DE1085297B - Herstellung und Gewinnung des Antibiotikums Holomycin - Google Patents

Description

Gegenstand der Erfindung ist zunächst die Herstellung eines neuen Antibiotikums, das mit Holomycin bezeichnet wird. Wie im folgenden gezeigt wird, besitzt das Antibiotikum Holomycin eine durch saure Hydrolyse abspaltbare Acetylgruppe. Dem Desacetylderivat, das im folgenden Holothin genannt wird, schreibt man auf Grund der weiter unten gegebenen Befunde die Formel I
S—-C = C-NH₂

C = O

CH

N
H

zu. Aus ihm lassen sich durch Acylierung Acylderivate herstellen, wobei das so gewonnene Acetylderivat mit dem Antibiotikum Holomycin identisch ist.

Die Acylderivate, vor allem die Alkanoylderivate, insbesondere das Acetylderivat, d. h. das Antibiotikum Holomycin selbst, besitzen die allgemeine Formel II
S- CC —NH-R

C = O

II

CH

N
H

worin R für Wasserstoff oder einen Acylrest, insbesondere einen Alkanoylrest oder Phenylalkanoylrest, steht.

Das Antibiotikum entsteht bei der Kultur eines neuen Stammes der Art Streptomyces griseus (Krainski) Waksman et Henrici, NRRL 2764, der im folgenden näher beschrieben wird. Er wurde aus einer in Riccino, Italien, gesammelten Bodenprobe isoliert und wird in den Laboratorien des Erfinders und in der Eidg. Techn. Hochschule, Institut für spez. Botanik, Zürich, unter der Bezeichnung A17474 aufbewahrt.

Der Stamm NRRL 2764 bildet ein gelblichgrünlichgraues Luftmycel. Das Substratmycel ist weißgelb oder weißgrau bis sattgelb. Die aus glatten Sporen bestehenden Sporenketten sind meist stark gewellt und bilden sympodial verzweigte Büschel mit kurzer Hauptachse. Bei der Kultivierung auf peptonhaltigen Nährböden tritt keine melanoide, schwarzbraune Verfärbung ein. Das Wachstum ist relativ wenig abhängig von der Temperatur, sowohl bei 18⁰C als auch bei 40⁰C entwickelt sich der Pilz +5 gut, doch liegt das Optimum zwischen 25 und 32° C.

Zur weiteren Charakterisierung wird im folgenden das Wachstum des Stammes NRRL 2764 auf verschiedenen Nährmedien beschrieben. Die Nährmedien 1 bis 7 und 10 wurden nach W. Lindenbein, Arch. Mikrobiol., 17, S. 361 (1952), hergestellt.
1. Synthetischer Agar:

Wachstum dünn, schleierartig, weißgelb; Luftmycel samtig, schneeweiß.

Herstellung und Gewinnung
des Antibiotikums Holomycin

Anmelder:
CIBA Aktiengesellschaft, Basel (Schweiz)

Vertreter: Dipl.-Ing. E. Splanemann, Patentanwalt, Hamburg 36, Neuer Wall 10

Beanspruchte Priorität:
Schweiz vom 25. Juli, 30. Juli 1958 und 12. Februar 1959

Dr. Ernst Gäumann, Dr. Vladimir Prelog, Zürich,

und Dr. Ernst Vischer, Basel (Schweiz),

sind als Erfinder genannt worden

2. Synthetische Lösung:

Spärliches, weißgelbes Grundwachstum und wenige Flocken; gutes Oberflächenwachstum mit kreideweißem Luftmycel.

3. Glukose-Agar:

Wachstum runzelig, sattgelb; Substrat sattgelb; Luftmycel kreideweiß.

4. Glukose-Asparagin-Agar:

Wachstum dünn, schleierartig, weißgelb-weißgrau; Luftmycel samtig, weißgelb bis gelblichgrünlichgrau.

5. Calciummalat-Agar:

Wachstum dünn, schleierartig, weißgrau; Substrat ziegelrot; Luftmycel spärlich, schneeweiß.

6. Gelatinestich (18° C):

Wachstum oberflächlich, spärlich, runzelig bis flechtenartig; Substrat unverfärbt; Luftmycel gelblichgrünlichgrau; Verflüssigung langsam, nach 30 Tagen 0,3 cm.

7. Stärkeplatte:

Wachstum pustelig, weißgelb; Luftmycel samtig, gelblichgrünlichgrau, Hydrolyse nach 7 Tagen 1,3 cm.

8. Kartoffeln:

Wachstum dünn, schleierartig bis runzelig; Luftmycel samtig, weißgelb bis gelblichgrünlichgrau.

9. Karotten:

Wachstum sehr spärlich, punktförmig, weißgelb. 10. Lackmusmilch:

Sehr stark ausgebildete Pellikula, hellgelb; Luftmycel staubig, einen feinen Überzug bildend, schneeweiß; langsame Peptonisierung, 0,5 cm in 8 Tagen; keine Koagulation; Lackmus entfärbt oder blau.

009 550/319

Es ist bekannt, daß verschiedene Stämme von Streptomyces griseus verschiedene Antibiotika bilden (vergleiche z. B. Waksman und Lechevalier, »Acetinomycetes and their Antibiotics«, Baltimore, 1953, S. 166). Daraus folgt, daß man die Bildung· eines bestimmten Antibiotikums nicht als charakteristische Eigenschaft einer bestimmten Streptomyceten-Art, sondern lediglich als Charakteristikum. eines bestimmten Streptomyceten-Stammes bezeichnen kann (vgl. Ettlinger et al., Arch. MikrobioL, 31, S. 326 bis 358 [1958]). Die folgenden Anti- ίο biotika werden von verschiedenen Stämmen der Art Streptomyces griseus produziert: Streptomycin, Mannosido-streptomycin, Grisein, Streptocin, Candicidin und Actidion (Cycloheximid). Wie weiter unten gezeigt werden soll, unterscheidet sich das neue Antibiotikum Holomycin von allen diesen Substanzen in charakteristischer Weise.

Die Erfindung ist, was die Herstellung des Antibiotikums Holomycin anbelangt, nicht auf die Verwendung des Stammes NRRL 2764 oder anderer der Beschreibung entsprechender Organismen beschränkt, sondern betrifft auch die Verwendung von Varianten dieser Streptomyceten, wie sie z. B. durch Selektionierung oder Mutation, insbesondere unter der Einwirkung von Ultraviolettoder Röntgenstrahlen oder von Stickstoff-Senfölen gewonnen werden.

Zur Erzeugung des Antibiotikums wird ein die Eigenschaften von NRRL 2764 aufweisender Stamm von S. griseus in wäßriger, anorganische Salze, eine Stickstoff- und Kohlenstoffquelle enthaltender Nährlösung aerob gezüchtet, bis diese eine wesentliche antibakterielle Wirkung zeigt und das Antibiotikum Holomycin hierauf isoliert.

Die Nährlösung enthält als anorganische Salze beispielsweise Chloride, Nitrate, Carbonate, Sulfate von Alkalien, Erdalkalien, Magnesium, Eisen, Zink, Mangan. Kohlenstoffquellen sind vor allem Kohlehydrate, wie Glukose, Saccharose, Laktose, Stärke. Als stickstoffhaltige Verbindungen und gegebenenfalls zuzusetzende wachstumsfördernde Stoffe seien z. B. genannt: Aminosäuren und ihre Gemische, Peptide und Proteine sowie ihre Hydrolysate, wie Pepton oder Trypton, Fleischextrakte, wasserlösliche Anteile von Getreidekörnern, wie Mais und Weizen, von Destillationsrückständen bei der Alkoholherstellung, von Hefe, Bohnen, insbesondere der Sojapflanze, von Samen, beispielsweise der Baumwollpflanze.

Die Züchtung erfolgt aerob, also beispielsweise in ruhender Oberflächenkultur oder vorzugsweise submers unter Schütteln oder Rühren mit Luft oder Sauerstoff in Schüttelflaschen oder den bekannten Fermentern. Als Temperatur eignet sich eine solche zwischen 18 und 40° C. Eine wesentliche antibakterielle Wirkung zeigt die Nährlösung dabei im allgemeinen nach 15 bis 72 Stunden.

Zur Isolierung des Holomycins können z. B. folgende Verfahren dienen: Man trennt das Mycel vom Kulturfiltrat ab, wonach die Hauptmenge des Antibiotikums im Kulturfiltrat gefunden wird. Es bleiben aber trotzdem namhafte Mengen des Antibiotikums am Mycel adsorbiert. Es ist daher vorteilhaft, letzteres gut auszuwaschen. Dazu eignen sich besonders organische, mindestens teilweise wasserlösliche Lösungsmittel, wie Alkohole, z. B. Methanol, Äthanol und Butanole, oder Ketone, z. B. Aceton und Methyläthylketon. Diese Mycelextrakte werden entweder direkt oder nach vorheriger Konzentration im Vakuum zum Kulturfiltrat gegeben. Man extrahiert das Gemisch mit einem mit Wasser nicht mischbaren, organischen Lösungsmittel, wie Estern niederer Fettsäuren, beispielsweise Äthylacetat oder Amylacetat, Kohlenwasserstoffen, z. B. Benzol, chlorierten Kohlenwasserstoffen, z. B. Äthylenchlorid, Methylenchlorid oder Chloroform, Ketonen, z. B. Methylpropylketon, Methylamylketon oder Diisobutylketon, Alkoholen, wie Butylalkoholen oder Amylalkoholen, Äthern, z. B. Äthyläther, Diisopropyläther, Dibutyläthern oder Glykoläthern u. dgl. An Stelle einer Lösungsmittelextraktion der Kulturen oder in Kombination mit einer solchen als weitere Reinigungsoperation kann man das Antibiotikum auch durch Adsorption gewinnen, beispielsweise an Aktivkohle oder an aktivierten Erden, wie Fullererde oder Floridin, und anschließende Extraktion des Adsorbates z. B. mit einem in Wasser wenigstens teilweise löslichen organischen Lösungsmittel, wie Aceton, Butanol oder Methyläthylketon.

Man kann auch die Kulturen direkt, ohne vorgängige Abtrennung des Mycels, in der angegebenen Art und Weise extrahieren.

Eine weitere Anreicherung läßt sich dadurch erzielen, daß man die antibiotikumhaltigen organischen Extrakte zuerst mit einer sauren wäßrigen Lösung mit einem pn unter 5 und dann mit einer alkalischen wäßrigen Lösung mit einem pn über 8 wiederholt auszieht, wobei die Hauptmenge der antibiotischen Aktivität in der organischen Phase bleibt, aus der das Holomycin isoliert wird. Als saure wäßrige Lösungen eignen sich verdünnte Säuren, wie Essigsäure, Salzsäure oder Schwefelsäure, oder Pufferlösungen, wie Citrat- oder Phosphatpuffer, und als alkalische wäßrige Lösungen verdünnte Alkalien, wie Natronlauge oder Kalilauge, oder Pufferlösungen, wie Phosphatpuffer u. dgl.

Ein gutes Reinigungsverfahren für das neue Antibiotikum stellt die Chromatographie dar. Als Adsorbens hat sich Aluminiumoxyd besonders bewährt, doch können auch andere adsorbierende Substanzen verwendet werden, z. B. Silicagel, Magnesiumsilikat u. dgl.

Auch die Verteilung zwischen einer wäßrigen Lösung und einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel ist zur Anreicherung des neuen Antibiotikums sehr geeignet. Zweckmäßig erfolgt dieselbe nach dem Gegenstromverfahren in entsprechenden Apparaten. Die Gewinnung des reinen Antibiotikums in kristalliner Form nimmt man z. B. aus organischen Lösungsmitteln, wie aus Aceton, Methanol, Äthanol, Essigester, Chloroform, Essigester-Methanol-Gemischen, Essigester-Äther-Gemischen oder Essigester-Petroläther-Gemischen vor. Zum Umkristallisieren dienen dieselben Lösungsmittel oder auch wäßrig-organische Lösungen, [wie verdünnte Alkohole, verdünntes Aceton usw. Weiter kann das Antibiotikum mittels Sublimation im Hochvakuum gereinigt werden.

Das Antibiotikum erhält man als organgegefärbte Kristallblättchen, F. 264 bis 271°C. Die Elementaranalyse liefert folgende Werte: C = 39,25 %, H = 2,79 %, N = 13,07%, S = 29,77%, (C)CH₃ = 7,04%, CH₃CO = 21,38%. Diese Werte weisen auf die Formel C₇H₆O₂N₂S₂ hin, wobei die Substanz keine O-Methyl- oder N-Methylgruppen, jedoch je eine C-Methyl- und Acetylgruppe enthält. Das Ultraviolett-Absorptionsspektrum (vgl. Fig. 1, Kurve 1) zeigt drei Banden bei 245 πΐμ (löge = 3,78), bei 302 πιμ (logs = 3,51) und bei 390 ΐημ (löge = 4,05). Im Infrarotspektrum (vgl. Fig. 2, Kurve 1) sind Banden unter anderem bei folgenden Wellenlängen sichtbar: 2,91 μ, 3,10 μ, 3,18 μ, 3,27 μ, 3,31 μ, 6,02 μ, 6,10 μ, 6,25 μ, 6,44 μ, 6,86 μ, 7,30 μ, 7,42 μ, 7,58 μ, 7,89 μ, 8,38 μ, 9,49 μ, 9,68μ, 12,10 μ, 12,65 μ, 12,98 μ, 13,90 μ, 14,25 μ und 15,35 μ. Holomycin ist eine neutrale Substanz und besitzt keine leicht acylierbaren Hydroxylgruppen.

Bei der sauren Hydrolyse wird unter Abspaltung von Essigsäure ein basisches Spaltprodukt erhalten, das als Hydrochlorid in kristalliner Form anfällt. Die Elementaranalyse liefert folgende Werte: C = 29,06 %, H = 2,54 %, N = 13,35%, S = 30,56% und Cl = 16,74%, die auf

die Summenformel C₅H₅ON₂S₂Cl hinweisen. Das Ultraviolett-Absorptionsspektrum (vgl. Fig. 1, Kurve 3) zeigt drei Banden, nämlich bei 226 ΐημ (löge = 3,70), bei 296 πιμ (löge = 3,70) und bei 381 χημ. {löge = 4,08). Das Infrarotspektrum ist in Fig. 3, Kurve 4, wiedergegeben.

Durch Behandlung mit acylierenden Mitteln, z. B. mittels Carbonsäureanhydriden oder -Chloriden, erhält man die entsprechenden acylierten Verbindungen. Verwendet man Acetanhydrid, so wird das Holomycin gebildet, das die obenerwähnten Eigenschaften besitzt. Es handelt sich demnach bei dem oben erwähnten basischen Spaltprodukt um das Desacetylderivat des Antibiotikums Holomycin. Bei der Umsetzung des Desacetylderivates mit Propionsäureanhydrid oder mit n-Buttersäureanhydrid wird das Propionyl bzw. das Butyrylderivat erhalten. Ersteres schmilzt bei 250 bis 260° C unter Zersetzung und letzteres bei 215 bis 218° C. Das Desacetylderivat läßt sich in üblicher Weise in seine Salze überführen.

Wird Holomycin mit entschwefelnden Mitteln, z. B. mit Raneynickelkatalysator, behandelt, so erhält man eine farblose, schwefelfreie Verbindung C₇H₁₂O₂N₂ der Formel Verwendung der beiden Lösungsmittelsysteme A (stationäre Phase—Formamid, mobile Phase—Benzol) und B (stationäre Phase—Natrium-meta-kresotinat, mobile Phase—Gemisch n-Butylacetat—Di-n-butyläther im Verhältnis 3:1) zeigen Holomycin und seine Homologen die folgenden R_Th-Werte. Als Rm-Werte wird das Verhältnis der Laufstrecken zu der Laufstrecke von Thiolutin angegeben:

CH, — CH-NH-CO—-CH,

CH₃-CH

C = O

NH

welche bei 191 bis 191,5° C schmilzt. Das Ultraviolett-Absorptionsspektrum zeigt nur eine schwache Endabsorption bei 210 ΐημ. Durch saure Hydrolyse dieser Substanz wird die a.y-Diaminovaleriansäure gebildet. Die gleichen Reaktionen lassen sich mit dem Desacetylderivat und allgemein mit seinen Acylderivaten durchführen.

Das Holomycin ist gemäß seinen physikalischen und chemischen Eigenschaften sowie gemäß den erhaltenen Abbauprodukten nahe verwandt mit dem Antibiotikum Thiolutin (W. D. Celmer, J. A. Solomons, Antibiotic Annual, 1953/54, S. 622; W. D. Celmer, F. W. Tanner, M. Harfenist, T. M. Lees, J. A. Solomons, J. Amer. Chem. Soc, 74, S. 6304 [1952]; W. D. Celmer, J. A. Solomons, J. Amer. Chem. Soc, 77, S. 2861 [1955]). Die Verschiedenheit dieser beiden Antibiotika geht aber aus der beobachteten Schmelzpunkterniedrigung von 20° C ihres Gemisches, aus ihren Infrarotspektren sowie aus ihrem Verhalten bei der Papierchromatographie hervor. Bei

	System A	System B
Thiolutin	1,00 1,47 1,76 0,10 0,28 0,52	1,00 1,62 2,10 0,78 1,50 1,87
Aureothricin Butyryl-pyrrothin Holomycin Propionyl-Holothin Butyryl-Holothin

Auf Grund dieser Befunde wird dem Holomycin die Formel II (R = COCH₃), dem Desacetylderivat die Formel I und der Propionyl- bzw. Butyrylverbindung die Formelll (R = COCH₂CH₃ bzw. R = COCH₂CH₂CH₃) zugeschrieben.

Das Holomycin ist verschieden von den von anderen Stämmen der Art Streptomyces griseus produzierten bekannten Antibiotika. Im Gegensatz zu Holomycin lassen sich Streptomycin, Mannosido-streptomycin und Grisein nicht mit organischen Lösungsmitteln aus dem Kulturnitrat extrahieren und besitzen basische Eigenschaften.

Das Actidion (Cycloheximid) und das Candicidin zeigen einen von Holomycin verschiedenen Schmelzpunkt und ein verschiedenes antibiotisches Wirkungsspektrum. Das letztere trifft auch für das Streptocin zu. Von allen diesen bekannten Antibiotika unterscheidet sich Holomycin weiter durch sein Absorptionsspektrum in Ultraviolett und Infrarot, mit Ausnahme des Griseins, durch seine Eigenfarbe.

Das Antibiotikum Holomycin, das Desacetylderivat sowie ganz allgemein Acylverbindungen des letzteren, besonders die zum Antibiotikum Holomycin homologen Propionyl- und n-Butyrylverbindungen besitzen eine sehr hohe antibiotische Wirksamkeit gegenüber verschiedenen Testorganismen. Verwendet man als Testmethode in vitro Verdünnungsreihen (Zehnerpotenzen) in Glukosebouillon, die während 24 Stunden bei 37⁰C bebrütet werden, so ergeben sich folgende noch hemmende Konzentrationen:

Testorganismen Hemmende Konzentration /ig/cm³

Holomycin	Holothin	Propionyl- verbindung	Butyryl verbindung
100	>100	>100	>100
10	>100	>100	>100
1	100	10	10
10	100	100	100
100	100	100	>100
1	10	1	0,1
10	>100	100	100
10	>100	100	100
10	>100	100	100
10	100	10	10
10	100	10	100
10	100	100	100
100	>100	>100	>100
10	100	10	>100
0,1	10	1	10
10	100	10	10
10	100	10	10
100	>100	>100	100

Micrococcus pyogenes, var. aureus

Micrococcus pyogenes, var. aureus Penicillin-resistent

Streptococcus pyogenes

Streptococcus viridans

Streptococcus faecalis

Corynebacterium diphtheriae

Escherichia coli

Escherichia coli, Chloromycetin-resistent

Escherichia coli, Streptomycin-resistent

Sahnonella typhosa

Salmonella schottmuelleri

Shigella sonnei

Pseudomonas aeruginosa

Klebsiella Typ A

Pasteurella pestis

Vibrio cholerae el Tor

Bacillus megatherium

Endomyces albicans

7 8

Die neuen Verbindungen oder entsprechende Gemische f) 3 g Casein, 2 g sek. Kaliumhydrophosphat, 10 g Rohkönnen als Heilmittel, z. B. in Form pharmazeutischer glukose und 11 Leitungswasser; pn vor der Sterilisation Präparate, Verwendung finden. Diese enthalten die ge- 7,5.

nannten Verbindungen in Mischung mit einem für die g) 20 g Mannit, 20 g Soyamehl und 11 Leitungswasser;

enterale, parenterale oder lokale Applikation geeigneten 5 Ph vor der Sterilisation 7,8.

pharmazeutischen organischen oder anorganischen Träger- . .

material. Für dasselbe kommen solche Stoffe in Frage, .Beispiel s

die mit den neuen Verbindungen nicht reagieren, wie Der Filterrückstand eines gemäß Beispiel 1 oder 2 er-

z. B. Gelatine, Milchzucker, Stärke, Magnesiumstearat, haltenen 150-1-Ansatzes wird mit 251 Aceton ausgerührt

Talk, pflanzliche Öle, Benzylalkohole, Gummi, Poly- io und erneut nitriert. Dies wird zweimal wiederholt, worauf

alkylenglykole, Vaseline, Cholesterin oder andere be- man die antibiotikumhaltigen Acetonlösungen vereinigt,

kannte Arzneimittelträger. Die pharmazeutischen Präpa- im Vakuum auf 51 einengt und mit dem Kulturnitrat

rate können z. B. als Tabletten, Dragees, Pulver, Salben, vereinigt. Diese Lösung wird mit 701 Äthylacetat extra-

Cremen, Suppositorien oder in flüssiger Form als Lö- hiert, wobei die gesamte antibakterielle Aktivität in die

sungen, Suspensionen oder Emulsionen vorliegen. Gege- 15 organische Phase übergeht. Der Extrakt wird mit Wasser

benenfalls sind sie sterilisiert und bzw. oder enthalten gewaschen, im Vakuum auf 51 eingedampft und dann

Hilfsstoffe, wie Konservierungs-, Stabilisierungs-, Netz- mehrere Male mit 0,5n-Essigsäure und mit 2n-Natron-

oder Emulgiermittel. Sie können auch noch andere thera- lauge ausgeschüttelt. Schließlich trocknet man die Äthyl-

peutisch wertvolle Stoffe enthalten. acetatlösung über Natriumsulfat und dampft sie im

Die Erfindung wird in den Beispielen beschrieben, ohne 20 Vakuum ein, wobei das rohe Antibiotikum Holomycin in daß damit eine Einschränkung des Erfindungsgegen- Form eines braunen Öls erhalten wird.
Standes beabsichtigt ist. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben. Beispiel 4

•η . . , ., 100 g des gemäß Beispiel 3 erhaltenen rohen Anti-

" 25 biotikums Holomycin werden an einer Säule aus 2 kg

Man bereitet eine Nährlösung der Zusammensetzung: Aluminiumoxyd (Aktivität III) nach der Durchlauf-20 g Distillers solubles, 20 g Malzextrakt, 1 g Natrium- methode chromatographiert, wobei mit Chloroform, nitrat, 5 g Natriumchlorid und 11 Leitungswasser und Chloroform-Methanol-Gemischen und Methanol eluiert stellt sie auf pn7,5 ein. Diese bzw. ein Vielfaches der- wird. Die einzelnen Fraktionen (je 41) werden im Vakuum selben wird in 500-cm³-Erlenmeyern (mit je 100 cm³ 30 eingedampft und auf ihre antibiotische Aktivität unterNährlösung) oder in 500-1-Fermentern (mit je 3001 Nähr- sucht. Die Chloroform- und die Chloroform-Methanollösung) abgefüllt und 20 bis 30 Minuten bei 1 atü sterili- (99:1)-Fraktionen enthalten nur unwirksame Begleitsiert. Dann impft man mit bis zu 10% ^einer teilweise substanzen, während die mit Chloroform-Methanolsporulierenden, vegetativen Kultur des Streptomyceten- (97: 3)-Gemischen eluierten Anteile gelbgefärbt und Stammes NRRL 2764 an und inkubiert unter gutem 35 hochwirksam sind. Sie werden vereinigt und aus Essig-Schütteln bzw. Rühren und in den Fermentern unter ester kristallisiert. Man erhält das Holomycin in Form Belüftung (mit etwa 1 Volumen steriler Luft pro Volumen von orangegelben Blättchen, F. 264 bis 271°; Misch-Nährlösung pro Minute) bei 27°, wobei sich in den KuI- Schmelzpunkt mit Thiolutin 240 bis 245°. Die Elementarturen eine antibakterielle Wirksamkeit entwickelt. Nach analyse liefert folgende Werte: C = 39,25 %, H = 2,79 %, 18 bis 72 Stunden Wachstum filtriert man die Kulturen 40 N = 13,07%, S = 29,77%, C(CH₃) = 7,04%, CH₃CO unter Zusatz eines Filterhilfsmittels je nach Volumen = 21,38%, N(CH₃) = 0%, OCH₃ = 0%. Das Ultradurch eine Nutsche oder durch eine Filterpresse oder violett-Absorptionsspektrum in Feinsprit (vgl. Fig. 1, einen rotierenden Filter und befreit so die antibiotisch Kurve 1) zeigt drei Banden bei 245 ΐημ (log s = 3,78), wirksame wäßrige Lösung vom Mycel und anderen festen bei 302 ηιμ (log ε = 3,51) und bei 390 πΐμ (log e = 4,05). Bestandteilen. 45 Im Infrarotspektrum in Kaliumbromid (vgl. Fig. 2, -ο . ■ λ η Kurve 1) sind Banden unter anderem bei folgenden .Beispiel £ Wellenlängen sichtbar: 2,91 μ, 3,10 μ, 3,18 μ, 3,27 μ,

Verwendet man an Stelle des im Beispiel 1 angegebenen 3,31 μ, 6,02 μ, 6,10 μ, 6,25 μ, 6,44 μ, 6,86 μ, 7,30 μ,

Mediums die im folgenden beschriebenen Nährlösungen a), 7,42 μ, 7,58 μ, 7,89 μ, 8,38 μ, 9,49 μ, 9,68 μ, 12,10 μ,

b), c), d), e), f) oder g), so erhält man nach analoger Steri- 50 12,65 μ, 12,98 μ, 13,90 μ, 14,25 μ und 15,35 μ.

lisation, Beimpfung mit dem Streptomyceten-Stamm .

NRRL2764, Inkubation bei 27° und Filtration wäßrige .Beispiel 5

antibiotisch wirksame Lösungen. 5,7 g des gemäß Beispiel 3 erhaltenen rohen Anti-

a) 10 g Rohglukose, 5 g Pepton, 3 g Fleischextrakt biotikums Holomycin werden einer 82stufigen Gegen-(Oxo Lab Lemco), 5 g Natriumchlorid, 10 g Calcium- 55 stromverteilung unterworfen, wobei man als Lösungscarbonat und 11 Leitungswasser; pn vor der Sterili- mittelgemisch das System Essigester—Wasser (1:1) versation 7,5. wendet.

b) 10 g Rohglukose, 10 g Distillers solubles, 1 g Na- Der Inhalt der Verteilungsgefäße, die am intensivsten triumnitrat, 5 g Natriumchlorid, 10 g Calciumcarbonat gefärbt sind, wird vereinigt. Die wäßrige Phase wird ab- und 11 Leitungswasser; pH vor der Sterilisation 7,5. 60 getrennt und zweimal mit frischem Essigester extrahiert.

c) 10 g Rohglukose, 10 g Soyamehl, 20 cm³ Maisquell- Die Essigesterauszüge werden vereinigt, über Natriumwasser (corn steep liquor), 5 g Natriumchlorid, 1 g Na- sulfat getrocknet und im Vakuum stark konzentriert, triumnitrat, 10 g Calciumcarbonat und 11 Leitungs- wobei das Holomycin in orangegelben Kristallen ausfällt, wasser; p_H vor der Sterilisation 7,5. F. 264 bis 271°.

d) 20 g Glycerin, 10 g Soyamehl, 5 g Natriumchlorid, 55 Es besitzt die im Beispiel 4 beschriebenen Eigen-1 g Natriumnitrat, 10 g Calciumcarbonat und 11 Lei- schäften.

tungswasser; pn vor der Sterilisation 7,5. .

e) 20 g Laktose, 20 g Distillers solubles, 5 g Natrium- Beispiel 6

chlorid, 1 g Natriumnitrat und 11 Leitungswasser; Eine Lösung von 500 mg Holomycin in 25 cm³ Dioxan

Ph vor der Sterilisation 8,0. 70 wird zum Sieden erhitzt, mit 5 cm³ konzentrierter Salz-

säure versetzt und dann 45 Minuten unter Rückfluß gekocht. Beim Abkühlen der Reaktionslösung scheidet sich das rohe Hydrochlorid des Holothins in Form von grünschwarzen Kristallen ab. Diese werden aus 90 ml heißer 2n-Salzsäure umkristallisiert. Die olivgrünen, metallisch schimmernden Blättchen verlieren bei 240 bis 260° langsam ihre Doppelbrechung, schmelzen aber bis 300° nicht. Die Elementaranalyse liefert die folgenden Werte: C = 29,06%, H = 2,54%, N = 13,35%, S = 30,56%, Cl = 16,74%. Das Ultraviolettspektrum in Feinsprit (vgl. Fig. 1, Kurve 3) zeigt drei Banden bei 226 πΐμ (löge = 3,70), bei 296 πιμ (log ε = 3,70) und bei 381 ηιμ (löge = 4,08). Das Infrarotspektrum in Kaliumbromid ist in Fig. 3, Kurve 4, dargestellt.

Beispiel 7

Eine Lösung von 133 mg des gemäß Beispiel 6 erhaltenen Hydrochlorids des Holothins in 13 cm³ Wasser wird unter Rühren mit 2 cm³ Essigsäureanhydrid versetzt, wobei sich Holomycin in Form von orangegelben Kristallen abscheidet. Nach halbstündigem Stehen werden diese abfiltriert und aus einem Methanol-Essigester-Gemisch umkristallisiert, F. 264 bis 271°. Das erhaltene Kristallisat ist in jeder Hinsicht identisch mit dem im Beispiel 5 beschriebenen Holomycin.

Beispiel 8

Zu einer Lösung von 130 mg des gemäß Beispiel 6 erhaltenen Hydrochlorids der desacetylierten Verbindung in 14 cm³ Wasser werden unter Rühren 3 cm³ Propionsäureanhydrid zugegeben. Es scheidet sich ein orangegelber kristalliner Niederschlag ab, der nach ¹/₂stündigem Stehen abfiltriert und aus einem Methanol-Essigester-Gemisch umkristalliert wird. Die so erhaltene Propionylverbindung schmilzt bei 250 bis 260° unter Zersetzung. Elementaranalyse: C = 41,91%, H = 3,45%, N = 12,26%, S = 28,17%. Das Ultraviolettspektrum in Feinsprit zeigt drei Banden bei 245 ηιμ (log ε = 3,78), bei 302 ΐημ (log ε = 3,51) und bei 390 ηιμ (log ε = 4,05), es ist identisch mit dem des Holomycins (vgl. Fig. 1, Kurve 1). Im Infrarotspektrum in Kaliumbromid (vgl. Fig. 2, Kurve 2) sind unter anderem folgende Banden sichtbar: 2,88 μ, 3,06 μ, 3,16 μ, 3,25 μ, 3,30 μ, 6,02 μ, 6,09 μ, 6,25 μ, 6,43 μ, 6,84 μ, 7,07 μ, 7,26 μ, 7,42 μ, 7,71 μ, 8,10 μ, 8,45 μ, 9,27 μ, 9,52 μ, 11,20 μ, 12,15 μ, 12,68 μ, 14,15 μ und 15,50 μ.

Beispiel 9

Eine Lösung von 110 mg des gemäß Beispiel 6 erhaltenen Hydrochlorids der desacetylierten Verbindung in 18 cm³ Wasser wird unter Rühren mit 2 cm³ Buttersäureanhydrid versetzt, wobei sich die Butyrylverbindung in Form von orangegelben Kristallen abscheidet. Es wird aus Methanol umkristallisiert, F. 215 bis 218°. Elementaranalyse: C = 44,57%, H = 4,25%, N = 11,56%, S =26,10%. Das Ultraviolettspektrum in Feinsprit zeigt drei Banden bei 245 ηιμ (log ε = 3,78), bei 302 ηιμ (log ε = 3,51) und bei 390 ηιμ (log ε = 4,05) und ist identisch mit dem des Holothins. Im Infrarotspektrum in Kaliumbromid (vgl. Fig. 2, Kurve 3) sind unter anderem folgende Banden sichtbar: 2,89 μ, 3,08 μ, 3,17 μ, 3,30 μ, 3,35 μ, 6,01 μ, 6,09 μ, 6,25 μ, 6,47 μ, 6,84 μ, 7,41 μ, 7,47 μ, 7,71 μ, 7,79 μ, 7,95 μ, 8,20 μ, 8,39 μ, 9,15 μ, 9,50 μ, 10,50 μ, 11,18 μ, 11,33 μ, 12,15 μ, 12,75 μ, 13,05 μ, 14,25 μ, 15,25 μ und 15,55 μ.

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Die Verwendung von Streptomyces griseus NRRL 2764 oder eines dessen Eigenschaften aufweisenden Mikroorganismus der Gattung Streptomyces zur Herstellung des Antibiotikums Holomycin durch übliche biologische Züchtung, Gewinnung des Antibiotikums aus dem Kulturfiltrat, Reindarstellung, gegebenenfalls Überführung der freien Basen in ihre Salze oder Hydrolysierung der Base oder ihrer Salze und gegebenenfalls Veresterung des Hydrolyseproduktes mit niederen Fettsäuren.

   Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

   © 009 550/319 7.60