung.
4. Gelatine-Medium (drei Tage bei 20, 27 bzw. 3O0C): Schwaches"
Wachstum, aber Verflüssigung der Gelatine; bei Stichkultur nicht klar. . · * v-
5. Lackmusmilch (sechs Tage bei 300C): Ziemlich sauer und nach
6U982Ä/1074
< — 5 sechstägiger Züchtung schwach verflüssigt; keine Koagulation
6. Kartoffel (zwei Tage bei 500C): Feuchtes Wachstum und geringe
Ausbreitung; Kartoffel dunkel verfärbt.
1. Nitrat-Reduktion v
2. Denitrogen-Reaktion
3. Methylrot-Test
4. Voges-Proskauer-Reaktion
5. Bildung von Indol
6. Bildung von Schwefelwasserstoff
7. Stärkehydrolyse
8. Verwertung von Citronensäure
Negativ Negativ Positiv Positiv Negativ Negativ Negativ Positiv in Koser-Medium
Negativ in Symmons-Medium
9. Verwertung rvon anorganischem Stickstoff:
Schwach positiv mit Kaliumnitrat
Schwach positiv mit Ammonium-. . sulfat
10. Pigmentbildung : Negativ
11. Urease : Negativ
12. Oxidase : Positiv
13. Katalase · : Positiv
14. Wachstumsbereich:
a) pH-Wert (zweitägige Züchtung unter·-Schütteln bei 300C in
Nährbrühe): Wachstum im sterilisierten Medium bei pH-Wert 5 bis 9,8 s' ' '
b) Temperatur (bei* zweitägiger Züchtung unter Schütteln in
Nährbrühe): Wachstum bei 20 bis 450G.
c) Salzkonzentration (bei zweitägiger Züchtung unter Schütteln in Nährbrühe): Wachstum innerhalb eines Tages bei einer
Konzentration von 0,5 bis 7,0 Prozent NaCl. Wachstum innerhalb von zwei Tagen bei einer Konzentration von 10
1 %
Prozent NaCl.
15. Sauerstoffbedarf: Fakultativ anaerob
6US824/1074
16. 0-F-Test nach dem Hugh-Leifson Verfahren: Säure wird sowohl
aerob als auch anaerob gebildet; keine Gasbildung.
17. Fermentationstest und Säurebildung mit Kohlenhydraten wie
folgt: . ■ ·
Säurebildung aerob anaerob
| Nr. | Kohlenhydrate |
| 1 | Arabinose |
| 2 | Xylose |
| 3 | Glucose |
| 4 | Mannose |
| 5 | Fructose |
| 6 | Galactose |
| 7 | Maltose |
| 8 | Saccharose |
| 9 | Lactose |
| 10 | Trehalose |
| 11 | Sorbit |
| 12 | Mannit |
| 13 | Inosit |
| H | Glycerin |
| 15 | Stärke |
Bei keinem def Kohlenhydrate tritt Gasbildung auf.
Säurebildung (+), leichte Säurebildung (+), keine Säurebildung (-)
Beim Vergleich der vorgenannten Eigenschaften des Bakteriums mit den in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 7.
Auflage, ergibt sich, daß dieses Bakterium als eine Art von Bacillus pumilus zu betrachten ist. Es wird als Bacillus pumilus
Kawaguchi bezeichnet. Dieser Bakteivienstamm EF 49-210 (ATCU
31 132) wurde.bei der Agency of Industrial Science and Technology,
Fermentation Research Institute in Japan unter der Hinterlegungsnummer
FERM-P 2677 hinterlegt. Ferner eignen sich zur
6üaö2A/107A. ·
■ K [mac. ji:p::;»;:HTj _
Durchführung des erfindungsgemäßen·Verfahrens auch die bekannten
Bakterienstämme Bacillus pumilus ΙΙΌ-12 092 und IPO- 12 110,
die beim Institute of Fermentation, Osaka, Japan, hinterlegt sind,
Zur Züchtung der erfindungsgemäß verwendeten Mikroorganismen können Nährmedien beliebiger Zusammensetzung und beliebige
Züchtungsbedingungen angewendet werden, vorausgesetzt, daß die
Mikroorganismen dabei ein Wachstum aufweisen und die gewünschten Aktivitäten zeigen. Die Medien können beispielsweise beliebige
organische oder anorganische Stickstoffquellen enthalten, wie
Pepton, Fleischextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenhydrolysat, Sojabohnenextrakt, Hefeextrakt, anorganische Ammoniumsalze und
dergl. Als Kohlenstoffquellen können beispielsweise Melassen,
Dextrose, Stärke und Hydrolyseprodukte davon verwendet werden. Ferner können anorganische Salze im Nährmedium enthalten sein.
Die Züchtung wird im allgemeinen unter Schütteln oder Belüften bei Temperaturen von 20 bis 45°C 1 bis 7 Tage durchgeführt.
Es wurde festgestellt, daß die entacylierende Wirkung von Bacillus pumilus sowohl intrazellulär als auch extrazellulär auftritt.
Dies bedeutet, daß erfindungsgemäß die Gärmaische,das Gärfiltrat,
die vollständigen Zellen, Trockenzellen und/oder daraus gewonnene Enzympräparate verwendet werden können.
Es ist nicht immer erforderlich, das erfindungsgemäß eingesetzte Ausgangsmaterial, das N-Acylpentapeptid, in gereinigter Form einzusetzen.
Beispielsweise können Gemische von N-Acylpentapeptide enthaltenden Materialien verwendet werden, die bei verschiedenen
Reinigungsstufen anfallen, beispielsweise kam das Gärfiltrat des Mikroorganismus, der N-Acylpentapeptide bildet, verwendet werden.
Ferner können auch Produkte verwendet werden, die durch Aussalzen aus diesem Filtrat erhalten werden. Schließlich können auch Produkte
verwendet werden, die durch Extraktion des Gärfiltrates mit einem organischen Lösungsmittel unter anschliessendem Entfernen des
Lösungsmittels erhalten werden.
G ü y B 7 U I 1 0 7 A
S*
Bei der praktischen Durchführung des erfindun^sgemäßeii Verfahrens
sind die Reaktiqnsbedingungen, wie Konzentration, Temperatur, pH-Wert und dergl. nicht kritisch und können je nach der
Art des eingesetzten Mikroorganismenstammes und des als Ausgangsmaterial gewählten N-Acylpentapeptids innerhalb eines breiten
Bereichs gewählt werden. Beispielsweise wird bei der Deacylierung von N-Acylpentapeptiden,unter Verwendung von Bacillus pumilus
Kawaguchi.EF 49-210 vorzugsweise ein pH-Wert von 4 bis 10 und eine Temperatur von etwa 30 his 5O0O gewählt. Entsprechende
Reaktionszeiten liegen im Bereich von 3 bis 60 Stunden. Durch Zugabe von zweiwertigen.Kobaltverbindungen, wie CoCIp, CoSO.
oder dergl. kann die Ausbeute an DA-Pepsidin gesteigert werden.
Die Abtrennung und Reinigung von DA-Pepsidin aus dem Reaktionsgemisch kann nach einem üblichen Verfahren durchgeführt werden,
beispielsweise 'durch Lösungsmittelextraktion, Säulenchromatographie, fraktionierende Kristallisation, Umkristallisation und
dergl.
Zum Nachweis der Bildung des erfindungsgemäßen DA-Pepsidins kann
folgendes dünnschichtchromatographisches Verfahren angewendet werden:
Die Probe wird auf eine Silica Gel G-Dünnschichtplatte (Handelsprodukt der Firma Merck AG) aufgesetzt. Als Laufmittel wird entweder
(I) ein-Gemisch aus n-Butanol, Essigsäure und Wasser im
Volumenverhältnis von 3:1:1 oder (II) ein Gemisch aus n-Butanql,
Essigsäure, Wasser und Essigsäurebutylester im Volumenverhältnis von 4:1:1:4 verwendet. DA-Pepsidin wird als Ninhydrin-positiver
Fleck, der auch eine .positive Rydon-Smith-Reaktion ergibt, nachgewiesen.
Bei Verwendung des Laufmittels (I) beträgt der Rf-Wert
0,48. -
Eine andere Nachweismöglichkeit besteht im.Casein^latten-Vei·-
f'ahren, das Wie folgt durchgeführt Swird:
Nach Entwicklung und Trocknung wird die vorerwähnte Dünnschichtplatte auf eine flache Platte aus Casein enthaltendem Agar übertragen.
Auf diese Platte wird ein mit einer Pepsinlösung impräg-
niertes Filterpapier gelegt. Anschließend'wird über Nacht bei
3O0C umgesetzt, um nicht zersetztes Casein nachzuweisen.
DA-Pepsidin- hat die folgenden Eigenschaften:
I. Aussehen: Weiße Nadeln
II. Löslichkeit: Leichtlöslich in Essigsäure und Methanol;
löslich in Äthanol, n-Butanal ,und Pyridin; und geringfügig
löslich in Aceton und Diäthylather.
III. Pärbungsreaktion: Positive Ninhydrin-,und Rydon-Smith-Reaktion.
· · :
IV. UV-Absorptionsspektrum: In einer 0,1 prozentigen- Methanollösung
tritt nur die auf die Peptidbindung zurückzuführende Absorption am Ende ein, während im Bereich von 250 bis 370 nm
keine Absorptionsmaxima auftreten.
V. IR-Absorptionsspektrum: vgl. Pig. 1
VI. Aminosäurezusammensetzung: Nach 72 stündiger Hydrolyse mit
6 η HCl bei 11O0C wird die Probe mittels eines Aminosäureanalysators
analysiert. Es ergibt sich ein Molverhältnis von Alanin zu Valin von 1:2.
VH. Molekulargewicht und Strukturformel:
Eine Probe wird nach dem Säurechloridve?.-fahren acetyliert
und anschließend mit Diazomethan einer Methylveresterung unterzogen. Die erhaltene Verbindung wird massenspektrographisch
analysiert. Es ergibt sich M+ = 657· Somit ist das Molekulargewicht der Probe identisch mit dem berechneten
Wert von. 601 für DA-Pepsidin. Das Maximum dieses Fragments ist auch identisch mit dem für die Strukturformel I von DA-Pepsidin
berechneten Wert. Außerdem ist das vorgenannte
acetylierte Produkt dünnschichtchromatographisch identisch
mit Pepsidin C. Das veresterte Produkt ist ferner identisch mit dem Methylester'von Pepsidin C.
VIII.Pepsinhemmende Wirkung: Die pepsinhemmende Wirkung von DA-Pepsidin
wird nach dem Verfahren gemäß S. Murao und S. Satoi,
Agr. Biol. Chem. Japan, Bd.34 (8), (1970), S.1265 bis 1267,
bestimmt. Es läßt sich feststellen, daß 0,82 ug DA-Pepsidin eine 50-prozentige Hemmung von 100 ^ug Pepsin ergeben. Der
entsprechende Wert für Pepsidin C liegt bei 0,86 jig.
6UÜ824M074
'■ ■ .. - ίο - ■ .
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
In eine 0,5 Liter fassende Sakaguchi-Flasche werden Ο,Ί Liter.,
eines flüssigen Nährmediums vom pH-Wert 7 gegeben. Das Nährmedium enthält 1 Prozent Fleischextrakt, 1 Prozent Pepton und 0,5 Prozent
NaCl und wird 10 Minuten beivi20°C sterilisiert.
Jeweils 20 dieser Flaschen werden mit jeweils 1 ml einer Gärbrühe vom Bacillus pumilus Kawaguchi EF 49-210 inokuliert. Das
Inokulum ist vorher in einem ähnlichen Nährmedium du^ch 24· stündige
Züchtung bei 3O0C hergestellt worden. Sodann wird unter
Schütteln 72 Stunden bei 3O0C gezüchtet.
•v.
Nach beendeter Züchtung werden die Zellen aus der Gärmaische
durch Zentrifugieren entfernt. Der vereinigte Überstand wird
tropfenweise unter Kühlen mit 4 Liter kaltem Aceton versetzt. Der erhaltene Niederschlag wird in destilliertem Wasser zu 50 ml *
einer Suspension suspendiert.
κ·
Getrennt davon werden 10 g eines N-Acylpentapeptid-Gemisches
(Pepsidin C, Pepsidin B und Pepsidin A im Gewichtsverhältnis von
94:4:2) in Wasser gelöst und zur Neutralisation mit 6 η NaOH versetzt. Man e'rhält 500 ml einer wäßrigen Lösung. In diese
wäßrige Lösung werden 10 ml der Suspension des vorgenannten Acetonniedersehlags gegeben. Das Gemisch"wird bei einem pH-Wert
von 8,5 5 Stunden bei 37°C gerührt. .
Die erhaltene Lösung wird dreimal mit jeweils 500 ml n-Butanol
extrahiert. Die n-Butano!phasen werden, vereinigt und unter
vermindertem. ,Druck zur Trockne eingedampft. Man erhält 9»8 g
Rückstand. .
Anschließend wird der Rückstand in 9Q ml eines Lösungsmittelgemisches,
das n-Butanol, Essigsäure, Wasser und"Essigsäureäthylester im Volumenverhältnis von 4:1:1:4 enthält, gelöst.
6' U a ö 2 U I 1 0 7 k
Die erhaltene Lösung wird auf eine mit 500 g Kieselgel beschickte Säule aufgesetzt. Anschließend wird unter Verwendung
des vorgenannten Lösungsmittelgemisches die Säulenchromatogxaphie durchgeführt. . ' ;·
Etwa 0,75 Liter der Hauptfraktion werden unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Man erhält, 0,7 g Rückstand. Dieser Rückstand
ergib-t beim Kristallisieren aus Äthanol 0,3 g eines rohen, kristallinen Produkts. Dieses rohe, kristalline Produkt wird
aus Äthanol umkristallisiert. Man erhält 0,17 g DA-Pepsidin in Form von weißen Nadeln.
Schmelzpunkt: Zersetzung bei 193 bis 199°C. Es läßt sich kein
klarer Schmelzpunkt beobachten.
ψ= -57 bis -60° (c=1; Methanol.)
Cfo
H$ N$
ber.: 56,19 9,26 11,29
gef.: ^ 56,39 8,99 n,27
In einen 30 Liter fassenden Fermenter werden 15 Liter eines flüssigen Nährmediums vom pH-Wert. 7 gegeben. Das Nährmedium
enthält 1 Prozent Fleischextrakt, 1 Prozent Pepton und 0,5 Prozent
NaCl und wird 10 Minuten bei 1200C sterilisiert.
Getrennt davon wird der Stamm EF 49-210 24 Stunden bei 300C
unter Schütteln in einem ähnlichen Nährmedium gezüchtet.
In den Fermenter werden 0,2 Liter des vorstehend erhaltenen Anzuchtmediums Von EF 49-210 überimpft. Die Züchtung wird sodann
unter folgenden Bedingungen durchgeführt:
Zeit: 24 Stunden Temperatur: 3O0C * "-Belüftung:
15 Liter/min . ■·. · • Eühren: 350 U/min
(50 9 8 24/ 107 4
Nach beendeter Züchtung werden die Mikroorganismen durch Zentrifugieren
von der Gärmaische abgetrennt. 12 Liter des Überstands .wprden mit Ammoniumsulfat bis zu einem Sättigungsgrad von 0,8
versetzt. Das Gemisch wird sodann 3 Tage in den Kühlschrank gestellt. Der erhaltene Niederschlag wird in destilliertem Wasser
suspendiert. Man erhält 750 ml Suspension.
Ein Gemisch aus 100 ml dieser Suspension, 4-00 ml einer neutralisierten,
wäßrigen Lösung mit 8 g Pepsidin C, 292 ml 1/I5*m Phos-
-2 phatpuffer vom pH-Wert 5,5 und 8 ml einer 5x10 m CoClg-Lösung
wird 40 Stunden bei 37°C inkubiert. Das Reaktionsgemisch wird
dreimal mit je- 800 ml n-Butanol extrahiert. Die vereinigten
Extrakte werden zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in einem möglichst geringen Volumen eines Lösungsmittelgemisehes
aus n-Butanol, Essigsäure, Wasser und Essigsäure- n-butylester
im Volumenverhältnis 4:1 :1 :4' gelöst. Diese"s Gemisch wird der
Säulenchromatographie an Kieselgel unter Verwendung dieses Lösungsmittelgemisehes als Elutionsmittel unterworfen.
2 Liter der Häuptfraktion werden vereinigt und zur Trockne eingedampft.
Man erhält 6 g weißes Pulver. Dieses Pulver wird zweimal aus Äthanol kristallisiert. Man erhält 2 g DA-Pepsidin in
Form von weißen Nadeln.
100 mg DA-Pepsidin, das gemäß Beispiel 1 erhalten worden ist,
werden in 10 ml Pyridin gelöst. 1,2 ml einer auf das 20-fache verdünnten Lösung von Acetylchlorid in Aceton wird unter Eiskühlung
in die vorgenannte Pyridinlösung eingetropft. Das Gemisch
wird über Nacht stehengelassen. Eine Aliquotmenge des Reaktionsgemisches wird der DünnschichtChromatographie an
Kieselgel unterworfen, wobei als Laufmittel ein Gemisch aus n-Butanol, Essigsäure, Wasser und Essigsäurebutylester im Volumenverhältnis
von 4:1:1:4 verwendet wird. Anschließend wird das Material durch die Ninhydrin-Reaktioh, Rydon-Smith-Reaktion
und das Caseinplatten-Verfahren nachgewiesen, wobei das erhaltene
GU9Ö2 W-in'7 4
Produkt einen Rf-Wert von 0,49 aufweist. Diese j Produk't erweist
sich als authentisches Pepsidin C.
Die Reaktionslösung wird sodann zur Trockne eingedampft. Der
Rückstand wird in 10 ml Methanol gelöst. J)Ie erhaltene Lösung
wird mit 17 ml einer Lösung von Diazomethan in Diäthyläther versetzt. Die Lösung wird 3· Stundende! Raumtemperatur stehengelassen
und sodann zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird· in Methanol
gelöst. Nach Zusatz von Diäthyläther kristallisieren*34 mg des
Methylesters von Pepsidin C. :
Man verfährt wie in Beispiel 3, verwendet aber Isovalerylchlorid anstelle von Acetylchlorid. Das Produkt weist bei der Dünnschichtchromatographie,
einen R~-Wert von 0,64 auf und erweist sich als authentisches Pepstatin A.
1 ml einer gemäß Beispiel 1 erhaltenen Gärmaische des Stammes EP 49-210 wird mit 1 ml einer wäßrigen Lösung, die durch Lösen
von 10 mg Pepsidin C in Wasser und Neutralisieren mit 6 η NaOH-Lösung
hergestellt worden ist, vermischt. Die erhaltene Lösung wird 5 Stunden bei 37°C geschüttelt.
Die Reaktionslösung wird der Dünnschichtchromatographie an Kieselgel
unterworfen, wobei als Laufmittel ein Gemisch aus n-Butanol, Essigsäure und Wasser im Volumenverhältnis von 3:1:1 verwendet
wird. Das Produkt hat e.inen Rf-Wert von 0,48 und erweist sich
als authentisches DA-Pepsidin.
_ Beispiel 6
Man verfährt wie in Beispiel 5, verwendet aber Pe-psid.in B bzw.
Pepsidin A anstelle von Pepsidin θ) Die Bildung von DA-Pepsidin
wird dünnschichtchromatographisch nachgewiesen/'"
Be i-spiel 7 'l
Man verfährt wie in Beispiel 5, verwendet·aber F-Isovalerylpentapeptid
(Pepstatin A) anstelle von Pepsidin C. Die Bildung von DA-Pepsidin wird dünnschichtchromatographisch nachgewiesen.
V ,
'-iin verfährt wie in Beispiel 5, verwendet aber N-n-Hexanoylpentapeptid
bzw. N-n-DeOanoylpentapeptid anstelle von' Pepsidin C.
Die Bildung von DA-Pepsidin wird dünnsohichtchromatographisch
nachgewiesen.
■dt
Man verfährt wie in Beispiel 5> verwendet aber Bacillus pumilus.
Ii1O 12 092 bzw. Bacillus pumilus IPO 12 110 anstelle von Bacillus
pumilus Kawaguchi IP 49-210. Die Bildung von DA-Pepsidin wird
in beiden Fällen dünnschichtchromatographisch nachgewiesen.
B e i s ρ i e 1 10
Man verfährt wie in Beispiel· 5, verwendet 'aber 10 mg. mit Aceton
getrocknete Zellen des Bakteriums anstelle von 1 ml Gärmaische
des Stammes BP 49-210. Die Bildung von DA-Pepsidin wird dünnschicht
chromatographisch nachgewiesen.
6UHÖ24/107
Claims (11)
- .Patentansprüche 1./ Desacyl-pepsidin der Formel IfHCH - CH CH0 OH CH, CHp OH (I)c.
- 2. Verfahren zur Herstellung von Desacyl-pepsidin nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man N-Acylpentapepticbmit einem Bakterium der Art Bacillus pumilus in Kontakt "bringt.
- 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeich net, daß man die Umsetzung etwa 3 bis 60 Stunden durchführt.
- 4. Verfahren nach Anspruch 2/ ,dadurch geke-nnzeic hnet, daß man den Stamm Bacillus pumilus Kawaguchi 49-210 (ATCG 31 132) verwendet.
- 5. Verfahren nach Anspruch 2, ' dadurch gekennzeichne t^ daß man den Stamm Bacillus pumilus IFO 12 092 verwendet.
- 6. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gek.e η η - ζ e i c hn et, daß man den Stamm Bacillus pumilus IFO 12 110 verwendet. · ■
- 7. Verfahren nach Anspruch 2 f dadurch gekennzeichnet, daß man das Bakterium in Form des Gärmaischenfiltrats, der vollständigen Zellen, Trockenzellen oder der daraus gewonnenen Enzympräparate verwendet.
- 8. Verfahren nach Anspruch 2 und 3, dadurch gekennzei chnet, daß man als N-Acylpentapeptid-Ausgangsmaterial das Gärmaischenfiltrat des Mikroorganismus, der das6U3Ö24/1074■■·■■- 16 -N-Acylpentapeptid bildet, aus diesem Filtrat ausgesalzte Produkte oder durch Extraktion mit organischen lösungsmitteln unter anschließender Trocknung gewonnene Produkte verwendet.
- 9· Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man zusätzlich eine zweiwertige Kobaltverbindung zusetzt. vfr
- 10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch g e k e *n n% ζ e i c hn e t, daß man CoOIp oder GoSO. verwendet.
- 11. Arzneipräpärate, gekennzeichnet durch einen Gehalt an Desacyl-pepsidin nach Anspruch 1.
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