Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibiotikums Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibiotikums, das im folgenden Cinerubin genannt wird.
Das Antibiotikum Cinerubin entsteht bei der Kul tur einer neuen Aktinomyceten-Art der Gattung Streptomyces, die mit keiner der in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology , 6.
Aufl., oder in Actinomycetes and their Antibioties von Waksman und Lechevalier 1953 aufgeführten Arten identisch ist und im folgenden als Streptomyces cinereoruber (Corbaz et a1.) var. fructofermentans beschrieben wird.
Sie wurde aus einer im Zürcher Zoo gesam melten Bodenprobe isoliert und wird in unseren La boratorien und in der Eidg. Technischen Hochschule, Institut für spezielle Botanik, Zürich, unter der Be zeichnung A 6143 aufbewahrt.
Streptomyces cinereoruber var. fructofermentans bildet ein spärliches Luftmycel, das anfänglich weiss, dann weissgrau und schliesslich aschgrau gefärbt ist. Es hat einzelne, nicht zu Büscheln vereinigte Konidien- ketten, die ein typisches Merkmal der Gattung Strepto- myces sind. Die Sporen sind glatt. Das Substratmycel ist rot und bildet ein lösliches Pigment.
Das Wachstum ist relativ wenig abhängig von der Temperatur, so wohl bei 18 als auch bei 40 entwickelt sich der Pilz gut, doch liegt das Optimum zwischen 25 und 32 .
Zur weiteren Charakterisierung wird im folgenden das Wachstum von Streptomyces cinereoruber var. fructofermentans auf verschiedenen Nährmedien be schrieben. Die Nährmedien 1-7 und 11 wurden nach W. Lindenbein, Arch. Mikrobiol. 17, 361 (1952), her gestellt.
Synthetischer Agar: Wachstum dünn, schleierartig, farblos nach 3 Ta gen, später rosa; Luftmycel staubig, nach 8 Tagen milchweiss oder blasskarmin, nach 14 Tagen asch- grau; ein rosarotes lösliches Pigment wird nach 4 Tagen gebildet.
Synthetische Lösung: Flocken weissgrau bis rosa; Pellikel mit spärli chem weissgrauem Luftmycel; Pigment blass- karmin. Glucose-Agar: Punktförmiges Wachstum, farblos oder stellen weise korallenrot nach 3 Tagen, fleischrot nach 8 Tagen; Luftmycel spärlich, weissgrau nach 8 Ta gen, aschgrau nach 14 Tagen; Substrat fleischrot gefärbt nach 8 Tagen.
Glucose-Asparagin-Agar: Wachstum wie auf Glucose-Agar; Luftmycel stau big, kreideweiss nach 4 Tagen, später weissgrau; blasskarminrotes lösliches Pigment. Calciummalat-Agar: Wie Glucose-Asparagin-Agar. Gelatinestich 18 C: Oberflächliches Wachstum weissgelb bis hellgelb rot; Luftmycel spärlich, weissgrau; lösliches Pig ment intensiv kastanienbraun bis rötlichbraun; Verflüssigung sehr langsam, beginnend nach 34 Tagen, 0,4 cm nach 42 Tagen.
Stärkeplatte: Wachstum punktförmig, farblos; Luftmycel meh lig bestäubt, weissgrau; Stärkehydrolysierung, Spu ren nach 4 Tagen.
Nähragar: Spärliches Wachstum, hellgelb; kein Luftmycel; Pigment schwach, rötlichbraun.
Kartoffeln: Flechtenartiges Wachstum, kupferrot nach 4 Ta gen, bräunlich bis pechschwarz nach 8 Tagen, kein Luftmycel; Substrat blauschwarz gefärbt. Karotten: Flechtenartiges Wachstum, graublau und blass- karmin; Luftmycel nach 8 Tagen sammetig, weiss grau bis aschgrau; Pigment blauschwarz. Lackmusmilch: Ringwachstum, Pellikel hellbraun; Luftmycel spär lich weissgrau; Peptonisierung nach 7 Tagen; keine Gerinnung.
Streptomyces cinereoruber var. fructofermentans wächst, nach der Methodik von T. G. Pridham und D. Gottlieb, J. Bacteriology 56, 107 (1948), unter sucht, bei Verwendung verschiedener Kohlenstoff quellen wie folgt:
L-Xylose + Inulin (-) LrArabinose + D-Mannit + L-Rhamnose (+) D-Sorbit + D-Fruktose + Dulcit (-) D-Galaktose + Mesoinosit + Saccharose (+) Salicin + Maltose + Natriumacetat (-) Lactose + Natriumcitrat (-) Raffinose - Natriumsuccinat (-)
Dabei bedeutet: + gutes Wachstum, sichere Verwendung der betr. Kohlenstoffquelle, (+) schwaches Wachstum, Verwendung der betr. Kohlenstoffquelle fraglich, (-) sehr schwaches Wachstum, Verwendung der betr. Kohlenstoffquelle unwahrscheinlich, - kein Wachstum, keine Verwendung der betr. Kohlenstoffquelle.
Streptomyces cinereoruber var. "fructofermentans stimmt morphologisch gut mit Streptomyces cinereo- ruber (R. Corbaz, L. Ettlinger, W. Keller-Schierlein und H. Zähner, Arch. Mikrob., im Druck) überein, unterscheidet sich aber biologisch von dieser Art durch seine Fähigkeit, verschiedene Kohlenstoff quellen auszuwerten.
Streptomyces cinereoniber var. fructofermentans zeigt weiter gewisse Ähnlichkeiten mit S. purpurascens Lindenbein, welcher aber stachelige Sporen bildet und ein völlig abweichendes Kohlenstoffquellenspektrum zeigt. Letzteres gilt ebenfalls für S. Bobiliae (Waks- man et Curtis) Waksman et Henrici.
Zur Herstellung des Antibiotikums Cinerubin können auch Varianten des Streptomyces cinereo- ruber var. fructofermentans, wie sie z. B. durch Selek- tionierung oder Mutation, insbesondere unter der Ein wirkung von Ultraviolett- oder Röntgenstrahlen oder von Stickstoff-Senfölen gewonnen werden, verwendet werden.
Zur Erzeugung des Antibiotikums Cinerubin wird Streptomyces cinereoruber var. fructofermentans oder dessen Mutanten, vorzugsweise in wässriger, anor ganische Salze, eine Kohlenstoff- und Stickstoffquelle enthaltender Nährlösung, gezüchtet. Das Cinerubin kann auch mit verdünnten Mineralsäuren hydrolysiert werden, wobei Cinerubinon erhalten wird.
Die Nährlösung enthält als anorganische Salze bei spielsweise Chloride, Nitrate, Carbonate, Sulfate von Alkalien, Erdalkalien, Magnesium, Eisen, Zink, Man gan. Als stickstoffhaltige Verbindungen und gege benenfalls zuzusetzende Kohlehydrate und wachs tumsfördernde Stoffe seien z.
B. genannt: Amino- säuren und ihre Gemische, Peptide und Proteine sowie ihre Hydrolysate, wie Pepton oder Trypton, Fleischextrakte, wasserlösliche Anteile von Getreide körnern, wie von Mais und Weizen, von Destilla- tionsrückständen bei der Alkoholherstellung, von Hefe, Bohnen, insbesondere der Sojapflanze, von Sa men, beispielsweise der Baumwollpflanze, ferner Glu- kose, Saccharose, Lactose, Stärke usw.
Die Züchtung erfolgt am besten aerob, also bei spielsweise in ruhender Oberflächenkultur oder vor zugsweise submers unter Schütteln oder Rühren mit Luft oder Sauerstoff in Schüttelflaschen oder den bekannten Fermentern. Als Temperatur eignet sich eine solche zwischen 20 und 40 . Eine wesentliche antibakterielle Wirkung zeigt die Nährlösung dabei im allgemeinen nach 11/.-5 Tagen.
Je nach der Zusammensetzung der verwendeten Nährlösung wird entweder ein Gemisch von Cinerubin A und B oder vorwiegend Cinerubin A oder vor wiegend Cinerubin B produziert. Beispielsweise kann Streptomyces cinereoruber var. fructofermentans auf Nährlösungen gezüchtet werden, die auf 1 Liter Was ser folgende Substanzen enthalten: Nährlösung Nr. 12/4l: Glycerin 20 g, Sojamehl 10 g, Natriumchlorid 5 g, Calciumcarbonat 10 g und Natriumnitrat 1 g.
Nährlösung Nr. 22: Mannit 20 g, Distillers solubles 20 g, Natrium chlorid 3 g und Natriumnitrat 1 g.
Nährlösung Nr. 19: Mannit 20 g und Sojamehl 20 g.
Dabei wird bei der Verwendung von Nährlösung Nr. 19 vorwiegend Cinerubin A gebildet und mit Nährlösung Nr. 12/41 hauptsächlich Cinerubin B. Mit Nährlösung Nr. 22 wird ein Gemisch von Cine- rubin A und B produziert.
Zur Isolierung des Antibiotikums können z. B. folgende Verfahren dienen: Man trennt das Mycel vom Kulturfiltrat ab, wonach die Hauptmenge des Antibiotikums im Kulturfiltrat gefunden wird. Es bleiben aber trotzdem namhafte Mengen des Anti biotikums am Mycel adsorbiert. Es ist daher vorteil haft, letzteres gut auszuwaschen. Dazu eignen sich besonders organische, mindestens teilweise wasserlös liche Lösungsmittel, wie Alkohole, z. B. Methanol, Äthanol und Butanole, oder Ketone, z. B. Aceton und Methyläthylketon, oder aber organische 'oder anorganische Säuren, wie Essigsäure, Salzsäure oder Schwefelsäure.
Diese Mycelextrakte werden entweder direkt oder nach vorheriger Konzentration im Va kuum zum Kulturfiltrat gegeben. Man extrahiert das Gemisch vorteilhaft bei einem PH über 7 mit einem mit Wasser nicht mischbaren, organischen Lö- sungsmittel, wie Estern niederer Fettsäuren, beispiels weise Äthylacetat oder Amylacetat, Kohlenwasser- stoffen, z. B. Benzol, chlorierten Kohlenwasserstoffen, z. B. Äthylenchlorid, Methylenchlorid oder Chloro form, Ketonen, z.
B. Methylpropylketon, Methylamyl- keton oder Diisobutylketon, Alkoholen, wie Butyl- alkoholen oder Amylalkoholen, Äthern, z. B. Äthyl- äther, Diisopropyläther, Dibutyläthern oder Glykol- äthern und dergleichen.
Anstelle einer Lösungsmittel- Extraktion der Kulturen, oder in Kombination mit einer solchen als weitere Reinigungsoperation, kann man das Antibiotikum auch durch Adsorption gewin nen, beispielsweise an Aktivkohle oder an aktivierten Erden, wie Fullererde oder Floridin, und anschlie ssende Extraktion des Adsorbates, z. B. mit einem in Wasser wenigstens teilweise löslichen organischen Lösungsmittel, wie Aceton, Butanol oder Methyl- äthylketon. .
Man kann auch die Kulturen direkt, ohne vor gängige Abtrennung des Mycels, in der angegebenen Art und Weise extrahieren.
Eine weitere Anreicherung lässt sich dadurch er zielen, dass man die antibiotikumhaltigen organischen Extrakte mit einer sauren wässrigen Lösung mit einem p11 unter 5 wiederholt auszieht, wobei die Hauptmenge der antibiotischen Aktivität in die wässrige Phase übergeht. Eine geringere Menge Aktivität bleibt in der organischen Phase zurück. Die vereinigten sauren wässrigen Lösungen werden dann bei einem pli über 7 in der beschriebenen Weise wieder mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel extrahiert. Diese Prozedur kann mehrere Male wie derholt werden.
Als saure wässrige Lösungen eignen sich verdünnte Säuren, wie Essigsäure, Salzsäure oder Schwefelsäure, oder Pufferlösungen, wie Citrat- oder Phosphatpuffer.
Ein gutes Reinigungsverfahren für das neue Anti biotikum stellt die Verteilung zwischen einer sauren oder einer alkoholischen wässrigen Lösung und einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel dar. Zweckmässig erfolgt die Verteilung nach dem Gegen stromprinzip in entsprechenden Apparaten. Auch Chromatographie ist zur Reinigung sehr geeignet. Die Gewinnung des reinen Antibiotikums in kristalliner Form nimmt man z. B. aus organischen Lösungs mitteln, wie aus Aceton, Methanol, Äthanol, Chloro form, Aceton-Methanol-Gemischen, Aceton-Äther- Gemischen oder Aceton-Petroläther-Gemischen vor.
Zum Umkristallisieren dienen dieselben Lösungsmit tel oder auch wässrig-organische Lösungen, wie ver dünnte Alkohole, verdünntes Aceton usw.
Das Antibiotikum Cinerubin A kristallisiert in stark lösungsmittelhaltigen Plättchen, die beim Trock nen an der Luft oder im Vakuum zu einem dunkel roten Pulver zerfallen. F. = 155-157 . Die Ele mentaranalyse liefert folgende Werte: C = 61,12%, H = 7,03 g, N =1,9l%, OCHS = 4,08%.
Sein UV.-Absorptionsspektrum zeigt Banden bei folgenden Wellenlängen: 234 in/", (log E = 2,28), 258 my (log E = 2,36), 292 my (log E = 1,92), 475 m,u (log E = 2,05), 495 my (log E = 2,1<B>1)</B> und 530 my log E = 1,94). Im Infrarot-Spektrum sind Banden u. a.
bei folgenden Wellenlängen sichtbar: 2,9 ,u, 3,4 ,u., <I>3,5</I> ,a., 5,776,06,u, 6,21,u, 6,81 ,u, <I>7,02,</I> u., 7,067,217,55,u, 7,68,u, 7,88 ,u, 8,14 ,u, 8,568,889,05,u, 9,56 ,u, 9,84,u, 10,37,u, 10,78 fc, 11,19,u, 11,31,u, 11,
79,u, 12,32 ,u, 12,71 ,u (Bande mit dreifacher Spitze), 13,10 ,u, 13,49 13,75,a und 14,21 ,u.
Bei der Hydrolyse mit verdünnten Mineralsäuren zerfällt das Antibiotikum Cinerubin A in zwei redu zierende Zucker-Komponenten und in ein neutrales, antibiotisch wirksames Aglykon, das Cinerubinon. Dieses bildet leuchtend rote Kristalle vom F. 217 bis 220 . Die Elementaranalyse ergibt die folgenden Werte: C = 63,70%, H = 5,38%, (C)CH3 = 3,42%, OCHS = 7,27% und aktiver Wasserstoff = 1,26%.
Im Ultraviolett-Spektrum sind Banden bei den fol genden Wellenlängen sichtbar: 234 my (log E = 3,01), 2,58 my (log E = 2,68), 294 my (log E = 2,25), 470 my (log E = 2,30), 495 my (log E = 2,34), 515 m,u (log E = 2,28) und 530 my (log E = 2,20).
Cinerubin B bildet leuchtend orange gefärbte Kristalle, die bei 180-181 schmelzen. Die Elemen taranalyse liefert folgende Werte: C = 59,76%, H = 6,50%, O = 30,44%, N = 1,78%, OCHS = 4,54%, C-CH3 = 6,38<B>%</B>.
Sein UV.-Spektrum zeigt Banden bei folgenden Wellenlängen: 235 my (log Ei m = 2,77), 258<I>my</I> (log E = 2,46), 291 my (log E = 2,03), 297 my (Inflexion), 394 my (In- flexion), 415 my (Inflexion), 471 mu (Inflexion), 488 m,u (log E = 2,24), 497 my (log E = 2,27), 519 my (log E = 2,16)
und 533 nu (log E = 2,10). Im Infrarotspektrum sind Banden u. a. bei folgenden Wellenlängen sichtbar: 2,83 ,u, 3,38 ,u, 3,58 ,u, 5,71,u, 6,16,u, 6,78,u, 7,02,u, 7,47,u, 7,60,u, 8,06,u, 8,48 ,u, 8,75 ,cc, 9,41 ,u, 9,72,u, 9,90,u, 10,18 10,62,u, 11,
62 ,u, 12,15,u, 12,43,a und 12,85,u.
Bei der Hydrolyse von Cinerubin B mit verdünn ten Mineralsäuren wird das gleiche Aglykon Cineru- binon gebildet, das auch bei der Hydrolyse von Cinerubin A entsteht.
Cinerubin A und B zeigen eine gewisse Ähnlich keit mit Rhodomycin A und B (H. Brockmann und Mitarbeiter, Chem. Berichte 88, 1792 [1955] und frühere, dort zitierte Mitteilungen), doch verhalten sie sich bei der Papierchromatographie verschieden.
Weiter unterscheidet sich das aus Cinerubin erhaltene Aglykon Cinerubinon von E-Rhodomycinon durch seinen Schmelzpunkt, seine analytische Zusammen setzung und vor allem durch sein Infrarot-Absorp- tionsspektrum.
Cinerubin A und B bilden mit anorganischen und organischen Säuren Salze, beispielsweise mit Salz säure, den Schwefelsäuren, der Essig-, Propion-, Va- lerian-, Palmitin- oder Ölsäure, der Bernsteinsäure, Zitronensäure, Mandelsäure, Glutaminsäure oder Pantothensäure. Diese Salze können neutral oder sauer sein.
Ihre Herstellung erfolgt am besten durch Einwirkung der entsprechenden Säuren auf die freie Base oder durch doppelte Umsetzung von Salzen, beispielsweise von Cinerubinsulfat mit pantothen- saurem Calcium.
Cinerubin A und B besitzen eine antibiotische Wirksamkeit gegenüber verschiedenen Testorganis- men. Verwendet man als Testmethode in vitro Ver dünnungsreihen (Zehnerpotenzen) in Glukosebouil- lon, die während 24 Stunden bei 37 bebrütet werden, so ergeben sich folgende noch hemmende Konzen trationen:
EMI0004.0011
Hemmende <SEP> Konzentration
<tb> Testorganismen <SEP> !4 <SEP> g/cm3
<tb> Cinerubin <SEP> A <SEP> Cinerubin <SEP> B
<tb> Micrococcus <SEP> pyogenes, <SEP> var. <SEP> aureus <SEP> 0,1 <SEP> 10
<tb> Micrococcus <SEP> pyogenes, <SEP> var. <SEP> aureus <SEP> 1 <SEP> 10
<tb> Penicillin-resistent
<tb> Streptococcus <SEP> pyogenes <SEP> <B>0,01</B> <SEP> 1
<tb> Streptococcus <SEP> viridans <SEP> 0,01 <SEP> 0,01
<tb> Streptococcus <SEP> faecalis <SEP> 1 <SEP> 10
<tb> Corynebacterium <SEP> diphtheriae <SEP> 0,001 <SEP> 0,1
<tb> Bacillus <SEP> megatherium <SEP> 0,01 <SEP> 1
<tb> Candida <SEP> vulgaris <SEP> 0,1 <SEP> 1
<tb> Endomyces <SEP> albicans <SEP> 0,
01 <SEP> 1
<tb> Mycobacterium <SEP> tuberculosis <SEP> 1 <SEP> 10
<tb> Entamoeba <SEP> histolytica <SEP> ^\^' <SEP> < 33 <SEP> < 100
<tb> In <SEP> Kirchners <SEP> synthetischem <SEP> Medium <SEP> mit <SEP> 5 <SEP> % <SEP> bovinem <SEP> Albumin <SEP> kultiviert;
<tb> Ablesung <SEP> des <SEP> Wachstums <SEP> nach <SEP> zwei <SEP> Wochen.
<tb> "' <SEP> Kultur <SEP> in <SEP> Bacto-Entamoeba-Medium; <SEP> Ablesung <SEP> der <SEP> amoebiciden <SEP> Wirkung
<tb> nach <SEP> 24 <SEP> Stunden.
Die Entwicklung von Influenza-Virus auf isolier ten Membranen der Hühner-Chlorioallantois von 14- tägigen Bruteiern wird von Cinerubin A und B noch in einer Konzentration von weniger als 1 jsg/cm3 ge hemmt, während das Chlorioallantois-Gewebe selbst durch 100 ltg!cmi> nicht toxisch geschädigt wird.
In vivo sind Cinerubin A und B ebenfalls aktiv. So hemmen sie in einer während 6 Tagen täglich intra- peritoneal applizierten Dosis von 1-3 mg/kg an Mäu sen und Ratten das Wachstum des subcutan implan tierten und sicher angesetzten Crocker-Sarcom 180 (Crock. Sa. 180) und des Ehrlich Carcinom (Ehrl. Ca.) leicht, und dasjenige des Adenocarcinoms, E0 771 (Ad. Ca. E0 771) mittelstark.
Weiter hemmt Cine- rubin A das Wachstum des Walker-Carcinosarcom 256 (Wal. Ca. Sa. 256) und des Uterus-Epitheliom T-8 Guerin (Ut. Ep. T-8 Guer.) mittelstark, wäh- rend von Cinerubin B das Wachstum des Walker Carcinosarcom nur leicht beeinflusst wird. Die ge brauchten Dosen sind bei der Maus eben noch tole riert und bedingen starke toxische Nebenerscheinun gen. Die gleichen Dosen werden bei den Ratten besser vertragen.
Als Vergleich sei die tumorhemmende Wirkung anderer Antibiotika angeführt. Das Actinomycin C (- Sanamycin Bayer) wirkt, bei der höchsten Dosis (5 mg/kg), die etwas über der in der Literatur an gegebenen LD 50 (3 mg/kg) liegt, nicht tumorhem mend in dem verwendeten Tumorspektrum. Ein eigenes Actinomycin C zeigt bei einer etwas kleineren therapeutischen Breite (5,0 zu 6,6) eine etwas schwä chere tumorhemmende Wirkung als diejenige von Cinerubin A und B (siehe Tabelle).
EMI0004.0057
Ak. <SEP> LD <SEP> 50 <SEP> Max. <SEP> Crock. <SEP> Ad. <SEP> Ca. <SEP> Wal. <SEP> Ut. <SEP> Ep.
<tb> Chemische <SEP> mg/kg <SEP> Behandlung <SEP> Tox. <SEP> Sa. <SEP> Ehr.. <SEP> E0 <SEP> Ca. <SEP> Sa. <SEP> T-8
<tb> Bezeichnung <SEP> Maus <SEP> ip. <SEP> Dosis <SEP> Wirk.
<SEP> 180 <SEP> Ca' <SEP> 771 <SEP> 256 <SEP> Guer.
<tb> Cinerubin <SEP> A <SEP> 2 <SEP> X <SEP> 10-5 <SEP> 3 <SEP> X <SEP> 10-6 <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> Cinerubin <SEP> B <SEP> 1 <SEP> X <SEP> l0-5 <SEP> 1,5 <SEP> X <SEP> 10-6 <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> ++ <SEP> + <SEP> $
<tb> Actinomycin <SEP> C <SEP> 5 <SEP> X <SEP> l0-6 <SEP> + <SEP> <I>@h</I>
<tb> (Sanamycin <SEP> Bayer)
<tb> Actinomycin <SEP> C <SEP> 5 <SEP> X <SEP> 10-7 <SEP> 1 <SEP> X <SEP> 10-7 <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> (Ciba)
<tb> <I>Legende</I>
<tb> + <SEP> = <SEP> mittelstarker <SEP> Behandlungseffekt, <SEP> das <SEP> heisst, <SEP> behandelter <SEP> Tumor <SEP> misst <SEP> weniger <SEP> als <SEP> die <SEP> Hälfte <SEP> des
<tb> Kontrolltumors;
<tb> + <SEP> = <SEP> leichter <SEP> Behandlungseffekt, <SEP> das <SEP> heisst, <SEP> behandelter <SEP> Tumor <SEP> misst <SEP> weniger <SEP> als <SEP> Dreiviertel <SEP> des
<tb> Kontrolltumors;
<tb> $ <SEP> = <SEP> kein <SEP> Behandlungseffekt, <SEP> das <SEP> heisst, <SEP> behandelter <SEP> Tumor <SEP> misst <SEP> mehr <SEP> als <SEP> Dreiviertel <SEP> des <SEP> Kontroll tumors. Die Cinerubine A und B, ihre Salze und das oben genannte Spaltprodukt Cinerubinon, oder entspre chende Gemische, können als Heilmittel, z. B. in Form pharmazeutischer Präparate, Verwendung fin den.
Man verwendet gewöhnlich Präparate, welche die genannten Verbindungen in Mischung mit einem für die enterale, parenterale oder lokale Applikation geeigneten pharmazeutischen organischen oder an organischen Trägermaterial enthalten. Für dasselbe kommen solche Stoffe in Frage, die mit den neuen Verbindungen nicht reagieren, wie z. B. Gelatine, Milchzucker, Stärke, Magnesiumstearat, Talk, pflanz liche Öle, Benzylalkohole, Gummi, Polyalkylen- glykole, Vaseline, Cholesterin oder andere bekannte Arzneimittelträger. Die pharmazeutischen Präparate können z.
B. als Tabletten, Dragees, Pulver, Salben, Cremen, Suppositorien oder in flüssiger Form als Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen vorliegen. Gegebenenfalls sind sie sterilisiert und bzw. oder ent halten Hilfsstoffe, wie Konservierungs-, Stabilisie- rungs-, Netz- oder Emulgiermittel. Sie können auch noch andere therapeutisch wertvolle Stoffe enthalten.
In den nachfolgenden Beispielen sind die Tem peraturen in Celsiusgraden angegeben.
<I>Beispiel 1</I> Man bereitet eine Nährlösung der Zusammen setzung: 20 g Sojamehl, 20 g Mannit und 1 Liter Lei tungswasser und stellt sie auf pIi 7,8 ein. Diese bzw. ein Vielfaches derselben wird in 500-cm-3-Erlen- tneyern (mit je<B>100</B> cm3 Nährlösung) oder in 500- Liter-Fermentern (mit je 300 Liter Nährlösung) ab gefüllt und 20-30 Minuten bei 1 atü sterilisiert.
Dann impft man mit bis zu 10% einer teilweise sporulie- renden, vegetativen Kultur des Streptomyces cinereo- ruber var. fructofermentans an und inkubiert unter gutem Schütteln bzw. Rühren und in den Fermen- tern unter Belüftung (mit etwa 1 Vol. steriler Luft pro Vol. Nährlösung pro Minute) bei 27 .
Nach 70 bis 120 Stunden Wachstum filtriert man die Kul turen unter- Zusatz eines Filterhilfsmittels je nach Volumen durch eine Nutsche oder durch eine Filter presse oder einen rotierenden Filter und befreit so die antibiotisch wirksame wässrige Lösung, die haupt sächlich Cinerubin A enthält, vom Mycel und anderen festen Bestandteilen.
<I>Beispiel 2</I> Verwendet man anstelle des in Beispiel 1 ange gebenen Mediums die im folgenden beschriebenen Nährlösungen<I>a, b, c, d</I> oder e, so erhält man nach analoger Sterilisation, Beimpfung mit Streptomyces cinereoruber var. fructofermentans, Inkubation bei 27 und Filtration wässrige antibiotisch wirksame Lö sungen, wobei mit den Nährlösungen<I>a, b,</I> c und e ein Gemisch von Cinerubin A und B und mit Nährlösung d vorwiegend Cinerubin B erhalten wird.
a) 10 g Rohglukose, 5 g Pepton, 3 g Fleisch extrakt ( Oxo Lab Lemco , eingetragene Marke), 5 g Natriumchlorid, 10 g Calciumcarbonat und 1 Liter Leitungswasser; pli vor der Sterilisation 7,5. b) 10g Rohglukose, 10g Distillers solubles, 1 g Natriumnitrat, 5 g Natriumchlorid, 10 g Calcium- carbonat und 1 Liter Leitungswasser; pIi vor der Sterilisation 7,5.
e) 10 g Rohglukose, 20 cm3 Maisquellwasser (corn steep liquor), 2 g sek. Kaliumhydrophosphat und 1 Liter Leitungswasser; pH vor der Sterilisation 7,5.
d) 20 g Glycerin, 10 g Sojamehl, 5 g Natrium chlorid, 10 g Calciumcarbonat, 1 g Natriumnitrat und 1 Liter Leitungswasser; PH vor der Sterilisation 7,5.
e) 20 g Mannit, 20 g Distillers solubles , 3 g Natriumchlorid, 1 g Natriumnitrat und 1 Liter Lei tungswasser; pH vor der Sterilisation 7,8. <I>Beispiel 3</I> Der Filterrückstand eines gemäss Beispiel 1 oder 2 erhaltenen 150-Liter-Ansatzes wird mit 25 Liter Ace ton ausgerührt und erneut filtriert.
Dies wird zweimal wiederholt, worauf man die antibiotikumhaltigen Ace- tonlösungen vereinigt, im Vakuum auf 5 Liter einengt und mit dem Kulturfiltrat vereinigt. Diese Lösung wird nun bei pü 8,5 mit 70 Liter Äthylacetat im Westfalia-Extraktor ausgezogen, wobei die gesamte antibakterielle Aktivität in die organische Phase über geht. Der Extrakt wird nun mit Wasser gewaschen, im Vakuum auf 5 Liter eingedampft und dann meh rere Male mit 0,5-n. Essigsäure ausgeschüttelt.
Die Äthylacetatlösung zeigt nun eine geringe antibak terielle Aktivität, während der Hauptteil der Aktivität in den essigsauren Lösungen gefunden wird. Diese orangerot gefärbten Lösungen werden vereinigt, mit 2-n. Sodalösung auf PH 8,5 gebracht, wobei die Farbe nach violett umschlägt, und erneut mit Äthylacetat extrahiert. Der Äthylacetatextrakt wird erneut mit 0,5-n. Essigsäure ausgezogen, worauf diese, wie be schrieben, alkalisiert und extrahiert wird. Schliess lich trocknet man die Äthylacetatlösung über Na triumsulfat und dampft sie im Vakuum ein. Man er hält so die dunkelrot gefärbten, antibakteriell hoch wirksamen Rohbasen.
Der Äthylacetatextrakt, der nach der beschrie benen Behandlung mit verdünnter Essigsäure noch eine relativ geringe antibakterielle Aktivität zeigt, wird mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat ge trocknet und im Vakuum eingedampft. Man erhält ein dünnflüssiges, rotes Öl. Dieses wird mit Petroläther behandelt, wobei ein rotes Pulver erhalten wird, das je nach der verwendeten Nährlösung aus Cinerubin A, Cinerubin B oder Gemischen davon besteht.
<I>Beispiel 4</I> 2,95 g der gemäss Beispiel 1 und 3 erhaltenen Rohbasen werden einer 120stufigen Gegenstromver teilung unterworfen, wobei man das folgende Lö- sungsmittelgemisch verwendet: 5 Volumteile Tetra chlorkohlenstoff, 4,5 Volumteile Methanol und 0,7 Volumteile Wasser. Nach dem Eindampfen des In- kaltes der einzelnen Verteilungsgefässe im Vakuum bei 30 findet man bei den Stufen 7, 51, 63, 88 und 115 kleine Substanz- und Aktivitätsmaxima, wäh rend die Hauptmenge der Substanz und der Aktivität bei Stufe 22 angereichert ist.
Die Fraktionen 14-35 werden vereinigt, und man erhält 1,61 g papier- chromatographisch einheitliches Cinerubin A. Es wird aus einem Aceton-Methanol-Gemisch umkri stallisiert und bildet stark lösungsmittelhaltige Plätt chen, die beim Trocknen zu einem dunkelroten Pulver zerfallen. F. = 155-157 .
Analyse: C 61,12%, H 7,03%, N 1,91%, OCHS 4,08 /a. UV.-Absorptions- spektrum in Feinsprit: Banden bei 234 m@t (log E = 2,28), 258 m,u (log E = 2,36), 292 mA (log E = 1,92), 475 mu (log E = 2,05), 495 m,u (log E = 2,11) und 530 m,u (log E = 1,94). IR.-Absorp- tionsspektrum in Nujol: Banden u. a. bei folgenden Wellenlängen:
2,9,u, 3,4,u, 3,5 ,u, 5,77,u, 6,06 /t, 6,21 ,u, 6,81,u, <I>7,02</I> ,u, 7,06 ,u, 7,21,u, 7,55 ,11, 7,68 ,u, 7,88 ,rt 8,14,u, 8,56 @t, 8,88 ,u, 9,05,u, 9,56,u, 9,84,u, 10,37,u,
10,78,u, 11,19,u, 11,31,u, 11,79 ,ct, 12,32,u, 12,71 It (Bande mit dreifacher Spitze), 13,10,u, 13,49 ,cc, 13,75,u und 14,21,a.
Im Rundfilter-Papierchromatogramm mit dem Lösungsmittelsystem Benzol-Formamid zeigt Cine- rubin A einen RF-Wert von 0,55. Unter den gleichen Bedingungen bleiben Rhodomycin A und B an der Auftropfstelle.
<I>Beispiel 5</I> Eine Lösung von 50 mg Cinerubin A in 10 cm3 1-n. Schwefelsäure wird 20 Minuten auf 100 erhitzt. Dabei scheiden sich rote Flocken aus. Nach dem Ab kühlen wird die rote Lösung mit Äthylacetat aus geschüttelt, wobei die Farbe in die organische Phase übergeht.
Die wässrige Phase wird nun mit 2-n. Barium hydroxyd neutralisiert, filtriert und im Vakuum ein gedampft. Der Rückstand enthält mindestens zwei reduzierende Zucker, die im Papierchromatogramm mit einem mit Wasser gesättigten Gemisch von Buta- nol-Eisessig <B>(9:</B> 1) RF-Werte von 0,13 respektive 0,38 zeigen.
Die rot gefärbten Äthylacetat-Extrakte werden mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft. Man erhält das Cine- rubinon aus einem Benzol-Methanol-Gemisch in leuchtend roten Kristallen; F. = 217-220 .
Analyse: C 63,70%, H 5,38%, (C)CH3 3,42%, OCHS 7,27%, akt. H 1,26%. UV.-Absorptionsspektrum in Fein sprit: Banden bei 234 mu (log E = 3,01), 258 m/c (log E = 2,68), 294 m,u (log E = 2,25), 470 my (log E = 2,30), 495 mu (log E = 2,34), 515 m,u (log E =2,28) und 530 mu (log E = 2,20). IR.-Ab_ sorptionsspektrum in Kaliumbromid:
Banden u. a. bei <I>2,87</I> ,u, 3,00,u, 3,25,u, 3,43 ,u, 3,52,u, 5,78,u, 6,06,u, <I>6,24</I> ,it, 6,88 ,u, 7,07,u, 7,55,u, 7,69 ,u, 8,13,u, 8,30,u, 8,54,u, 8,84 ,u, 9,06,u, 9,34,u, 9,56 ,u,
9,75,u, 9,98<I>,</I>1<I>,</I> 10,07,u, 10,28,u, 10,47<I>,</I><B>4</B> 11,01,u, 11,59,u, 11,87,u, 12,02,a, 12,72,u, 13,31 <B>13,8</B> 8 it, 14,10 ,u und 14,49,u. Im Papierchromatogramm mit dem Lösungs- mittelsystem Benzol-Formamid zeigt Cinerubinon einen RF-Wert von 0,85.
Mit konzentrierter Schwefel säure gibt es eine rein blaue Färbung.
Das Cinerubinon ist gegenüber verschiedenen Testorganismen antibiotisch wirksam.
<I>Beispiel 6</I> 16 g der gemäss Beispiel 2 (Nährlösung d) und Beispiel 3 erhaltenen Rohbasen werden einer 300- stufigen Gegenstromverteilung unterworfen, wobei das folgende Lösungsmittelgemisch verwendet wird: 7,5 Volumteile Tetrachlorkohlenstoff, 6,375 Volumteile Methanol und 1,125 Volumteile Wasser. Der In halt der einzelnen Verteilungsgefässe wird im Vakuum bei 30 eingedampft. Neben kleineren Aktivitäts- und Substanzmaxima, z.
B. bei den Stufen 260-295, fin det sich das Cinerubin A in den Stufen 54-70 und das Cinerubin B in den Gefässen 17-37. Die Lösun gen aus diesen Gefässen werden vereinigt und mit 500 m3 Wasser versetzt. Darauf trennt man die untere Phase ab und extrahiert die obere Phase noch zwei mal mit je 200 cm3 Tetrachlorkohlenstoff. Die Ex trakte werden vereinigt, mit etwas Wasser gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum ein gedampft.
Man löst den Rückstand in 50 cm3 Ben zol und gibt in der Wärme etwas Methanol zu. Beim Stehen scheidet sich das Cinerubin Bin Form von orange gefärbten Kristallen ab. Sie werden aus dem gleichen Lösungsmittelgemisch umkristallisiert und schmelzen bei 180-181 .
Analyse: C 59,76 iö, H 6,50%, O 30,44%, N 1,78%, OCHS 4,54%, C-CH3 6,38 a0. Das UV.-Absorptionsspektrum in Feinsprit zeigt folgende Banden:
EMI0006.0142
)Max <SEP> (mti) <SEP> 235 <SEP> 258 <SEP> 291 <SEP> 297 <SEP> 394 <SEP> 415
<tb> log <SEP> Ei <SEP> m <SEP> 2,77 <SEP> 2,46 <SEP> 2,03 <SEP> 2,025 <SEP> 1,56 <SEP> 1,67
<tb> 2,",a@ <SEP> (\) <SEP> 471 <SEP> 488 <SEP> 497 <SEP> 519 <SEP> 533
<tb> log <SEP> E <SEP> i <SEP> m <SEP> 2,17 <SEP> 2,24 <SEP> 2,27 <SEP> 2,16 <SEP> 2,10 IR.-Spektrum (in Kaliumbromid): Banden u. a.
bei 2,83,u, 3,38,u, 3,58,u, 5,71 ,lt, 6,16,u, 6,78 ,Ä, 7,02,u, <I>7,47</I> ,u, 7,60 ,u, 8,06 ,u., 8,48<I>,</I> u., 8,75 /.t, 9,41,u, <I>9,72</I> it, 9,90 ,u, 10,18 ,lt, 10,62<I>1</I>1<I>,</I> 11,62 ,u,
12.15 u. 12.43 tt und 12.85 tt. <I>Beispiel 7</I> Eine Lösung von 50 mg Cinerubin B in 10 cm33 1-n. Schwefelsäure wird 20 Minuten auf 100 erhitzt und wie in Beispiel 5 beschrieben aufgearbeitet. Die aus den Äthylacetat-Extrakten gewonnene Substanz ist identisch mit dem in Beispiel 5 beschriebenen Cinerubinon.