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Verfahren zur Gewinnung von Thiactin
EMI1.1
<Desc/Clms Page number 2>
EMI2.1
Xylose, Glukose, Laevulose, Rohrzucker, Raffinose, Maltose, Lactose, d-Mannit, d-Sorbit, Cellobiose, dl-Inosit, Natriumacetat, Natriumzitrat, Natriumoxalat, Natriumtartrat, Natriumsuccinat und Kalziummalat. Dulcit erwies sich als minderwertige Kohlenstoffquelle und Natriumsalicylat war nicht in der Lage, das Wachstum zu unterhalten.
Eine eingehende Beschreibung der Wachstumseigenschaften auf einer Reihe von Nährböden für Streptomyceten wird in der nachfolgenden Tabelle I gegeben. Darin sind die Art des Wachstums, die Pigmenterzeugung und andere charakteristische Eigenschaften angegeben. Die Nährböden werden im Ausstrichverfahren beimpft und dann bei 27 bis 290 C 14 Tage lang bebrütet.
Streptomyces BL-678506 säuert Lackmusmilch bei der Bebrütung bei 29 - 300 C, ohne dass Koagulation oder Peptonisierung eintritt. Der Nachweis der reduzierenden Wirkung auf Nitrate wurde mit Kulturen in Czapeks Bouillon nach der Sulfanilsäure-a-Naphthylaminmethode durchgeführt. Dabei wurde Nitrit in Schüttelkulturen in 4 Tagen bei 2'7 - 290 C gebildet. Streptomyces BL-678506 bewirkt keine Hämolyse von Blutagarnährboden, erzeugt aber darin ein schwarzes Pigment. Die Reaktion von StärkeAgar-Kulturen mit Lugol'scher Jodlösung deutet darauf hin, dass der Mikroorganismus eine schwache diastatische Wirkung besitzt. In 14 Tagen wird eine 2 mm breite Zone, in der Hydrolyse erfolgt ist, gebildet. Gelatine wird nicht verflüssigt.
Tabelle I
EMI2.2
<tb>
<tb> Kulturelle <SEP> Eigenschaften <SEP> von <SEP> Streptomyces <SEP> BL-678506.
<tb>
Nährboden <SEP> : <SEP> Wachstum <SEP> : <SEP> Luftmycel <SEP> und <SEP> Lösliches <SEP> Pigment <SEP> : <SEP> Bemerkungen <SEP> : <SEP>
<tb> Farbe <SEP> d. <SEP> Sporen <SEP> : <SEP>
<tb> AsparaginDextrose-Agar <SEP> gut <SEP> weiss <SEP> keine <SEP> Pigmentbildung <SEP> Rückseite <SEP> braun
<tb> AsparaginGlycerin-Fleisch- <SEP> Rückseite <SEP> violett,
<tb> extrakt-Agar <SEP> gut <SEP> weiss <SEP> keine <SEP> Pigmentbildung <SEP> Spiralenbildung
<tb> Bennetts-Agar <SEP> gut <SEP> weiss <SEP> bis <SEP> grau <SEP> braun <SEP> ! <SEP> Rückseite <SEP> braun
<tb> Nähragar <SEP> gut <SEP> weiss <SEP> hellbraun <SEP> Rückseite <SEP> braun
<tb> Emersons <SEP> Agar <SEP> gut <SEP> weiss <SEP> braun <SEP> Rückseite <SEP> hellbraun
<tb> Czapeks <SEP> Agar <SEP> gut <SEP> schwach <SEP> weisses <SEP> keine <SEP> Pigmentbildung <SEP> Rückseite <SEP> schwach
<tb> Luftmycel,
<SEP> gelb
<tb> Czapeks <SEP> Agar
<tb> mit <SEP> Dextrin <SEP> mässig <SEP> weiss <SEP> gelb <SEP> Rückseite <SEP> gelb, <SEP> beim
<tb> Zurückstreifen <SEP> des
<tb> Luftmycels <SEP> findet <SEP> sich
<tb> darunter <SEP> ein <SEP> glasiges,
<tb> pfannkuchenartiges
<tb> Gebilde.
<tb>
Keine <SEP> Spiralbildung
<tb> Kalziummalatagar <SEP> schlecht <SEP> schwach <SEP> weisses <SEP> keine <SEP> Pigmentbildung <SEP> Rückseite <SEP> farblos
<tb> Luftmycel
<tb> Maisweich- <SEP> mässig <SEP> weiss <SEP> mit <SEP> hell- <SEP> hellbraun <SEP> Rückseite <SEP> hellbraun,
<tb> wasser-Agar <SEP> grauem <SEP> Zentrum <SEP> keine <SEP> Spiralbildung
<tb> Tomaten-Ha-gut <SEP> weiss <SEP> bis <SEP> fleisch- <SEP> schwach <SEP> gelb- <SEP> Rückseite <SEP> gelblich- <SEP>
<tb> fermehl- <SEP> farben <SEP> braun <SEP> braun. <SEP> Spiralbildung
<tb> Agar
<tb> Kartoffel-gut <SEP> grau-Kolonien <SEP> hellbraun,
<tb> scheiben <SEP> werden <SEP> später <SEP> grau
<tb> mit <SEP> Luftmycel
<tb>
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Die in der Tabelle angegebenen Farbenbezeichnungen sind dem "Dictionary of Color" von Maerz und Paul, 1. Ausgabe, entnommen.
Das Antibiotikum Thiactin hat sich in vitro gegen eine grosse Anzahl von grampositiven Bakterien und gegen die Gruppe der säurefesten Stäbchen (Mycobacterium) als hoch wirksam erwiesen. Die folgende Zusammenstellung in Tabelle II zeigt die antibiotische Wirksamkeit von Thiactin (Charge 3 - 7 erhältlich gemäss dem nachfolgenden Beispiel 10). Die Untersuchung wurde in der Weise durchgeführt. dass eine Lösung von 5, 0 mg Thiactin je cm3 in einen Einschnitt in eine Herzinfusion-Agarplatte vom PH 7, 0 gegeben und die Hemmungszone in mm gemessen wurde.
Tabelle II
EMI3.1
<tb>
<tb> Thiactin-Plattenspektrum <SEP> . <SEP>
<tb>
Testorganismus <SEP> : <SEP> Hemmungszone <SEP> in <SEP> mm <SEP> : <SEP>
<tb> Staph. <SEP> aureus <SEP> 11
<tb> E. <SEP> typhosa <SEP> keine <SEP> Hemmung
<tb> E. <SEP> coli <SEP> keine <SEP> Hemmung
<tb> E. <SEP> coli <SEP> keine <SEP> Hemmung
<tb> S. <SEP> paratyphi <SEP> B <SEP> keine <SEP> Hemmung
<tb> K. <SEP> pneumoniae <SEP> keine <SEP> Hemmung
<tb> Ps. <SEP> aeruginosa <SEP> keine <SEP> Hemmung
<tb> S. <SEP> gallinarum <SEP> keine <SEP> Hemmung
<tb> B. <SEP> anthracis <SEP> 13
<tb> S. <SEP> Schottmulleri <SEP> keine <SEP> Hemmung
<tb> B. <SEP> subtilis <SEP> 9
<tb> B. <SEP> mycoides <SEP> 0 <SEP> 9 <SEP>
<tb>
Im einzelnen wird dieser Wirksamkeitstest wie folgt durchgeführt :
Etwa 30 cm3 einer sterilen Herzinfusionsbouillon, zu der eine Agarlösung als Verfestigungsmittel zugesetzt wird, werden in eine sterile Petrischale von 9 cm Durchmesser gegeben und erstarren gelassen. Mit einem sterilen Spatel wird in diesen Agarnährboden eine Rinne (8 mm x 40 mm) gezogen. Der Boden dieser Rinne wird mit 1 oder 2 Tropfen geschmolzenem Agar bedeckt. Mit einer kleinen Platinöse wird das betreffende Testbakterium aus einer Nährlösung nach 24-stündiger Bebrütung bei 370 C entnommen und in bekannter Weise über die Agarplatte gestrichen. Der Strich zieht sich vom Rande der Rinne bis zur Wand der Petrischale. Die Rinne wird dann mit einer Lösjng des Antibiotikums in der oben angegebenen Konzentration gefüllt. Die Petrischale wird daraufhin bei 370 C 18 - 24 Stunden lang bebrütet.
Die Hemmungszone wird vom Rande der Rinne bis zu dem Punkt, wo der Testorganismus wieder zu wachsen anfängt, gemessen. Charge 8 unterbindet das Wachstum vonM. tuberculosis H 37 Rv in Dubos-Nährmedium in einer Konzentration von 0, 04 bis 0, 014 mg/cm3.
Die nachstehende Tabelle III gibt die bakteriostatische Wirksamkeit von kristallinem Thiactin in vitro an. Die Prüfung erfolgte nach der Verdünnungsmethode in Reagenzgläser, wobei die Mindestkonzentration an Antibiotikum, die das Wachstum der untersuchten Bakterien 24 Stunden lang völlig zu unterbinden vermag, bestimmt wurde.
Als Kulturmedium wurde, soweit nicht anders angegeben, Herzinfusionsbouillon verwendet.
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Tabelle III
EMI4.1
<tb>
<tb> Testorganismus <SEP> : <SEP> Geringste <SEP> hemmend <SEP> wirkende
<tb> Konzentration <SEP> in <SEP> r <SEP> je <SEP> cm3 <SEP> : <SEP>
<tb> Micrococcus <SEP> pyogenes <SEP> var. <SEP> aureus <SEP> 0, <SEP> 025 <SEP>
<tb> Micrococcus <SEP> aureus <SEP> var. <SEP> pyogenes
<tb> 52-79 <SEP> (penicillinresistent) <SEP> 0, <SEP> 25 <SEP>
<tb> Micrococcus <SEP> aureus <SEP> var.
<SEP> pyogenes
<tb> 72-75 <SEP> (penicillinresistent) <SEP> 0,25
<tb> Enterococcus <SEP> McDonough <SEP> 0, <SEP> 125 <SEP>
<tb> Enterococcus <SEP> McDonough <SEP> (crithromycinresistent) <SEP> 0, <SEP> 25 <SEP>
<tb> Gaffkya <SEP> tetragena <SEP> 0,025
<tb> Streptococcus <SEP> pyogenes <SEP> C203+ <SEP> 0,5
<tb> Streptococcus <SEP> pyogenes <SEP> C203+
<tb> (penicillin-und <SEP> erithiomycinresistent) <SEP> 0, <SEP> 008 <SEP>
<tb> S1Ieptococcus <SEP> agalactiae <SEP> 7077 <SEP> 0, <SEP> 003 <SEP>
<tb> Streptococcus <SEP> dysgalactiae <SEP> 9926 <SEP> 0, <SEP> 002 <SEP>
<tb> Diplococcus <SEP> pneumoniae+ <SEP> 0,002
<tb> Lactobacillus <SEP> acidophilus <SEP> No. <SEP> 4356++ <SEP> 0, <SEP> 003 <SEP>
<tb> Lactobacillus <SEP> casei <SEP> No.
<SEP> 4646++ <SEP> 0, <SEP> 025 <SEP>
<tb> Lactobacillus <SEP> Leichmannii++ <SEP> 0,006
<tb> Bacillus <SEP> anthracis <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP>
<tb> Bacillus <SEP> cereus <SEP> var. <SEP> mycoides <SEP> > <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP>
<tb> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> 0, <SEP> 01 <SEP>
<tb> Corynebacterium <SEP> xerosis <SEP> 0, <SEP> 003 <SEP>
<tb> Clostridiumwelchü601 <SEP> 0, <SEP> 02 <SEP>
<tb> Clostridium <SEP> welchii <SEP> M+++ <SEP> 0,06
<tb> Clostridium <SEP> sporogenes <SEP> 84+++ <SEP> 0.
<SEP> 03 <SEP>
<tb> Clostridium <SEP> sporogenes <SEP> 40+++ <SEP> 0, <SEP> 007 <SEP>
<tb> Salmonelle <SEP> typhosa <SEP> > <SEP> 10
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> > <SEP> 10
<tb> Shigella <SEP> sonnei <SEP> > <SEP> 10
<tb> Shigella <SEP> dysenteriae <SEP> > <SEP> 10
<tb> Klebsiella <SEP> pneumoniae <SEP> > <SEP> 10
<tb> Proteus <SEP> vulgaris <SEP> > <SEP> 10
<tb> Pseudomonas <SEP> aeruginosa <SEP> > <SEP> 10
<tb> Neisseria <SEP> sp. <SEP> > <SEP> 10
<tb> Salmonella <SEP> paratyphi <SEP> A <SEP> > <SEP> 10
<tb> Candida <SEP> albicans <SEP> 6, <SEP> 25 <SEP>
<tb>
+ Geprüft in Serumbouillon, ++ geprüft in Tomatensaftbouillon, +++ geprüft in Thioglykolatbouillon.
Die bakteriostatische Wirksamkeit von Thiactin kann auch mit dem zur Auswertung der Antibiotika gebräuchlichen Diffusionsplattentest durch Bestimmung der Hemmungszone erfolgen.
Thiactin ist sowohl in vivo als auch in vitro wirksam und zeigt eine beachtliche chemotherapeutische Wirksamkeit bei experimenteller Infektion von Mäusen. Die folgende Tabelle IV gibt die Ergebnisse entsprechender Testversuche und Toxizitätsbestimmungen wieder.
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Tabelle IV
EMI5.1
<tb>
<tb> Organismus <SEP> CD <SEP> in <SEP> mg <SEP> Thiacr1n <SEP> je <SEP> kg <SEP> Maus
<tb> intraperitoneal <SEP> intramuskulär <SEP> oral
<tb> D. <SEP> pneumoniae <SEP> 0, <SEP> 0004 <SEP> 5, <SEP> 0 <SEP> 62, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Strept. <SEP> hemolyticus <SEP> 0, <SEP> 13 <SEP> 30, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Candida <SEP> albicans <SEP> 1000, <SEP> 0 <SEP>
<tb>
Das Antibiotikum zeigt die gleiche Wirksamkeit (CD) gegen D. pneumoniae, wenn es 18 Stunden vor oder 6 Stunden nach der Infektion mit diesem Mikroorganismus intramuskulär verabreicht wird.
Toxische Erscheinungen wurden bei intramuskulärer Verabreichung von 1000 mg/kg Maus oder bei intraperitonealer Verabreichung von 2000 mg/kg Maus nicht beobachtet.
CD (dosis curativa - 50) ist die geringste Dosis an Thiactin, die 50 NO einer Gruppe von Mäusen heilt, denen 100-1000 LD-Dosen z. B. von Diplococcus pneumoniae intraperitoneal injiziert worden sind, wobei jede einzelne LD-Dosis, wenn allein verabreicht, ausreichen würde, 50 % der betreffenden Gruppe von Mäusen zu töten. Die Infektion wird auf einmal gesetzt u. zw. zur Zeit der Injektion des zu prüfenden Thiactins, das in wässeriger 0, 4 %iger Carboxymethylcellulose-Lösung suspendiert ist. Die Versuchstiere werden 4 Tage lang beobachtet und die in jeder Tiergruppe eingetretenen Todesfälle werden umgerechnet in Prozente aller Tiere der bet-effenden Gruppe.
Der Prozentbetrag der Todesfälle wird in "Probit"-Werte (Wahrscheinlichkeitseinheiten) umgewandelt und diese werden gegen den Logarithmus der Dosis in mg per kg Mausg2wicht aufgetragen. Der Schnittpunkt der"Probit 5"-Linie und der günstigsten Kurve, die sich durch die experimentell gefundenen Punkte hindurchlegen lässt, gibt die Konzentration des Antibiotikums an, die unter den Versuchsbedingungen die Hälfte der Versuchstiere schützen wird. Der Antilogarithmus dieses Wertes wird als CD -Wert bezeichnet.
Um die chronische Toxizität von Thiactin an Mäusen zu bestimmen, wurde an 2 Gruppen von je 10 männlichen Mäusen täglich eine intraperitoneale Injektion einer 2 % igen Suspension von Thiactin (Charge 4-8) in einem 0, 5 % Carboxymethylcellulose enthaltenden Gel in Mengen von 50 mg/kg bzw.
75 mg/kg Maus verabreicht. Eine dritte Tiergruppe erhielt das der höheren Dosis entsprechende Volumen an 0, 5 % Carboxymethylcellulose enthaltendem Gel ohne Thiactin und diente als Kontrollgruppe.
Nach 4 Wochen wurde die Untersuchung beendet. Während dieser Zeit traten keine Todesfälle in der Kontrollgruppe und in der 50 mg/kg-Gruppe ein. Bei den Tieren der 75 mg/kg Gruppe traten nach 7 Injektionen die ersten Todesfälle ein, bis nach 13 Tagen alle Tiere bis auf 2 tot waren.
Zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens wurden die üblichen Nährböden verwendet, die Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, wachstumsfördernde Stoffe, Mineralsalze, wie Natriumchlorid, Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Natriumnitrat und erforderlichenfalls eine säurebindende Substanz, wie Kalziumcarbonat, enthalten.
Als Kohlenstoffquellen kommen insbesondere Stärke, Dextrose, lösliche Stärke, Arabinose, Zucker, Rhamnose, Glukose, Fruktose, Maltose, Laktose, Glycerin, Insulin, Galaktose und Dextrin in gereinigter Form oder in Form von Konzentraten, u. zw. in Mengen, die erheblich variieren können, in Betracht. Sie betragen zwecks Erzielung bester Ausbeuten an Antibiotikum etwa 0, 5 - 5, 0 %, berechnet auf das Gesamtgewicht des Nährbodens.
Geeignete Stickstoffquellen, die häufig auch wachstumsfördernde Stoffe enthalten oder zu liefern vermögen, sind z. B. die für die Gewinnung von Antibiotika gebräuchlichen nachfolgend aufgezählten Substanzen : Aminosäuren, Kasein oder Kaseinhydrolysat, Fischmehl, Sojamehl, Fleischextrakt, Leberpresskuchen, Harnstoff, Nitrate, Ammoniumverbindungen, Brennereischlempe, Maisweichwasser, Molken oder Molkenkonzentrate, Mais-bzw. Weizenglutenhydrolysate, Pepton, Schlachthausabfälle, Brauereihefe, Baumwollsaatmehl, Lactalbumin und Trypton.
Diese eiweisshaltigen Bestandteile brauchen nicht in hochgereinigter Form zugesetzt zu werden. Es hat sich vielmehr herausgestellt, dass auch weniger reine Materialien Verwendung finden können, zumal diese häufige Spuren von wachstumsfördernden Stoffen und erhebliche Mengen an Mineralstoffen enthalten. Wegen der undefinierten Natur vieler dieser Stickstoff liefernden Materialien ist es natürlich nicht möglich, genau bestimmte Angaben über die zuzusetzenden Mengen zu machen. In den meisten Fällen hat sich ein Zusatz an diesen stickstoffhaltigen Stoffen von etwa 0, Ibis 5, 0 Gew.-'%), auf Festsubstanz berechnet, zu dem Nährboden als brauchbar erwiesen.
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EMI6.1
von 3 bis 5 Tagen erzielt, je nach den Bedingungen, unter denen der Streptomyces BL-678506 gezüchtet wird.
Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung.
Beispiel l : Zur Herstellung von Thiactin im Laboratoriumsmassstab wird die Fermentierung in Schüttelflaschen durchgeführt, die mit Watte- oder Gazestopfen, welche der Luft freien Zutritt gewähren, gegen Verunreinigungen geschützt sind. Der Streptomyces BL-678506-Stamm wird im submersen Kulturvertahren in einer geeigneten Nährlösung gezüchtet, wobei die Kultur auf einer hin-und hergehenden
EMI6.2
EMI6.3
<tb>
<tb> Dadurch1, <SEP> 0 <SEP> % <SEP> Maltose, <SEP>
<tb> 1, <SEP> 5 <SEP> % <SEP> Monokaliumphosphat, <SEP>
<tb> 0, <SEP> 5 <SEP> % <SEP> Diammoniumphosphat,
<tb> 0, <SEP> 5 <SEP> % <SEP> Natriumchlorid,
<tb> 0,0000033 <SEP> % <SEP> Manganchlorid <SEP> (MnCl4.4HnO0,
<tb> 0, <SEP> 0000033 <SEP> % <SEP> Kupfersulfat <SEP> (CuS04. <SEP> 5H20), <SEP>
<tb> 0, <SEP> 005 <SEP> % <SEP> Zinksulfat <SEP> (ZnSO.
<SEP> 7H <SEP> 0), <SEP>
<tb> 0, <SEP> 5 <SEP> % <SEP> Pepton <SEP> und
<tb> 0, <SEP> 5 <SEP> % <SEP> Rindfleischextrakt
<tb>
enthält, in Vierliterflaschen unter Druck sterilisiert und danach mit etwa 1 VoL-% einer trüben wässerigen Sporensuspension des neuen Streptomycetenstammes beimpft. Die Sporen werden Schrägagarrohrehen entnommen. Der pH-Wert der Nährlösung soll zu Beginn der Gärung bei 6, 0-6, 2 liegen. Die Kulturen werden dann 48 Stunden lang unter Schütteln auf 26-28 C gehalten. Die Schüttelmaschine soll so arbeiten, dass pro Minute 130 Hin- oder Hergänge, jeder von etwa 33 mm Länge, erfolgen. Bei Beendigung des Verfahrens wird die Gärflüssigkeit nach dem Diffusionsplattentest auf antibiotische Wirksamkeit geprüft.
Sie zeigt nach dreifacher Verdünnung eine Hemmungszone von etwa 17, 7 mm. Das in der Gärflüssigkeit enthaltene Thiactin kann nach den Angaben in den nachfolgenden Beispielen isoliert werden.
Beispiel 2: Zur Gewinnung von Thiactin in grösseren Massstab wird eine Impfkultur wie folgt hergestellt. Die Gärflüssigkeit enthält
EMI6.4
<tb>
<tb> 1, <SEP> 0 <SEP> Gew.- <SEP> o <SEP> Maltose,
<tb> 1, <SEP> 5 <SEP> Gew.-% <SEP> Monokaliumphosphat, <SEP>
<tb> 0,5 <SEP> Gew. <SEP> -% <SEP> Diammoniumphosphat,
<tb> 0, <SEP> 5 <SEP> Gew.- <SEP> Natriumchlorid, <SEP>
<tb> 0,0000033 <SEP> Gew.-% <SEP> Manganchlorid <SEP> (MnCl2.4H2O),
<tb> 0, <SEP> 0000033 <SEP> Gew.-% <SEP> Kupfersulfat <SEP> (CuSO. <SEP> 5H <SEP> 0),
<tb> 0, <SEP> 005 <SEP> Gew.-% <SEP> Zinksulfat <SEP> (ZnSO. <SEP> 7H <SEP> 0), <SEP>
<tb> 0, <SEP> 5 <SEP> Gew.-% <SEP> Peptonund <SEP>
<tb> 0,5 <SEP> Gew. <SEP> -% <SEP> Rindfleischextrakt.
<tb>
2, 500 cm3 dieser Lösung werden in einer Zehnliterflasche bei 118-120 C l Stunde lang dampfsterilisiert. Nach dem Abkühlen wird die Nährlösung mit etwa 0, 5 Vol.-% einer trüben wässerigen Sporensuspension des Streptomycetenstarrmes aus einem Schrägagarröhrchen beimpft. Die Kultur wird dann 72 Stunden lang bei 26 - 280 C auf einer hin-und hergehenden Schüttelmaschine bebrütet, wobei sterile Luft über die Flüssigkeitsoberfläche geblasen wird. Danach wird die Tmpfkultur unter streng aseptischen Bedingungen in den Gärbottich übergeführt. Gegebenenfalls kann die Garflüssigkeit auch, wie weiter unten beschrieben, aufgearbeitet und Thiactin daraus isoliert werden.
Beispiel 3 : Thiactin, das von Streptomyces BL-678506 erzeugte Antibiotikum, kann im Grossbetrieb durch Züchtung im Submersverfahren erzeugt wer Jen. Für diesen Zweck haben sich stationäre Gär bottiche, die mit geeigneten Rühr- und Belüftungsvorrichtungen versehen sind, als geeigneterwiesen.
Eine Nährlösung, die
1, 0 % Maltose, 1, 5 % Monokaliumphosphat,
0, 5 % Diammoniumphosphat, 0, 5 % Natriumchlorid,
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0000033 %0, 5 % Rindfleischextrakt enthält und mit Wasser auf etwa 5670 1 aufgefüllt ist, wird ir. einem mit Glas ausgekleideten Gärbottich von 7500 1 Inhalt, der mit einem Kühlwassermantel zur Temperaturkontrolle, einem geeigneten Rührer aus rostfreiem Stahl und einer geeigneten Luftverteilungsvorrichtung versehen ist, durch Erhitzen mit Dampf unter Druck sterilisiert und dann gekühlt. Nach der Sterilisierung soll der PH- Wert der Nährlösung etwa 6, 2 betragen. Sie wird dann mit 15 Vol. -0/0 einer vegetativen Kultur des Mikroorganismus beimpft.
Diese wird vorher in einem ähnlichen Gärbottich durch Beimpfung mit der in Beispiel 2 beschriebenen Impfkultur oder mit im Laboratorium hergestelltem Impfmaterial gewonnen. Die Kultur in dem 7500-1Gärbottich wird bei einer Temperatur von etwa 280 C 3 - 4 Tage lang gehalten und dabei sterile Luft mittels eines Ventilators, der mit einer Geschwindigkeit von 90 Umdrehungen pro Minute rotiert, durch den Verteiler in einer Menge von etwa 2, 2mSpro Minute in die Nährlösung geblasen. Bei Beendigung des Verfahrens enthält die Kulturflüssigkeit normalerweise genügend antibiotische Wirkstoffe, um bei Verdünnung um das Vierfache im Diffusions2lattentest eine Hemmungszone von etwa 17 mm Durchmesser zu erzeugen ; Thiactin wird aus der Kulturflüssigkeit, wie weiter unten beschrieben, isoliert.
Weitere geeignete Nährlösungen zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens sind die im folgenden aufgezählten :
EMI7.2
<tb>
<tb> a) <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> % <SEP> Weizengluten,
<tb> 1, <SEP> 0 <SEP> % <SEP> Glycerin,
<tb> 0, <SEP> 5 <SEP> % <SEP> Natriumchlorid, <SEP>
<tb> 0, <SEP> 050/0 <SEP> lösliche <SEP> Brennereiabfälle,
<tb> 0, <SEP> 1 <SEP> % <SEP> Kalziumcarbonat, <SEP> mit <SEP> Wasser <SEP> auf
<tb> 100 <SEP> % <SEP> aufgefüllt.
<tb> b) <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> % <SEP> Baumwollsaatmehl,
<tb> 1, <SEP> 0 <SEP> % <SEP> Glukose,
<tb> 0, <SEP> 050/0 <SEP> lösliche <SEP> Brennereiabfälle,
<tb> 0, <SEP> 5 <SEP> % <SEP> Natriumchlorid,
<tb> 0, <SEP> 1 <SEP> % <SEP> Kalziumcarbonat, <SEP> mit <SEP> Wasser <SEP> auf
<tb> 100 <SEP> % <SEP> aufgefüllt.
<tb> c) <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> % <SEP> Maisweichwasser,
<tb> 1,
0 <SEP> % <SEP> Glukose,
<tb> 0, <SEP> 5 <SEP> % <SEP> Natriumchlorid, <SEP>
<tb> 0,1 <SEP> % <SEP> Kalziumcarbonat, <SEP> mit <SEP> Wasser <SEP> auf
<tb> 100 <SEP> In <SEP> aufgefüllt.
<tb> d) <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> % <SEP> Sojabohnenmehl, <SEP>
<tb> 1, <SEP> 0 <SEP> % <SEP> Glukose,
<tb> 0, <SEP> 5 <SEP> % <SEP> Natriumchlorid, <SEP>
<tb> 0, <SEP> 05% <SEP> Hefeextrakt,
<tb> 0, <SEP> 1 <SEP> % <SEP> Kalziumcarbonat, <SEP> mit <SEP> Wasser <SEP> auf
<tb> 100 <SEP> % <SEP> aufgefüllt.
<tb> e) <SEP> 3, <SEP> 0 <SEP> % <SEP> Sojamehl, <SEP>
<tb> 0, <SEP> 5 <SEP> % <SEP> Maisstärke,
<tb> 0, <SEP> 1 <SEP> % <SEP> enzymatisches <SEP> Kasein-Abbauprodukt,
<tb> 0, <SEP> 3 <SEP> % <SEP> Natriumnitrat,
<tb> 0, <SEP> 5 <SEP> % <SEP> Kalziumcarbonat, <SEP> mit <SEP> Wasser <SEP> auf
<tb> 100 <SEP> % <SEP> aufgefüllt.
<tb> f) <SEP> 1,
<SEP> 0 <SEP> % <SEP> enzymatisches <SEP> Kasein-Abbauprodukt,
<tb> 1,0 <SEP> % <SEP> Glukose,
<tb> 0,5 <SEP> % <SEP> Hefeextrakt,
<tb> 0, <SEP> 5 <SEP> % <SEP> Natriumchlorid,
<tb> 0, <SEP> 1 <SEP> % <SEP> Kalziumcarbonat, <SEP> mit <SEP> Wasser <SEP> auf
<tb> 100 <SEP> % <SEP> aufgefüllt.
<tb>
<Desc/Clms Page number 8>
EMI8.1
<tb>
<tb> g) <SEP> 1,0 <SEP> % <SEP> Kohlchydrat,
<tb> 1, <SEP> 0 <SEP> % <SEP> Maisweichwasser,
<tb> 0, <SEP> 5 <SEP> % <SEP> Natriumchlorid,
<tb> 0, <SEP> 5 <SEP> % <SEP> Diammoniumphosphat,
<tb> 1, <SEP> 5 <SEP> % <SEP> Monokaliumphosphat, <SEP>
<tb> 0,0000033 <SEP> % <SEP> Manganchlorid <SEP> (MgCl2.4H2O),
<tb> 0, <SEP> 0000033 <SEP> % <SEP> Kupfersulfat <SEP> (CuSO. <SEP> 5H20), <SEP>
<tb> 0, <SEP> 005 <SEP> % <SEP> Zinksulfat <SEP> (ZnSo4.7H2O).
<tb>
Der Anfangs-pH-Wert dieser Nährlösung liegt bei 6, 0-6, 2.
Nach 96-stündigem Rühren und Belüftung unter aseptischen Bedingungen werden mit den in der folgenden Tabelle angegebenen Kohlehydraten die ebenfalls angegebenen Mengen an Thiactin erhalten, wobei zum Schluss der Vergärung die nachstehenden PH-Werte gemessen wurden
Tabelle V
EMI8.2
<tb>
<tb> Kohlehydrat <SEP> Gehalt <SEP> an <SEP> Thiactin <SEP> End-pH-Wert:
<tb> @/cm3 <SEP> :
<tb> Maltose <SEP> 83 <SEP> 5, <SEP> 6 <SEP>
<tb> Rohrzucker <SEP> 48 <SEP> 5, <SEP> 5 <SEP>
<tb> Dextrose <SEP> 32 <SEP> 5, <SEP> 5 <SEP>
<tb> Glycerin <SEP> 18 <SEP> 5, <SEP> 2 <SEP>
<tb> Laktose <SEP> 37 <SEP> 5, <SEP> 6- <SEP>
<tb> D-Galaktose <SEP> 55 <SEP> 5, <SEP> 5 <SEP>
<tb> Polysaccharide <SEP> 144 <SEP> 5, <SEP> 9 <SEP>
<tb> Dextii-Maltose <SEP> 73 <SEP> 5, <SEP> 8 <SEP>
<tb>
Dextri-Maltose ist eine Mischung von Maltose und Dextrinen, wie sie durch enzymatische Einwirkung von Gerstenmalz auf Maismehl erhalten wird.
EMI8.3
<tb>
<tb> h) <SEP> 3, <SEP> 0 <SEP> % <SEP> Polysaccharide,
<tb> 3, <SEP> 0 <SEP> % <SEP> Maisweichwasser,
<tb> 1, <SEP> 0 <SEP> % <SEP> Brauereihefe,
<tb> 0, <SEP> 7 <SEP> % <SEP> Dikaliumphosphat,
<tb> 0, <SEP> 2 <SEP> % <SEP> Magnesiumsulfat <SEP> (MgSO.
<SEP> 7H <SEP> 0), <SEP>
<tb> 0, <SEP> 5 <SEP> % <SEP> Natriumchlorid.
<tb>
Anfangs-pH-Wert=6,0-6,2.
Gehalt an Thiactin nach 96 Stunden = 253y/cm3, End-pH-Wert=7,6.
EMI8.4
<tb>
<tb> i) <SEP> 3, <SEP> 0 <SEP> % <SEP> Polysaccharide,
<tb> 3, <SEP> 0 <SEP> % <SEP> Maisweichwasser, <SEP>
<tb> 0,75% <SEP> Brauereihefe,
<tb> 0,25% <SEP> Ferrosulfat <SEP> (FeSO4.7H2O),
<tb> 0, <SEP> 2 <SEP> % <SEP> Magnesiumsulfat <SEP> (MgSO. <SEP> 7H20), <SEP>
<tb> 0, <SEP> 5 <SEP> % <SEP> Natriumchlorid,
<tb> 0,625 <SEP> % <SEP> Kalziumcarbonat.
<tb>
Gehalt an Thiactin nach 120 Stunden 341 y/cm3.
End-PH-Wert= 7, 5.
EMI8.5
<tb>
<tb> j) <SEP> 3, <SEP> 0 <SEP> % <SEP> Kohlehydrat,
<tb> 3, <SEP> 0 <SEP> % <SEP> Maisweichwasser,
<tb> 0, <SEP> 75% <SEP> Brauereihefe,
<tb> 0, <SEP> 7 <SEP> % <SEP> Dikaliumphosphat,
<tb> 0, <SEP> 2 <SEP> % <SEP> Magnesiumsulfat <SEP> (MgSO. <SEP> 7HO), <SEP>
<tb> 0, <SEP> 5 <SEP> % <SEP> Natriumchlorid.
<tb>
EMI8.6
<Desc/Clms Page number 9>
Tabelle VI
EMI9.1
<tb>
<tb> Kohlehydrat <SEP> Gehalt <SEP> an <SEP> Thiactin <SEP> in <SEP> End-pH-Wert
<tb> y/cm3 <SEP> nach <SEP> 96 <SEP> Stunden <SEP> :
<SEP>
<tb> Polysaccharide <SEP> 340 <SEP> 7, <SEP> 2 <SEP>
<tb> Lösliche <SEP> Maisstärke <SEP> 242 <SEP> 7, <SEP> 0 <SEP>
<tb> k) <SEP> 3, <SEP> 0 <SEP> % <SEP> Polysaccharide, <SEP>
<tb> 1, <SEP> 0 <SEP> % <SEP> Stickstoff <SEP> liefernder <SEP> Zusatz,
<tb> 0, <SEP> 7 <SEP> % <SEP> Dikaliumrhosphat, <SEP>
<tb> 0, <SEP> 2 <SEP> % <SEP> Magnesiumsulfat <SEP> (MgSO. <SEP> 7H <SEP> 0), <SEP>
<tb> 0, <SEP> 5 <SEP> % <SEP> Natriumchlorid. <SEP>
<tb>
Anfangs-PH-Wert= 6, 0 - 6, 2.
Tabelle VII
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<tb>
<tb> Stickstoff <SEP> liefernder <SEP> Gehalt <SEP> an <SEP> Thiactin <SEP> in <SEP> End-pH-Wert:
<tb> , <SEP> Zusatz <SEP> : <SEP> y/cm3 <SEP> nach <SEP> 96 <SEP> Stunden <SEP> : <SEP>
<tb> Wilsons <SEP> Proto <SEP> Pepton
<tb> Nr. <SEP> 366 <SEP> 76 <SEP> 5, <SEP> 7 <SEP>
<tb> 'Stamino <SEP> Typ <SEP> A <SEP> 22 <SEP> 5, <SEP> 9 <SEP>
<tb> Blutmehl <SEP> 17 <SEP> 6, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Dracketts <SEP> Protein <SEP> Nr. <SEP> 220 <SEP> 56 <SEP> 6, <SEP> 2 <SEP>
<tb>
EMI9.3
<Desc/Clms Page number 10>
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in dieses Konzentrat eingerührt und die Mischung über Nacht in der Kälte stehen gelassen. Dabei fallen 3, 02 g festes Thiactin aus, die abfiltriert werden.
Austestung einer Lösung von 1 mg dieser Verbindung im Kubikcentimeter im Plattentest gegen B. subtilis bei einem PH von 6, 2 ergibt im allgemeinen bei vierfacher Verdünnung eine Hemmungszone von 18, 2 mm und bei sechsfacher Verdüsung eine Hemmungszone von 16, 2 mm. Dieses Produkt soll als Produkt 3 - 4 bezeichnet werden.
1 g dieses festen Thiactins wird in 40 cms Chloroform gelöst. Die Lösung wird filtriert, auf eine chromatographische Säule von 150 g Aluminiumoxyd gegeben und mit Chloroform gewaschen. Nach Auffangen von 310 cms Eluat wird die Säule mit Chloroform entwickelt, das 2, 5 % Methanol enthält. Zwei getrennte Zonen werden mit diesem Lösungsmittelgemisch entwickelt. Die erste Zone wird durch Passieren von weiteren 190 cm Eluat eluiert und liefert Eluat A. Die nächsten 70 cm3 Eluat werden verworfen und die zweite Zone wird in den folgenden 50 cm3 Eluat als Eluat B gewonnen.
Eluat A wird nach Zusatz von 3 cm3 tertiärem Butylalkohol im Vakuum destilliert, bis Chloroform und Methanol völlig abdestilliert sind und nur noch tertiärer Butylalkohol im Destillationsgefäss verbleibt. Das
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subtilisbezeichnet.
Eluat B wird in der gleichen Weise wie Eluat A in 6 cm3 tertiären Butylalkohol übergeführt. Durch Zusatz von 60 cm Petroläther vom Siedepunkt 60 - 710 C {Skellysolve B) werden 110 mg festes Thiactin ausgefällt und durch Filtration gewonnen. Eine Probe dieser Fraktion von 1 mg im cm3 ergibt im allgemeinen bei sechzehnfacher Verdünnung bei der Austestung gegenüber B. subtilis bei einem PH von 6, 2 eine Hemmungszone von 15, 4 mm. Diese Fraktion wird als Produkt 3-6 bezeichnet.
1, 3 g festes Thiactin (Produkt 3-4) werden in 50 cms Chloroform eingerührt, ein unlöslicher Rück- stand von 210 mg wird durch Filtration entfernt und das Filtrat lässt man eine chromatographische Säule mit 120 g Aluminiumoxyd passieren.Die Säule wird dann nacheinander mit 320 cm Chloroform 300cms Chloroform, enthaltend 1,5% Methanol, 100 cm3 Chloroform, enthaltend 2, 5% Methanol, entwik- kelt, und schliesslich mit Chloroform, enthaltend 5% Methanol, eluiert. Eine rötliche Zone wird dabei gebildet und 200 cm gelbes Eluat werden aufgefangen, bis die Zone bei ihrer Abwärtswanderung das untere Ende der Säule erreicht hat.
Die darauffolgenden 85 ems Eluat werden getrennt aufgefangen und mit 155 cm3 Eluat vereinigt, das durch erneute Entwicklung der Säule mit Chloroform, enthaltend 25 % Methanol, gewonnen wird. Diese beiden vereinigten Eluate werden, wie oben beschrieben, in tertiären Butylalkohol übergeführt. Die so erhaltene Lösung in tertiärem Butylalkohol wird lyophilisiert und ergibt 230 mg festes Thiactin, das als Produkt 3 - 7 bezeichnet wird. Ein Muster dieses Produktes von 1 mg im cms ergibt im allgemeinen bei vierfacher Verdünnung gegenüber B. subtilis bei
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Das gemäss der oben beschriebenen Arbeitsweise gewonnene Thiactin kann eindeutig durch sein "Aktivitätsspektrum", d. h. durch sein Wanderungsvermögen bzw. seine Rr-Werte, charakterisiert werden.
Zur Bestimmung des Rf-Spektrums von Thiactin wurden je 0, 005 cms einer Lösung von 5 mg des Antibiotikums in 1 ems auf jedem Papierstreifen als Testlösung aufgebracht und die Streifen wurden nach Entwicklung in den nachstehend angeführten 12 Lösungsmitteln gegen B. subtilis auf Agar vom PH 6, 2 ausgetestet.
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:D : Mit Wasser gesättigtes Butanol.
E : Trockenes Methylisobutylketon.
F : Mischung von 100 Teilen 80 %igem Methanol und 10, 5 Teilen Piperidin, die mit Essigsäure auf
EMI10.5
5H : Mit Wasser gesättigtes Butanol, das 2 % p-Toluolsulfosäure enthält.
I : Mischung von 100 cms mit Wasser gesättigtem Butanol und 5 ems Eisessig.
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J : Mit Wasser gesättigtes Butanol, das 2 % p-Toluolsulfosäure und 2 % Piperidin enthält.
K : 100 Teile mit Wasser gesättigtes Butanol, das 2 g p-Toluolsulfosäure, 2 cm* Piperidin und 2 g
Laurinsäure enthält.
L : Mischung von 2 Teilen Isoamylalkohol und 1 Teil Chloroform, gesättigt mit wässeriger 10% iger
Natriumcitratlösung. In diesem Falle werden die Papierstreifen mit einer wässerigen 10 %igen
Natriumcitratlösung, die mit Zitronensäure auf einen PH von 5, 4 eingestellt war, gesättigt und getrocknet, bevor das zu untersuchende Muster aufgebracht wird.
Die folgende Tabelle VIII gibt das Ergebnis wieder, das mit diesen verschiedenen. Lösungsmitteln und Thiactin erhalten wurde.
Tabelle VIII
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<tb>
<tb> Lösungsmittel <SEP> : <SEP> A <SEP> B <SEP> C <SEP> D <SEP> E <SEP> F <SEP> G <SEP> H <SEP> I <SEP> J <SEP> K <SEP> L
<tb> Rf-Wert <SEP> 1,2 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 8,9,10 <SEP> 1-4 <SEP> - <SEP> 4-8 <SEP> 10 <SEP> 8-10 <SEP> 10 <SEP> 10 <SEP> 9, <SEP> 10
<tb>
Thiactin zersetzt sich im Lösungsmittelgemisch F und neigt auch in den Lösungsmittelgemischen H, J und K zur Zersetzung.
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der Agarplatten dargestellt, wie sie bei der Bestimmung des Rf-Spektrums von Thiactin in der oben beschriebenen Weise erhalten werden. Die Zeichnungen zeigen die Lage der Papierstreifen auf den Agar- platten und die Punkte oder Flaschen, an denen das Thiactin seine antibakterielle Wirksamkeit ausübt.
Der Papierstreifen, wie er ursprünglich aufgehängt war, ist dargestellt von rechts oben nach unten und dann fortgesetzt von links oben nach unten ; denn die Streifen müssen vor dem Auflegen auf die Agarschalen in der Mitte zerschnitten werden, da sie fast zweimal so lang sind wie die Schalen. Die erhaltenen Rf-Werte und die oben angegebenen Buchstabenbezeichnungen der verwendeten Lösungsmittelsy-
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:phat und 0,45 % schaumverhinderndes Mittel, aerob gezüchtet, wobei auf 1 Vohimen Nährflüssikeit ein Volumen Luft je Minute verwendet wird. Der pH-Wert der Gärflüssigkeit beträgt nach 25 Stunden 6, 0, nach 50 Stunden 6 1 und am Schluss der Gärung 6, 3.
Zu 380 1 der Gärflüssigkeit, die bei der Austestung, wie oben beschrieben, bei vierfacher Verdünnung eine Hemmungszone von 14, 0 mm zeigt, werden nach dem Filtrieren 20 kg Diatom-senerde (Dicalite) hinzugesetzt. Das Filtrat wird dann mit 75 1 Methylisobutylketon extrahiert.
Der Methylisobutylextrakt wird abgetrennt und durch Vakuumdestillation auf 200 cd eingedampft.
Dieses Konzentrat wird in 2, 5 1 Petroläther vom Siedepunkt 60 - 71 C (Skellysolve B) eingerührt. Beim Stehenlassen über Nacht fällt fesees, gelblichbraunes, nicht hygroskopisches Thiactin aus. Nach dem Abfiltrieren werden 1, geines Produktes erhalten, von dem eine Probe von 1 mg gelöst in 1 cm'50 tigem wässerigem Butanol bei sechzehnfacher Verdünnung bei der Austestung gegenüber B. subtilis bei einem
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Methylisobutylketon extrahiert. Der Methylisobutylketonextrakt wird abgetrennt und auf 11 eingedampft.
Weitere Mengen an Methylisobutylketon werden zum Konzentrat hinzugesetzt und die Lösung wird durch azeotrope Destillation vom Wasser befreit, auf ein Volumen von 200 cm3 eingedampft und in 1. 5 1 Pe- troläther vom Siedepunkt 60 - 710 C (Skellysolve B) eingerührt. Festes, gelblichbraunes Thiactin fällt dabei aus und wird abfiltriert (3, 9 g). Eine Probe von 1 mg dieses Thiactins pro cm wird nach sechzehnfacher Verdünnung gegenüber B. subtilis bei einem PH von 6, 2 ausgetestet und zeigt eine Hemmungszone von 20, 4 mm. Das so erhaltene Thiactin wird als Produkt 5 - 9 bezeichnet.
Beispiel 7 : Thiactin von beliebigem Reinheitsgrad wird in sein Hydrochlorid übergeführt, indem man einer Suspension der Verbindung in Wasser so viel Salzsäure zusetzt, dass eine klare Lösung entsteht und der PH-Wert unter 3-4 erniedrigt ist. Die so erhaltene Lösung gibt bei der Gefriertrocknung ein leicht lösliches Pulver.
In ähnlicher Weise werden z. B. das Thiactinsulfat und sein Phosphat, aber auch andere Salze mit anorganischen und organischen Säuren erhalten.
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Beispiel 8 : Thiactin von beliebigem Reinheitsgrad wird in sein Natriumsalz übergeführt, indem man einer Suspension der Verbindung Natronlauge zusetzt, bis der pH-Wert 9, 5 überschreitet. Die Lösung wird dann der Gefriertrocknung unterworfen, wobei das trockene Natriumsalz in Form eines stabilen, wasserlöslichen Pulvers erhalten wird.
In ähnlicher Weise lassen sich andere Metallsalze gewinnen, z. B. das KaMumsalz.
Beispiel 9 : 4100 cm3 Thiactin enthaltende Gärflüssigkeit, die wie oben beschrieben erhalten wird und bei 64-facher Verdünnung eine Hemmungszone von 14, 5 mm ergibt, werden mit dem gleicher.
Volumen Methylisobutylketon extrahiert und durch Diatomeenerde (Dicalite) filtriert. Der Methylisobutylketonextrakt wird abgetrennt und durch Vakuumdestillation auf ein Volumen von etwa 45 cm3 eingedampft. Beim Abkühlen fallen 200 mg kristallines Thiactin aus, die abfiltriert werden. Eine Probe von 0, 25mgpro cms 50% igemwässerigcmMethanol ergibt bei sechzehnfacher Verdünnung bei der Austestung gegenüber B. subtilis eine Hemmungszone von 14, 7 mm.
Beispiel 10 : 4000 ems wie oben gewonnene Thiactin enthaltende Gärflüssigkeit werden mit dem gleichen Volumen Methylisobutylketon extrahiert und durch Diatomeenerde (Dicalite) filtriert. Der Methylisobutylketouextrakt wird abgetrennt und durch Vakuumdestillation auf ein Volumen von etwa 20 cm3 eingedampft. Beim Abkühlen kristallisieren 198 mg Thiactin aus, die abfiltriert, mit Äther gewaschen und an der Luft getrocknet werden. Eine Lösung von 0, 5 mg dieses Produktes in 50 UJoigem wässerigem Formamid ergibt bei der Austestung einen Gehalt von 1280 -1350 y/mg im Vergleich zu einem Standardmuster (Produkt 5-9), das nach Beispiel 6 erhalten wird und für das willkürlich ein Gehalt von 1000 y/mg festgesetzt wurde.
Dieses Standardmuster ergibt in einer Probe von 1 mg/cm3 bei sechzehnfacher Ver-
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2form gelöst. Etwa 18 mg in Chloroform unlösliches Material werden durch Filtration entfernt, worauf dem Filtrat das gleiche Volumen Methylisobutylketon zugesetzt wird. Dann verdampft man in einem Luftstrom etwa die Hälfte, wobei Thiactin auszufallen beginnt. Es wird durch Erhitzen auf etwa 40 - 450 C für etwa 4 Minuten in kristalline Form übergeführt. Darauf wird das Volumen der Mischung weiterhin auf etwa 8 cm reduziert. 156 mg kristallines Thiactin werden abfiltriert, mit Äther gewaschen, an der Luft getrocknet und erneut in der gleichen Weise umkristallisiert. Man erhält schliesslich 114 mg kristallines Thiactin, das sich beim Erhitzen auf etwa 2200 C dunkel färbt und bei etwa 223 - 2310 C schmilzt.
Dieses Produkt zeigt einen Thiactingehalt von 2800 y/mg im Vergleich zu dem Standardmuster (Produkt 5 - 9).
Thiactin ist zu mehr als 2-5 mg/cm3 löslich in Formamid, Chloroform, Äthylenglykolmonomethyl- äther (Methyl-Ce11osolve), warmem Butanol, warmem Dioxan und heissem Amylalkohol und zu weniger als 2-5 mg/cm löslich in heissem Aceton, heissem Benzol, heissem Amylacetat, heissem Äthylacetat, heissem Dimethoxyäthan, heissem Dimethoxydiäthylenglykol, Äthanol und 0, 1 n Salzsäure.
Tabelle IX zeigt den Schmelzpunkt von Proben des Thiactins, die im Vakuum 2 Stunden lang bei
600 C über Phosphorpentoxyd getrocknet waren, und von nicht getrockneten Proben, sowie von getrockneten, in einer evakuierten Kapillare eingeschlossenen Proben.
Tabelle IX
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<tb>
<tb> Probe <SEP> : <SEP> Dunkelfärbung <SEP> bei <SEP> : <SEP> Schmelzpunkt <SEP> : <SEP>
<tb> Getrocknet <SEP> 2050 <SEP> C <SEP> 223 <SEP> - <SEP> 2350 <SEP> C <SEP>
<tb> nicht <SEP> getrocknet <SEP> 2050 <SEP> C <SEP> 220 <SEP> - <SEP> 2350 <SEP> C <SEP>
<tb> eingeschlossen, <SEP> evakuiert <SEP> 2240 <SEP> C <SEP> 226 <SEP> - <SEP> 2350 <SEP> C <SEP>
<tb>
Die chemische Analyse des Thiactins zeigt folgende Werte. Zum Vergleich werden die Daten für Sulfactin, dessen Herstellung im"Journ. Biol. Chem.", Band 168, Nr. 2 vom Mai 1947 beschrieben ist, und für Phalamycin, dessen Herstellung in"Antibiotics and Chemotherapy", Band 3, Nr. 8, Seite 818 vom August 1953 beschrieben ist, angegeben.
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<tb>
<tb>
Thiactin <SEP> : <SEP> Sulfactin <SEP> : <SEP> Phalamycin <SEP> : <SEP>
<tb> 0/0 <SEP> C <SEP> : <SEP> 51, <SEP> 8 <SEP> ; <SEP> 52, <SEP> 2 <SEP> ; <SEP> 51, <SEP> 7 <SEP> 50, <SEP> 3 <SEP> 53, <SEP> 5 <SEP>
<tb> 0/0 <SEP> H <SEP> : <SEP> 5, <SEP> 56 <SEP> ; <SEP> 5, <SEP> 66 <SEP> ; <SEP> 5, <SEP> 57 <SEP> 6, <SEP> 0 <SEP> 5, <SEP> 45 <SEP>
<tb> % <SEP> N <SEP> : <SEP> 18, <SEP> 1 <SEP> ; <SEP> 15, <SEP> 3 <SEP> ; <SEP> 16,4 <SEP> 17, <SEP> 2 <SEP> 13, <SEP> 65 <SEP>
<tb> % <SEP> S <SEP> : <SEP> 10, <SEP> 1 <SEP> ; <SEP> 9, <SEP> 2 <SEP> ; <SEP> 9,3 <SEP> 14, <SEP> 1 <SEP> 5, <SEP> 11 <SEP>
<tb> Halogen <SEP> : <SEP> nicht <SEP> vorhanden
<tb> Phosphor <SEP> : <SEP> nicht <SEP> vorhanden
<tb> % <SEP> Verbrennungsrückstand <SEP> : <SEP> 0, <SEP> 57 <SEP> ; <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> ; <SEP> 0, <SEP> 1
<tb> % <SEP> Flüchtige
<tb> Bestandteile <SEP> : <SEP> 6, <SEP> 65 <SEP> ;
<SEP> 8, <SEP> 56 <SEP> : <SEP> 4, <SEP> 42. <SEP>
<tb>
Das spezifische Drehungsvermögen von Thiactin nach zweistündigem Trocknen im Vakuum bei 600C
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zu Kügelchen erhalten wird, zeigt im Infrarotspektrum viele charakteristische Absorptionsbande. Unter diesen seien besonders die Absorptionsbande der folgenden Wellenlängen (in J. l) genannt : 2, 98 ; 3, 37 ; 4, 20-4, 28 (breite Bande) ; 6, 05 ; 6, 50-6, 70 (breite Bande) ; 7, 00-7, 10 (Absatz) ; 7, 25 ; 7, 70-7, 95
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der charakteristischen Wellenlängen 5 - 13 J. l ist in der Fig. 3 der beigefügten Zeichnung dargestellt.
Das Ultraviolettabsorptionsspektrum einer Lösung von 20 y Thiactin je cm3 2n-Salzsäure bzw. je cm3 4n-Natronlauge zeigt im Bereich von 200 m l bis 400 mJ.'kein Maximum. Im Bereich von 300 my findet sich anscheinend ein schwacher Absatz.
Wird eine Suspension von Thiactin in Wasser zum Sieden erhitzt und etwa 1 Minute im Sieden gehalten, so zeigt sich bei der Testung des daraus wiedergewonnenen Thiactins kein Wirksamkeitsverlust.
Wird eine Lösung von Thiactin in 6n-Salzsäure über Nacht bei 100 C sowie im zugeschmolzenen Glasrohr bei 150 C erhitzt, so ergeben die Hydrolysate einen positiven Ninhydrintest. Durch papierchromatographische Analyse der Hydrolysate kann die Anwesenheit von Cystin oder Cystein, Threonin, Alanin, Glycin und eines Leucins festgestellt werden. Andere Aminosäuren sind möglicherweise ebenfalls zugegen. Leucine finden sich nicht in Phalamycin.
Die folgenden Verfahren haben sich als besonders brauchbar für die Gewinnung von Thiactin aus seinen Lösungen, z. B. auch aus Gärflüssigkeiten, erwiesen.
1) Extraktion der Lösung bei tiefer Temperatur mit Methylisobutylketon mit nachfolgender sehr schneller Aufarbeitung des Extraktes, indem man ihr im Vakuum unter Zusatz von Wasser destilliert, bis das ursprünglich vorhandene Lösungsmittel vollkommen abgetrieben ist, und darauffolgender Gefriertrocknung.
2) Adsorption an Aktivkohle (Darco) mit nachfolgender Elution mit kleinen Mengen Elutionsflüssigkeit bei tiefer Temperatur.
3) Man lässt einen kalten Methylisobutylketonextrakt einer Gärfiüssigkeit oder eine Thiactinlösung eine Aluminiumoxydsäule passieren, die danach mit wässerigem tertiärem Butylalkohol eluiert wird.
4) Extraktion einer Thiactin16sung oder der Gärflüssigkeit mit Methylisobutylketon mit nachfolgender Überführung des Thiactins in tertiären Butylakohol durch Destillation des Extraktes im Vakuum unter Zusatz von tertiärem Butylalkohol, bis das ursprünglich vorhandene Methylisobutylketon vollständig abdestilliert ist, und nachfolgender Gefriertrocknung.
5) Extraktion der Gärflüssigkeit oder einer Thiactinlösung mit Methylisobutylketon mit nachfolgendem Eindampfen auf ein kleines Volumen und Ausfällung des Thiactins durch Zusatz eines niederen Alkans (Petroläther von der Art des Skellysolve).
6) Vollständige Adsorption von Thiactin aus seiner Chloroformlösung an eine Säule von Aluminiumoxyd mit nachfolgender Elution mittels Methanol-Chloroform - Mischungen (z.B. 5% Methanol, 95% Chloroform).
Kristallines Thiactin, das wie oben beschrieben erhalten wurde. kann wie folgt umkristallisiert werden :
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1) Auflösung in Chloroform in einer Menge von etwa 25 mg/cm3 mit nachfolgender Konzentration auf etwa 1/5 des ursprünglichen Volumens, worauf das so gewonnene Konzentrat im Vakuum unter Zusatz von Methylisobutylketon destilliert wird, bis alles Chloroform abgetrieben ist.
2) Auflösung in Äthylenglykolmonomethyläther (Methyl-Cellosc ? ve) in einer Menge von etwa 20 mg/cm3 durch Erhitzen auf etwa 50 - 550 C für einige Minuten-Abkühlung der erhaltenen Lösung und Zusatz von etwa 10 bis 50 Viol.-'%) Wasser.
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einige Minuten mit nachfolgendem Zusatz von etwa 7 Vol.-Teilen Wasser zu der erhaltenen Lösung.
4) Auflösung inDioxan in einer Menge von etwa 20 mg/cm3 durch Erwärmen auf etwa 50 - 55 :) C für einige Minuten, Eindampfen der Lösung auf 1/5 ihres Volumens, Abkühlen und Zusatz von Aceton.
In der Gesamtkullur von Streptomyces BL-678506 findet sich der Wirkstoff sowohl in der Lösung als auch im Mycel. Thiactin kann aus beiden gewonnen werden. Die Aufarbeitung und Extraktion der gesamten Kulturmasse und nicht nur die des Filtrates hat sich daher als ein recht brauchbares Verfahren zur Gewinnung von Thiactin erwiesen.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Herstellung eines hochwirksamen Antibiotikums, dadurch gekennzeichnet, dass man Streptomyces BL-678506 (ATCC Nr. 12. 236) oder deren Mutanten in einem wässerigen Nährboden unter aeroben Bedingungen, vorzugsweise 3 - 5 Tage bei einer Temperatur von 24 - 300 C, zweckmässig im submersen Verfahren züchtet, bis der Nährboden erhebliche antibiotische Wirksamkeit aufweist, worauf das so erzeugte Thiactin aus dem Kulturgemisch, insbesondere aus der Gärflussigkeit, isoliert und gegebenenfalls in seine Salze mit Säuren oder Metallen, übergeführt wird.