DE2044004C3

DE2044004C3 - Verfahren zur Herstellung des Antibiotikumkomplexes Polyfungin

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Publication number: DE2044004C3
Application number: DE19702044004
Authority: DE
Inventors: Auf Nichtnennung Antrag
Original assignee: INSTYTUT ANTYBIOTYKOW WARSCHAU
Current assignee: INSTYTUT ANTYBIOTYKOW WARSCHAU
Priority date: 1969-09-11
Filing date: 1970-09-04
Publication date: 1974-03-07
Also published as: FR2070684B1; JPS5538117B1; DE2044004B2; PL71259B1; DE2044004A1; GB1318361A; CH558425A; FR2070684A1

Description

Tabelh 1

Die Zusammenstellung der Summenformeln der bekannten Tetraen-Antibiotika, sowie des Polifungins A und B

Name des Antibioukums	Summenformel
Protozidin	C₂₉H₄₅NO₁₃
Pimarizin	C₃₄H₄₉NO_{14 t}
Tetrin B
Tetrin A	Cr₅H₅₃-I₅Nb₁₄ *
PA-166	C₃₅H₅₃NO₁₄
Etruskomyzin	C₃₆H₅₇NO₁₄
Rhimozidin	C₃₇H₅₉NO₁₃
Amphotericin A	C₄₄H₇₅NO₁₇
Nystatin (A₁ und A₂)	C₄₇H₇₅NO₁₈
Polifungin A (A₁ und A₂)	C₄₇H₇₅NO₁₈
Polifungin B	C„-_4!H,₅-„NO₁₈

Wie aus den oben gegebenen Beweisen hervorgeht, 20 A₂ und B, was eine starke antifungale In-vitro-Wirkung ist Polifungin das einzige gegenwärtig bekannte Anti- des Polifungin-Komplexes gegenüber hefeähnlichen biotikum der Gruppe der Tetraene, welches drei Pilzen wie auch gegenüber Fadenpilzen gewährleistet, antifungale Tetraene enthält, nämlich Polifungin A., was in der Tabelle 2 gezeigt wird.

Tabelle 2

Spektrum der antifungalen Wirkung von Polifungin

(Für die Untersuchungen wird das Polifunginpräparat mit der

Leistung von 6100 Einheiten/mg angewandt)

	Name des Teststammes	Polifungin-	100	10	1
Lfd. Nr.		Konzentration in mcg/ml		_	₊
	Candida albicans 7889	—	—	-f-
1	Candida albicans 7841	—	±	+
2	Candida albicans 7331	—	-)-
3	Candida albicans 7848	—	—	+
4	Candida albicans 7831	—	—	+
5	Candida albicans 6470	—	±	+
6	Candida albicans 6672	—	—	+
7	Candida albicans 7204	+	+	+
8	Candida tropicalis	+	-t-	+
9	Candida parakrusei	-f	+	+
10	Candida lipolytica	—	—	+
11	Saccharomyces cerevisiae
12	sp.	—	+	+
	Microsporum canis	—	—	+
13	Microsporumadouini 3701	—	+	+
14	Trichosporon cutaneum	—	T	+
15	Trichophyton mentagro-
16	phytes 6405	+	+	+
	Trichophyton violaceum
17	3060	+		+
	Trichophyton verrucosum
18	6739	—	+	+
	Trichophyton rubrum 6967	—	—	+
19	Epidermophyton floccosum	—	—	+
20	Aspergillus niger 3317	+	+	4-
21	Aspergillus versicolor	—	-f-	+
22	Penicillum sp. 6895	+	+	+
23	Cephalosporium sp.	+	+	+
24	Fusarium sp.
25

— bedeutet kein Wachstum des Teststammes,

± bedeutet Wachstum des Teststammes in Spurenmengen,

4- bedeutet ein starkes Wachstum des Teststammes.

und

Die untersuchten Stämme wurden aus den klinischen Fällen von Mykosen abgesondert. Das Wirkungsspektrum wurde nach der Verdünnungsmethode im Nährboden von Sabouraud und zusätzlich auch für die Stämme Candida albicans nach dem Filamenttest bestimmt.

Tabelle 2 a
Spektrum der antifungalen Wirkung des Polifungins

	Name des Teststammes	Minimale	hemmende	konzentration des	72	Polifungins in
Lfd. Nr.			mcg/ml Wirkungsdauer in Stunden	>5,0
	Absidia archidis	24		2,0	%
1	Aspergillus niger	2,0		5,0	>5,0
2	Aspergil'us terreus 56-B	1,0		0,2	3,0
3	Brettanomyces bruxellensis R-35	—		2,0	>5,0
4	Candida albicans 102	—		1,0	0,3
5	Candida tropicalis d/1	1		0,6	2,0
6	Cephalosporium acremonium CMI 49137	0,6		0,8	2,0
7	Cryptococcus neoformans R-32	—		0,8	1.0
8	Fusarium caucasicum	0,4		1,0	2,0
9	Fusarium maniliforme var minus	—		0,3	1,5
10	Kloeckera apiculata R-29	—		0,2	3,0
11	Lipoyces starkeyi R-28	0,1		4,0	0,3
12	Penicillium chrysogenum Q-176	—		1,0	0,4
13	Rhizopus arrhizus	—		0,8	5,0
14	Rhodotorula flava R-14	—		0,8	3,0
15	Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763	—		0,8	1,5
16	Eporobolomyces salmonicolor R-41	0,4		5,0	1,0
17	Sporotrichum schenkii	0,4		1.0	1,0
18	Torulasp. 11/31	—		1,0	5,0
19	Torulopsis Utilis 11/38	0,4		1,0	1,5
20	Trichophyton plicatile G	0,4		0,6	1,5
21	Trichithecium roseum	—		5,0	1,5
22	Trichosporon sericeum R-33	—		0,3	1,0
23	Trigonopsis variabilis R-34	2,0		5,0
24	—		0,6
	48
5,0
1,5
5,0
—
1,5
0,8
—
0,6
0,6
0,8
0,2
—
3,0
0,8
0,6
0,6
0,6
4,0
0,6
0,6
—
—
3,0
0,2

Anmerkungen: Bestimmt nach der Methode der Verdünnungen auf dem Pepton-Hefe-Agar-Nährboden mit Fleischextrakt mit pH-Wert 6,5.

Für die Untersuchung wird das Polyfungin-Präparat mit der Leistung von 6100 Einheiten pro mg angewandt.

Von den bisher beschriebenen über dreißig Tetraen-Antibiotika haben im Hinblick auf ihre hohe In-vivo-Toxizität nur zwei eine klinische Anwendung gefunden, und zwar Nystatin und Pimarizin. Polifungin verspricht eine breitere klinische Anwendung als antimykotisches Arzneimittel im Vergleich zu den obengenannten Antibiotika, insbesondere gegenüber den saprophytischen Pilzen, die ein potentielles Agens der systemischen Mykosen sind. Es kann auch ein wertvolles Arzneimittel bei Infektionen sein, die durch einen Pilz der Gruppe Dermatophyten, nämlich Epidermophyton floecosum, verursacht werden. Gleichzeitig ist der Polifungin-Komplex ein wenig toxisches Antibiotikum. Bei Versuchen mit Mäusen bei oraler Gabe in Mengen von 10 g per kg Körpergewicht wurde keine toxische Wirkung beobachtet. Bei Verabreichung durch das Bauchfell betrug die LD₅₀1000 mg per kg Körpergewicht.

Der Aktinomyzetenstamm Streptomyces nourse var. polyfungini ATCC 21581, welcher das Polifungir erzeugt, wurde aus dem Boden in China isoliert. Ir den taxonomischen Untersuchungen, welche gemät der Empfehlung des Unterausschusses für die An gelegenheiten der Taxonomie der Aktinomyzeter (Intern. Jour. System. Bacter. [1966] 16, S. 313) durchgeführt wurden und in den Tabellen 3 bis 6 auf geführt sind, wies dieser Mikroorganismus nach den Schlüsse! zur Klassifizierung von Aktinomyzeten S. A. W a k s m a n, »The Actinomycets«, 1961, Bd. 2 S. 156, die fundamentalen taxonomischen Merkmali aus, welche für die Spezies Streptomyces nourse charakteristisch sind, aber wegen der wesentlichei Unterschiede in der Qualität der erzeugenden Polyen Antibiotika wurde er als eine Abart dieser Spezie anerkannt und Streptomyces noursei var. polifungir ATCC 21581 genannt.

7 8

Tabelle 3 Die Zuchteigenschaften des Streptomyces noursei var. polifungini ATCC 21581

Nährboden·)	Wachstum	Sporenbildung	Farbe des Luftmyzels)**	Farbe des Grund myzels)*	Lösliches Pigment
Malz-Hefe-Agar (2)	reichlich	reichlich	Blaßpurpur (227)	Oc 6r	kein
			CHM code 7 fe
			Serie GY
Hafer-Agar (3)	reichlich	gut	leicht graulich-rötlich-	Oc 6t	kein
			bronzfarbe (45) CHM
			code 5 fe Serie GY
Stärke-Agar (4)	gut	gut	leicht bräunlich grau	Coo6b	kein
			(63) CHM code 3 fe
			Serie GY
Glyzerolasparagin-	gut	gering	leicht graulich-rötlich-	Oc 6t	kein
Agar(5)			bronzfarbe (45) CHM
			code 5 fe Serie GY

Die Farben wurden nach 14 Tagen Inkubation in der Temperatur von 28° C bestimmt.

·) nach E. B. S h i r 1 i η g, D. G ρ 11 i b. Methods for charakterization of Streptomyces species, Intern. Journal of Systematic Bacteriology, 1966, 16, S. 313; *·) nach H. D. Tresner, E. J. Backus, Appl. MikroTabelle

Wachstum des Aktinomyzeten Streptomyces noursei var. Polifungini ATCC 21581 auf dem Nährboden mit

verschiedenen Kohlenstoff-Quellen biol., 1963,11,4, 335; Color Harmony Manual, Container Corporation of America, Chicago, Illinois, 60 603, USA., ♦*♦) nach H. Prauser, Z., AlIg. Mikrobiologie, 1964, 4, 1, 95; Code for determinating the colours of serial mycelia of streptomycetes, composed by H. Prauser from colour tabs of Baumann Farbtonkarten Atlas I.

Tabelle 5 (Fortsetzung)

Die zu untersuchenden Eigenschaften

Kohlenstoff-Quelle

Keine

D-Glukose . L-Arabinose Saccharose . D-Xylose ... I-Inositol .. D-Mannitol. D-Fruktose . Rhamnose . Raffinose ..

Wachstum des Aktinomyzeten

6. Erzeugung des
Pigments von
Melamin-Typ

7. Erzeugung von
Schwefelwasserstoff

8. Erzeugung von
Antibiotika

Anmerkungen: ++ bedeutet reichliches Wachstum, + gutes Wachstum, + geringes Wachstum, — kein Wachstum.

Tabelle

Die physiologischen Eigenschaften der Streptomyces noursei var. polifungini ATCC 21581

Ergebnisse

Die zu untersuchenden Eigenschaften

1. Peptonisation von Milch

2. Hydrolyse von Stärke

3. Verflüssigung von Gelatine

4. Reduktion von Nitraten

5. Fähigkeit zum Wachstum in der Temperatur 50⁰C

Ergebnisse

erzeugt nicht

Antibiotikum der Zykloheximid-Gruppe; 2 Antibiotika, die gegen die
Gram-positiven Bakterien wirken; Polifungin A₁, A, und B; Antifungales Antibiotikum der Polyen-Gruppe, weichesein System von drei konjugierten Doppelbindungen enthält; Antifungales Antibiotikum det Polyen-Gruppe, welches
sieben konjugierte Doppelbindungen enthält

^s" . Tabelle 6

Die morphologischen Eigenschaften des Streptomyces noursei var. polifungini ATCC 21581

Züchtung von 14 Tagen auf dem Malz-Hefe-Agar (2), Hafer Agar (3), Stärke-Agar (4) und Glyzerol-Asparagin-Agar (5) *' Sporophoren

koaguliert, dann peptonisiert intensiv und alkalisiert hydrolisiert intensiv verflüssigt schwach

reduziert schwach (Spurmengen an Nitraten) schwaches Wachstum

Form

Sporen
Ausmaße

Offene Spiralen mit 3 bis 5 Windungen auf Fragmenten des Luftmyzels, wechselständig (Spira) odei Ringe umher (MonoverticUlus Spira) untergebracht, Haken, locke gewickelte Schleifen, restliche Spi ralen (Retinaculnm-Apertum)
Elliptische, kettenförmig geordnet je mehr als 10 Sporen
Oberfläche mehrere, dünne, lange Auswüchse
1,0 bis 1,5 · 0,4 bis 0,8 μ

·) Die Nährböden wie in der Tabelle 3.

409610/3«

9 10

Die in der Anlage befindlichen Photos illustrieren Das Nährmedium in den Kolben wird im Autoklav

die Textur der Sporophoren in den Kulturen auf binnen 30 Minuten bei 117°C nach vorhergehender

Agarnährböden: Korrektur des pH-Wertes auf 6,4 sterilisiert. Das auf

A b b. 1: Die Type der Sporophoren des Stammes diese Weise vorbereitete Saatmedium wird entweder

Streptomyces noursei var. polifungini ATCC 21581. 5 mit einer Wassersuspension der aus der Agar-

Die Züchtung von 14 Tagen auf Haferagar (125mal Kultur gesammelten Sporen oder mit einem Teil der

Vergrößerung). Kultur angeimpft. Die Kultur wird bei 28°C gezüchtet,

A b b. 2: Die Type der Sporophoren des Stammes wobei die Kolben auf einer Drehschüttelmaschine mit

Streptomyces noursei var. polifungini ATCC 21581. 220 Umdrehungen pro Minute angebracht sind. Die

Die Züchtung von 14 Tagen auf Stärkeagar (125mal io Produktionskultur auf einem flüssigen Nährboden

Vergrößerung). wird binnen 96 Stunden in Erlenmeyerkolben von

Die Züchtung des Stamms Streptomyces noursei 500 ml Inhalt gezüchtet, welche 30 ml Nährmedium

var. poliCungini ATCC 21581 wird auf den Nähr- von folgender Zusammensetzung enthalten:

medien geführt, welche als Kohlenstoff-Quelle ein- Technische Glukose 3°/₀

fache und/oder zusammengesetzte Kohlenhydrate, 15 Kartoffelstärke I⁰/

vorzugsweise Glukose, Stärke, Dextrin in der Menge Maisquellwasser 1 °/°

von 1 bis 10 Gewichtsprozent enthalten. _(500/ Trockensubstanz)

Als Quelle von organischem Stickstoff werden Trockenhefe 0 25°/

Pflanzen und Tierrohstoffe verwendet, wie Pflanzen- Ammoniumsulfat oY°/ "

extrakte von Mehl aus Samen, Hydrolysate von*» kalriumkarbonat '. 0*8°/I

Pflanzenmaterial, Hydrolysale von Tiermaterial, vor- Leitungswasser bis zu 100,0°/₀

z"igsweise Maisquellwasser, Sojamehl, Trockenhefe,

Hefehydrolysate, Peptone, Harnstoff, Fischmehl in der Das Nährmedium in den Kolben wird im Autoklav

Menge von 0,1 bis 5 Gewichtsprozent. binnen 30 Minuten bei 117 C nach vorhergehender

Als Quelle von nichtorganischem Stickstoff werden 25 Korrektur des pH-Wertes auf 6,4 sterilisiert. Das auf

Arnmoniumchlorid, Natriumnitrat, Kaliumnitrat, Am- diese Weise vorbereitete Produktionsnährmedium

moniumnitrat, Ammoniumsulfat. Ammoniumazetat, wird mit 5°/₀ im Verhältnis zum Nährmedium-Volu-

Ammoniumzitrat in der Menge von 0,1 bis 3 Ge- men der auf dem Saatmedium erhaltenen Kultur

wichtsprozent verwendet. angeimpft. Die Kultur wird bei 28°C gezüchtet, mit

Als Pufferverbindiing wird Kalziumkarbonat in der 30 den auf einer Schüttelmaschine mit 220 Umdrehungen

Menge von 0,1 bis 3 Gewichtsprozent verwendet. pro Minute angebrachten Kolben. Der Gehalt an

Als organisches Lösungsmittel werden aliphatisch^ Antibiotikum wird nach der mikrobiologischen Zylin-

Ci-Q-Alkohole bzw. ihre wäßrigen Lösungen, Essig- derplattenmethode in Gegenwart des Teststamms

säure. Pyridin, schwache Pyridinbasen, Formamid. Torula sp. 11/31 (unempfindlich gegen die Wirkung

Dimethylformamid, Tetrachlorkohlenstoff, Äthylen- 35 von Zykloheximid) im Methanol-Extrakt aus dem

glykol und/oder ihre Mischungen verwendet. Myzel des Aktinomyzeten Streptomyces noursei var.

Die Extraktion wird bei 10 bis 5O⁰C durchgeführt. polifungini ATCC 21581 bestimmt. Die Bezeichnung

Die Verdampfung des Extraktes von Polifungin wird in Gegenwart von einem Standard-Präparat von

wird unter vermindertem Druck bei einer Temperatur " Nystatin durchgeführt und die Ergebnisse in Ver-

nicht höher als 50° C durchgeführt. 40 gleichseinheiten in Umrechnung auf Brühe angegeben.

Die Reinigung wird durch Auswaschen der Ver- Für die wie oben gezüchtete Kultur erhält man die unreinigungen mit Lösungsmitteln bei 15 bis 6O⁰C Brühe mit einem Gehalt an Polifungin gleich 6695 Eindurchgeführt, heiten/ml.

Als organische Lösungsmittel werden aliphatische Beispiel 2

C₁-C₄-AIkOhOIe, ihre wäßrigen Lösungen und/oder 45

wäßrige Lösungen der Alkohole, welche Natrium- Der Stamm des Aktinomyzeten Streptomyces noursei

hexametaphosphat, Azeton, Äthylazetat, Äthylen- var. polifungini ATCC 21581 wird auf festem und

chlorid und Benzol enthalten, verwendet. flüssigem Saatmedium in der im Beispiel 1 angegebenen Weise gezüchtet. Die Produktionskultur aul

Beispiele für die Züchtung von Streptomyces 50 einem flüssigen Nährboden wird in Erlenmeyerkolbeii

noursei var. polifungini ATCC 21581 von 500 ml Inhalt gezüchtet, welche 30 ml Nährmedium von folgender Zusammensetzung enthalten

^BeiSpie11 Technische Glukose 2,0°/₀

Der Stamm des Aktinomyzeten Streptomyces noursei Kartoffelstärke ,.. 2,0°/₀

var. polifungini ATCC 21581 wird während 14 Tagen 55 Maisquellwasser l>O^fl/o

bei 28° C auf dem Schrägagar des Nährbodens mit (50 °/₀ Trockensubstanz)

Kartoffelextrakt gezüchtet. Die Saat-Kultur auf flüssi-" Trockenhefe 0,25 °/„

gem Nährboden wird binnen 42 Stunden in Erlen- Ammoniumsulfat 0,4 °/„

meyerkolben von 500ml Inhalt gezüchtet, wobei Kalziumkarbonat 0,8°/₀

dieser Kolben 50 ml Nährmedium von folgender Zu- 60 Leitungswasser bis zu 100,0°/₀

sammensetzung enthält:

Das Nährmedium in den Kolben wird im Autokla

Reine Glukose 2°/₀ binnen 30 Minuten bei 117° C nach vorhergehend«

Ammoniumnitrat 0,5 °/₀ Korrektur des pH-Wertes auf 7,0 sterilisiert. Das ai

Maisquellwasser 1,0% ⁶5 diese Weise vorbereitete Produktionsnähnnediu]

(50 % Trockensubstanz) wird mit 5°/₀ im Verhältnis zum NährmediuE

Kalziumkarbonat 0,5 % Volumen der auf dem Saatmedium gemäß Beispiel

Leitungswasser bis zu 100,0 °/„ vorbereiteten Kultur angeimpft. Die Kultur wird b

¹¹ 12

28°C in dem auf einer Schüttelmaschine mit 220 Um- getrocknet, und dann werden die Verunreinißuniien

drehungen prc,M,nute fur 96 Stunden angebrachten bei Zimmertemperatur mit der doppe en M ng"

An Sn.if " \ r 5^ezeichn _n ^U"S ^df ^{Gehaltes an} (Gewicht/Volumen) Äthylenchlorid emaniert nS

Antib.oükum wird aui die .m Beisp.el 1 angegebene Abfiltrieren und Trocknen bei Zimmertemperatur We.se durchge uhrt, wöbe, man die Brühe mit dem 5 wird der Niederschlag wieder mi der Sd en

Gehalt an [>_ol.f_ungin gle.ch 9235 Einheiten/ml erhält. Menge (Gewicht/Volumen) an dSilHertem Wasser

Beispiel 3 extrahiert und nach Abfiltrieren unter vermindertem

DerStammdesAktinomyzetenStreptomycesnoursei Ä «ÄSTÄuS P-tmg und'die

var. pohfungm, ATCC 21581 wird auf dem Schräg- t. gesamte Ausbeute des Prozesse?^ 5mrl auf

agar und Saatmed.um auf die im Be.spiel 1 angege- das in der Brühe enthaltene Polifungin beträgt ff,»"

bene Weise gezüchtet. Die Produktionskultur wird LD₅₀ =-, 60,2 mg kg. "«ragi on _i0. auf einem flüssigen Nährboden in Erlenmeyerkolben

vom 500 ml Inhalt gezüchtet, welche 30 ml Nähr- Beispiel 5

medium von folgender Zusammensetzung enthalten: 15 Die Verarbeitung der Brühe mit der Aktivität von

Technische Glukose 2,0°/₀ ¹⁶⁵⁶⁹ Einheiten'ml wird auf die im Beispiel 4 ange-

Kartoffelstärke 4,0°/₀ gebene Weise durchgeführt, und zwar mit dem Unter-

Maisquellwasser l,0°/₀ schied, daß anstatt Äthylenchlorid eine analoge

(50°/₀ Trockensubstanz) Menge von Athylazetat verwendet wird. Das erhaltene

Trockenhefe 0,25 °/₀ ^{20 Produ}kt enthält 5300 Einheiten Polifungin pro 1 mg,

Ammoniumsulfat 0,5 °/„ und die gesamte Ausbeute des Prozesses in Um-

Kalziumkarbonat 0,8 °/„ rechnung auf das in der Brühe enthaltene Polifungin

Leitungswasser bis zu 100,0 °/„ beträgt 57°/,. LD₆₀ - 61,7 mg/kg.

Das Nährmedium in den Kolben wird im Autoklav »5 B e i s ρ i e 1 6

binnen 30 Minuten bei 117⁰C nach vorhergehender 5 1 Brühe mit Gehalt an Polifungin gleich 16569 Ein

Korrektur des pH-Wertes auf 7,0 sterilisiert. Das auf heiten/ml wird abfiltriert. Die erhaltenen 400 g des diese Weise vorbereitete Produktionsnährmedium feuchten Myzels werden mit Wasser und Azeton Rewird mit 5%, im Verhältnis zum Nährboden-Volumen, waschen, mit Methanol extrahiert dann werden die der auf dem Saatmedium gemäß Beispiel 1 vorbereite- 30 Extrakte eingedampft, der abgeschiedene Niederschlag ten Kultur geimpft. Die Kultur wird bei 28°C in den abfiltriert und mit Azeton, wie im Beispiel 4 gewaauf einer Schüttelmaschine mit 220 Umdrehungen pro sehen. Der Niederschlag wird in der Zimmertem-Minute für 96 Stunden angebrachten Kolben gezüch- peratur getrocknet. Der erhaltene Niederschlag wird let. Die Bezeichnung des Gehaltes an Antibiotikum in 50 ml 30°/₀iges Isopropanol mit Zugabe von 1 °/ wird auf dk im Beispiel 1 angegebene Weise durchge- 35 Natriumhexametaphosphat suspendiert und binnen !ihrt, wobei man die Brühe mit dem Gehalt an PoIi- 30 Minuten bei 6O⁰C erwärmt, dann auf Zimmermgin gleich 16569 Einheiten/ml erhält. temperatur gekühlt und abfiltriert. Der erhaltene

Niederschlag wird mit 100 ml Azeton gewaschen und

_n · ■ . -_L ,· , , λ _n ■ λ ^unter vermindertem Druck bei 40⁰C getrocknet Das

Beispiele über die Isolierung und Reinigung des ₄„ erhaltene Produkt enthält 6350 Einheiten Polifunan

Antibiotikums aus der Kultur _pro l _mg, und die Gesamtausbeute des Prozesses in

B e i s ρ i e 1 4 Umrechnung auf das in der Brühe enthaltene PoIi-

^F f ungm beträgt 61 %. LD₅₀ = 700 mg/kg.

5 1 der gemäß Beispiel 3 erhaltenen Brühe mit Ge-

nalt an Polifungin gleich 16569 Einheiten/ml wird 45 Beispiel 7

bfiltriert. Die erhaltenen 400 g des feuchten Myzels Die Verarbeitung der Brühe mit der Aktivität von

werden mit 101 Wasser und dann mit 0,41 Azeton 16569 Einheiten/ml wird in der im Beispiel 6 ange- ;twaschen. Das Myzel wird dreimal je 1 Stunde gebenen Weise durchgeführt, und zwar mit dem xtrahiert, wobei für jede Extraktion 1,21 Methanol Unterschied, daß kein Natriumhexametaphosphat gebraucht wird. Die gesammelten Extrakte werden 50 zum 3O⁰Z₀JgCn Isopropanol zugegeben wird. Das erunter vermindertem Druck bei Temperatur des Bades haltene Produkt enthält 6480 Einheiten Polifungin gleich 40⁰C zum Volumen von 50 ml eingedampft. pro 1 mg, und die Gesamtausbeute in Umrechnunj Der abgeschiedene Niederschlag wird abfiltriert, mit auf das in der Brühe enthaltene Polifungin beträft ml Azeton gewaschen und bei Zimmertemperatur 61 °/₀. LD₅₀ = 1000 mg/kg.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentanspruch: violettabsorptionsspektra sowie die in der F i g. ί

dargestellten Infrarotabsorptionsspektra beweisen, da£

Verfahren zur Herstellung des Antibiotikum- Polifungin A als auch Polifungin B Tetraene sind. Komplexes Polifungin, dadurch gekenn- Eine successive Trennung von Polifungin A durch

ze ichn et, daß man den Aktinomyzetenstamm 5 Gegenstromextraktion mit 400 Überführungen im Streptomyces noursc; vai. polifungini ATCC 21581 System von Amylalkohol -Isoamylalkohol -Zitratunter aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Pufferlösung 12:17:29, weiche in der Fig. 6 darge-Nährmedium, das Puffersubstanzen enthält, bei stellt ist, führt zur weiteren Trennung von Polifungin A 25 bis 35° C und bei einem pH-Wert von 6 bis 7 in Polifungin A₁ und A_t.

züchtet, danach das Myzel abfiltriert und in üb- io Das Präparat, welches aus der Fraktion B hergestellt licher Weise aufarbeitet. wurde, erwies sich als eine homogene Substanz und

wurde Polifungin B genannt

Es ist aus der Literatur bekannt, daß die inhomo-

Verfahren air Herstellung des Antibiotikumkom- genen Antibiotika in der Gruppe der Tetraen-Antiplexes Polifungin, dadurch gekennzeichnet, dafo man 15 biotika, aus denen je zwei biologisch wirksame Beden Aktinomyzetenstamm Streptomyces noursei var. standteile getrennt wurden, Nystatin (S c h e η i π polifungini ATCC 21581 unter aeroben Bedingungen D. Ju., Kotenko T. W., Ekzempljaiow in einem wäßrigen Nährmedium, das Puffersubstanzen O. N., Antibiotika 1968, XIII, Nr. 5, S. 387, S c h eenthält, bei 25 bis 35°C und bei einem pH-Wert von η i η D. Ju., K ο t e η k ο T. W., UgliewaM. F., 6 bis 7 züchtet, danach das Myzel abfiltriert und in »o Ekzempljarow C. M., Materialy ν Nautschnoj üblicher Weise aufarbeitet, Konferenzji Leningradakogo Nautschno-Issledowa-

Polifungin ist ein antibiotischer Komplex, in dem talnogo Instituta Antibiotikow, 1967, S. 206), Antidie Anwesenheit von mindestens drei biologisch wirk- mykoin (C. P. Schaffner, I. D. 5 t e i η m a. η n, samen Bestandteilen festgestellt wurde. Auf Grund B. S. Safferman, H. Lachevalier, Antivon Ergebnissen der chemischen Analysen wurde »5 biotics Annual 1957/58, S. 869) und Tetrin (K. L. von festgestellt, daß die einzelnen Bestandteile in dem R i η e h a r t jr., V. F. German, W. P. Tucker, Makrolidring ein System von vier konjugierten S. G ο 111 i e b, Justus Liebigs Annalen der Chemie, Doppelbindungen sowie ein System von zwei konju- 1963, S. 668 bis 677) sind.

gierten Doppelbindungen enthalten. Jedes der drei Eine vergleichbare Trennung von Polifungin und

Antibiotika der Bestandteile von Polifungin besitzt 30 Nystatin durch Gegenstromextraktion im Craigauch das glykosidisch gebundene Mykosamin, ein Apparat hat gezeigt, daß die Fraktion A des PoIi-Mannosederivat. Auf diesen Eigenschaften basierend fungin-Komplexes und Nystatin eine identische Stelwurde Polifungin in die Polyenantibiotika aus der lung des Extraktionsmaximums aufweisen. Die Frak-Tetraengruppe eingereiht. tion B des Polifungins hat keinen entsprechenden

Die papierchromatografische Trennung des PoIi- 35 Bestandteil im Nystatin-Präparat. Bei der Durchfungin-Komplexes im System des mit Wasser gesättig- führung von weiteren vergleichenden Untersuchungen ten Butanols und mit der biologischen Entwicklung des Polifungin-Präparates aus der Fraktion A und unter Anwendung des Stamms Saccharomyces cere- Nystatin erwies es sich, daß die Polifungine A₁ und A_s visiae als Testmikroorganismen ist in der F i g. 1 eine identische Stellung des Extraktionsmaximums, dargestellt, in der Punkt Nr. 1 der Auftragung des 40 wie die Bestandteile A₁ und A₂ des Nystatins, aufAntibiotikums dem Präparat von Polifungin-Kom- weisen. Die Anwesenheit von Polifungin B im PoIiplex, Punkt Nr. 2 dem Präparat von Polifungin A, fungin-Komplex unterscheidet wesentlich diese zwei Punkt Nr. ? dem Präparat von Polifungin B, Punkt Antibiotika, nämlich Nystatin und Polifungin.
Nr. 4 der Mischung der Präparate von Polifungin A Das zweite der beschriebenen Tetraen-Antibiotika,

und B entsprechen. 45 die mehr als einen biologisch wirksamen Bestandteil

Die dünnschichtchromatographische Trennung des enthalten, ist Tetrin, das in die Bestandteile A und B Polifungin-Komplexes auf Silicagel im System von getrennt wurde. Im Gegensatz zu Polifungin wurde Methanol-Chloroform-Wasser 2:2:1 und mit der für beide Tetrin Bestandteile die Abwesenheit von biologischen Entwicklung unter Anwendung desselben Diengruppen und ein niedrigeres Molekulargewicht Testmikroorganismus ist in der F i g. 2 dargestellt, so festgestellt, was diese zwei Antibiotika Tetrin und in welcher die Nummern der Auftragungspunkte den Polifungin wesentlich unterscheidet.
Präparaten nach der Reihenfolge wie oben ent- Das dritte der beschriebenen antifungalen Anti-

sprechen. biotika dieser Art ist Antimykoin. Bei seiner chromato-

Die beiden chromatographischen Trennungen haben graphischen Trennung wurde die Anwesenheit vor die Anwesenheit von zwei Bestandteilen des FoIi- 55 zwei biologisch wirksamen Bestandteilen festgestellt, fungins bewiesen: der Fraktion A und Fraktion B mit welche Antimykoin A und B genannt wurden. Dei antifungaler Wirkung. · dieses Antibiotikum erzeugende Stamm verlor mil

Eine Bestätigung der chromatographischen Ergeb- der Zeit die Fähigkeit, den Bestandteil B zu syniheti· nisse gibt die Trennung von Polifungin nach der sieren. Es ist deshalb unmöglich, die vergleichender Methode der Gegenstromextraktion mit 400 Über- 60 Untersuchungen durchzuführen, um so mehr, als aucli führungen im System Methanol-Chloroform-Borat- die Literaturangaben über dieses Thema nur bePufferlösung 2:2:1 bei einem pH-Wert von 8,2, schränkt sind.

welche in der F i g. 3 dargestellt ist, in der die Ver- Polifungin B entspricht keinem der bisher beschrie-

teilungskurve auch die Anwesenheit von zwei Be- benen Tetraen-Antibiotika, was durch den Unterstandteilen beweist, und zwar, der Fraktion A, deren 65 schied im Anteil von vor allem Kohlenstoffatomen Maximum im Gläschen Nr. 352 auftritt, und der in dem Molekül bewiesen ist. Eine Zusammenstellung Fraktion B, deren Maximum im Gläschen Nr. 305 zu der Summenformeln für die bekannten Tetraen-Anti-• finden ist. Die in der F i g. 4 dargestellten Ultra- biotika und Polifungin B ist in der Tabelle 1 gegeben