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Herstellung und Gewinnung neuer Antibiotika Die Erfindung betrifft
die Herstellung und Gewinnung von zwei neuenAntibiotika, die im folgenden » Cinerubin
A« und »Cinerubin B" genannt werden, ihren Derivaten und Salzen.
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Die Cinerubine entstehen bei der Kultur einer neuen Aktinomycetenart
der Gattung Streptomyces, die mit keiner der in Bergeys »Manual of Determinative
Bacteriology«, 6. Auflage, oder in »Actinomycetes and their Antibiotics" von Waksman
und Lechevalier, 1953, aufgeführten Arten identisch ist und im folgenden als Streptomyces
cinereoruber Corbaz et a1. var. fructofermentans beschrieben wird. Sie wurde aus
einer im Zürcher Zoo gesammelten Bodenprobe isoliert und wird in den Laboratorien
der Erfinder und in der Eidg. Technischen Hochschule, Institut für spezielle Botanik,
Zürich, unter der Bezeichnung A 6143 aufbewahrt.
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Streptomyces cinereoruber var. fructofermentans bildet ein spärliches
Luftmycel, das anfänglich weiß, dann weißgrau und schließlich aschgrau gefärbt ist.
Es hat Konidienketten, die ein typisches Merkmal der Gattung Streptomyces sind.
Die Sporen sind glatt. Das Substratmycel ist rot und bildet ein lösliches Pigment.
Das Wachstum ist relativ wenig abhängig von der Temperatur, sowohl bei 18'
als auch bei 40° entwickelt sich der Pilz gut, doch liegt das Optimum zwischen 25
und 32°.
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Zur weiteren Charakterisierung wird im folgenden das Wachstum von
Streptomyces cinereoruber var. fructofermentans auf verschiedenen Nährmedien beschrieben.
Die Nährmedien 1 bis 7 und 11 wurden nach W. Lindenbein, Arch. Mikrobiol., 17, S.
361 (1952), hergestellt.
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Synthetischer Agar: Wachstum dünn, schleierartig, farblos nach 3 Tagen,
später rosa; Luftmycel staubig, nach 8 Tagen milchweiß oder blaßkarmin, nach 14
Tagen aschgrau; ein rosarotes lösliches Pigment wird nach 4 Tagen gebildet.
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Synthetische Lösung: Flocken weißgrau bis rosa; Pellikel mit spärlichem
weißgrauem Luftmycel; Pigment blaßkarmin.
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Glukose-Agar: Punktförmiges Wachstum, farblos oder stellenweise korallenrot
nach 3 Tagen, fleischrot nach 8 Tagen; Luftmycel spärlich, weißgrau nach 8 Tagen,
aschgrau nach 14 Tagen; Substrat fleischrot gefärbt nach 8 Tagen.
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Glukose-Asparagin-Agar : Wachstum wie auf Glukose-Agar ; Luftmycel
staubig, kreideweiß nach 4 Tagen, später weißgrau; blaßkarminrotes lösliches Pigment.
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Calciummalat-Agar: Wie Glukose-Asparagin-Agar. Gelatinestich 18°C:
Oberflächliches Wachstum weißgelb bis hellgelbrot; Luftmycel spärlich, weißgrau;
löslichesPigmentintensivkastanienbraun bis r ötlichbraun ; Verflüssigung sehr langsam,
beginnend nach 34 Tagen, 0,4 cm nach 42 Tagen.
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Stärkeplatte: Wachstum punktförmig, farblos; Luftmycel mehlig bestäubt,
weißgrau; Stärkehydrolysierung Spuren nach 4 Tagen.
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Nähragar : Spärliches Wachstum, hellgelb; kein Luftmycel; Pigment
schwach, rötlichbraun.
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Kartoffeln: Flechtenartiges Wachstum, kupferrot nach 4 Tagen, bräunlich
bis pechschwarz nach 8 Tagen, kein Luftmycel; Substrat blauschwarz gefärbt.
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Karotten: Flechtenartiges Wachstum, graublau und blaßkarmin; Luftmycel
nach 8 Tagen sammetig, weißgrau bis aschgrau; Pigment blauschwarz.
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Lackmusmilch: Ringwachstum, Pellikel hellbraun; Luftmycel spärlich
weißgrau; Peptonisierung nach 7 Tagen; keine Gerinnung.
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Streptomyces cinereoruber var. fructoferrr entanswächst, nach der
Methodik von T. G. PridhamundD.Gottlieb, J. Bacteriology, 56, S.107 (1948), untersucht,
bei Verwendung verschiedener Kohlenstoffquellen wie folgt:
z-Xylose . . . + Inulin . . . . . . . . . (-) |
r.-Arabinose -@- n-Mannit .... |
r. Rhamnose (-f-) n-Sorbit ....... + |
i)-Fruktose Dulcit . . . . . . . . . (-) |
v-Galaktose -I- Mesoinosit ... |
Saccharose (+) Salicin . . . . . . . . . |
Maltose . . . + Natriumacetat. . (-) |
Lactose ... -!- Natriumcitrat .. (-) |
Raffirrose Natriumsuccinat (-) |
Dabei bedeutet: gutes Wachstum, sichere Verwendung der betreffenden Kohlenstoffquelle,
(-i-) schwaches Wachstum, Verwendung der betreffenden Kohlenstoffquelle fraglich,
(-)
sehr schwaches Wachstum, Verwendung der betreffenden Kohlenstoffquelle unwahrscheinlich,
- kein Wachstum, keine Verwendung der betreffenden Kohlenstoffquelle.
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Streptomyces cinereorubervar.fructofermentans stimmt morphologisch
gut mit Streptomyces cinereoruber (R. Corbaz, L. Ettlinger, W. Keller-Schierlein
und H. Zähner, Arch. Mikrob., im Druck) überein, unterscheidet sich aber biologisch
von dieser Art durch seine Fähigkeit, verschiedene Kohlenstoffquellen auszuwerten.
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Streptomyces cinereoruber var. fructofermentans zeigt weiter gewisse
Ähnlichkeiten mit S. purpurascens Lindenbein, welcher aber stachelige Sporen bildet
und ein völlig abweichendes Kohlenstoffquellenspektrum zeigt. Letzteres gilt ebenfalls
für S. Bobiliae (Waksman et Curtis) Waksman et Henrici.
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Die Erfindung ist, was die Herstellung der Antibiotika Cinerubin A
und Cinerubin B oder ihrer Gemische anbelangt, nicht auf die Verwendung des Streptomyces
cinereoruber var. fructofermentans oder anderer der Beschreibung entsprechender
Stämme beschränkt, sondern betrifft auch die Verwendung von Varianten dieser Organismen,
wie sie z. B. durch Selektionierung oder Mutation, insbesondere unter der Einwirkung
von Ultraviolett- oder Röntgenstrahlen oder von Stickstoff-Senfölen gewonnen werden.
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Zur Erzeugung der Cinerubine wird ein die Eigenschaften von Streptomyces
cineroeruber var. fructofermentans aufweisender Streptomycetenstamm, z. B. in wäßriger,
anorganische Salze, stickstoffhaltige Verbindungen und gegebenenfalls Kohlenhydrate
enthaltender Nährlösung aerob gezüchtet, bis diese eine wesentliche antibakterielle
Wirkung zeigt, und hierauf Cinerubin A und/oder Cinerubin B oder Gemische davon
aus dem Kulturfiltrat isoliert.
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Die Nährlösung enthält als anorganische Salze beispielsweise Chloride,
Nitrate, Carbonate, Sulfate von Alkalien, Erdalkalien, Magnesium, Eisen, Zink, Mangan.
Als stickstoffhaltige Verbindungen und gegebenenfalls zuzusetzende Kohlehydrate
und wachstumsfördernde Stoffe seien z. B. genannt: Aminosäuren und ihre Gemische,
Peptide und Proteine sowie ihre Hydrolysate, wie Pepton oder Trypton, Fleischextrakte,
wasserlösliche Anteile von Getreidekörnern, wie Mais und Weizen, von Destillationsrückständen
bei der Alkoholherstellung, von Hefe, Bohnen, insbesondere der Sojapflanze, von
Samen, beispielsweise der Baumwollpflanze, ferner Glukose, Saccharose, Lactose,
Stärke usw.
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Die Züchtung erfolgt aerob, also beispielsweise in ruhender Oberflächenkultur
oder vorzugsweise submers unter Schütteln oder Rühren mit Luft oder Sauerstoff in
Schüttelflaschen oder den bekannten Fermentern. Als Temperatur eignet sich eine
solche zwischen 20 und 40°. Eine wesentliche antibakterielle Wirkung zeigt die Nährlösung
dabei im allgemeinen nach 11/z bis 5 Tagen.
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Je nach der Zusammensetzung der verwendeten Nährlösung wird entweder
ein Gemisch von Cinerubin A und B oder vorwiegend Cinerubin A oder vorwiegend Cinerubin
B produziert. Beispielsweise kann Streptomyces cinereoruber var. fructofermentans
auf Nährlösungen gezüchtet werden, die auf 1 1 Wasser folgende Substanzen enthalten
Nährlösung Nr. 12/41: Glycerin 20 g, Sojamehl 10 g, Natriumchlorid 5 g, Calciumcarbonat
10 g und Natriumnitrat 1 g.
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Nährlösung Nr. 22: Mannit 20 g, -Distillers solubles.: 20 g, Natriumchlorid
3 g und Natriumnitrit 1 g. Nährlösung Nr. 19: Mannit 20 g und Sojamehl 20 g. Dabei
wird bei der Verwendung von Nährlösung Nr. 19 vorwiegend Cinerubin A gebildet und
mit Nährlösung Nr. 12/41 hauptsächlich Cinerubin B. Mit Nährlösung Nr. 22 wird ein
Gemisch von Cinerubin A und B produziert.
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Zur Isolierung der Cinerubine können z. B. folgende Verfahren dienen:
Man trennt das Mycel vom Kulturfiltrat ab, wonach die Hauptmenge der Antibiotika
im Kulturfiltrat gefunden wird. Es bleiben aber trotzdem namhafte Mengen der Antibiotika
am Mycel adsorbiert. Es ist daher vorteilhaft, letzteres gut auszuwaschen. Dazu
eignen sich besonders organische, mindestens teilweise wasserlösliche Lösungsmittel,
wie Alkohole, z. B. Methanol, Äthanol und Butanole, oder Ketone, z. B. Aceton und
Methyläthylketon, oder aber organische oder anorganische Säuren, wie Essigsäure,
Salzsäure oder Schwefelsäure. Diese Mycelextrakte werden entweder direkt oder nach
vorheriger Konzentration im Vakuum zum Kulturfiltrat gegeben. Man extrahiert das
Gemisch vorteilhaft bei einem pu über 7 mit einem mit Wasser nicht mischbaren, organischen
Lösungsmittel, wie Estern niederer Fettsäuren, beispielsweise Äthylacetat oder Amylacetat,
Kohlenwasserstoffen, z. B. Benzol, chlorierten Kohlenwasserstoffen, z. B. Äthylenchlorid,
Methylenchlorid oder Chloroform, Ketonen, z. B. Methylpropylketon, Methylamylketon
oder Diisobutylketon, Alkohlen, wie Butylalkoholen oder Amylalkoholen, Äthern, z.
B. Äthyläther, Diisopropyläther, Dibutyläthern oder Glykoläthern und dergleichen.
An Stelle einer Lösungsmittelextraktion der Kulturen oder in Kombination mit einer
solchen als weitere Reinigungsoperation kann man die Antibiotika auch durch Adsorption
gewinnen, beispielsweise an Aktivkohle oder an aktivierten Erden, wie Fullererde
oder Floridin, und anschließende Extraktion des Adsorbates z. B. mit einem in Wasser
wenigstens teilweise löslichen organischen Lösungsmittel, wie Aceton, Butanol oder
Methyläthylketon.
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,Man kann auch die Kulturen direkt, ohne vorgängige Abtrennung des
Mycels, in der angegebenen Art und Weise extrahieren.
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Eine weitere Anreicherung läßt sich dadurch erzielen, daß man die
antibiotikahaltigen organischen Extrakte mit einer sauren wäßrigen Lösung mit einem
pA unter 5 wiederholt auszieht, wobei die Hauptmenge der antibiotischen Aktivität
in die wäßrige Phase übergeht. Eine geringe Menge Aktivität bleibt in der organischen
Phase zurück. Die vereinigten sauren wäßrigen Lösungen werden dann bei einem px
über 7 in der beschriebenen Weise wieder mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen
Lösungsmittel extrahiert. Diese Prozedur kann mehrere Male wiederholt werden. Als
saure wäßrige Lösungen eigner. sich verdünnte Säuren, wie Essigsäure, Salzsäure
oder Schwefelsäure, oder Pufferlösungen, wie Citrat- oder Phosphatpuffer.
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Ein gutes Reinigungs- und gegebenenfalls Trennungsverfahren für die
neuen Antibiotika stellt die Verteilung zwischen einer sauren oder einer alkoholischen
wäßrigen Lösung und einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel dar. Zweckmäßig
erfolgt die Verteilung nach dem Gegenstromverfahren in entsprechenden Apparaten.
Auch Chromatographie ist zur Reinigung und gegebenenfalls Trennung geeignet. Die
Gewinnung der reinen Antibiotika in kristalliner Form nimmt man z. B. aus organischen
Lösungsmitteln, wie aus Aceton, Methanol, Äthanol, Chloroform, Aceton-i@lethanol-(@emischen,
Aceton-Äther-Gemischen, Aceton-Petroläther-Gemischen oder Benzol-Methanol-Gemischen,
vor. Zum Umkristallisieren dienen dieselben Lösungsmittel oder auch wäßrig-organische
Lösungen, wie verdünnte Alkohole, verdünntes Aceton USW.
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Das Antibiotikum Cinerubin A kristalliierte in stark lösungsmittelhaltigen
Plättchen, die beim Trocknen an der Luft oder im Vakuum zu einem dunkelroten Pulver
zerfallen.
F. = 155 bis 157°. Die Elementaranalyse liefert folgende Werte: C = 61,12 0/a, H
= 7,03 °/a, N = 1,910/0, O C H3 = 4,08 °/o. Sein UV-Absorptionsspektrum zeigt Banden
bei folgenden Wellenlängen: 234mp. (log E = 2,28), 258 m#t (log E = 2,36), 292 m@a,
(log E = 1,92), 4,75 m#L (log E = 2,05), 495 m#t (log E = 2,11) und 530 m#t (log
E = 1,94). Im Infrarotspektrum sind Banden unter anderem bei folgenden Wellenlängen
sichtbar: 2,9 p., 3,4 #t, 3,5 N., 5,77 #t, 6,06 It, 6,21 p,, 6,81 7,02 @., 7,06
7,21 7,55 #t, 7,68 #t, 7,88 #t, 8,14 #t, 8,56,, 8,88 9,05 9,56 9,84 #t, 10,37 &,,
10,78 V., 11,19 #L, 11,31 11,79 #t" 12,32 V., 12,71 V. (Bande mit dreifacher Spitze),
13,10 #t" 13,49 V., 13,75 #t und 14,21 Bei der Hydrolyse mit verdünnten Mineralsäuren
zerfällt das Antibiotikum Cinerubin A in zwei reduzierende Zuckerkomponenten und
in ein neutrales, antibiotisch wirksames Aglykon, das Cinerubinon. Dieses bildet
leuchtendrote Kristalle vom F. 217 bis 220°. Die Elementaranalyse ergibt die folgenden
Werte: C = 63,70°/o, H = 5,380/0, (C)CH, = 3,420/" O C H3 = 7,27"/, und aktiver
Wasserstoff = 1,26'/,. Im UV-Spektrum sind Banden bei den folgenden Wellenlängen
sichtbar: 234m, (log E = 3,01), 258 m#t (log E = 2,68), 294 m#L (log E = 2,25),
470 m#L (log E = 2,30), 495 mV. (log E = 2,34), 515 mp, (log E = 2,28) und 530 mp,
(log E = 2,20).
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Cinerubin B bildet leuchtendorangegefärbte Kristalle, die bei 180
bis 181' schmelzen. Die Elementaranalyse liefert folgende Werte:
C = 59,76 °/a, H --- 6,50 °/, 0 = 30,44°/0,N = 1,78°/o, OCHS = 4,54°i, C-CH3
-= 6,38 °/o. Sein UV-Spektrum zeigt Banden bei folgenden Wellenlängen: 235 mp, (log
= 2,77), 258 m#t (log E = 2,46), 291 m#L (log E = 2,03), 297 m#L (Inflexion), 394
mp, (Inflexion), 415 mV, (Inflexion), 471 m&, (Inflexion), 488 m#t (log E =
2,24), 497 m#L (log E = 2,27), 519 mp. (log E = 2,16) und 533 m#t (log E = 2,10).
Im Infrarotspektrum sind Banden unter anderem bei folgenden Wellenlängen sichtbar:
2,83 ta, 3,38 p., 3,58 u" 5,71 6,16 6,78 @" 7,02 V,, 7,47 #t, 7,60 #t, 8,06 #t"
8,48 8,75 9,41 9,72 V., 9,90 g,, 10,18 #t, 10,62 &,, 11,62 12,15 #t,
12,43 #t und 12,85 Bei der Hydrolyse von Cinerubin B mit verdünnten Mineralsäuren
wird das gleiche Aglykon Cinerubinon gebildet, das auch bei der Hydrolyse von Cinerubin
A entsteht.
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Die Cinerubine zeigen eine gewisse Ähnlichkeit mit Rhodomycin A und
B (H. Brockmann und Mitarbeiter, Chem. Berichte, 88, S. 1792 [1955], und frühere,
dort zitierte Mitteilungen), doch verhalten sie sich bei der Papierchromatographie
verschieden. Weiter unterscheidet sich das aus Cinerubin A und B erhaltene Aglykon
Cinerubinon von a-Rhodomycinon durch seinen Schmelzpunkt, seine analytische Zusammensetzung
und vor allem durch sein Infrarot-Absorptionsspektrum.
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Die Salze von Cinerubin A und Cinerubin B leiten sich von den bekannten
anorganischen und organischen Säuren ab, beispielsweise von der Salzsäure, den Schwefelsäuren,
der Essig-, Propion-, Valerian-, Palmitin- oder Ölsäure, der Bernsteinsäure, Zitronensäure,
Mandelsäure, Glutaminsäure oder Pantothensäure. Sie stellen neutrale oder saure
Salze dar. Ihre Herstellung erfolgt durch Einwirkung der entsprechenden Säuren auf
die freie Base oder durch doppelte Umsetzung von Salzen, beispielsweise von Cinerubinsulfat
mit pantothensaurem Calcium.
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Die Antibiotika Cinerubin A und B besitzen eine antibiotische Wirksamkeit
gegenüber verschiedenen Testorganismen. Verwendet man als Testmethode in vitro Verdünnungsreihen
(Zehnerpotenzen) in Glukosebouillon, die während 24 Stunden bei 37° bebrütet werden,
so ergeben sich folgende noch hemmende Konzentrationen
Hemmende Konzentration |
Testorganismen #tg/cm3 |
Cinerubin A Cinerubin B |
Micrococcus pyogenes, var. |
aureus.................. 0,1 10 |
Micrococcus pyogenes, var. |
aurens, penicillinresistent . . 1 10 |
Streptococcus pyogenes .... 0,01 1 |
Streptococcus viridans...... 0,01 I 0,01 |
Streptococcus faecalis ...... 1 10 |
Corynebacterium diphtheriae 0,001 0,1 |
Bacillus megatherium ...... 0,01 1 |
Candida vulgaris . . . . . . . . . . . 0,1 1 |
Endomyces albicans . . . . . . . . 0,01 1 |
Mycobacterium tuberculosis* 1 10 |
Entamoeba histolytica" * ... < 33 I < 100 |
In Kirchners synthetischem Medium mit 500u bovinem Albumin kultiviert; Ablesung
des Wachstums nach 2 Wochen.
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@°y° Kultur in Bacto-Entamoeba .'Medium: Ablesung der amoebiciden
Wirkung nach 24 Stunden.
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Die Entwicklung von Influenzavirus auf isolierten Membranen der Hühner-Chorioallantois
von 14tägigen Bruteiern wird von Cinerubin A und B noch in einer Konzentration von
weniger als 1 #tg/cm3 gehemmt, während das Chorioallantoisgewebe selbst durch
100
#tg/cm3 nicht toxisch geschädigt wird.
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Ferner sind die Cinerubine stark tumorhemmend wirksam, so wird z.
B. das Wachstum des Mäusetumors Adenocarcinom E0 771 stark gehemmt.
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Gegenstand der vorliegenden Erfindung bilden außer den Herstellungsverfahren
für die kristallinen Antibiotika Cinerubin A und B und für ihre neutralen und sauren
Salze auch die genannten Verbindungen selbst, insbesondere die Cinerubinsulfate,
die Cinerubir_hydrochloride, -acetate und -pantothenate, weiter die mittels Hydrierung
oder Oxydation erhaltenen Umwandlungsprodukte sowie die Spaltprodukte, wie sie z.
B. bei der Hydrolyse von Cinerubin A und B erhalten werden.
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Die Antibiotika Cinerubin A und B, ihre Salze und Derivate, die obengenannten
Umwandlungs- und Spaltprodukte oder entsprechende Gemische können als Heilmittel,
z. B. in Form pharmazeutischer Präparate, Verwendung finden. Diese enthalten die
genannten Verbindungen in :Mischung mit einem für die enterale, parenterale oder
lokale Applikation geeigneten pharmazeutischen organischen oder anorganischen Trägermaterial.
Für dasselbe kommen solche Stoffe in Frage, die mit den neuen Verbindungen nicht
reagieren, wie z. B. Gelatine, Milchzucker, Stärke, Magnesiumstearat, Talk, pflanzliche
Öle, Benzylalkohole, Gummi, Polyalkylenglykole, Vaseline, Cholesterin oder andere
bekannte Arzneimittelträger. Die pharmazeutischen Präparate können z. B. als Tabletten,
Dragees, Pulver, Salben, Cremen, Suppositorien oder in flüssiger Form als Lösungen,
Suspensionen oder Emulsionen vorliegen. Gegebenenfalls sind sie sterilisiert und
bzw. oder enthalten Hilfsstoffe, wie Konservierungs-, Stabilisierungs-, Netz- oder
Emulgiermittel. Sie können auch noch andere therapeutisch wertvolle Stoffe enthalten.
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Die Erfindung wird in den nachfolgenden Beispielen beschrieben, ohne
daß damit eine Einschränkung des Erfindungsgegenstandes beabsichtigt ist. Die Temperaturen
sind in Celsiusgraden angegeben.
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Beispiel 1 Man bereitet eine Nährlösung der Zusammensetzung: 20 g
Sojamehl, 20 g Mannit und 1 1 Leitungswasser und
stellt sie auf
PH 7,8 ein. Diese bzw. ein Vielfaches derselben wird in 500-cm3-Erlenmeyern (mit
je 100 cm3 Nährlösung) oder in 500-1-Fermentern (mit je 3001 Nährlösung) abgefüllt
und 20 bis 30 Minuten bei 1 atü sterilisiert. Dann impft man mit bis zu 10 0%0 einer
teilweise sporulierenden, vegetativen Kultur des Streptomyces cinereoruber war.
fructofermentans an und inkubiert unter gutem Schütteln bzw. Rühren und in den Fermentern
unter Belüftung (mit etwa 1 Volumen steriler Luft pro Volumen Nährlösung pro Minute)
bei 27°. Nach 70 bis 120 Stunden Wachstum filtriert man die Kulturen unter Zusatz
eines Filterhilfsmittels je nach Volumen durch eine Nutsche oder durch eine Filterpresse
oder einen rotierenden Filter und befreit so die antibiotisch wirksame wäßrige Lösung,
die hauptsächlich Cinerubin A enthält, vom My cel und anderen festen Bestandteilen.
Beispiel 2 Verwendet man an Stelle des im Beispiel 1 angegebenen Mediums die im
folgenden beschriebenen Nährlösungen a), b), c), d) oder e), so erhält man nach
analoger Sterilisation, Beimpfung mit Streptomyces cinereoruber war. fructofermentans,
Inkubation bei 27° und Filtration wäßrige antibiotisch wirksame Lösungen, wobei
mit den Nährlösungen a), b), c) und e) ein Gemisch von Cinerubin A und B und mit
Nährlösung d) vorwiegend Cinerubin B erhalten wird.
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a) 10 g Rohglukose, 5 g Pepton, 3 g Fleischextrakt (Oxo Lab Lemco),
5 g Natriumchlorid, 10 g Calciumcarbonat und 11 Leitungswasser; p$ vor der Sterilisation
7,5.
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b) 10 g Rohglukose, 10 g Distillers solubles, 1 g Natriumnitrat, 5
g Natriumchlorid, 10 g Calciumcarbonat und 11 Leitungswasser; pH vor der Sterilisation
7,5.
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c) 10 g Rohglukose, 20 cm3 Maisquellwasser (corn steep liquor), 2
g sek. Kaliumhydrophosphat und 1 1 Leitungswasser; p$ von der Sterilisation 7,5.
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d) 20 g Glycerin, 10 g Sojamehl, 5 g Natriumchlorid, 10 g Calciumcarbonat,
1 g Natriumnitrat und 11 Leitungswasser; p$ vor der Sterilisation 7,5.
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e) 20 g Mannit, 20 g -Distillers solubles", 3 g Natriumchlorid, 1
g Natriumnitrat und 1 1 Leitungswasser; PH vor der Sterilisation 7,8. Beispiel 3
Der Filterrückstand eines gemäß Beispiell oder 2 erhaltenen 150-1-Ansatzes wird
mit 251 Aceton ausgerührt und erneut filtriert. Dies wird zweimal wiederholt, worauf
man die antibiotikumhaltigen Acetonlösungen vereinigt im Vakuum auf 5 1 einengt
und mit dem Kulturfiltrat vereinigt. Diese Lösung wird nun bei pH 8,5 mit 701 Äthylacetat
im Westfalia-Extraktor ausgezogen, wobei die gesamte antibakterielle Aktivität in
die organische Phase übergeht. Der Extrakt wird nun mit Wasser gewaschen, im Vakuum
auf 51 eingedampft und dann mehrere Male mit 0,5 n-Essigsäure ausgeschüttelt. Die
Äthylacetatlösung zeigt nun eine geringe antibakterielle Aktivität, während der
Hauptteil der Aktivität in den essigsauren Lösungen gefunden wird. Diese orangerotgefärbten
Lösungen werden vereinigt, mit 2 n-Sodalösung auf ph 8,5 gebracht, wobei die Farbe
nach Violett umschlägt, und erneut mit Äthylacetat extrahiert. Der Äthylacetatextrakt
wird erneut mit 0,5 n-Essigsäure ausgezogen, worauf diese, wie beschrieben, alkalisiert
und extrahiert wird. Schließlich trocknet man die Äthylacetatlösurg über Natriumsulfat
und dampft sie im Vakuum ein. Man erhält so die dunkelrotgefärbten, antibakteriell
hochwirksamen Rohbasen.
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Der Äthylacetatextrakt, der nach der beschriebenen Behandlung mit
verdünnter Essigsäure noch eine relativ geringe antibakterielle Aktivität zeigt,
wird mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft.
Man erhält ein dünnflüssiges, rotes. Öl. Dieses wird mit Petroläther behandelt,
wobei ein rotes Pulver erhalten wird, das je nach der venvendeten Nährlösung aus
Cinerubin A, Cinerubin B oder Gemischen davon besteht.
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Beispiel 4 2,95 g der gemäß Beispiel 1 und 3 erhaltenen Rohbasen werden
einer 120stufigen Gegenstromverteilung unterworfen, wobei man das folgende Lösungsmittelgemisch
verwendet: 5 V olumteileTetrachlot kohlenstoff, 4,5 Volumteile Methanol und 0,7
Volumteile Wasser. Nach dem Eindampfen des Inhaltes der einzelnen Verteilungsgefäße
im Vakuum bei 30' findet man bei den Stufen 7, 51, 63, 88 und 115 kleine Substanz-
und Aktivitätsmaxima, während die Hauptmenge der Substanz und der Aktivität bei
Stufe 22 angereichert ist. Die Fraktionen 14 bis 35 werden vereinigt, und man erhält
1,61 g papierchromatographisch einheitliches Cinerubin A. Es wird aus einem Aceton-11ethanol-Gemisch
umkristallisiert und bildet stark lösungsmittelhaltige Plättchen, die beim Trocknen
zu einem dunkelroten Pulver zerfallen. F. = 155 bis 157°. Analyse: C 61,12°;'0,
H 7,03°;0, N 1,910;0, 0 CH34,08010. UV-Absorptionsspektrum in Feinsprit:
Banden bei 234 mp, (log E = 2,28), 258 mu. (log E = 2,36), 292 mu, (log E = 1,92),
475 mu. (log E = 2,05), 495 mu, (log E = 2,11) und 530 mu, (log E = 1,94). IR.-Absorptionsspektrum
in Nujol: Banden unter anderem bei folgenden Wellenlängen: 2,9 li., 3,4 #t, 3,5
;u, 5,77 #t, 6,06 #L, 6,21 #t" 6,81 u" 7,02 &t" 7,06 u, 7,21 #t1 7,55 u" 7,68
u, 7,88 8,14 ,1" 8,56 ta, 8,88 #L, 9,05 #t, 9,56 t-, 9,84 p#, 10,37 10,78 #t" 11,19
#t" 11,31 u,11,79 Ei" 12,32 #t" 12,71 #t (Bande mit dreifacher Spitze), 13,10
Er, 13,49 [L" 13,75 #t und 14,21 #t.
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Im Rundfilter-Papierchromatogramm mit dem Lösungsmittelsystem Benzol-Formamid
zeigt Cinetubin A einen R,-Wert von 0,55. Unter den gleichen Bedingungen bleiben
Rhodomycin A und B an der Auftropfstelle. Beispiel 5 Eine Lösung von 50 mg Cinerubin
A in 10 cm3 1 n-Schwefelsäure wird 20 Minuten auf 100 erhitzt. Dabei scheiden sich
rote Flocken aus. Nach dem Abkühlen wird die rote Lösung mit Äthylacetat ausgeschüttelt,
wobei die Farbe in die organische Phase übergeht.
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Die wäßrige Phase wird nun mit 2 n-Bariumhydroxyd neutralisiert, filtriert
und im Vakuum eingedampft. Der Rückstand enthält mindestens zwei reduzierende Zucker,
die im Papierchromatogramm mit einem mit Wasser gesättigten Gemisch von Butanol-Eisessig
(9: 1) R,--Werte von 0,13 bzw. 0,38 zeigen.
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Die rotgefärbten Äthylacetatextrakte werden mit Wasser gewaschen,
über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft. -Man erhält das Cinerubinon
aus einem Benzol-Methanol-Gemisch in leuchtendroten Kristallen; F. = 217 bis 220°.
Analyse: C 63,700f0, H 5,38 0;'0, (C) C H3 3,42 0; 0, 0 C H;3 7,27 0j 0, akt. H
1,26 07,
UV-Absorptionsspektrum in Feinsprit: Banden bei 234 mu, (log
E = 3,01), 258 mu, (log E = 2,68), 294 mu. (log E = 2,25), 470 mu. (log E = 2,30),
495 mu, (log E = 2,34), 515 mu. (log E = 2,28) und 530 mu. (1o;; E = 2,20). IR-Absorptionsspektrum
in Kaliumbromid: Banden unter anderem bei 2,87 u,, 3,00 u., 3,25 u,, 3,43 u., 3,52
u" 5,78 6,06 u., 6,24 u, 6,88 u., 7,07 u,, 7,55 u., 7,69 u., 8,13 @i" 8,30
u,, 8,54 u., 8,84 u., 9,06 u 9,34 u" 9,56u., 9,75 u" 9,98 u" 10,07 u., 10,28u" 10,47
u" 11,01u" 11,59 u., 11,87 u,, 12,02 u" 12,72 u" 13,31 u,, 13,88 14,10 u, und 14,49
u,.
Im Papierchromatogramm mit dem Lösungsmittelsystem Benzol-Formamid
zeigt Cinerubinon einen R,-Wert von 0,8. Mit konzentrierter Schwefelsäure gibt es
eine reinblaue Färbung.
-
Das Cinerubinon ist gegenüber verschiedenen Testorganismen antibiotisch
wirksam.
-
Beispiel 6 16 g der gemäß Beispiel 2 (Nährlösung d) und Beispie13
erhaltenen Rohbasen werden einer 300stufigen Gegenstromverteilung unterworfen, wobei
das folgende Lösungsmittelgemisch verwendet wird: 7,5 Volumteile Tetrachlorkohlenstoff,
6,375 Volumteile Methanol und 1,125 Volumteile Wasser. Der Inhalt der einzelnen
Verteilungsgefäße wird im Vakuum bei 30° eingedampft. Neben kleineren Aktivitäts-
und Substanzmaxima, z. B. bei den Stufen 260 bis 295, findet sich das Cinerubin
A in den Stufen 54 bis 70 und das Cinerubin B in den Gefäßen 17 bis 37. Die Lösungen
aus diesen Gefäßen werden vereinigt und mit 500 cm3 Wasser versetzt. Darauf trennt
man die untere Phase ab und extrahiert die obere Phase noch zweimal mit je 200 cm3
Tetrachlorkohlenstoff. Die Extrakte werden vereinigt, mit etwas Wasser gewaschen,
mit Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft. Man löst den Rückstand in
50 cm' Benzol und gibt in der Wärme etwas Methanol zu. Beim Stehen scheidet sich
das Cinerubin B in Form von orangegefärbten Kristallen ab. Sie werden aus dem gleichen
Lösungsmittelgemisch umkristallisiert und schmelzen bei 180 bis 181°. Analyse: C
59,76 %, H6,50 0/("0 30,440/0, N 1,78 0%, O C H3 4,54 %, C - C H3 6,38 %. Das UV-Absorptionsspektrum
in Feinsprit zeigt folgende Banden:
A, maxf'#1l 235 258 291 297 394 415 |
log Ei',1ro 2,77 2,46 2,03 2,025 1,56 1,67 |
Amax('@) 471 488 497 519 533 |
log EK,m 2,17 2,24 2,27 2,16 2,10 |
IR-Spektrum (in Kaliumbromid) : Banden unter anderem bei 2,83 #t, 3,38 V. 3,58 #t,
5,71 V,, 6,16 #t, 6,78 #t, 7,02 7,47 #t, 7,60 #t, 8,06 V., 8,48 #t8,75 #L9,41 #t,
9,72 a,9,90 10,18 #t" 10,62 #t, 11,62 #t, 12,15 #t, 12,43 #t, und 12,85 @Z. Beispiel
7 Eine Lösung von 50 mg Cinerubin B in 10 cm3 1 n-Schwefelsäure wird 20 Minuten
auf 100° erhitzt und, wie im Beispiel 5 beschrieben, aufgearbeitet. Die aus den
Äthylacetatextrakten gewonnene Substanz ist identisch mit dem im Beispiel s beschriebenen
Cinerubinon.