DE1110821B - Herstellung und Gewinnung der Antibiotika Lankavamycin und/oder Lankavacidin - Google Patents

Herstellung und Gewinnung der Antibiotika Lankavamycin und/oder Lankavacidin

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DE1110821B
DE1110821B DEC21413A DEC0021413A DE1110821B DE 1110821 B DE1110821 B DE 1110821B DE C21413 A DEC21413 A DE C21413A DE C0021413 A DEC0021413 A DE C0021413A DE 1110821 B DE1110821 B DE 1110821B
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Dr Ernst Gaeumann
Dr Vladimir Prelog
Dr Ernst Vischer
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Novartis AG
BASF Schweiz AG
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Ciba Geigy AG
Ciba AG
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    • AHUMAN NECESSITIES
    • A01AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01NPRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/20Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • A01N63/28Streptomyces

Description

Die Erfindung betrifft die Herstellung und Gewinnung von zwei neuen Antibiotika, die im folgenden als Lankavamycin und Lankavacidin bezeichnet werden.
Das Antibiotikum Lankavamycin und/oder Lankavacidin entsteht bei der Kultur eines neuen Stammes der Gattung Streptomyces, der aus einer in Ceylon gesammelten Bodenprobe isoliert wurde und in den Laboratorien des Erfinders und in der Eidg. Technischen Hochschule, Institut für spezielle Botanik, Zürich, unter der Bezeichnung A 20388 und im United States Department of Agriculture, Agricultural Research Service, Northern Utilization Research and Development Division, Peoria, Illinois, unter der Bezeichnung NRRL 2834 aufbewahrt wird.
Der Stamm NRRL 2834 bildet ein zimtbraunes Luftmycel. Die Sporenketten sind monopodial verzweigt mit engen, geschlossenen Spiralen. Die Oberfläche der einzelnen Sporen ist glatt. Beim Wachstum auf peptonhaltigen Nährböden wird keine melanoide Verfärbung beobachtet. Das Wachstum ist relativ wenig abhängig von der Temperatur, sowohl bei 18- C als auch bei 40° C entwickelt sich der Pilz gut.
Zur weiteren Charakterisierung wird im folgenden das Wachstum des Stammes NRRL 2834 auf verschiedenen Nährmedien beschrieben. Die Nährmedien 1 bis 7und 10 wurden nach W. Lindenbein, Arch. Mikrobiol., 17, S. 361 (1952), hergestellt.
1. Synthetischer Agar
2. Synthetische
Lösung
3. Glukose-Agar ...
4. Glukose-Asparagin-Agar ..
5. Calciummalat-Agar
6. Gelatinstich
(180C) ....
Wachstum dünn, schleierartig, weißgelb.
Feine, weißgelbe Trübung.
Wachstum dünn, schleierartig, weißgelb bis hellgelb.
Wachstum dünn, schleierartig, hellgelb, Luftmycel samtig, kreideweiß bis zimtbraun.
Wachstum dünn, schleierartig, weißgelb, Luftmycel spärlich, meist milchweiß, an einigen Stellen zimtbraun.
Wachstum spärlich, dünn, schleierartig, weißgelb bis bräunlichgelb; Verflüssigung spärlich, nach 60 Tagen 2 mm.
Herstellung und Gewinnung
der Antibiotika Lankavamycin
und/oder Lankavacidin
Anmelder:
CIBA Aktiengesellschaft, Basel (Schweiz)
Vertreter: Dipl.-Ing. E. Splanemann, Patentanwalt, Hamburg 36, Neuer Wall 10
Beanspruchte Priorität:
Schweiz vom 20. Mai 1959 und 5. Februar 1960
Dr. Ernst Gäumann, Dr. Vladimir Prelog, Zürich,
und Dr. Ernst Vischer, Basel (Schweiz),
sind als Erfinder genannt worden
7. Stärkeplatte
8. Kartoffeln
9. Karotten
10. Lackmusmilch .
Wachstum dünn, schleierartig, weißgelb, Luftmycel fehlt, Hydrolyse spärlich, auch nach 10 Tagen nur Spur.
Wachstum pustelig bis dünn, schleierartig, bräunlichgelb, Luftmycel samtig, anfangs schneeweiß bis weißgrau, später blaßkarmin und zimtbraun.
Wachstum spärlich, pustelig, Luftmycel spärlich, weißgrau,
Ringwachstum und pusteliges Oberflächenwachstum, weißgeib, Lackmus rötlich, sehr starke Peptonisierung und starke Koagulation.
In seinen wesentlichen Merkmalen, wie Luftmycelfarbe, Morphologie der einzelnen Sporen sowie der Sporenketten und melanoide Verfärbung von peptonhaltigen Nährböden, stimmt der Stamm NRRL 2834 mit Streptomyces violaceo-niger (Waksman und Curtis) überein und wird deshalb vorläufig dieser Art zugezählt. Es ist bekannt, daß das Antibiotikum Nigericin von einem Streptomyces-Stamm produziert
109 647/467
wird, der ebenfalls der Gattung S. violaceo-niger angehört (vgl. Harnedetal., Antibiotics and Chemotherapy, 1, S. 594 [1951]). Das Nigericin ist eine organische Säure, die leicht mit Alkali titriert werden kann (Äquivalentgewicht 728). Wie weiter unten gezeigt wird, handelt es sich bei den neuen Antibiotika Lankavamycin und Lankavacidin um neutrale oder phenolische Substanzen, so daß eine Identität mit Nigericin ausgeschlossen werden kann.
Die vorliegende Erfindung ist, was die Herstellung der Antibiotika Lankavamycin und Lanakavacidin anbelangt, nicht auf die Verwendung des Organismus NRRL 2834 oder anderer der Beschreibung entsprechender Stämme beschränkt, sondern betrifft auch die Verwendung von Varianten dieser Organismen, wie sie z. B. durch Selektionierung oder Mutation, insbesondere unter der Einwirkung von Ultraviolett- oder Röntgenstrahlen oder von Stickstoff-Senfölen gewonnen werden.
Zur Erzeugung von Lankavamycin und/oder Lankavacidin wird ein die Eigenschaften des Organismus NRRL 2834 aufweisender Streptomyceten-Stamm, z. B. in wäßriger, anorganische Salze, eine Kohlenstoff- und Stickstoffquelle und gegebenenfalls wachstumsfördernde Stoffe enthaltender Nährlösung aerob gezüchtet, bis diese eine wesentliche antibakterielle Wirkung zeigt, und das Antibiotikum Lankavamycin und'oder Lankavacidin hierauf isoliert.
Die Nährlösung enthält als anorganische Salze beispielsweise Chloride, Nitrate, Carbonate, Sulfate von Alkalien, Erdalkalien, Magnesium, Eisen, Zink, Mangan. Als stickstoffhaltige Verbindungen und gegebenenfalls zuzusetzende Kohlehydrate und wachstumsfördernde Stoffe seien z. B. genannt: Aminosäuren und ihre Gemische, Peptide und Proteine sowie ihre Hydrolysate, wie Pepton oder Trypton, Fleischextrakte, wasserlösliche Anteile von Getreidekörnern, wie Mais und Weizen, von Destillationsrückständen bei der Alkoholherstellung, von Hefe, Bohnen, insbesondere der Sojapflanze, von Samen, beispielsweise der Baumwollpflanze, ferner Glukose, Saccharose, Laktose, Stärke, Mannit, Glycerin usw.
Die Züchtung erfolgt aerob, also beispielsweise in ruhender Oberflächenkultur oder vozugsweise submers unter Schütteln oder Rühren mit Luft oder Sauerstoff in Schüttelflaschen oder den bekannten Fermentern. Als Temperatur eignet sich eine solche zwischen 18 und 40° C. Eine wesentliche antibakterielle Wirkung zeigt die Nährlösung dabei im allgemeinen nach IVa bis 5 Tagen.
Bei dieser Fermentation wird gewöhnlich ein Gemisch von Lankavamycin und Lankavacidin gebildet. Das Verhältnis der erzeugten Mengen der beiden Antibiotika kann durch geeignete Variation der Fermentationsbedingungen beeinflußt werden. Daneben wird bei der Fermentation noch ein drittes, pilzaktives Antibiotikum gebildet. Zur Isolierung dieser Antibiotika können z. B. folgende Verfahren dienen: Man trennt das Mycel vom Kulturnitrat ab, wonach das Lankavamycin und/oder Lankavacidin zur Hauptsache im Kulturfiltrat gefunden wird. Die pilzaktive Substanz bleibt am Mycel adsorbiert und kann daraus extrahiert werden. Dazu eignen sich besonders organische, mindestens teilweise wasserlösliche Lösungsmittel, wie Alkohole, z. B. Methanol, Äthanol und Butanole, oder Ketone, z. B. Aceton und Methyläthylketon. Aus diesen Mycelextrakten kann man beispielsweise durch Behandlung mit Essigester die piizaktive Substanz in fester Form isolieren. Im Ultraviolettabsorptionsspektrum sind Maxima bei folgenden Wellenlängen sichtbar: 360 πΐμ (log E H =2,71), 342 ΐημ (log El* =2,73), 325 nut (log Ei:; =2,57) und 309 ma (log Eil =2,32). Dies deutet darauhin, daß es sich bei dieser Substanz um ein Pentaen handelt.
Zur Isolierung des Lankavamycins und/oder Lankavacidins extrahiert man das Kulturfiltrat mit
ίο einem mit Wasser nicht mischbaren, organischen Lösungsmittel, wie Estern niederer Fettsäuren, beispielsweise Äthylacetat oder Amylacetat, Kohlenwasserstoffen, z. B. Benzol, chlorierten Kohlenwasserstoffen, z. B. Äthylenchlorid, Methylenchlorid oder Chloroform, Ketonen, z. B. Methylpropylketon, Methylamylketon oder Diisobutylketon, Alkoholen, wie Butylalkoholen oder Amylalkoholen, Äthern, z. B. Äthyläther, Diisopropyläther, Dibutyläthern oder Glykoläthem u. dgl. An Stelle einer Lösungsmittelextraktion der Kulturen oder in Kombinationen mit einer solchen als weitere Reinigungsoperation kann man die Antibiotika auch durch Adsorption gewinnen, beispielsweise an Aktivkohle oder an aktivierten Erden, wie Fullererde oder Floridin, und anschließende Extraktion des Adsorbats z. B. mit einem in Wasser wenigstens teilweise löslichen organischen Lösungsmittel, wie Aceton, Butanol oder Methyläthylketon.
Eine weitere Anreicherung des Lankavamycins und/oder Lankavacidins läßt sich dadurch erzielen, daß man die antibiotikumhaltigen organischen Extrakte zuerst mit einer sauren wäßrigen Lösung mit einem pH unter 5 und dann mit einer alkalischen wäßrigen Lösung mit einem pH über 8 wiederholt auszieht, wobei die Hauptmenge der antibakteriellen Aktivität in der organischen Phase bleibt, aus der die genannten Antibiotika isoliert werden.
Wie bereits erwähnt, werden bei der Fermentation des Stammes NRRL 2834 meistens Gemische von Lankavamycin und Lankavacidin erhalten. Diese Substanzen lassen sich leicht mittels Gegenstromverteilung in einheitlicher Form isolieren. Für diese Auftrennung eignen sich speziell zweiphasige Lösungsmittelsysteme, die aus einem Gemisch von chlorierten Kohlenwasserstoffen, Alkoholen und Wasser bestehen. Beispielsweise hat sich für diesen Zweck ein Gemisch von Tetrachlorkohlenstoff, Cloroform, Methanol und Wasser gut bewährt.
Ein gutes Reinigungsverfahren für die beiden neuen Antibiotika stellt wiederum die Verteilung zwischen einer alkoholischen wäßrigen Lösung und einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel dar. Zweckmäßig erfolgt die Verteilung nach dem Gegenstroniverfahren in entsprechenden Apparaten. Auch Chromatographie, beispielsweise an Aluminiumoxyd, ist zur Reinigung sehr geeignet. Diese Reinigungsverfahren können einzeln oder in Kombination miteinander angewandt werden.
Die Gewinnung des reinen Lankavamycins und des reinen Lankavacidins in kristalliner Form nimmt man z. B. aus organischen Lösungsmitteln, wie aus Aceton, Methanol, Äthanol, Essigester, Chloroform, Aceton-Methanol - Gemischen, Aceton - Äther - Gemischen, Aceton-Petroläther-Gemischen oder Essigester-Petroläther-Gemischen. Zum Umkristallisieren dienen dieselben Lösungsmittel oder auch wäßrig-organische Lösungen, wie verdünnte Alkohole, verdünntes Aceton usw.
Das Antibiotikum Lankavamycin bildet farblose Kristalle, die einen doppelten Schmelzpunkt bei 147 bis 15O0C und bei 181 bis 182°C zeigen, [a]f = —94° (in absolutem Alkohol). Die Elementaranalyse liefert folgende Werte: C = 60,18%, H=8,75%, 0 = 31,06%,CH3CO=ll,49<Vo,OCH3 = 8,67%, (C) C H3=20,54 °/o. Das Ultraviolettabsorptionsspektrum zeigt ein Maximum bei 289 ΐημ (log E=1,50). Im Infrarotspektrum in Kaliumbromid (vgl. Fig. 1) sind Banden unter anderem beifolgenden Wellenlängen sichbar: 2,88, 3,36, 3,40, 5,73, 6,12, 6,68, 6,87, 7,02, 7,27, 7,49, 8,12, 8,58, 8,73, 9,12, 9,32, 9,45, 9,98, 10,28, 10,65, 10,88, 11,08, 11,45, 12,47, 13,30 und 14,45 μ. Die Substanz ist unter anderem löslich in Alkohol, Aceton, Chloroform, Essigester, Äther und Benzol und nur schwer löslich in Wasser und Petroläther. In Aceton gelöst, ist sie bei Zimmertemperatur beständig gegen Kaliumpermanganat. Bei der Hydrolyse mit 0,5 η-Schwefelsäure bei 100° C wird ein reduzierender Zucker abgespalten. Bei der Behandlung mit Alkali wird Essigsäure freigesetzt. Lankavamycin gibt mit Salzsäure nach Fischbach und Le vine (Antibiotics and Chemotherapy, 3, S. 1159 [1953]) die gleiche Farbreaktion wie das Makrolid-Antibiotikum Erythromycin. Außerdem gibt es eine tiefblaue Farbreaktion nach Ke 11er-Kiliani.
Das Antibiotikum Lankavacidin bildet blaßgelbe Kristalle, die bei 165 bis 168° C schmelzen und mit Ferrichloridlösung eine grüne Farbreaktion geben. Die Elementaranalyse liefert die folgenden Werte: C = 62,710Zo, H = 7,11%, N = 2,87%, (C)CH3 = 12,60%. [a] 2S = -161° (in absolutem Äthanol). Das Antibiotikum ist unter anderem löslich in Alkohol, Aceton, Chloroform und Essigester und nur mäßig oder schwer löslich in Petroläther und Wasser.
Das Ultraviolettabsorptionsspektrum zeigt ein Maximum bei 227 ηΐμ (log E}1 =2,95). Im Infrarotspektrum in Kaliumbromid (vgl. Fig. 2) sind Banden unter anderem bei folgenden Wellenlängen sichtbar: 2,93, 3,39, 5,71, 5,84, 5,92, 6,58, 6,89, 7,38, 7,92, 8,18, 8,59, 8,79, 9,07, 9,40, 9,87, 10,34, 11,46, 12,03, 13,36 und 14,31 μ. Bei der Hydrolyse mit 6n-Salzsäure bei 110° werden keine Spaltstücke gebildet, die mit Ninhydrin eine Farbreaktion geben.
Die Antibiotika Lankavamycin und Lankavacidin sowie ihre Gemische besitzen eine sehr hohe antibiotische Wirksamkeit gegenüber verschiedenen Testorganismen. Verwendet man als Testmethode in vitro Verdünnungsreihen (Zehnerpotenzen) in Glukosebouillon, die während 24 Stunden bei 37° C bebrütet werden, so ergeben sich folgende noch hemmende Konzentrationen:
Testorganismen
Staphylococcus aureus ..
Streptococcus pyogenes ..
Streptococcus viridans ...
Corynebacterium
diphteriae
Bacillus megatherium ....
Ent. histolytica
* Abtötung der Trophozoiten in Bacto Entamceba-Mediiim.
Hemmende Konzentration Lankava
,«.g/cm3 cidin
Lankava 100
mycin 100
100 10
100 100
100 100
100 1000
100
125 *
Escherichia coli, Salmonella typhosa, Salmonella schoitmuelleri, Shigella sonnei, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae (Typ A), Pasteurella pestis, Vibrio comma (El Tor), Streptococcus faecalis, ferner Pilze wie Candida albicans und Trichophyton interdigitale werden durch Konzentrationen von 100 μg/cm3 der beiden Verbindungen nicht gehemmt. Wie aus der Tabelle hervorgeht, sind Lankavamycin und Lankavacidin hauptsächlich gegenüber gram-
xo positiven Mikroorganismen in vitro wirksam. Lankavacidin zeigt in vivo eine ausgeprägte chemotherapeutische Aktivität. Mit Streptococcus pyogenes bzw. Staphylococus aureus infizierte Mäuse überleben den zehnten Versuchstag zu 100%, wenn sie innerhalb 30 Stunden nach der Infektion 5 · 33 mg/kg Lankavacidin subcutan erhalten. Die unter gleichen Bedingun-• gen wirksame Dosis per os beträgt 5· 100 mg/kg. Lankavamycin ist in lOfacher Dosis nur schwach wirksam bzw. unwirksam.
ao Gleichzeitige Anwendung von Lankavacidin und Lankavamycin ergibt in vitro wie in vivo bessere antibakterielle Effekte als der Wirkung der Komponenten allein zukommt. Der synergistische Effekt zeigt sich z. B. auf Staphylokokken beimpften Agar-
a5 platten, auf die mit Lösungen von Lankavacidin und Lankavamycin getränkte Filterpapierstreifen gelegt wurden. Fig. 3 zeigt einen Kreuzstreifentest gegen Staphylococcus aureus mit Lankavamycin (L') und Lankavacidin (L") in verschiedenen Konzentrationen (mg/cm3), die am rechten bzw. unteren Streifenende angegeben sind. Die Konzentrationen von 0,1 mg/cm3 Lankavamycin allein bzw. 0,01 mg/cm3 Lankavacidin allein sind unwirksam.
In vivo ist die subkutane Dosis, die 100% der mit Staphylokokken infizierten Mäuse schützt, 10 mg/kg Lankavacidin +100 mg/kg Lankavamycin, d. h. eine Dosis, bei der die einzelnen Komponenten allein nicht wirksam sind.
Die Antibiotika Lankavamycin und Lankavacidin können mittels Hydrierung oder Oxydation in Umwandlungsprodukte sowie in Spaltprodukte durch Hydrolyse übergeführt werden.
Die Antibiotika Lankavamycin und/oder Lankavacidin, die obengenannten Umwandlungs- und Spaltprodukte oder entsprechende Gemische können als Heilmittel, z. B. in Form pharmazeutischer Präparate, Verwendung finden. Diese enthalten die genannten Verbindungen in Mischung mit einem für die enterale, parenterale oder lokale Applikation geeigneten pharmazeutischen organischen oder anorganischen Trägermaterial. Für dasselbe kommen solche Stoffe in Frage, die mit den neuen Verbindungen nicht reagieren, wie z. B. Gelatine, Milchzucker, Stärke, Magnesiumstearat, Talk, pflanzliche Öle, Benzylalkohol, Gummi, Polyalkylenglykole, Vaseline, Cholesterin oder andere bekannte Arzneimittelträger. Die pharmazeutischen Präparate können z. B. als Tabletten, Dragees, Pulver, Salben, Cremen, Suppositorien oder in flüssiger Form als Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen vorliegen. Gegebenenfalls sind sie sterilisiert und bzw. oder enthalten Hilfsstoffe, wie Konservierungs-, Stabilisierungs-, Netz- oder Emulgiermittel. Sie können auch noch andere therapeutisch wertvolle Stoffe enthalten.
Die Erfindung wird in den nachfolgenden Beispielen beschrieben, ohne daß damit eine Einschränkung des Erfindungsgegenstandes beabsichtigt ist. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben.
Beispiel 1
Man bereitet eine Nährlösung der Zusammensetzung: 20 g Distillers solubles, 20 g Laktose, 1 g Natriumnitrat, 5 g Natriumchlorid und 11 Leitungswasser und stellt sie auf pH 7,5 ein. Diese bzw. ein Vielfaches derselben wird in 500-cm3-Erlenmeyern (mit je 100 cm3 Nährlösung) oder in 500-1-Fermentern (mit je 3001 Nährlösung) abgefüllt und 20 bis 30 Minuten bei 1 atü sterilisiert. Dann impft man mit bis zu 10 °/o einer teilweise sporulierenden, vegetativen Kultur des Streptomyces-Stammes NRRL 2834 an und inkubiert unter gutem Schütteln bzw. Rühren und in den Fermentern unter Belüftung (mit etwa 1 Volumen steriler Luft je Volumen Nährlösung je Minute) bei 27°. Nach 70 bis 120 Stunden Wachstum filtriert man die Kulturen unter Zusatz eines Filterhilfsmittels je nach Volumen durch eine Nutsche oder durch eine Filterpresse oder einen rotierenden Filter und befreit so die antibiotisch wirksame wäßrige Lösung vom Mycel und anderen festen Bestandteilen.
Beispiel 2
Verwendet man an Stelle des im Beispiel 1 angegebenen Mediums beispielsweise die im folgenden beschriebenen Nährlösungen a) bis f), so erhält man nach analoger Sterilisation, Beimpfung mit dem Streptomyces-Stamm NRRL 2834, Inkubation bei 27: und Filtration wäßrige antibiotisch wirksame Lösungen.
a) 20 g Mannit, 20 g Distillers solubles, 1 g Natriumnitrat, 3 g Natriumchlorid und 11 Leitungswasser; pH vor der Sterilisation 7,3.
b) 20 g Malzextrakt, 20 g Distillers solubles, 1 g Natriumnitrat, 5 g Natriumchlorid und 11 Leitungswasser; pH vor der Sterilisation 7,8.
c) 10 g Rohglukose, 10 g Distillers solubles, 1 g Natriumnitrat, 1 g Natriumchlorid, 10 g Calciumcarbonat und 11 Leitungswasser; pH vor der Sterilisation 7,5.
d) 5 g Distillers solubles, 40 g Sojamehl, 20 g Rohglukose, 20 g Natriumchlorid, 10 g Calciumcarbonat und 11 Leitungswasser; pH vor der Sterilisation 7,5.
e) 20 g Malzextrakt, 20 g Maisquellwasser, 5 g Natriumchlorid, 0,2 g sek. Kaliumphosphat, 20 g Calciumcarbonat und 11 Leitungswasser; pH vor der Sterilisation 7,5.
f) 20 g Mannit, 20 g Sojamehl und 11 Leitungswasser; pn vor der Sterilisation 7,3.
Beispiel 3
Der Filterrückstand eines gemäß Beispiel 1 oder 2 erhaltenen 150-1-Ansatzes wird mit 25 1 Aceton ausgerührt und erneut filtriert. Dies wird zweimal wiederholt, worauf man die pilzaktiven Acetonlösungen vereinigt im Vakuum zur Trockne eindampft. Nach Behandlung mit Essigester erhält man die pilzaktive Substanz in Form eines bräunlichen Pulvers, das im Ultraviolettspektrum folgende Absorptionsbanden zeigt:
360 mu (log E{* =2,71), 342 ma (logE}» =2,73), 325 mii (log E \t =2.57) und 309 πΐμ (log Ei* =2,32).
Das Kulturfiltrat wird mit 701 Äthylacetat extrahiert, wobei die gesamte antibakterielle Aktivität in die organische Phase übergeht. Der Extrakt wird mit Wasser gewaschen, im Vakuum auf 51 eingedampft und dann mehrere Male mit 0,5 η-Essigsäure und mit 2 η-Natronlauge ausgeschüttelt. Schließlich trocknet man die Äthylacetatlösung über Natriumsulfat und dampft sie im Vakuum ein, wobei ein öliger Rückstand erhalten wird. Durch Behandlung mit Petroläther gewinnt man daraus ein Pulver, das aus einem rohen Gemisch der Antibiotika Lankavamycin und ίο Lankavacidin besteht.
Beispiel 4
5,3 g des gemäß Beispiel 3 erhaltenen rohen Gemisches löst man in 100 cm3 absolutem Chloroform und trägt die Lösung auf eine Säule aus 150 g Aluminiumoxyd (AktivitätIII nach Brockmann) auf. 400 cm3 absolutes Chloroform lösen nur inaktive Begleitstoffe heraus. Anschließend wird mit 450 cm3 Cloroform, das 3% Methylalkohol enthält, eluiert,
»ο wobei die gesamte wirksame Substanz im Eluat erhalten wird. Reichlich braune bis schwarze Verunreinigungen bleiben in der Säule haften. Durch Eindampfen der aktiven Fraktionen gewinnt man 2,75 g eines angereicherten Gemisches der Antibiotika Lankavamycin und Lankavacidin in Form eines dickflüssigen blaßbräunlichen Öls.
Beispiel 5
2,75 g des gemäß Beispiel 4 angereicherten Gemisches werden einer lOOstufigen Gegenstromverteilung unterworfen, wobei man folgendes Lösungsmittelgemisch verwendet: 3 Volumteile Tetrachlorkohlenstoff, 2 Volumteile Chloroform, 4 Volumteile Methanol und 1 Volumteil Wasser. Die einzelnen Fraktionen v/erden auf ihre antibakterieile Aktivität geprüft, wobei als Testorganismen Bacillus subtilis und Micrococcus pyogenes, var. aureus verwendet werden. Mit dem ersteren ergibt sich ein Aktivitätsmaximum bei der Stufe 27 (Antibiotikum Lankava- mycin), während mit dem zweiten Testorganismus ein solches bei Stufe 80 (Antibiotikum Lankavacidin beobachtet wird. Darauf vereinigt man einerseits die Stufen 20 bis 37 und anderseits die Stufen 70 bis 91 und arbeitet sie getrennt auf folgende Art auf: Nach dem Abtrennen der unteren Phase wird die obere Phase mit Wasser verdünnt und dreimal mit frischem
„ Chloroform ausgeschüttelt. Man vereinigt diese Extrakte mit der abgetrennten unteren Phase, trocknet diese Lösung über Natriumsulfat und dampft sie im Vakuum ein. Man erhält so das Antibiotikum Lankavamycin und das Antibiotikum Lankavacidin in einheitlicher Form.
Beispiel 6
9,63 g des gemäß Beispiel 5 erhaltenen Antibiotikums Lankavamycin werden an einer Säule aus 200 g Aluminiumoxyd (AktivitätIII nach Brockmann) Chromatographien. Die mit 800 cm3 Benzol eluierten Anteile sind unwirksam und werden verworfen.
400 cm3 Chloroform, das man durch Destillation über Phosphorsäureanhydrid völlig von Alkohol befreit hat, lösen 2 g einer blaßbräunlichen, honigartigen Substanz mit mittelmäßiger Aktivität heraus. Durch weitere Elution mit 300 cm3 Chloroform— Methylalkohol 99:1 gewinnt man die Hauptmenge des Antibiotikums als weißes amorphes Pulver (5,5 g). Die weiteren Eluate enthalten nur noch geringe Menge an Aktivität.

Claims (1)

  1. 9 10
    4g der Hauptfraktion löst man in wenig Aceton Beispiel 7
    und verdünnt diese Lösung mit der fünffachen Menge 600 mg des gemäß Beispiel 5 erhaltenen Antibioti-
    Äther. Nun wird die Lösung konzentriert und das kums Lankavacidin werden zur weiteren Reinigung
    verdampfte Lösungsmittel sukzessive durch Petrol- an einer Säule aus 15 g Aluminiumoxyd chromato-
    äther ersetzt. Beim Stehen in der Kälte kristallisiert 5 graphiert, wobei mit Chloroform und mit Chloro-
    das Antibiotikum Lankavamycin in unregelmäßigen form-Methanol-Gemischen eluiert wird. Die gesamte
    derben Kristallen aus. Die farblosen Kristalle sind Aktivität ist in den Fraktionen, die mit Chloroform—
    bei 130° im Hochvakuum nicht sublimierbar. Einer Methanol 99:1 und 49:1 eluiert werden, enthalten.
    Lösung in Äthylacetat kann das Antibiotikum weder Die aktiven Fraktionen geben beim Eindampfen im
    mit verdünnter Essigsäure noch mit verdünntem Na- io Vakuum 280 mg eines gelblichen Öls, das beim
    triumcarbonat entzogen werden. Ein viermal um- Stehen teilweise kristallin erstarrt. Durch Kristallisa-
    kristallisiertes und 20 Stunden im Hochvakuum bei tion aus wenig Äthylacetat kann man das Antibioti-
    80° getrocknetes Präparat zeigt folgende Eigenschaf- kum als blaßcremefarbiges Kristallpulver gewinnen,
    ten: F. 147 bis 150°, beim weiteren Erhitzen wachsen Ausbeute etwa 90 mg. Die ,Mutterlaugen sind nahezu
    aus der Schmelze lange Nadeln, die endgültig bei 181 15 so aktiv wie die Kristalle und erstarren beim Stehen
    bis 182° schmelzen: [a] 2S =93,8° (c = 1,23 in Fein- teilweise. Das Antibiotikum Lankavacidin schmilzt
    sprit); Elementaranalyse: C=60,18%, H= 8,75%, nach Umkristallisieren aus Äthylacetat—Äther bei
    O=31,06%,CH„CO=ll,49%,CH3-(C)=20,54%, 165 bis 168°. Die Elementaranalyse gibt folgende
    OCH3=8,67%. Werte: C=62,71'%, Η=7,1Γ%, Ν=2,87β/ο, (C)CH3
    Eine 0,25%ige Lösung des Antibiotikums in optisch 20 =12,60%. [α] %° = -161° (in absolutem Äthanol),
    reinem Feinsprit zeigt ein Absorptionsmaximum bei Mit 5%iger alkoholischer Ferrichloridlösung erhält
    289 πΐμ (log E=1,50). Im Inforarotspektrum, auf- man eine grüne Farbreaktion.
    genommen in Kaliumbromid (vgl. Fig. 1), sind Ban- Das Ultraviolettabsorptionsspektrum in Feinsprit
    den unter anderem bei folgenden Wellenlängen sieht- zeigt ein Maximum bei 227 m (logE}l =2,95). Im
    bar: 2,88, 3,36, 3,40, 5,73, 6,12, 6,68, 6,87, 7,02 25 Infrarotspektrum (aufgenommen in Kaliumbromid
    7,27, 7,49, 8,12, 8,58, 8,73, 9,12, 9,32, 9,45, 9,98, [vgl. Fig. 2]) sind Banden unter anderem bei folgenden
    10,28, 10,65, 10,88, 11,68, 11,45, 12,47, 13,30 und Wellenlängen sichbar: 2,93, 3,39, 5,71, 5,84, 5,92,
    14,45 μ. 6,58, 6,89, 7,38, 7,92, 8,18, 8,59, 8,79, 9,07, 9,40,
    Bei der Hydrolyse des Antibiotikums Lankavamy- 9,87, 10,34, 11,46, 12,03, 13,36 und 14,31 μ.
    ein mit O,5n-Schwefelsäure (1 Stunde, 100°) wird 30 5 mg Lankavacidin werden in 1 cm3 6 n-Salzsäure
    ein reduzierender Zucker abgespalten, der bei der über Nacht bei 110° hydrolisiert. Die papierchroma-
    Papierchromatographie im System n-Butanol—Eis- tographische Untersuchung des Hydrolysats ergibt,
    essig—Wasser (4:1:1) einen RrWert von 0,68 zeigt. daß keine ninhydrinpositiven Substanzen darin ent-
    Wird Lankavamycin mit Alkali behandelt, so ent- halten sind.
    steht Essigsäure, wie durch Papierchromatographie 35 ΡΛΤΕΝΤΛΝίΡϊπηϊ.
    sowie durch Mischschmelzpunkt und Infrarotabsorp- i'AibNiANi.MUtH.
    tionsspektrum des kristallinen p-Phenyl-phenacyl- Die Verwendung von Streptomyces violaceo-
    esters (F. 112,5 bis 114°) gezeigt werden kann. niger NRRL 2834 oder eines dessen Eigenschaf-
    Eine Lösung von Lankavamycin in oxydations- ten aufweisenden Mikroorganismus zur Herstel-
    beständigem Aceton wird durch eine 5°/oige wäßrige 40 lung des Antibiotikums Lankavamycin und/oder
    Kaliumpermanganatlösung bei Zimmertemperatur des Antibiotikums Lankavacidin durch übliche
    während mehreren Stunden nicht angegriffen. Bei biologische Züchtung, Gewinnung des Antibioti-
    95° erfolgt dagegen rasche Abscheidung von Braun- kums Lankavanycin und/oder Lankavacidin aus
    stein. dem Kulturfiltrat und Reindarstellung.
    Hierzu 1 Blatt Zeichnungen
    © 109 647/467 7.61
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