DE1116864B - Herstellung und Gewinnung des Antibiotikums Avilamycin - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Herstellung und Gewinnung des neuen Antibiotikums, das im folgenden Avilamycin genannt wird, seiner Derivate und Spaltprodukte.

Das Antibiotikum Avilamycin entsteht bei der Kultur eines neuen Aktinomyceten-Stammes der Gattung Streptomyces, der im folgenden als Streptomyces viridochromogenes A 23575 beschrieben wird. Er wurde aus einer in Caracas, Venezuela, gesammelten Bodenprobe isoliert und wird in unseren Laboratorien und in der Eidgenössischen Technischen Hochschule, Institut für spezielle Botanik, Zürich, unter dieser Bezeichnung aufbewahrt.

Streptomyces viridochromogenes A 23575 bildet ein hellblaues Luftmycel. Die Sporenketten bilden zahlreiche offene, meist regelmäßige Spiralen mit monopodialen Verzweigungen und langer, gerader Hauptachse. Die Sporen sind elliptisch bis oval. Die Oberfläche der einzelnen Sporen ist mit etwa 0,2 μ langen Stacheln bedeckt, die an der Basis breit sind und eine Spitze bilden. Beim Wachstum auf peptonhaltigen Nährsubstraten verursacht der Stamm A 23575 eine dunkle melanoide Verfärbung des Nährbodens. Das Wachstum des Stammes ist relativ wenig abhängig von der Temperatur, sowohl bei 18 als auch bei 40⁰C entwickelt sich der Pilz gut, doch liegt das Optimum zwischen 25 und 32⁰C.

Zur weiteren Charakterisierung wird im folgenden das Wachstum von Streptomyces viridochromogenes A 23575 auf verschiedenen Nährmedien beschrieben. Die Nährmedien 1 bis 7 und 10 wurden nach W. Lindenbein, Arch. Mikrobiol., 17, S. 361 [1952], hergestellt.

1. Synthetischer Agar:

Wachstum anfangs dünn, schleierartig und weißgelb, später runzelig und hellgelb; Luftmycel einen staubigen Überzug bildend, kreideweiß.

2. Synthetische Lösung:

Grundwachstum und Sediment punktförmig, milchweiß, selten Sediment als Flocken; spärliche, farblose Pellikula.

3. Glucose-Agar:

Wachstum dünn, schleierartig bis runzelig, hellbraun bis katanienbraun; Luftmycel samtig bis wollig, hellblau; Substrat kastanienbraun.

4. Glucose-Asparagin-Agar:

Wachstum dünn, schleierartig, hellgelb bis grünlichgelb; Luftmycel wenig wollig, weiß, teilweise hellblau.

Herstellung und Gewinnung
des Antibiotikums Avilamycin

Anmelder:
CIBA Aktiengesellschaft, Basel (Schweiz)

Vertreter: Dipl.-Ing. E. Splanemann, Patentanwalt, Hamburg 36, Neuer Wall 10

Beanspruchte Priorität:

Schweiz vom 23. JuH 1959 (Nr. 76 114)

und 10. Mai 1960 (Nr. 5342/60)

Dr. Ernst Gäumann, Dr. Vladimir Prelog, Zürich, und Dr. Ernst Vischer, Basel (Schweiz),

sind als Erfinder genannt worden

5. Calciummalat-Agar:

Wachstum dünn, schleierartig, hellgelb; Luftmycel anfangs samtig und weiß, stellenweise nach 10 bis 15 Tagen samtig und hellblau.

6. Gelatinestich (18°Q.Wachstum sehr langsam und spärlich; Substrat kastanienbraun bis dunkelbraun; Verflüssigung nach 15 Tagen etwa 1 cm.

7. Stärkeplatte:

Wachstum dünn, schleierartig, weißgelb bis hellgelb; Luftmycel samtig bis wollig, mehlweiß; Hydrolyse nach 5 Tagen 5 mm, nach 12 Tagen 13 mm.

8. Kartoffel:

Wachstum pustelig, hellbraun; Luftmycel dick wollig, anfangs weißgrau, später hellblau; Substrat kastanienbraun bis dunkelbraun.

9. Karotte:

Wachstum spärlich, punktförmig bis pustelig; Luftmycel spärlich, kreideweiß.
10. Lackmusmilch:

Wachstum in Form einer dicken, zusammenhängenden, runzeligen Oberflächendecke, kastanienbraun bis dunkelbraun bis bräunlichpechschwarz; Luftmycel spärlich, grauweiß; starke Peptonisierung, aber nur sehr schwache Koagulation; Substrat dunkelbraun.
Weiter reduziert der Stamm A 23575 Nitrate langsam zu Nitriten.

109 738/384

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Gemäß Ettlinger u. a. (Archiv Mikrobiologie, 31, Gemisch mit einem mit Wasser nicht mischbaren S. 326 [1958]) werden die Arten der Gattung Strepto- organischen Lösungsmittel, wie Estern niederer Fettmyces charakterisiert durch Farbe des Luftmycels, säuren, beispielsweise Äthylacetat oder Amylacetat, Morphologie der einzelnen Sporen und der Sporen- Kohlenwasserstoffen, z. B. Bsnzol, chlorierten Kohlenketten und schließlich durch die melanoide Verfärbung 5 Wasserstoffen, z. B. Äthylenchlorid, Methylenchlorid von peptonhaltigen Nährsubstraten. Der Stamm oder Chloroform, Ketonen, z. B. Methylpropylketon, A 23575 stimmt in diesen vier Merkmalen mit Strepto- Methylamylketon oder Diisobutylketon, Alkoholen, myces viridochromogenes (Krainsky) Waksman et wie Butylalkoholen oder Amylalkoholen, Äthern, z. B. Henrici überein und wird deshalb vorläufig dieser Art Äthyläther, Diisopropyläther, Dibutyläthern oder zugezählt. io Glykoläthern u. dgl. An Stelle einer Lösungsmittel-Aus der Literatur ist bekannt, daß Stämme von extraktion der Kulturen oder in Kombination mit Streptomyces viridochromogenes das Antibiotikum einer solchen als weitere Reinigungsoperation kann Chartreusin bilden. Chartreusin ist eine gelbgefärbte man das Antibiotikum auch durch Adsorption geSäure und hat völlig andere Eigenschaften als das winnen, beispielsweise an Aktivkohle ode an aktifarblose, neutrale Avilamycin. 15 vierten Erden, wie Fullererde oder Floridin, und

Die vorliegende Erfindung ist, was die Herstellung anschließende Extraktion des Adsorbates z. B. mit

von Avilamycin anbelangt, nicht auf die Verwendung einem in Wasser wenigstens teilweise löslichen orga-

von Streptomyces viridochromogenes A 23575 oder nischen Lösungsmittel, wie Aceton, Butanol oder

anderer der Beschreibung entsprechender Stämme Methyläthylketon.

beschränkt, sondern betrifft auch die Verwendung von 20 Man kann auch die Kulturen direkt, ohne vorgängige

Varianten dieser Organismen, wie sie z. B. durch Abtrennung des Mycels, in der angegebenen Art und

Selektionierung oder Mutation, insbesondere unter Weise extrahieren.

der Einwirkung von Ultraviolett- oder Röntgen- Eine weitere Anreicherung läßt sich dadurch

strahlen oder von Stickstoff-Senf ölen gewonnen erzielen, daß man die antibiotikumhaltigen organischen

werden. 25 Extrakte zuerst mit einer sauren wäßrigen Lösung mit

Zur Erzeugung von Avilamycin wird ein die einem pn unter 5 und dann mit einer alkalischen Eigenschaften von Streptomyces viridochromogenes wäßrigen Lösung mit einem ph über 8 wiederholt A 23575 aufweisender Streptomyceten-Stamm in auszieht, wobei die Hauptmenge der antibiotischen wäßriger, anorganische Salze, eine Kohlenstoff- und Aktivität in der organischen Phase bleibt. Aus dieser Stickstoffquelle enthaltender Nährlösung aerob ge- 30 wird das Antibiotikum Avilamycin entweder direkt züchtet, bis diese eine wesentliche antibakterielle mittels Kristallisation oder nach vorheriger AnWirkung zeigt, und das Antibiotikum Avilamycin reicherung in reinem Zustand isoliert,
isoliert. Ein gutes Anreicherungsverfahren für das neue

Die Nährlösung enthält als anorganische Salze Antibiotikum stellt die Verteilung zwischen einer beispielsweise Chloride, Nitrate, Carbonate, Sulfate 35 alkoholischen wäßrigen Lösung und einem mit von Alkalien, Erdalkalien, Magnesium, Eisen, Zink, Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel dar. Zweck-Mangan. Als Stickstoff- und Kohlenstoffquelle und mäßig erfolgt die Verteilung nach dem Gegenstromwachstumsfordernde Stoffe seienz. B. genannt: Amino- verfahren in entsprechenden Apparaten. Auch Chrosäuren und ihre Gemische, Peptide und Proteine sowie matographie, z. B. an Aluminiumoxyd, ist zur Anihre Hydrolysate, wie Pepton oder Trypton, Fleischex- 40 reicherung sehr geeignet. Die Gewinnung des reinen trakte, wasserlösliche Anteile von Getreidekörnern, Antibiotikums in kristalliner Form nimmt man z. B. wie Mais und Weizen, von Destillationsrückständen aus organischen Lösungsmitteln, wie aus Aceton, bei der Alkoholherstellung, von Hefe, Bohnen, Methanol, Äthanol, Chloroform, Aceton-Methanolinsbesondere der Sojapflanze, von Samen, beispiels- Gemischen, Aceton-Äther-Gemischen oder Acetonweise der Baumwollpflanze oder von Erdnuß und 45 Petroläther-Gemischen, vor. Zum Umkristallisieren Kokosnuß, ferner Glukose, Saccharose, Lactose, dienen dieselben Lösungsmittel oder auch wäßrig-Stärke, Mannit, Glyzerin usw. organische Lösungen, wie verdünnte Alkohole, ver-

Die Züchtung erfolgt aerob, also beispielsweise in dünntes Aceton.

ruhender Oberflächenkultur oder vorzugsweise sub- Das neue, neutrale Antibiotikum erhält man als

mers unter Schütteln oder Rühren mit Luft oder 50 farblose Kristalle, die bei der Verwendung von

Sauerstoff in Schüttelflaschen oder den bekannten acetonhaltigen Lösungsmitteln als Nadeln ausgebildet

Fermentern. Als Temperatur eignet sich eine solche sind. F. 188 bis 189,5⁰C, [«]!? = +0,8° (in Feinsprit)

zwischen 18 und 40° C. Eine wesentliche antibakterielle und —7,7° (in Chloroform). Die Elementaranalyse

Wirkung zeigt die Nährlösung dabei im allgemeinen liefert folgende Werte: C = 51,24%, H = 6,54%,

nach IV₂ bis 5 Tagen. 55 Cl = 4,93%, CH₃O = 8,79%, (C)CH₃ = 8,97%

Zur Isolierung des Antibiotikums können z.B. und akt. H = 0,68%- Nach der Methode von Signer

folgende Verfahren dienen: Man trennt das Mycel wurde ein Molgewicht von 708 gefunden. Diese Werte

vom Kulturfiltrat ab, wonach die Hauptmenge des weisen auf die Formel C₃₁H₄₇O₁₇Cl hin, wobei die

Antibiotikums im Kulturfiltrat gefunden wird. Es Substanz keinen Stickstoff und keinen Schwefel ent-

bleiben aber trotzdem namhafte Mengen des Anti- 60 hält (UV- und IR-Absorptionsspektrum s. Fig. 1 und 2).

biotikums am Mycel adsorbiert. Es ist daher vorteilhaft, Mit alkoholischer Ferrichloridlösung zeigt das neue

letzteres gut auszuwaschen. Dazu eignen sich besonders Antibiotikum keine Farbreaktion. Die Jodoformprobe

organische, mindestens teilweise wasserlösliche Lö- ist stark, der Legaltest nur schwach positiv. Tetranitro-

sungsmittel, wie Alkohole, z. B. Methanol, Äthanol methan wird nicht verfärbt.

und Butanole, oder Ketone, z. B. Aceton und Methyl- 65 Bei der alkalischen Hydrolyse des neuen Anti-

äthylketon. Diese Mycelextrakte werden entweder biotikums werden 1,80 Mol einer flüchtigen Säure

direkt oder nach vorheriger Konzentration im Va- abgespalten, die im Papierchromatogramm (System

kuum zum Kulturfiltrat gegeben. Man extrahiert das Äthanol—Ammonium—Wasser, 8:1:1) etwas weiter

wandert als Essigsäure (Re = 1,20, bezogen auf Essigsäure = 1).

Wird das Antibiotikum mittels verdünnter Säuren, z. B. mit verdünnter Schwefelsäure, hydrolysiert, so werden drei zuckerartige reduzierende Substanzen abgespalten, die im Papierchromatogramm (System n-Butanol—Eisessig—Wasser, 4:1:1) Rf-Werte von 0,18, 0,41 und 0,52 aufweisen.

Antibiotika, die wie das neue Antibiotikum Avilamycin Kohlenstoff, Wasserstoff, Sauerstoff und Chlor, hingegen weder Stickstoff noch Schwefel enthalten, sind relativ selten. Das einzige bekannte Antibiotikum dieser Art ist das von Umezawa u. a. (J. Antibiotics Japan, 5,466 [1952]) beschriebene Exfoliatin. Trotzdem diese Substanz in gewisser Hinsicht (z. B. UV-Spektrum) ähnlich ist mit dem Avilamycin, bestehen doch deutliche Unterschiede, die im folgenden aufgeführt werden:

Die für Exfoliatin vorgeschlagene Summenformel C₂₇H₄₀O₁₉Cl stimmt nicht mit den für Avilamycin gefundenen Analysenwerten überein.

Exfoliatin besitzt einen niedrigeren Schmelzpunkt als Avilamycin (172°C, verglichen mit 189⁰C).

Exfoliatin zeigt im Gegensatz zu Avilamycin eine positive Eisenchloridreaktion.

Die IR-Spektren von Exfoliatin und von Avilamycin zeigen einige deutliche Unterschiede.

Exfoliatin und Avilamycin lassen sich durch ihr papierchromatographisches Verhalten gut unterscheiden, indem mit dem Fließmittel Benzol—Chloroform auf mit Formamid imprägniertem Papier Exfoliatin einen Rf-Wert von 0,51, Avilamycin aber einen solchen von 0,63 besitzt.

Weiter ist der Produzent von Exfoliatin, Stamm Z-3-5 (Jap. J. Med. Ser„ 5, 466 [1952]) deutlich verschieden von Stamm A 23575. Das Luftmycel des Exfoliatinproduzenten weist Quirle, aber keine Spiralen auf, während der Stamm A 23 575 keine Quirle, dagegen aber Spiralen bildet.

Aus diesen Befunden geht eindeutig hervor, daß Avilamycin nicht identisch ist mit dem bekannten Antibiotikum Exfoliatin.

Das Antibiotikum Avilamycin besitzt eine sehr hohe antibiotische Wirksamkeit gegenüber verschiedenen Testororganismen. Verwendet man als Testmethode in vitro Verdünnungsreihen (Zehnerpotenzen) in Glukosebouillon, die während 24 Stunden bei 37° C bebrütet werden, so ergeben sich folgende noch hemmende Konzentrationen:

	Hemmende
Testorganismen	Konzentration
	μg/cm3
Micrococcus pyogenes, var. aureus
(penicillinresistent)	10
Streptococcus pyogenes	0,1
Streptococcus viridans	10
Streptococcus faecalis	100
Corynebacterium diphtheriae	10
Pasteurella pestis	100
Bacillus megatherium	10
Mycobacterium tuberculosis*	100
Trichomonas foetus**	100

* In Kirchners synthetischem Medium mit 5 % bovinem Albumin kultiviert; Ablesung des Wachstums nach 2 Wochen. ** In Bouillon mit 10% Pferdeserum bei 37⁰C kultiviert; Ablesung nach 4 Tagen.

In vivo ist das Antibiotikum Avilamycin ebenfalls gut wirksam. Bei fünfmaliger subkutaner Verabreichung von 100 bzw. von 33 mg/kg an mit Micrococcus pyogenes, var. aureus infizierte Mäuse werden 100 bzw. 75% Überlebende beobachtet. Eine ähnliche Heilwirkung wird bei Mäusen festgestellt, die mit Streptococcus haemolyticus infiziert sind. Dabei ist die Toxizität gering, indem eine einmalige subkutane Applikation von 1000 mg/kg bei Mäusen keine

ίο Schädigungen hervorruft. Höhere Dosen wurden noch nicht geprüft.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung bilden außer den Herstellungsverfahren für das Antibiotikum Avilamycin auch die genannte Verbindung selbst, weiter die mittels Hydrierung oder Oxydation erhältlichen Umwandlungsprodukte sowie die Spaltprodukte, wie sie z. B. bei der Hydrolyse des Antibiotikums erhalten werden.
Das Antibiotikum Avilamycin, die obengenannten Umwandlungs- und Spaltprodukte oder entsprechende Gemische können als Heilmittel, z. B. in Form pharmazeutischer Präparate, Verwendung finden. Diese enthalten die genannten Verbindungen in Mischung mit einem für die enterale, parenterale oder lokale Applikation geeigneten pharmazeutischen organischen oder anorganischen Trägermaterial. Für dasselbe kommen solche Stoffe in Frage, die mit den neuen Verbindungen nicht reagieren, wie z. B. Gelatine, Milchzucker, Stärke, Magnesiumstearat, Talk, pflanz-

liehe Öle, Benzylalkohol, Gummi, Polyalkylenglykole, Vaseline, Cholesterin oder andere bekannte Arzneimittelträger. Die pharmazeutischen Präparate können z. B. als Tabletten, Dragees, Pulver, Salben, Cremes, Suppositorien oder in flüssiger Form als Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen vorliegen. Gegebenenfalls sind sie sterilisiert und bzw. oder enthalten Hilfsstoffe, wie Konservierungs-, Stabilisierungs-, Netzoder Emulgiermittel. Sie können auch noch andere therapeutisch wertvolle Stoffe enthalten.

Die Erfindung wird in den nachfolgenden Beispielen beschrieben, ohne daß damit eine Einschränkung des Erfindungsgegenstandes beabsichtigt ist. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben.

Beispiel 1

Man bereitet eine Nährlösung der Zusammensetzung: 20 g Fleischmehl, 20 g Malzextrakt, 10 g Calciumcarbonat und 11 Leitungswasser und stellt sie auf Ph 7,2 ein. Diese bzw. ein Vielfaches derselben wird in 500-cm³-Erlenmeyern (mitje 100 cm³ Nährlösung) oder in 500-1-Fermentern (mit je 3001 Nährlösung) abgefüllt und 20 bis 30 Minuten bei 1 atü sterilisiert. Dann impft man mit bis zu 10% einer teilweise sporulierenden, vegetativen Kultur von Streptomyces viridochromogenes A 23575 an und inkubiert unter gutem Schütteln bzw. Rühren und in den Fermentern unter Belüftung (mit etwa 1 Volumen steriler Luft pro Volumen Nährlösung pro Minute) bei 27^C. Nach 24 bis 48 Stunden Wachstum filtriert man die Kulturen unter Zusatz von etwa 1,5 % eines Filterhilfsmittels je nach Volumen durch eine Nutsche oder durch eine Filterpresse oder einen rotierenden Filter und befreit so die antibiotisch wirksame wäßrige Lösung vom Mycel und anderen festen Bestandteilen.

Beispiel 2

Verwendet man an Stelle des im Beispiel 1 angegebenen Mediums die im folgenden beschriebenen

7 8

Nährlösungen a), b) oder c), so erhält man nach analysenreine Antibiotikum zeigt folgende Eigenanaloger Sterilisation, Beimpfung mit Streptomyces schäften: F. 188 bis 189,5° (unter dem Mikroskop A 23575, Inkubation bei 27° und Filtration wäßrige bestimmt); [<x]² ₀° = + 0,8° (c = 1,165 in Feinsprit) antibiotisch wirksame Lösungen. oder — 7,7° (c = 1,083 in Chloroform).

a) 10 g Rohglukose, 5 g Pepton, 3 g Fleischextrakt ⁵ , Mit alkoholischer Eisen(III)-chloridlösung tritt (Oxo Lab Lemco), 5 g Natriumchlorid, 10 g ^keme Farbreaktion ein. In konzentrierter Schwefel-Calciumcarbonat und 11 Leitungswasser; p_H vor f^{ure 1ο}?ί sich das Antibiotikum anfangs mit oliv-/W Qt/»r;iic.at;«r. 7 ^ brauner Farbe; spater verändert sich der Farbton nach

Violettbraun. Die Jodoformprobe ist positiv, der

b) 40 g Erdnußschrot, 10 g Rohglukose, 200 mg ₁₀ Legaltest schwach positiv. Tetranitromethan wird sek.Kaliumhydrophosphat, 10 g Calciumcarbonat _ni_cht verfärbt. Die Elementaranalyse gibt folgende und 11 Leitungswasser; p_H vor der Calcium- Werte: C = 51,24%, H = 6,54%, Cl = 4,93%, carbonatzugabe 7,5. CH₃O = 8,79 %, CH₃-(C) = 8,97 %, H akt. = 0,68%.

c) 20 g Kokosnußschrot, 20 g Malzextrakt, 10 g Stickstoff und Schwefel sind nicht nachweisbar. Nach Calciumcarbonat und 11 Leitungswasser; p_H vor *5 der Methode von Signer in Chloroform mit Azoder Calciumcarbonatzugabe 7,2. benzol als Referenzsubstanz wird ein Molekulargewicht

von 708 gefunden. Diese Werte sind am besten mit

Beispiel 3 ^emer Bruttoformel von C₃₁H₄₇O₁₇Cl verträglich

(UV-Absorptionsspektrum in Feinsprit s. Fig. 1;

251 eines gemäß Beispiel 1 oder 2 erhaltenen Kultur- ao IR-Absorptionsspektrum in Kaliumbromid s. Fig. 2). filtrates werden mit 101 Essigester ausgezogen und der Bei der alkalischen Hydrolyse werden 1,80MoI

Extrakt im Vakuum auf ein Volumen von etwa 200 ml flüchtige Säure abgespalten, die im Papierchromatoeingeengt. Die konzentrierte Lösung schüttelt man gramm (Äthanol—Ammoniak—Wasser, 8 : 1: 1) einen dreimal mit je 100 ml 0,5normaler wäßriger Essigsäure einheitlichen Fleck gibt und etwas weiter wandert als aus. Die abgetrennte wäßrige Phase wird mit Natrium- 25 Essigsäure und Propionsäure (R_E = 1,20, bezogen auf carbonatlösung alkalisiert und wieder mit Essigester Essigsäure = 1). ausgeschüttelt. Man dampft den gewaschenen und

getrockneten Extrakt im Vakuum ein und erhält Beispiel 5

19 mg Trockenrückstand, der das Wachstum von
B. subtilis und Staph. aureus nicht zu hemmen vermag. 3° Die vereinigten Mutterlaugen der im Beispiel 4 be-

Der, wie soeben beschrieben, von den Basen befreite schriebenen Kristallisationen werden im Vakuum ein-Essigesterauszug wird dann dreimal mit wäßriger gedampft und der Rückstand mit Petroläther ge-Natriumcarbonatlösung ausgeschüttelt, worauf die waschen. Der in Petroläther unlösliche Anteil von wäßrige Phase mit Salzsäure angesäuert und mit 5,8 g wird in Benzol aufgenommen und an einer Säule Äthylacetat ausgezogen wird. In gleicher Weise wie 35 aus 170 g Aluminiumoxyd (Aktivität III) chromatooben werden aus dieser Lösung 64 mg antibiotisch graphiert. 200 ml Benzol, 500 ml absulotes Chlorounwirksame Säuren erhalten. form und 500 ml Chloroform—Methanol (99 : 1)

Der von Basen und Säuren befreite Rohextrakt wird eluieren nur inaktive Begleitstoffe. Die mit 500 ml schließlich mit Wasser gewaschen, mit Natriumsulfat Chloroform—Methanol (97: 3) und 500 ml Chlorogetrocknet und im Vakuum eingedampft. Man versetzt 40 form—Methanol (9 : 1) eluierten Fraktionen enthalten den öligen Rückstand mit Petroläther. Der Pertol- die gesamte Aktivität. Sie hinterlassen beim Einäther, der nur unwirksame Bestandteile aufzulösen dampfen 2,25 g Rückstand, aus dem sich durch vermag, wird abdekantiert. Es hinterbleiben 91 mg des Kristallisation 1,04 g reines Avilamycin vom F. 187 rohen Antibiotikums Avilamycin, das die gesamte bis 188° gewinnen lassen. Aktivität des ursprünglichen Extraktes enthält. 45

Beispiel 6 Beispiel 4

2,51 g kristallisiertes Avilamycin werden mit einer

901 Kulturfiltrat werden mit 201 Essigester extrahiert Lösung von 1,5 g konzentrierter Schwefelsäure in und der Extrakt auf 400 ml eingeengt. Bei 20stündigem 50 30 ml Wasser versetzt und während 2 Stunden im Stehen bei 2° fällt das Avilamycin in Form eines Wasserbad (etwa 95°) erwärmt. Das abgekühlte dichten flockigen Niederschlages aus, der abfiltriert Reaktionsgemisch wird durch Ausschütteln mit Äther wird. Nach dem Trocknen im Exsikkator wiegt der von lipophilen Anteilen (850 mg braunes Öl) befreit nahezu farblose, aus stark verfilzten Nädelchen und die wäßrige Phase anschließend durch eine Säule bestehende Kristallkuchen 3,07 g. Die Mutterlaugen 55 aus 70 ml Dowex 3 (O Η-Form) perkoliert. Das werden auf etwa 200 ml eingeengt und mit der doppelten neutrale Eluat wird im Vakuum zur Trockene ver-Menge Äther versetzt. Nach 4 Tagen Stehen bei 0° dampft und hinterläßt 1,02 g eines nahezu farblosen kristallisieren weitere 3,28 g Avilamycin aus. zähflüssigen Öls.

3,0 g des Kristallisates löst man in 50 ml Aceton. Von Proben von 300 μg dieses Öls werden auf Filter-

einem geringen unlöslichen Schlamm wird abfiltriert. 60 papier Whatman No. 1 papierchromatographisch Das klare Filtrat wird nun unter Zugabe von Äther untersucht. Als Fließmittel dient ein Gemisch aus konzentriert. Beim Erkalten scheiden sich 2,0 g farblose n-Butanol, Eisessig und Wasser im Volumenverhältnis Kristalle in feinen Nädelchen ab. Durch Einengen der 4:1:1. Bei der Entwicklung mit Anilin-Phthalsäure Mutterlaugen auf etwa ein Viertel des Volumens sowie mit ammoniakalischer Silbernitratlösung lassen können nochmals 0,48 g Kristalle gewonnen werden. 65 sich drei reduzierende Zucker nachweisen. Der eine, mit Zur Analyse wird eine Probe dieser Kristalle noch Rj 0,18, zeigt eine rötliche, der zweite, mit Rf 0,41 viermal aus Aceton—Äther umkristallisiert und eine bräunlichgelbe und der dritte, mit Rf 0,52, wieder 20 Stunden im Hochvakuum bei 70° getrocknet. Das eine rötliche Anilin-Phthalsäurereaktion.

Die drei Zucker lassen sich präparativ an einer Cellulosepulversäule mit demselben Lösungsmittelgemisch trennen. Für 1,02 g Zuckergemisch wird eine Cellulosepulversäule von 3 cm Querschnitt und 42 cm Höhe verwendet. Die Eluate werden in Fraktionen von 16 ml aufgefangen. Aus den Fraktionen 19 bis 20 werden 330 mg des papierchromatographisch einheitlichen Zuckers mit Rf 0,52 als zähes Öl gewonnen. Die Fraktionen 21 bis 22 geben 348 mg desselben Zuckers im Gemisch mit demjenigen mit Rf 0,41. Der einheitliche zweite Zucker wird in einer Menge von 93 mg aus den Fraktionen 23 und 24 des Chromatogramms gewonnen. Von der Verbindung mit Rf 0,18 werden 340 mg aus den Fraktionen 27 bis 32 erhalten.

Claims (1)

1. PATENTANSPRUCH:

   Die Verwendung von Streptomyces viridochromogenes A 23 575 oder eines dessen Eigenschaften aufweisenden Mikroorganismus zur Herstellung des Antibiotikums Avilamycin durch übliche biologische Züchtung, Gewinnung des Antibiotikums aus dem Kulturfiltrat und Reindarstellung.

   Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

   © 109 738/384 10.61