DE2039990A1 - Neue Antibiotika und Verfahren zu ihrer Herstellung - Google Patents

Description

PATENTANWÄLTE «JA Oft« Oft

. VONKREISLER DR.-ING. SCHtJNWALO 203999Q DR.-ING. TH. MEYER DR. FU¹ES DIPL.-CHEM. ALEK VON KREISLER DIPL-CHEM. CAROLA KELLER DR.-ING. KLÖPSCH

KÖLN 1, DEICHMANNHAUS

Köln,den 6.8.1970 Kl/Ax

Takeda Chemical Industries_r Ltd.,

27t Doshomachi 2-chome, Higashi-ku, Osaka (Japan)«

Neue Antibiotika und Verfahren zu ihrer Herstellung

Die Erfindung betrifft neue Antibiotika "B-5Q5O^M und ihre Herstellung.

Es wurde gefunden, daß eine Gruppe von neuen antibiotischen Substanzen von einem zur Gattung Streptomyces gehörenden Mikroorganismus gebildet und in der Kulturbrühe angehäuft wird, und daß die einzelnen Mitglieder oder Komponenten der neuen Antibiotika in ihren Eigenschaften sowie in ihren chemischen Strukturen eng verwandt sind, daß sie jedoch aus der Ku.lturbrühe getrennt als

tO Einzelverbindungen oder als Gemische in jedem gewünschten Reinheitsgrad isoliert werden können. Die Gruppe der neuen Antibiotika ist mit dem Sammelbegriff "Antibiotikum B"-505O^H bezeichnet worden. Es wurde ferner gefunden, daß das Antibiotikum B-5050 als aktive Bestandteile die Antibiotika enthält, die als Antibiotika B-5O5O-A, B-5O5O-B, B-5050-tO, B-5O5O-D, B-5O5O-E und B-5O5O-P bezeichnet worden sind. In dieser Beschreibung und in den Ansprüchen wird d4her jeder dieser aktiven Bestandteile oder ein ■ Gemisch von zwei oder mehr dieser Bestandteile einfach mit dem Sammelbegriff "Antibiotikum B-5050» bezeichnet, falls nicht anders angtgeben.

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Sie Erfindung umfaßt demgemäß das neue und wertvolle Anti_T blotikum B-5050 als Geaamtgemisoh oder in Form der einzelnen Mitglieder oder von Gemischen bestimmter Mitglieder, ein Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums B-5050 durch Züchtung von Mikrobien sowie Verfahren zur Isolierung des als Produkt gebildeten Antibiotikums B-5050 als Gesamtgemisch oder in Form der Einzelmitglieder oder in Form von Gemischen der Einzelmitglieder.

Sie Aufgabe, die die Erfindung sich stellt, wird gelöst durch Kultivierung eines das Antibiotikum B-5O5O bildenden Mikroorganismus der Gattung Streptomyces in einem geeigneten Kulturmedium, bis das Antibiotikum B-5050 in der Kulturbrühe in wesentlichen Mengen angehäuft worden ist, und Isolierung der Produkte.

Für die Zwecke der Erfindung werden Mikroorganismen verwendet, die zur Gattung Streptomyces gehören und das Antibiotikum B-5050 zu bilden vermögen. Zu diesen Mikroorganismen gehört beispielsweise Streptomyces hygroscopl-CU8 B-5050, der von den Erfindern von einer Bodenprobe in Chichibu, Saitama (Japan) isoliert wurde. Die mikrobiologischen Eigenschaften dieses Mikroorganismus sind nachstehend beschrieben. In der folgenden Beschreibung bedeutet ^MRdg.^M die entsprechende Farbbezeichnung aus Ri dg way "»Color Standards and Color Nomenclature¹¹. Die Beobachtungen wurden an Kultivierungen bei 28⁰G für 14 Tage gemacht, falls nicht anders angegeben. Die Abkürzungen ^NWⁿ, ^MLⁿ, ^WR^M und ^MLP^M haben folgende Bedeutungen! W ■ Wachstum, L » Luftmycel, R β Rückseite und LP- lösliches Pigment.

Morphologische Eigenschaften

Sie sporentragenden Hyphen sind schleifenförmig oder < spiralförmig. Jede Spore ist elliptisch oder zylindrisch ' und hat eine Größe von etwa 0,7 bis 1,7 Λΐ χ etwa 0,9 bis 1,4/* und eine glätte Oberfläche. . ^l

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Kultureigenschaften

1) Czapek-Agar

W: gut, farblos bis blaßgelblich-braun L: gut, samtartig, weiß bis Pale Olive Gray 5 (Rag.LI, 23^tlM-f) oder Light Olive Gray (Rdg.

■ I₁J₁ 23""-<3) mit schwarzen Flecken. : R: Smoke Gray (Rdg. XLVI, 21"^M-d) LPi nicht vorhanden

ι 2) Glucose-Czapek-Agar
.10' W: mäßig, farblos

■ L: mäßig, weiß bis Pale Drab Gray (Rdg.XLVI, 17""-f) R: farblos bis Pale Drab Gray (Rdg. XLVI, 17""-f)

: · LP: Pale Vinaceous-Fawn (Rdg. XL, 13^IM-f).

?) Glycerin-Czapek-Agar
15 W: mäßig, farblos

; Li mäßig, pulverförmig, weiß bis Pale Drab Gray j (Rdg. XLVI, 17""-f).

.j R: Cream Color (Rdg.XVI, 1?^f-f). i LP: nicht vorhanden

20 4) Glucose-Asparaßin-Agar

W: mäßig, farblos bis blaßgelb

Li mäßig, weiß bis gräulich-braun..mit schwarzen Flecken

Ri Cream Color (Rdg.XVI, 19^!-f) bis Smoke Gray 25 (Rdg.XLVI 21""-d)

LPi nicht vorhanden oder blaß-gelblichbraim

5) Nähragar

Wi mäßig, sich ausbreitend, farblos bis schwachgelb L: mäßig, weiß

·, 30 Ri Cream Color (Rdg. XVI, 19'-f)

'' LPi schwachgelb

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6) Nährbrühe

Wi schlecht bis mäßig, farblos, sinkt zu Boden Lj nicht vorhanden : LPίnicht vorhanden

I 5 7) Glycerln-Nähragar ι W: gut, faltig, farblos bis schwachgelb • L: gut, weiß

j Ri Cream Buff (Rdg.XXX, 19" -f) LPi gelb bis goldgelb

j10 8) Glucose-Nähragar

! Wi gut, faltig, farblos bis schwachgelb ■ Li gut, weiß bis Pallid Mouse Gray (Rdg.LI, 15^nnt-f) ; ' Rt Sorghum Brown (Rdg.XXXIX, 19"'-i) LPi Fawn Color (Rdg.XL, 13"')

15 9) Stärke-Agar , Wi schlecht, farblos j Li nicht vorhanden oder schlecht, weiß j Ri blaßgelb j LPi nicht vorhanden

20 10) Hefeextrakt-Aear

Wi gut, faltig, farblos bis echwachgelb " Li gut, weiß

' Ri Cream Buff (Rdg. XXX, 19"-d) LPi gelb bis goldgelb

25 11) Ei (kultiviert bei 37⁰C)

Wi mäßig, sich ausbreitend Li mäßig, pulverförmig, weiß LPi nicht vorhanden

12) Kartoffel-Stichkultur : 30 Wi gut, faltig, erhöht, blaßgelb

Li schlecht, weiß bis Pallid Mouse Gray (Rdg. LI, 15«wi_f)

LPi nicht vorhanden

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15) Möhren-Stiohkultur W: gut, faltig Li mäßig, weiß LPi nicht vorhanden

U) Lackmusmilch (kultiviert hei 37°C) W: ringförmig, sinkt später zu Boden L: nicht vorhanden Peptonisierung ohne Koagulierung

15) Löffler-Serum (kultiviert bei 37°C) Wj mäßig, glänzend, farblos L: nicht oder schlecht, weiß LPj nicht vorhanden keine Verflüssigung

16) Gelatine-Stichkultur (kultiviert 25 Tage bei 24°C) : 15 Wj schlecht, begrenzt, blaßgelb J Lj schlecht, weiß ι keine Verflüssigung

17) Oellulosej kein Wachstum

18) Calciummaleat-Agar Wj mäßig, farblos Lj mäßig, pulverförmig, weiß Rj Buff Pink (Rdg.XXVIII, 11»-d) LPi Vinaceous-Oinnamon (Rdg. XXIX, 13"-b)

19) ffvrosin-Agar

Wi mäßig, farblos Li schlecht, weiß bis Light Drab (Rdg.XLVI, 17^IMI-b) Ri Drab Gray (Rdg.XLVI, 17""-d) bis Light Drab

(Rdg.XLVI, 17"ⁿ-b) LPi nicht vorhanden

30. 20) Pepton-Agar Wi schlecht, farblos Li schlecht, weiß Ri farblos

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LP: nicht vorhanden

21) Nitratreduktion: Positiv auf Czapek-Nährlösung und

Peptomedium.

22) Hydrolyse von Stärke:
Wachstumszone: 8 bis 10 mm Enzymatische Zone:27 his 30 mm

Wenn dieser Stamm auf einem synthetischen Medium kultiviert wird, ist das vegetative Mycel farblos oder blaß-

j gelb bis blaßbraun. Lösliches Pigment wird nicht gebildet;

I 10 wenn es gebildet wird, ist es Pale Vinaceous-Fawn

; (Rdg.XL, 13"*-f) oder blaß-purpur bis blaß-gelblichbraun.

j Das Luftmycel ist zuerst weiß, später Pale Olive Gray

! (Rdg. LI, 23^IIIIf-d) bis Pale Drab Gray (Rdg.XLVI, 17"^M-f)

j oder wird in einigen Fällen schwarz. Bei Kultivierung auf

j 15 einem proteinhaltigen Medium ist dieser Stamm farblos oder

j ■ gelb bis Fawn Color (Rdg.XL, 13^MI), bildet jedoch kein

! melanoides Pigment. Dies bedeutet, daß dieser Stamm ein

j nicht-chromogener Typ ist.

; Ausnutzung von Kohlenstoffquellen

20 Die Beobachtungen nach der Methode von Pridham und

j Gottlieb (Journal of Bacteriology, Band 59, Seite 107

! (1948)) an Kulturen, die 10 Tage bei 2O⁰C bebrütet wurden,

! sind nachstehend in Tabelle 1 zusammengestellt.

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Tabelle 1

Kohlenstoffquelle	Wachstum	Kohlenstoffquelle Wachstum
Erythrit	+	Maltose +++
Adonit	+++	Saccharose +++
D-Sorbit	+++	Lactose ++
i-Inosit	++	Raffinose +++
D-Mannit	+++	Trehalose +++
Dulcit	+	Salicin
D-Xylose	+	Esculiη
L-Arabinose	+	Inulin + oder +
L-Sorbose	+	D-Mannoee +++
D-Galactose	+++	Stärke +++
D-Glucose	+++	Glycerin +++
D-Pructose	+++	Natriumacetat +
Rhamnose	+	Natriumsuccinat ++
Melibiose		Kontrolle -

+++: Reichliches Wachstum
++i Gutes Wachstum
+: Mäßiges Wachstum

+: Schlechtes Wachstum

-: Kein Wachstum

Ein Vergleich dieser mikrobiologischen Eigenschaften des Stammes B-5O5O mit denen bekannter Mikroorganismen an Hand von S.A. Waksman "The Actinornycetes", Band 2. (herausgegeben von The Williams & Wilkins Co. 1961) ergibt, daß dieser Stamm mit Streptomyces hygroscopicus in den meisten Merkmalen mit Ausnahme der Fähigkeit zur Bildung von löslichem Pigment auf synthetischen Medien, der Oeilulosezersetzung, Nitratreduktion usw. eine große Ähnlichkeit · hat. Aus diesen Beobachtungen wird geschlossen, daß der Stamm B-5O5O zu Streptorayces hygroscopicus gehört. Eine Probe dieses Stammes wurde beim Institute for Fermentation, Osaka (Japan) unter der Nummer IFO-12995 hinterlegt. In dieser Beschreibung wird dieser Stamm als "Streptorayces

35. hygroscopicus Nr.B-5O5O" oder einfach als "Stamm B-5050"

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bezeichnet. Es ist zu bemerken, daß "Streptomyces hygroacopicus (IPO-12995)" eine hinterlegte Probe dieses Stammes bezeichnet. .

Das antibiotische Spektrum des Stammes B-5O5O, ermittelt nach der Kreuz-, Stichmethode, ist in Tabelle 2 angegebenJfes Ergebnis wurde wie folgt erhalten: Der Stamm wurde auf eine Nähragarplatte (p„ 7,0) oder eine G-lycerin-Nähragarplatte (pjt 7»0) aufgestrichen. Der Mikroorganismus wurde 4 Tage bei 28⁰C bebrütet. Der in Tabelle 2 genannte Testorganismus wurde quer über den Strich dieses Stammes auf der Platte aufgestrichen, wobei erneut 18 Stunden bei 37⁰C (im Falle gewöhnlicher Bakterien) oder 40 Stunden (im Falle von säurefesten Bakterien) kultiviert und anschließend die Länge der Hemmzone gemessen wurde. Das Ergebnis zeigt, daß der Stamm B-5O5O das Wachstum von grampositiven Bakterien stark hemmt und auch das Wachstum von Mycobacterium avium.hemmt.

	Tabelle	2	0	_	Hemmzone, mm	0	-	28	-	35
TestOrganismus		Länge der	0		Glycerin-Nährap.ar	0	27	36
	Nährapar	32		0	30	23
Escherichia coli	0	0	0
Proteus vulgaris	0	>40	29
Staphylococcus aureus	30	30
dto. (*)	0	23	29
Bacillus subtilis	>40	39	27
Bacillus cereus	26	36
Bacillus brevis	31	34
Sarcina Iutea	35	34
Micrococcus flavus	34	20
Mycobacterium avium

(*)i Dieser Stamm ist gegen Oleandomycin und Erythromycin

resistent.
- s nicht getestet

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Die Beobachtung dieses Stammes nach der Kreuzstrich-Agar-Scheibenmethode (Motoo Shibatai Annual Reports of The Takeda Research Laboratories, Band 20, Seite 222 ff.(1956)) unter Verwendung von Bacillus subtilis als Testorganismus 5 und Mhragarplatten als Testmedium hat ergeben, daß der Stamm B-5O5O ein physiologisch basisches Antibiotikum bildet. Das Ergebnis der Beobachtung ist in Tabelle 3 genannte .

Tabelle 3

10 Testorganismus p^-Wert des Länge der Hemmzone

Testmediuros mm

j Bacillus subtilis 6 15 15 j 8 23 23

i Die mikrobiologischen Eigenschaften der zur Familie

j 15 Actinomycetaceae gehörenden Mikroorganismen, insbesondere

I der Gattung Streptomyces, liegen jedoch nicht immer fest

! und unterliegen Mutationen, gleichgültig,ob die Mutation spontan oder künstlieh hervorgebracht wird, z.B. mit Röntgenstrahlen, Ultraviolettstrahlen oder durch Einwirkung

|20 mutagener chemischer Verbindungen wie Stickstofflost,

\ Nitrosoguanidin oder Schwermetallsalzen« Streptomyces

! hygroscopictts B-5O5O ist keine Ausnahme und kann Mutanten

j ' ergeben, die vom Ursprungsstamm etwas abweichen, bei«

! ■ spielsweise in den Kultureigenschaften. Von diesen Mutanten

Z5 ' können für das Verfahren gemäß der Erfindung alle dieje-

j nigen verwendet werden, die das Antibiotikum B-5O5O "bilden.

Gemäß der Erfindung werden Mikroorganismen, die Antibio- ; tikum B-5050 bilden und zur Gattung Streptomyces gehören,

in einem Medium kultiviert, das Quellen von assimilier-30 barem Kohlenstoff, Quellen von verwertbarem Stickstoff und j ' andere Nährstoffe enthält. Das Kulturmedium kann flüssig j · oder fest sein, jedoch ist ein flüssiges Medium vorteil- ; hafter und zweckmäßiger.

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- ίο -

Im Medium werden eine oder mehrere Quellen von assimilierbarem Kohlenstoff wie Glucose, Saccharose, Maltose, Dextrin, Glycerin und Stärkesirup und eine oder mehrere Quellen von verwertbarem Stickstoff, z.B. Pepton, Sojabohnenmehl, Maisquellwasser, Fleischextrakt, Reiskleie, Weizenkleie, Harnstoff und verschiedene Ammoniumsalze (z.B. NH.C1, NH.NO, und (NEL)₂SO-) sowie geringe Mengen anorganischer Salze, die üblicherweise für die Kultivie-, rung von Mikroorganismen verwendet werden, z.B. Natrium-Chlorid, Phosphate oder bestimmte Metallsalze von Calcium, Magnesium, Zink, Mangan und Eisen verwendet. Außerdem werden zweckmäßig ein wachstumsfördernder Stoff und ein Antischaummittel, z.B. Fett, öl oder Mineralöl, nach Bedarf zugesetzt.

Der das Antibiotikum B-5O5O bildenae Stamm bildet häufig unter üblichen Bedingungen auch andere Antibiotika zusammen mit dem Antibiotikum B-5050. Zur vorteilhaften Herstellung von Antibiotikum B-5050 ist eine sorgfältige Wahl des Stammes und des Kulturmediums zu empfehlen. Beispielsweise wird bei Verwendung des Stammes B-5050 vorzugsweise ein Kulturmedium verwendet, das etwa 3 bis 5/£ einer Kohlenstoffquelle und etwa 1 bis 2# einer Quelle von organischem Stickstoff enthält.

Die Kultivierung kann in stationärer Kultur erfolgen, jedoch ist im allgemeinen die Submerskultur mit Bewegung durch Belüftung vorteilhafter. Im letzteren Fall wird der Po-Wert des Kulturmediums vorzugsweise im neutralen Bereich, d.h. bei etwa 6 bis 8, vorzugsweise bei etwa 6,8 bis 7,4 gehalten. Die Kultivierungstemperatur liegt zwischen etwa 20 und 43⁰C, insbesondere im Bereich von 23 bis 32⁰C.

Die in der beschriebenen Weise erhaltene Fermentationsbrühe enthält die Komponenten von Antibiotikum B-5050. Die Isolierung dieser Gruppe von Antibiotika kann nach !

■I

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den Methoden erfolgen, die bisher zur Gewinnung von Metaboliten eines Mikroorganismus aus seiner Fermentationsbrühe angewandt wurden. Beispielsweise kann unter Wahrnehmung des Vorteils, daß die Antibiotika dieser Klasse schwach basische und fettlösliche Substanzen sind, die Abtrennung nach Methoden, bei denen diese Eigenschaften ausgenutzt werden, erfolgen.

Da das Antibiotikum B-5C5O vorwiegend in der flüssigen ! Phase der Permentationsbrühe angehäuft wird, kann die 10 Brühe zur Entfernung des Mycels zuerst filtriert werden, worauf die aktiven Bestandteile mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen lösungsmittel bei einem pg-Wert im schwach basischen Bereich aus der filtrierten Brühe extrahiert werden können. Beispielsweise wird die filtrierte Permentationsbrühe auf einen p_H-Wert von etwa 7 bis 10

eingestellt und mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert, das mit Wasser nicht mischbar oder nicht vollstän-. dig mischbar ist, z.B. mit einem Ester einer niederen ^; Fettsäure (z.B. Äthylacetat und n-Butylacetat), einem ' 20 halogenierten aliphatischen Kohlenwasserstoff (z«,B„ Chloroform und Äthylenchlorid), einem Keton (z.B. Methyl-' äthylketon und Methylisobufcylketon), einem aromatischen Kohlenwasserstoff (z.B. Benzol und Toluol), einem Alkohol (z.B. n-Butanol) oder'einem Geraisch von zwei oder mehreren dieser Lösungsmittel.

Der im Mycel enthaltene Anteil der Antibiotika kann nach Filtration der Kulturbrühe mit einem wasserlöslichen organischen Lösungsmittel, z.B. Aceton oder Methanol oder einer verdünnten wässrigen Säurelösung, aus dem Mycel extrahiert werden. Aus den Extrakten werden die aktiven · Bestandteile durch Filtration, Einengung unter vermindertem Druck und-Extraktion mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel der oben genannten Art isolierte Aus der wässrigen Säurelösung können Gie durch Filtration, Einstellung auf einen p„~Wert im neutrr.len

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oder schwach "basischen Bereich und Extraktion mit einem der genannten mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel isoliert werden·

Die aktiven Bestandteile in der Fermentationsbrühe können an einem Adsorptionsmittel wie Aktivkohle, weißer Kohle ; (kolloidales Siliciumdioxyd) o.dgl. aösorbiert werden.

Sie können dann mit einem geeigneten Entwickler oder j Blutionsmittel, z.B. einem wässrigen Alkohol (beiepieleweise wässriges Methanol und wässriges Äthanol), wässrigem Aceton oder einem Gemisch einer solchen wässrigen Lösung ; mit einer Säure, einem organischen Lösungsmittel (z.B. Xthylacetat und Chloroform) o.dgl, eluiert werden.

Unter Ausnutzung des Vorteils der Tatsache, daß das Antibiotikum B-5O5O basisch ist, können die aktiven Beständig teile auch an einem Kationenau3tausoherharz adsorbiert ! werden, z.B. an den Produkten der Handelsbzelchnung : "Amberlite IRC-50", »Amberlite IR-120« (Hersteller Rohm ^; & Haas Co., U.S.A.) oder "Dowex 5O^W (Hersteller Dow ; Chemical Co., U.S.A.). Die an einem solchen Harz adsor- . bierten aktiven Bestandteile können dann mit einem geeigneten Elutionsmittel, z.B. einer verdünnten wässrigen Säurelösung, einer verdünnten wässrigen basischen Lösung, einer wässrigen sauren Methanollösung, einer wässrigen basischen Methanollösung, einer wässrigen sauren Acetonlösung und einer wässrigen basischen Acetonlösung, eluiert werden.

Der auf diese 'Weise erhaltene organische Extrakt wird, vorzugsweise nach einer Wäsche mit Wasser, weiter in eine wässrige Säurelösung überführt. Die Säurelösung kann für diesen Zweck eine verdünnte wässrige Säurelösung oder eine saure Pufferlösung sein. Der hierbei erhaltene wässrige Extrakt wird dann auf einen p„-Wert im neutralen öder schwach basischen Bereich eingestellt und kann erneut mit einem der oben genannten, mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel extrahiert werden.

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Wenn der Gehalt an aktiven Bestandteilen im hierbei erhaltenen Lösungsmittelextrakt verhältnismäßig hoch ist, kann das Antibiotikum B-5050 bereits durch Einengung de3 ; Extrakts unter vermindertem Druck auskristallisieren· j" 5 Wenn dies nicht der Fall ist, wird ein nicht polares organisches Lösungsmittel, z.B. Petroläther oder η-Hexan, dem • Konzentrat zugesetzt, wobei das rohe pulverförmige Anti- : biotikum B-5050 sich abscheidet. Das-pulverförmige Produkt j kann aus einem organischen Lösungsmittel, z.B. Benzol, j 10 Diäthyläther, Äthylacetat, einem Äthylacetat-n-Hexan-Gei misch, einem Aceton-n-Hexan-Gemisch, einem Aceton-Wasser-J Gemisch oder Äthanol-Wasser-Gemisch, kristallisiert werden.

i Wenn das rohe Pulver farbige Verunreinigungen enthält, ■ können diese mit Hilfe von Aktivkohle entfernt werden.

15 In dem besonderen Fall, in dem das Antibiotikum B-5050

selbst durch die oben beschriebene Behandlung nicht kri- : stallisierbar ist, kann eine weitere Reinigung mit Adsorp- ! tionsmitteln wie Kieselgel oder Aluminiumoxyd vorgenommen I werden. Die adsorbierten Bestandteile können mit einem 20 Fettsäureester (z.B. Methylacetat, Äthylacetat und n-Butylacetat) oder einem Lösungsmittelgemisch (z.B. Benzol-Aceton, Benzol-Äthylacetat, Benzol-Methanol und Chloroformj. . Methanol) eluiert werden.

! Das Antibiotikum -Gemisch B 5050 und seine einzelnen Koinpo-25 nenten sind basische Substanzen und können Salze mit wasserlöslichen Säuren wie Salzsäure, Schwefelsäure, Weinsäure, Nicotinsäure o.dgl. bilden.

Nachstehend sind die allgemeinen Eigenschaften des j Gemisches der Antibiotika B-5050 genannt, jedoch ist zu 30 bemerken, daß-die genannten Werte an einer ErObe des gemäß Beispiel 7 hergestellten Gemisches der Antibiotika B-5050 ermittelt wurden, und daß natürlich bei anderen Proben von , Antibiotika B-5050 gewisse Abweichungen von den speziellen

ι Il

'j Werden auftreten können.

■•35 1) Schmelzpunkts 137 bis 141⁰C

' "' · ' " ' ' " J0Ö80Ö./22SS

-u-

2) Elementaranalyse: C HN

Umkristallisiert

aus Benzol« 58,14 + 0,5 7,88 + 0,3 1,73 + 0,3

ümkristallisiert
aus Äthylacetat: 57,83 ± 0,5 8,14+0,3 1,33+0,3

3) Molekulargewicht, gemessen durch Dampfdruckosmose:

880 + 90 (in Äthylacetat)

4) Spezifische Drehung:

(a)£⁴ : -76,4° + 8° (c»1,.Äthanol) 5) Farbreaktionent

Dragendorff-Reaktion: positiv

Erythromycintest: positiv mit Auftreten einer rötlichen Purpurfarbe, während die Chloroformschicht blaßblau sein kann. Carbomycintest: negativ

6) Löslichkeit:

Leicht löslich in Methanol, Äthanol, Aceton, Äthylacetat, Methyläthylketon, Chloroform und wässrigen Säurelösungen; löslich in Benzol und Diäthyläther; schwerlöslich in η-Hexan und neutralem Wasser.

7) Ultraviolettabsorption:

Kein ausgeprägtes Maximum in Methanol

8) Infrarotabsorption:

Wie Pig.1 zeigt (KBr-Scheibe), enthält das Infrarot-25· spektrum die folgenden hauptsächlichen Absorptionsbanden (cm )i

3448 (stark), 2924 (mittel), 1736 (stark), 1453(mittel), 1376 (mittel), 1295 (mittel), 1167 (stark), 1081 (stark! 1050 (stark), 968 (mittel), 912 (mittel), 861(schwach), 840(schwach).

Wie bereits erwähnt, besteht das Antibiotikum gemäß der _; Erfindung aus mehreren Komponenten· Bisher wurden wenigstens eeohs Komponenten bestätigt, die in ihren chemischen und biologischen Eigenschaften nahe verwandt sind. Dies läßt sich leicht bestätigen, indem das Antibiotikumgeraisoh

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der Papierchromatographie oder Dünnschichtehromatographie unterworfen wird. Beispielsweise wurden die jeweiligen Bestandteile wie folgt identifiziert:

1) Papierchromatographie

Papier: Toyoroshi Nr.50, imprägniert mit einer 2$igen _t Lösung von Paraffin in Ligroin Entwickler: M/15-Phosphatpufferlösung, p_H 8,0, gesättigt mit n-Butylacetatj

j «Nachweis: Bioautographie unter Verwendung von '10 Bacillus subtilis als !Pestmikroorganismus.

j Rf-Werte: B-5O5O-A = 0,32 + 0,05 ■ B-5O5O-B «0,38+0,05

•B-5O5O-C «0,66+0,05 B-5O5O-D =0,72+0,05 B-5O5O-E * 0,74 + 0,05

B-5O5O-F β 0,82 + 0,05

2) Dünnschichtchromatographie Dünnschicht:

a) Kieselgel ,("Spotfilm f^M, Hersteller iokyo Kasei K.K., ,20 · Japan), 1 Stunde auf 105⁰C vorerhitzt.

b) Kieselgel ("Kieselgel G", Hersteller Merck AG, Darmstadt)

c) wie (b)

Entwickler«

25' a) Benzol-Aceton (Volumenverhältnis 3:2) To) Benzol-Aceton (Volumenverhältnis 3:2) c) Benzol-Methanol (Volumenverhältnis 10:1), jedoch

mit dreimaliger Wiederholung der Entwicklung. Nachweis:

a) Konzentrierte HpSO. aufgesprüht *b) und c): Behandlung wie folgt:

1) Eine"5$ige lösung von Phosphomolybdat in Äthanol wurde aufgesprüht und 5 Minuten bei 110⁰O getrocknet.

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- 16 -

2) eine 5$ige Cersulfatlösung. in "In-HgSO, wurde aufgesprüht und 5 Minuten bei 11O⁰G getrocknet.

3) Eine 10$ige wässrige HgSO^-Lösung wurde aufgesprüht und 5 Minuten bei 110⁰C getrocknet,

4) Konzentrierte HpSO. oder eine 5$ige Jodlösung in Chloroform wurde aufgesprüht.

Rf-Werte:	0,48	(a)	0,68	(b)	0,71	(c)
B-5O5O-A	0,42	± 0,05	0,63	+ 0,05	0,66	+ 0,05
B-5050-B	0,37	+ 0,05	0,57	± 0,05	0,61	+ 0,05
B-5050-C	0,32	+ 0,05	0,53	+ 0,05	0,55	+ 0,05
B-5O5O-D	0,30	+ 0,05	0,50	± 0,05	0,52	+ 0,05
B-5O5O-E	0,27	± 0,05	0,43	+ 0,05	0,48	+ 0»05
B-5O5O-F	± 0,05	+ °»°5	+ 0,05

Zur Abtrennung oder Isolierung dieser Bestandteile bei der Großherstellung werden Methoden der Adsorptionsch.romatographie, Verteilungschromatographie oder Gegenstromverteilung empfohlen.

Als Adsorptionsmittel für die Adsorptionschromatographie eignen sich beispielsweise Kieselßel und Aluniiniumoxyd.

Wenn beispielsweise Kieselgel verwendet wird, kann die Elution mit einem Gemisch eines nichtpolaren or£anischen Lösungsmittels und eines polaren organischen Lösungsmittels erfolgen, wobei die einzelnen Bestandteile fraktionierend in der Reihenfolge der Affinität zum nichtpolaren Lösungsmittel eluiert werden, d.h. in der Reihenfolge Antibiotikum B-5O5O-A, -B, -C, -D, -E und -F. Als Elutionsmittel geeignete Lösungsmittelgemische sind beispielsweise Bensol-Äthylacetat, Benzol-Aceton, n-Hexan-Methanol und Chloroform-Ilethanol.

Als Mittel zur Ausnutzung des Unterschiedes in der Verteilung zwischen zwei Flüssigphasen ist die Kombination eines lipophilen organischen Lösungsmittels (z.B. Äthylacetat) und einer'-wässrigen Pufferlösung zu empfohlen.

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Durch Verwendung einer Pufferlösung mit einem ρττ-Wert von 5,5 können die Antibiotika B-5O5O-D, B-5O5O-E und B-5050-F in den Puffer überführt werden, während B-5O5O-A, B-5050-B und B-5O5O-C in der organischen Lösungsmittelphase bleiben. Aus der letztgenannten Lösungsmittelphase kann B-5O5O-C mit einem Puffer, der einen p^-Wert von 4,9 hat, extrahiert werden. Mit einem Puffer vom p_H~¥ert 4,4 können B-5O5O-B und B-5O5O-C aus der oben genannten organischen Schicht extrahiert werden, während B-5O5O-A in der organischen Lösungsmittelphase bleibt. Auf diese Weise können die einzelnen Bestandteile endgültig isoliert werden.

Die VerteilungsChromatographie ist eine weitere geeignete Methode« Als Träger der stationären Phase sind die üblicherweise verwendeten Materialien wie Cellulosepulver oder Diatomeenerde (z.B. die Produkte der Handelsbezeichnung "Gelite" oder "Hyflo Super CeI", Hersteller Johns Manville Sales Corp., USA) geeignet.

Die Eigenschaften und Kennzahlen der aktiven Bestandteile von Antibiotikum B-5O5O sind nachstehend angegeben.

1) Sehmelzpunkt (Zers.)j gemessen an Proben, die aus einem Gemisch von Aceton und η-Hexan (Volumenverhältnis 1:3) umkristallisiert worden sindi

B-5050-At	129	bis	1320C
Β-5050-Βί	134	bis	136°O
B-5050-Ci	135	bis	1380C
B-5O5O-D:	143	bis	1460C
Β-5050-Εί	144	bis	1490C
B-5050-Fi	149	bis	1540C

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2033990

2) Elementaranylyse:

Β-5Θ5Ο-Α B-5O5O-B B-5O5O-C B-5O5O-D B-5O5O-E B-5O5O-F

C H

59,40+ 0,5 8,15 + 0,3

58,67 + 1,0 8,02 + 0,5

57,93 ± 1,0 8,18 + 0,5

57,48 + 1,0 8,17 + 0,5

57,34 + 1,0 8,25 + 0,5

58,59 + 0,5 7,82 + 0,3

1,40 + 0,3

1,86 + 0,5

1,69 + 0,5

1,64 + 0,5

1,34 + 0,5

1,62 + 0,3

3) Molekulargewicht:

Alle Komponenten haben ein Molekulargewicht von etwa j 10 800 bis 900, gemessen durch Dampfdruckosmose in ! Äthylacetat.

^; ' 4) Spezifische Drehung:

	B-5O5O-A:
	B:
15	C:
	D:
	E:
	F:

-72,3°+ 7° (c=i, Äthanol) -71,9° + 7° (c=1, Äthanol)

Ct²J³ -76,0° + 8° (c=1, Äthanol)

Ct²J³ -76,2° + 8° (c =1, Äthanol)

α²)³ -73,6° + 7° (c=1, Äthanol)

α²,³ -77,7° + 8° (c=1, Äthanol)

5) Farbreaktionen:

20 · Alle Komponenten sind positiv in der Dragendorff-Reaktion und beim Erythromyointest, aber negativ im Carbomycintest.

6) Löslichkeit:

Alle Komponenten sind löslich in Methanol, Äthanol, 25 Aceton, Methylethylketon, Äthylacetat, Benzol, Diäthyläther, Chloroform und wässrigen Säurelösungen, aber schwerlöslich in η-Hexan und neutralem Wasser.

7) Ultraviolettabsorption»

Alle Komponenten haben kein ausgeprägtes Absorptions-30 maximum.

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8) Infrarotspektrum (Or-Seheibe) ·.

B-5O5Q-A: wie in Fig„2 dargestellt mit folgenden Hauptabsorptionsbanden in Wellenzahlen (cm ): 3448(mittel), 2941(mittel), 1739(stark), ί458(schwach), 1374(mittel), 1295(mittel), '1188(stark), 1167(stark)_s 1120(mittel), 1086 (stark), 1053(StBrIc), 1033 (stark), 971(mittel), 917(schwach), 862(mittel).

B-5050-B: wie in Pig.3 dargestellt mit folgenden Hauptabsorptionsbanden in Wellenzahlen (cm^r )s

35OO(stark), 2990(stark), 2960(stark), 1740(sehr stark), 1454(mittel), 1370(mittel), 1296(mittel), 1233(stark)₉ 1188(Schülter), 1-166(sehr stark), 1120(stark), 1080(stark), . 1052(sehr stark), 1O25(sehr stark), 968(mittel), 916 (schwach), 858(schwach), 842(schwach),

B-5O5O-C: wie in Fig.4 dargestellt mit folgenden Hauptab-

sorptionsbanden in Wellenzahlen (cm ):

346O(stark), 2980(stark)_s 2940(stark), 1735(sehr stark), 1455(mittel), 1375(stark), 1357 (stark), 1295(stark), 1270(stark), 1240(mittel), 1183(Schulter), 1162(sehr stark), 1080(sehr stark), 1050(sehr stark), 1028(Schulter),. 1018(Schulter), 972(mittel), 910(mittel), 862(sohwach), 840(schwach).

B-5050-Di wie in Fig.5 dargestellt und mit folgenden ausgeprägten Absorptionsbanden in Wellenzahlen (cm )i

3440(stark), 2946(mittel), 1735(sehr stark), H50(mittel), 1373(mittel), 1357(Schulter), 1296(mittel), 1274(mittel), 1237(stark), 1163(stark), 1127(mittel), 1083(stark), 1047(sehr stark), 1031(schulter), 1012(Schulter), 972(mittel), 913(mittel), 862(schv7ach), 843(schv;ach)»

B-5O5O-E; wie in Fig.6 dargestellt mit folgenden ausgeprägten Absorptionsbanden in Wellenzahlen (cm ): 343O(stark), 2920(mittel), 1732(sehr stark), 145O(mittel), 1373(mittel), 1354(mittel), 1296(mittel), 1239(stark),

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1163(stark), 11 27(rnittel), 1084(stark), 1O48(sehr atark), 1O32(Schulter)_# 1011(Schulter), 97O(raittel), 914(mittel), 862(schwach) ι 840(schv/ach),

B-5O5O-F: wie in Fig.7 dargestellt mit folgenden ausgeprägten Absorptionsbanden in Wellenzahlen (cm"* ):

3425(stark), 2994(mittel), 1745(stark), 173O(stark), 146O(schwach), 1379(mittel), 1362(mittel), 13OO(mittel), 1242(stark), 1166(stark), 1133(mittel), 1089(mittel), 1O53(stark), 1031(mittel), 973(schwach), 919(schwach), 864(schwach).

Die antibiotischen Spektren des auf die beschriebene Weise hergestellten Gemisches der Antibiotika B-5O5O und der einzelnen Komponenten (B-5O5O-A, -B, -C, -D, -E und -F) ergeben sich aus Tabelle 4· Für die Messungen wurden gewohnliche Bakterien auf einem Nähragarrnedium kultiviert, während die Micobacterium-Spezies auf einem Glycerin-Nähragar-Medium kultiviert wurden. Hefen und andere Kleinpilze wurden auf einem Glueose-Nähragar-Medium kultiviert.

Tabelle 4

Hemmende Mindestkons
20

Hemmende Mindestkonzentration (ttg/	Gemisch	A	ml)	G	J)	B-5O5O	F
Testmikroorganismus	0,5	0,2		0,5	1	E	. 2
	1	0,5	Antibiotikum	1	2	2	5
Bacillus subtilis	0,5	0,2	B	0,5	5	5	10
Bacillus cereus	1	0,5	0,2	0,5	1	10	2
Bacillus brevis	1	0,5	0,5	1	2	2	5
Bacillus megate- rium	50	20	0,2	50 >	100	5	>100
Staphylococcus aureus	50	20	0,5	50 V	100	»00	>100
Staphylococcus aureus(*1)		0,5		>1C0
Staphylococcus aureus (*2)	20
	20

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Iestmikroorganismua Gemisch A B G D Ξ F

0,1 0,2 0,5 0,5 0,5

O,1' 0,2 0,5 0,5 0,5

>100 >100 >100 MOO 5*100 VIOO

>ioo >ioo >ioo >ioo yioo

>100 >100 >100 >100 >100

>100 >100 >100 >100 >100 100 VlOO >100 >100 >100

100 >100 >100 >100 >100 100 >100 VlOO VlOO >100

100>100 >100 >100 v100 100 >10O >100 >100 >100 100 >100 >100 >100 >100

	10	Sarcina lutea	0,2	0,1
		Micrococcus flavus	0,2	0,1
		Serratia marcescens	>100	>100
; 5		Escherichia coli	>100	>100
		Proteus vulgaris	>100	>100
	15 .	Pseudomonas
f		aeruginosa	>100	>100
		Mycobacterium avium	50	50
	Mycobacterium avium
	(*3)	50	50
20	Mycobacterium avium
	(*4)	50	50
	Mycobacterium
	smegmatis	50	50
	Mycobacterium phlei	50,	50
25	Mycobacterium 607	50	50
Candida albicans	>100	—,
Saecharomyces
cerevisiae	>100	-
Penicillium
chrysogenum	>100	-
Aspergillus niger	>100	-
irichophyton
mentagrophytes	100	—

_; i Gegen Oleandomycin und Erythromycin resistenter

Stamm.

(*2)s Gegen Streptomycin, Chloramphenicol, Tetracyelin, Oleandomycin und Erythromycin resistenter Stamm«,

(*3)i Gegen Streptomycin resistenter Stamm

(*4)ί Gegen Dextromycin resiatenter Stamm
j nicht getestet.

Wie bereits erwähnt, gehört aas Antibiotikum B-5O5O auf Grund seiner Eigenschaften wie Farbreaktionen (z,B. Erythromycintest), löslichkeit (z.B» lipophil und basioch), Infrarotspektrum (z.-B, die V/erte von ¥_rt -, ■. oder V_n _ )»

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antibiotisches Spektrum (z.B. Unterschiede in den hemmenden Mindestkonzentrationen gegenüber einem gegen Erythromycin und Oleandomycin resistenten Stamm und einem empfindlichen Stamm von Stphylococcus aureus) zu den sog. "Makrolid-Antibiotika".

Unter den Makrolid-Antibiotika unterscheidet sich das Antibiotikum B-5O5O von den Antibiotika, die ein Abaorptionsmaximum bei einer Wellenlänge von 225, 230, 240 oder 280 bis 290 mu zeigen. Erythromycin "und Oleandomycin haben verhältnismäßig schwache Absorptionsmaxima im Bereich von 280 bis 290 mu, aber sie unterscheiden sich von Antibiotikum B-5O5O in ihren Infrarotspektren, Molekulargewichten, Schmelzpunkten usw.

Bisher sind Carbomycin, Relomycin und Tylosin als Makrolid-Antibiotika bekannt, die durch Streptomyces hygroscopicus gebildet werden. Diese Antibiotika haben jedoch Absorptionsmaxima bei Wellenlängen von 238, 282 bzw. 289 nm und unterscheiden sich deutlich von Antibiotikum B-5O5O. Hieraus ist zu folgern, daß das Antibiotikum B-5O5O eine neue Gruppe von Antibiotika darstellt, von denen jedes ebenfalls neu ist.

Das Antibiotikum B-5O5O hat ohne Rücksicht darauf, ob es ein Gemisch der oben "genannten aktiven Bestandteile oder ^: , ein isolierter aktiver Bestandteil ist, eine starke antimikrobische Wirkung, insbesondere gegen grampositive Bakterien^ und zeichnet sich durch eine ungewöhnlich niedrige Toxizität für Warmblüter einschließlich des Menschen : aus. Beispielsweise betrug die mittlere effektive Dosis (ED₅₀) des Gemisches von Antibiotikum B-5O5O bei Mäusen, <Ue mit Staphylococcus areus infiziert waren, 640 mg/kg ! bei oraler Verabreichung. Dagegen konnte seine mittlere } Letaldosis (LD₅₀) bei der Maus auf Grund der zu niedrigen ι Toxizität nicht bestimmt werden. Sie kann nur mit ι "über 10 000 mg/kg" bei oraler Verabreichung angegeben ; 35 werden. Ferner erh'ielten Ratten täglloh 1 g/kg des Gemiacteo

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von Antibiotikum B-5050 oral über eine Zeit von 1 Monat«, Während der Beobachtung wurden keine wesentlichen Unterschiede gegenüber der normalen Vergleichsgruppe festgestellt. Die anschließende Autopsie ergab keine wesentliehe Veränderung in den Organen und Eingeweiden der Versuchstiere.

Staphylokokken sind pyogene oder eiterbildende Bakterien» Sie pflegen umschriebene Läsionen beispielsweise in Form von Abszessen u.dgl. hervorzurufen, die häufig in der Haut auftreten. Staphylokokken sind die Ursache von Furunkeln und Karbunkeln und anderen üblichen Wundinfektionen. Die neuen Produkte gemäß der Erfindung sind v/ertvoll für örtlich anzuwendende Zubereitungen für die Behandlung dieser Art von Infektionen bei Warmblütern (Hunde, Katzen, Menschen usw.). Eine brauchbare Zubereitung für die örtliche. Anwendung zur Behandlung einer auf Staphylococcus aureus zurückzuführenden Infektion hat beispielsweise die folgende Zusammensetzungi

In 1 g Wollfett wird eine der folgenden Komponenten gleichmäßig eingearbeitet;

jt) 20 mg Antibiotikum B-5O5O-A
*2) 20 mg Antibiotikum B-5O5O-B

3) 20 mg Antibiotikum^Β-5050-σ ·

4) 50 mg Antibiotikum B-5G5O-D
25· 5) 50 mg Antibiotikum B-5O5O-E

6) 50 mg Antibiotikum B-5O5O-P

7) 20 mg des gemäß Beispiel 1 erhaltenen kristallinen

Gemisches von Antibiotikum B-5050 · oder
8) 20 mg des gemäß Beispiel 2 hergestellten Kristalls II,

Das Gemisch wird dann gleichmäßig mit weißem Petrolatum in einer solchen Menge gemischt, daß 10 g Salbe erhalten werden. Diese Salbe wird örtlich in einer Menge, die zur Bedeckung der behandelten-Wunde genügt, unter leichtem Einreiben aufgebracht. Die Behandlung erfolgt wenigstens

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einmal täglich und wird, falls erforderlich oder erwünscht, mehrmals täglich wiederholt.

Infolge der oben genannten bakteriziden und baktereostatischen Eigenschaften eignen sich die neuen Produkte gemäß der Erfindung beispielsweise zur Desinfektion von Geräten in Krankenhäusern usw., die im allgemeinen patho-

genen grampositiven Bakterien ausgesetzt sind, die empfindlich gegenüber den oben genannten Produkten sind. Die Desinfektion erfolgt durch Auftrag oder Aufsprühen einer ■ 10 Lösung (z.B. in Methanol oder Äthanol), die eine der fc folgenden Komponenten enthält:

: D 20 ug/ml Antibiotikum B-5O5O-A

. 2) 20wg/ml Antibiotikum B-5O5O-B

3) 20 jug/ml Antibiotikum B-5O5O-C

4) 50 Jflg/ml Antibiotikum B-5O5O-D

5) 50/ug/ml Antibiotikum B-5O5O-E

: 6) 50 ng/ml Antibiotikum B-5O5O-P

; 7) 20 iig/ml des gemäß Beispiel 1 hergestellten kristallinen : Gemisches von Antibiotikum B-5O5O

8) 20 yug/ml des gemäß Beispiel 2 hergestellten Kristalls II,

In den folgenden Beispielen beziehen sich die Prozentsätze bei der Angabe der Zussainmensetzung der Kulturmedien auf Gewicht/Volumen, d.h. g/100 ml. Im übrigen sind alle Prozentsätze auf das Gewicht bezogen, falls nicht anders angegeben.

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Beispiel 1

Je 500 ml eines Vorimpfkulturmediums (p„ 7*0), bestehend aus 2,0$ Glucose, 3,0% löslicher Stärke, 1,0$ Sojabohnenmehl¹, 1,0$ Maisquellwasser, 0,5$ "Polypepton" (Handelsbezeichnung eines Caseinhydrolysats, Hersteller: Daigo Nutritive Chemicals,Ltd., Osaka (Japan) ), Q₃~5% Natriumchlorid, 0,2$ Calciumearbonat und Wasser werden in 2000 ml-Sakaguchi-Kolben gegeben und sterilisiert. Das sterilisierte Medium wird mit einer ösenmenge Streptomyces hygroscopicus (lFO-12995) aus einer wenigstens vier Tage alten Agarschrägkultur geimpft und bei 28°C 48 Stunden auf einer hin- und hergehenden Schüttelvorrichtung bei 115 Zyklen/Minute und einer Ausschlaglänge von 10 cm bebrütet. Die erhaltene Kulturbrühe wird in einer Menge von 1000 ml als Vorimpfkultür verwendet.

Die Vorimpfkultur wird in 100 Liter eines Kulturmediums (Pjj 7,0) geimpft, das in einen 200 1-Tank aus nichtrostendem Stahl gegeben und sterilisiert wird und aus 3,0$ Glucose, 0,5$ Malsquellwasser, 1,0$ entfettetem Sojabohnenmehl, 0,,5$ Natriumchlorid, 0,05$ Magnesiumsulfat, 0,3% Calciumearbonat und Wasser besteht. Die Bebrütung wird bei 28°C 24 Stunden durchgeführt, während 100 Liter Luft pro Minute zugeführt werden und mit 200 U/Minute gerührt wird.

100 Liter der erhaltenen Impfkultur werden in 100 Liter eines sterilisierten Hauptkulturmediums gegeben, das die ^: gleiche Zusammensetzung wie das Kulturmedium für die Impfkultur hat und in einem 2000 1-Tank aus nichtrostendem Stahl enthalten ist. Die Bebrütung wird 66 Stunden bei 28⁰C durchgeführt, während 1000 Liter Luft/ Minute zugeführ-t werden und mit einem Kreiselmischer

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bei 120 U/Minute gerührt wird. Während der Bebrütung wird ein Polyoxypropylengemisch, das eine OH-Zahl von 56 hat (Handelsbezeichnung: "Actocol", hergestellt von der Anmelderin) als Antischaummittel in einer Konzentration von etwa 0,05$, bezogen auf das Gesamtmedium, zugesetzt. Die auf diese V/eise erhaltene Kulturbrühe hat eine antimikrobische Wirkung von J35O Einheiten, gerechnet als Verdünnungseinheiten gegen Bacillus subtilis als Testorganismus.

Die Kulturbrühe wird filtriert. Die filtrierte Brühe (950 1) wird mit einer wässrigen 2n-NaOH-Lösung auf ρ_Η8,5 eingestellt und mit Xthylacetat (JOO 1) extrahiert. Die Xthyl-■ acetatsehicht wird abgetrennt, mit Wasser gewaschen und zweimal mit Je 70 1 0,005n-HCl extrahiert. Die wässrigen Extrakte werden vereinigt, mit verdünntem wässrigem Ammoniak auf Pu 8,5 eingestellt und erneut zweimal mit je 45 1 Xthylacetat extrahiert. Die Extrakte v/erden mit Wasser gewaschen, dehydratisiert und unter vermindertem Druck auf 50 ml eingeengt. Dem Konzentrat werden 750 ml η-Hexan zugesetzt, wobei 95 g des rohen pulverförmigen Antibiotikums B-5050 erhalten werden.

• Das pulverförmlge Produkt wird in 450 ml Benzol gelöst, während

erwärmt wird. Nach Zusatz von 2 g Aktivkohle zur erwärmten • Lösung wird das Gemisch filtriert und das Piltrat zur Abkühlung stehen gelassen. Hierbei scheiden sich 19»0 g des Antibiotikum-5050-Gemisches als farblose Nadeln ab.

10 g des Gemisches der kristallinen Antibiotika B-5050 werden in 50 ml Xthylacetat gelöst. Die Lösung wird der Säulenchromatographie an Kieselgel unterworfen (450 g, hergestellt von Merck AG., Korngröße 0,05 bis 0,2 mm). Die eingesetzten Materialien werden mit einem Gemisch von Xthylacetat und Benzol (Volumenverhältnis 2:1) entwickelt und eluiert. Die ersten 600 ml des El,uats, das antibiotisehe Wirkung zeigt, werden zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird in heißem

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Benzol gelöst. Die Lösung wird stehen gelassen, wobei sich 1 g farblose Kristalle abscheiden, die hauptsächlich aus dem Antibiotikum B-5050-A bestehen. *

Nachdem die Säule mit 4 1 des Xthylacetat-Benzol-Gemisches eluiert worden ist, wird sie weiter mit 3 1 Äthylacetat eluiert. Die Eluate werden aufgefangen und unter vermindertem Druck eingeengt. Der Rückstand wird in heißem Benzol gelöst. Die Lösung wird stehen gelassen, wobei sich 550 mg farblose Kristalle abscheiden, die hauptsächlich aus dem Antibiotikum B-5050-F bestehen.

500 mg der hauptsächlich aus dem Antibiotikum B-5050-A bestehenden Kristalle werden in 1,5 ml Xthylacetat gelöst und erneut an einer Kieselgelöäule (50 g, siehe oben) chromatographiert. Das zugeführte Material wird mit einem Gemisch von Xthylacetat und Benzol ("VEiumenVerhaltnis 1:1) eluiert, wobei mehrere Fraktionen abgenommen werden. Jede Fraktion wird auf die darin enthaltenen aktiven Bestandteile durch Dünnschichtehromatographie an Kieselgel (Handelsbezeichming:

"HFgcjij."* Hersteller: Merck AG) analysiert, wobei ein Gemisch von Benzol und Aceton (Volumenverhältnis 3:2) als Entwickler verwendet wird. Die Fraktionen, die ausschließlieh das Antibiotikum B-5050-A als aktiven Bestandteil enthalten, werden aufgefangen und unter vermindertem Druck eingeengt. Der Rückstand wird aus Benzol kristallisiert, wobei 88,5 mg Antibiotikum B-5050-A in Form von farblosen Prismen erhalten werden.

350 mg der hauptsächlich aus Antibiotikum B-5050-F bestehenden Kristalle werden der Säulenchromatographie an Kieselgel (50 g) in der oben beschriebenen Weise unterwerfen. Nachdem die Säule mit 700 ml eines Gemisches von Xthylacetat und Benzo] (Volumenverhältnis 2:1) eluiert worden ist, wird sie

Ii

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weiter mit einem Gemisch von Xthylacetat und Benzol (Volumenverhältnis 3:1) eluiert. Anschließend werden durch Dünnschichtchromatographie die aktiven Bestandteile jeder Fraktion bestimmt. Die Fraktionen, die ausschließlich Antibiotikum B-5050-F als aktiven Bestandteil enthalten, werden aufgefangen und unter vermindertem Druck eingeengt. Der Rückstand wird kristallisiert, wobei 75,6 mg B-5050-F als farblose Prismen erhalten werden.

15

Beispiel 2

In 2 1-Sakaguchi-Kolben werden Je 500 ml eines sterilisier ten Vorimpfkultürmediums der gleichen Zusammensetzung wie in Beispiel 1 mit Streptomyces hygroscopicus (IFO-12995) g impft. Die geimpften Kolben werden zu:" Herstellung einer Vorimpfkultür auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise bebrütet.

In einem 500 1-Tank aus nicht-rostendem Stahl werden 200 1 eines Kulturmediums hergestellt, das die gleiche Zusammensetzung wie das gemäß Beispiel 1 für die Impfkultur ver- ' wendete Medium hat. Nach Sterilisation bei 121°C für 20 Mlnuten wird die Kultur mit 2 1 der oben genannten Vorimpfkultur geimpft. Die Bebrütung zur Herstellung der Impfkultür für die Hauptfermentation wird 2k Stunden bei 28⁰C durchgeführt, während 200 1 Luft/Minute zugeführt werden und mit 200 U/Minute geführt wird.

200 1 der so hergestellten Impfkultür werden in ^000 1 eines Hauptkulturmediutns überführt, das die oben genannte Zusammensetzung hat und in einem 6000 1-Tank aus nicht-rostendem · Stahl enthalten wird. Die Kultivierung wird 48 Stunden bei 28⁰C durchgeführt, während 2^00 1 Luft/Minute zugeführt werden und mit einem Kreiselmischer bei I80 U/Minute gerührt wird. Während der Bebrütung wird das in Beispiel 1 genannte Polyoxypropylen~Gertil£3ch "Actocol" als Antischaummittel zu-

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ORIGINAL

INSPECTED

gesetzt.

. Die Kulturbrühe wird filtriert. Die filtrierte Brühe (4000 l) wird mit 2 η-NaOH auf p„ 9 eingestellt, mit 1350 1 Äthylacetat extrahiert und mit Wasser gewaschen, wobei 1052 1 Äthylacetatextrakt erhalten werden. Die Äthylacetatlösung wird unter vermindertem Druck auf 100 1 eingeengt. Die konzentrierte Lösung wird zweimal mit je 50 1 einer 1,5-molaren wässrigen KHgPO^-Lösung extrahiert, die vorher mit Phosphorsäure auf Pu 4,0 eingestellt worden ist. Die Extrakte werden vereinigt, mit einer verdünnten wässrigen Ammoniaklösung auf Pu 8,5 eingestellt und mit 50 1 Äthylacetat extrahiert. Die .Äthylacetatlösung wird mit Wasser gewaschen, dehydratisiert und unter vermindertem Druck eingeengt, wobei ein Sirup als Rückstand verbleibt. Durch Zusatz von 3 1 η-Hexan zum Sirup werden 330 g eines rohen Pulvers erhalten. 300 g dieses Pulvers werden in 1,1 1 Benzol unter Erwärmung gelöst. Die Lösung wird zur Abkühlung stehen gelassen, wobei 117 g Kristalle erhalten werden, die hauptsächlich aus den Antibiotika B-5O5O-C, B-5050-D und B-5050-E (Kristall I) bestehen.

Die Äthylacetatschicht, die mit der Phosphatlösung extrahiert worden ist, wird weiterhin zweimal mit je 50 1 N/200 HgSO^ extrahiert. Die wässrigen Schichten werden vereinigt, mit , einer verdünnten wässrigen Ammoniaklösung auf p_H 8 eingestellt und dreimal mit je 30 1 Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatextrakte werden vereinigt, mit Wasser gewaschen, dehydratisiert und unter vermindertem Druck zu einem Sirup eingeengt. Durch Zusatz von 1,5 1 η-Hexan zum Sirup werden I60 g eines rqhen Pulvers gebildet. 250 g dieses Pulvers werden aus heißem benzol kristallisiert, wobei 72,5 g Kristalle erhalten.

werden, 'die hauptsächlich Antibiotikum B-5050-A und B-5050-B und einer geringen Menge Antibiotikum B-5Q5O-C bestehen (Kristall II), Bei der Dünnschichtchromatographie unter den oben unter (a) oder (c) für ein B-5050-Gemisch mit β Bestand-. · teilen genannten Bedingungen ergibt der Kristall II zwei

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Flecken, nämiich bei Rf-Werten von 0,48 und 0,54 unter den Bedingungen (a) oder bei den Rf-Werten von 0,66 und 0,71 unter den Bedingungen (c).

2,0 g Kristall II werden in 20 ml Xthylacetat gelöst. Zur - 5 Lösung werden 14 ml Benzol gegeben. Die Lösung wird der Säulenchromatographie an Kiese]gel (Merck AG, Korngröße 0,05 bis 0,2 mm) unterworfen, das vorher mit einem Gemisch von Benzol und Xthylacetat (Volumenverhältnis 1:1) gefüllt worden ist. Das Chromatogramm wird zuerst mit Xthylacetat-Benzol (Volumenverhältnis 1:1) entwickelt, wobei 200 ml . Eluat aufgefangen werden. Dann wird mit Xthylacetat-Benzol (Volumenverhältnis J5 : 2) eluiert, wobei Fraktionen aufgefangen werden, die antimikrobische Wirkung gegen Bacillus subtilis aufweisen. Die Fraktionen, die den gleichen Bestand-IS teil enthalten, werden vereinigt, eingeengt und aus Benzol kristallisiert, wobei 4^5 g Kristalle von Antibiotikum B-5050-A einerseits und I85 mg Kristalle von Antibiotikum B-5050-B andererseits erhalten werden.

10 g Kristall I werden in 50 ml Xthylacetat gelöst. Zur Lb"-sung werden 25 ml Benzol gegeben. Die Lösung wird an Kieselgel (400 g) auf die oben beschriebene Weise chroniatograph3s*t. Die Säule wird zuerst mit J5 1 Xthylacetat-Benzol (Volumenverhältnis 1:1) und dann mit Xthylacetat-Benzol (Volumenverhältnis 2:L) eluiert. Das Eluat wird in Fraktionen von 500 ml geteilt. Die mit dem l:l-Gemisch erhaltenen Fraktionen enthalten die Antibiotika B-5050-A und B-5O5O-B. Die erste Fraktion, die mit dem 2:!-Gemisch erhalten wird, enthält die Antibiotika B-5050-B und B5O5O-C. Die zweite Fraktion enthält die Antibiotika B-5O5O-C und B-5O5O-D und die dritte Fraktion die Antibiotika B-5050-D und B-5050-E. Die letzte Fraktion enthält die Antibiotika B-5O5O-E und B-5050-F.

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2 g der Kristalle, die aus der die Antibiotika B-5O5O-B . _: und B-5O5O-C enthaltenden Fraktion erhalten worden sind,

werden erneut in 15 ml Äthylacetat gelöst. Zur Lösung werden : 10 ml Benzol gegeben. Die Lösung* wird der Säulenchromatoj 5 graphie an 250 g Kieselgel unterworfen. Die Säule wird mit j Äthylacetat-Benzol (Volumenverhältnis 3:2) unterworfen. j Das Eluat wird in Fraktionen von je 20 ml abgenommen, die Fraktionen der gleichen Komponente werden vereinigt, eingej engt und aus Benzol oder einem Gemisch von Äthylacetat und 10 η-Hexan kristallisiert, wobei 83 mg Kristalle vom Antibiotij kum B-5050-B, 940 mg Kristalle von Antibiotikum B-5050-C ! und 75 mg Kristall« von Antibiotikum B-5Q5O-D erhalten werden.

ι In der gleichen Weise werden 1,2 g der Fraktion, die die Antibiotika B-5050-D und B-5050-E enthält, der Säulenchromatographie an Kieselgel unterworfen, wobei 600 ml Kristalje von Antibiotikum B-5050-E erhalten werden.. ,

Die Fraktion, die anschließend an die Antibiotika B-5050-B

und B-5050-C enthaltende Fraktion erhalten wird, enthält Antibiotikum B-5O5O-C als Hauptbestandteil. 770 mg der er- haltenen rohen Kristalle werden erneut in 5 ml Aceton gelöst. Die Lösung wird der Säulenchromatographie an 100-g Kieselgel auf die oben''beschriebene Weise unterworfen, wobei , 220 mg Antibiotikum B-5050-C in Form von Kristallen erhalten werden.

Beispiel 3

4000 1 der filtrierten Kulturbrühe, die bei der in Beispiel 2 beschriebenen Hauptfermentation erhalten worden Ißt., werden auf p_H 8,0 eingestellt und mit 1/3 ihres Volumen."· an Äthylacetat extrahiert. Der Äthylacetatextrakt wird auf etwa 100 1 eingeengt. Das Konzentrat wird mit 50 1 Vanner gewaschen und dreimal mit je 50 1 einer 3-molnren wäpwrigen KHpPO₂^-Lösung extrahiert, die vorher mit Phosphorijgure auf pH 3,9 eingestellt worden ist. Die wässrigen Extrakte'werden

, 10 9 8 0 8/2288

ίο

15

20

25

vereinigt, mit wässrigerQi-Ammoniak-Lösung auf p„ 9 bis 30 eingestellt und mit 75 1 Xthylaceta^xtrahiert.Der Xthylacetatextrakt wird dreimal mit je 25 1 Wasser gewaschen und dann auf etwa 1,5 1 eingeengt. Durch Zusatz von etwa 30 1 η-Hexan zum Konzentrat werden 522 g eines rohen Pulvers gebildet. Durch Kristallisation des Pulvers aus Benzol werden 272 g Kristalle des Antibiotikum B-5050-Gemisches erhalten.

Im wesentlichen das gleiche Ergebnis wird bei dem vorstehend beschriebenen Verfahren erhalten,, wenn eine wässrige 0,2n-Essigsäurelösung anstelle der KHgPO^-Lösung verwendet wird.

.19 g des so erhaltenen.Antibiotikum B-5050-Gemisches werden in 75 ml Aceton gelöst. Die Lösung wird der Säulenchrotnntogrephie mit 800 g Kieselgel (Merck A.G.. s.o.) unterworfen. Die Säule wird mit 3000 ml Xthylacetat-Benzol (Volumenverhältnis 1:3) eluiert. wobei J. 25 g Kristalle erhalten werden,- die hauptsächlich aus den Antibiotika B-5O5O-A und B-5O5O-B bestehen. Die Säule wird denn mit Xthy3acetat-Ber.zol (Valumenverhältnis 2:3) eluiert. Die mit 3300 m3 des Entwicklers eluierte erste Fraktion wird in der gleichen Weise behandelt, wobei ?.22 g Kristalle erhalten werden, die hauptsächlich aus den Antibiotika B-5050-B und B-5O5O-C bestehen. Die anschließende Fraktion aus 200 ml ergibt 0,90 g Kristalle, die hauptsächlich aus Antibiotikum B-5050-C bestehen. Aus der folgenden Fraktion von 300 ml werden 1,4 g eines Gemisches erhalten, das hauptsächlich aus den Antibiotika B-5050-C und B-5050-D besteht. Aus der letzten Fraktion von 600 nil werden 1»99 g Kristalle erhalten, die hauptsächlich aus den Antibiotika B-5050-D und B-5050-12 bestehen. Die Säule wird dann mit 600 ml Xthylacet-Benzol (Volumenverhaltnis'3 1 1) eluiert, wobei 0,6^5 S Kristalle erhalten werden, die hauptsäcblich aus den Antibiotika B-5050-D und B-5050-E bestehen. Aus der letzten Fraktion, die mit I600 ml Xthylacetat eluiei:t, wird, werden 2,09 g Kristalle erhalten, die hauptsächlich au:" Antibiotikum B⁽j0!30-F bestehen.

109808/2286

BAD ORIGINAL

j Die in der beschriebenen Weise erhaltenen Kristalle der Antibiotika B-5050-A und B-5050-B (7,25 g) werden in 40 ml Aceton gelöst und der Säulenchromatographie mit 400 g Kieselgel j unterworfen. Durch Elution mit Äthylacetat-Benzol (Volumen- ! 5 verhältnis 1 : 1) werden 1,5 g Kristalle vom Antibiotikum ■ B-5050-A und 0,65 g Kristalle von Antibiotikum B-5050-B er- ; halten.

i ■ .

! Die in der beschriebenen Weise erhaltenen Kristalle der Änti-1 biotika B-5050-B und B-5050-C (2,22g ) werden in 20 ml Acetoni10 gelöst und. der Säulenchromatographie an 300 g Kieselgel unterworfen. Durch Elution mit Benzol-Aceton (Volumenverhältnis '3 : 1) werden 0,398 g Kristalle vom Antibiotikum B-5050-B erhalten. Die weitere Elution mit Benzol-Aceton (Volumenverhältnis 2 ι 1) ergibt 0,269 g Kristalle von Antibiotikumj 15 B-5050-C.

Die hauptsächlich aus Antibiotikum B-5050-C bestehenden ■ ; Kristalle (0,90 g) werden in 5 ml Aceton gelöst und dann an einer Säule von 100 g Kieselgel chromatographiert. Die Elution mit Äthylacetat-Benzol (Volumenverhältnis 2 : 1) ergibt 20 0,258 g Kristalle von Antibiotikum B-5050-C.

Die Kristalle der Antibiotika B-5050-C und B-5050-D (1,40 g) ■ aß

I werden in 10 ml Aceton gelöst und dann/einer Säule von 150 g

Kieselgel chromatographiert. Durch Elution mit Benzol-Aceton (Volumenverhältnis 2 : 1) werden 0,596 g Antibiotikum B-5O5O-C 25 und O,l87 g Kristalle von Antibiotikum B-5050-D erhalten*

Die Kristalle der Antibiotika B-3050-D und B-5050-E {1,99g} werden In 30 ml. Aceton gelöst ursid an einer Säule von 300 g Kieselgpl chromatographiert. Duifch Elution mit Benzol-Aceton - (Voiume|iverhältni8 2 s 1) w«rde«' Q,304 g Kristalle von Anti-

-pQ- biotiktwi B-5050-D und 0,18? g Kristalle von Antibiotikum

jl B-5050-E erhalten. .. '

101808/22 8 a

Die hauptsächlich aus Antibiotikum B-5050-F bestehenden Kristalle (2,09 g) werden in 15 ml Aceton gelöst und an einer Säule von 250 g Kieselgel chromatographiert. Durch Elution mit Xthylacetat-Benzol ( Volumenverhältnis 3 : 1) werden 0,585g Kristalle von Antibiotikum B-5050-F erhalten.

Beispiel 4

Ein Gemisch von 120 ml η-Hexan, 80 ml Äthylendichlorid, 30 ml Methanol und 6 ml Wasser wird gut gerührt und dann stehen gelassen, wobei sich zwei Schichten bilden. Die untere Schicht wird von der oberen Schicht getrennt. In 6 ml der unteren Schicht wird 1 mg Chlorphenolrot gelöst. Zur Lösung werden 5 S einer verarbeiteten ; Diatomeenerde der Handelsbezeichnung "Celite" (Hersteller: Johns Manville Sales Corp., USA; besonders bevorzugt wird "Celite 535") und 100 ml der vorher abgetrennten oberen Schicht gegeben. Das Gemisch wird kräftig gerührt, worauf Chlorwasserstoff eingeleitet wird, bis die violette Farbe des Indikators nach gelb umgeschlagen 1st. Diese Suspension läßt man nach und nach auf eine Glaskolonne fließen, um eine gleichmäßige Säule aus der Diatomeenerde "Celite" zu bilden.

10

20

25

25 mg Kristalle des gemäß Beispiel 3 erhaltenen Gemisches der Antibiotika B-5050 werden in 0,4 ml der in der oben beschriebenen Weise abgetrennten oberen Schicht gelöst. Die Lösung wird an der in der beschriebenen Weise hergestellten Säule der Diatomeenerde ohromatographiert. Die Säule wird mit der oberen Schicht entwickelt, wodurch die aktiven Bestandteile abge- _; trennt werden und Jeweils als violette Banden zu beobachten j sind. Duron weitere Elution werden in getrennten Fraktionen .;■ die Antibiotika B-5050-A, B-5050-B, B-5050-C, B-3Ö5O-D, B-5050-E und B-5O5O-P in dieser Reihenfolge erhalten« Als Pro* dukte werden hierbei 4 »g B-SOfKKA, 3 mg B-5O5O~B» 5 «8 B-5050-C, 4 mg eines Gemisches von B-5050-D und B-5050-E und 2 mg B-5O5O-F in Form von Kristallen erhalten.

103808/2286

2D3999Q

Beispiel 5

Auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise wird eine Impfkultur von Streptomyces hygroscopicus (IFO-12995) hergestellt« Je 2 ml der Impfkultur werden in je 50 ml eines Hauptkulturmediums geimpft, das in 200 ml-Erlenmeyerkolben enthalten ist und sterilisiert worden ist und aus 3>0$ Glucose, 0,5$ Maisquellwasser, 1,0$ entfettetem Sojabohnenmehl, 0,5$ Natriumchlorid, 0,05$ Magnesiumsulfat, 0,1$ Dikaliumhydrogenphosphat, 0,05$ Kaliumchlorid, 0,3$ Calcium-10 carbonat und Masser besteht und auf Pjt7>0 eingestellt ist. j Die Fermentation wird 96 Stunden bei 28⁰C auf einer ro-' tierenden Schüttelvorrichtung durchgeführt. Die hierbei erhaltene filtrierte.Kulturbrühe zeigt eine antimikrobische

j Wirksamkeit von 350 Verdünnungseinheiten gegen Bacillus 15 subtilis.

1,6 1 der filtrierten Kulturbrühe werden auf p„ 7>8 eingestellt und mit 800 ml Äthylacetat und dann mit 600 ml Äthylacetat extrahiert. Die vereinigten Extrakte werden mit Wasser gewaschen und zweimal mit je 600 ml wässriger 0,005n~ HCl-Lösung extrahiert. Die wässrigen Schichten werden vereinigt, mit wässriger ,0,In-NaOH-Losung auf p_H 7 bis 8 eingestellt und zweimal mit je 500 ml Äthylacetat extrahiert. ' Die Äthylacetatextrakte werden mit Wasser gewaschen, mit wasserfreiem Natriumsulfat dehydratisiert und unter vermindertem Druck eingeengt. Zum Rückstand werden 30 ml n-Hexan gegeben, wobei 59 mg eines rohen Pulvers erhalten werden. Das Pulver wird in heißem Benzol gelöst. Die Lösung wird stehen gelassen, wobei sich 3 5 mg eines Gemisches der Antibiotika B-5050 als farblose Nadeln abscheiden.

-SO Beispiel 6

2 ml einer Impfkultur, die auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise hergestellt worden ist, werden in je 50 ml eines in

109808/2286 .

200 ml-Erlenmeyerkolben enthaltenen Hauptkulturmediums geimpft, das die gleiche Zusammensetzung wie das gemäß Beispiel 1 verwendete Hauptkulturmedium hat. Die Kultivierung wird 96 Stunden bei 28⁰C auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung durchgeführt. Die hierbei erhaltene filtrierte Kulturbrühe hat eine antimikroblsche Wirksamkeit von 350 VerdUnnungseinheiten gegen Bacillus subtilis.

1,8 1 der filtrierten Kulturbrühe werden auf p_H 8,0 eingestellt und zweimal mit je 400 ml Xthylacetat extrahiert.

Die Xthylacetatlösung wird mit Wasser gewaschen, dehydratisiert und unter vermindertem Druck eingeengt. Zum Rück-. stand werden 30 ml η-Hexan gegeben, wobei 210 mg eines rohen Pulvers erhalten werden. Das Pulver wird in 15 ml Benzol unter Erwärmung gelöst. Die Lösung wird stehen gelassen, wobei sich 59 mg eines Gemisches der Antibiotika B-5050 in Form von Kristallen abscheiden.

Beispiel 7

900 1 einer filtrierten Kulturbrühe, die auf die in Bei- · spiel 1 beschriebene Weise erhalten worden ist, werden auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise behandelt, wobei 70 g eines rohen Gemisches der Antibiotika B-5050 erhalten werden. Die rohe Probe wird in einem Gemisch von Xthylacetat und Benzol (Volumenverhältnis 2:1) gelöst und an einer mit . 2,1 kg 1 Kieselgel gefüllten Säule (Merck AO., ßi«he oben) chromatographiert. Die Säule wird mit Xthylacetat-Benzol (Volumenverhältnis 2 : 1) eluiert. Farblose Fraktionen werden -aufgefangen und zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird in 350 ml heißem Benzol gelöst und die Lösung stehen gelassen, wobei 7,0 g farblose Nadeln des Gemisches der Antibioti. B-5050 erhalten werden.

10980872286

Beispiel 8

800 ml einer filtrierten Kulturbrühe, die auf die in Beispiel 6 beschriebene Weise erhalten worden ist, werden auf P_H 7,6 eingestellt und durch eine Säule geleitet, die mit 40 ml "Amberlite XAD-2" (Molekularsieb, Hersteller: Rohm & j' Haas Co., USA) gefüllt ist. Die Säule wird mit 200 ml de- ! stilliertem Wasser gewaschen und dann mit 200 ml einer 30#i-J gen wässrigen Methanollösung eluiert, wobei ein braunes Eluat erhalten wird, das im wesentlichen keine antimikrobische Wirksamkeit zeigt. Die Elution wird mit 500 ml ÖO^igem wässrigem Methanol fortgesetzt, wobei die Fraktionen erhal-. ten werden, die den größten Teil der aktiven Bestandteile enthalten. Die Fraktionen werden unter vermindertem Druck

eingeengt, bis das Methanol entfernt ist. Das Konzentrat wird auf p_H 7,5 bis 8,5 eingestellt und zweimal mit je 100 ml Xthyiacetat extrahiert. Die Äthylacetatextrakte werden vereinigt, mit Wasser gewaschen, dehydratisiert und unter vermindertem Druck eingeengt. Zum Rückstand wird η-Hexan gegeben, wobei 53 mg eines rohen Pulvers des Gemisches der Antibiotika B-5050 erhalten werden. Das Pulver wird in.heißem Benzol gelöst und die Lösung stehen gelassen, wobei 17 mg Kristalle abgeschieden werden.

• Beispiel 9

j In 100 ml Xthyiacetat wird 1,0 g des gemäß Beispiel 2 er- ;25 haltenen Kristalls I gelöst. Die Lösung wird dreimal mit je : 100 ml S^rensen's-Pufferlösung, die bei der ersten Extrakj tion einen p^-Wert von 5*5» bei der zweiten Extraktion einen ι PjT-Wert von 4,9 und bei der dritten Extraktion einen p^-Wert von 4,4 hat (und 0,1-molar an Diiiatriumhydrogencitrat ist), in dieser Reihenfolge extrahiert. Jede Fraktion wird mit ver- ;

• dünnt em'wässrigem Ammoniak auf p*» 9,5 eingestellt und mit dem halben Volumen an Xthylaoetat extrahiert. Die Äthylaoetatschicht wird mit Walser gewaschen, dehydratisiert und unter

106808/2260

vermindertem Druck eingeengt, wobei sich Kristalle abscheiden. Aus der mit der Pufferlösung von p„ 4,9 extrahierten Fraktion werden 365 mg Antibiotikum B-5050-C erhalten.

Die Xthylacetatsehicht, die nach der Extraktion mit diesen Pufferlösungen zurückbleibt, ergibt 110 mg Kristalle, die hauptsächlich aus den Antibiotika B-5050-A und B-5050-B bestehen. Die mit der Pufferlösung vom p„-Wert 4,4 extra-

hierte Fraktion ergibt I65 mg Kristalle, die hauptsächlich aus den Antibiotika B-505O-B und B-5050-C bestehen, die mirb der Pufferlösung vom p_H-Wert 5,5 extrahierte Fraktion ergibt 320 mg Kristalle, die hauptsächlich aus den Antibiotika " B-5050-D, B-5050-D , B-5050-E und B-5050-F bestehen.

Beispiel 10

In 1 Liter Xthylacetat werden 10 g des gemäß Beispiel 2 hergestellten Kristalls II gelöst. Die Lösung wird zweimal mit je 800 ml S^rensen-Pufferlösung vom p^-Wert 4,9 und viermal mit je 1 Liter Spfrensen-Pufferlösung vom p„-Wert 4,4 in dieser Reihenfolge extrahiert. Jede Fraktion wird mit verdünntem wässrigem Ammoniak auf p„ 9*5 eingestellt und mit ihrem halben Volumen an Xthylacetat extrahiert. Die Xthylacetatschicht wird mit Wasser gewaschen, dehydratisiert und unter vermindertem Druck eingeengt, wobei sich Kristalle abscheiden. Die jeweiligen Fraktionen werden auf die im Beispiel 9 beschriebene Weise behandelt. Die nach der Extraktion mit den Pufferlösungen zurückbleibende Xthylacetatschicht ergibt 4,2 g Kristalle, die hauptsächlich aus Antibiotikum B-5050-A bestehen. Die mit der Pufferlösung vom p„-Wert 4,4" extrahierten Fraktionen ergeben 3,8 g Kristalle, die hauptsächlich aus Antibiotikum B-5050-B bestehen. Die mit der Pufferlösung vom p_H-Wert 4,9 extrahierten Fraktionen ergeben 1*3 g Kristalle, die hauptsächlich aus den Antibiotika B-5050-B und B-5050-C bestehen.

109808/2286

Claims (19)

Patentansprüche

1) Verfahren zur Herstellung von Antibiotikum B-5050, dadurch gekennzeichnet, daß man einen das Antibiotikum B-5050 bildenden Mikroorganismus, der Gattung Streptomyces in einem Kulturmedium, das eine Quelle von assimilierbarem Kohlenstoff und eine Quelle von verwertbarem Stickstoff ent-

; hält, unter aeroben Bedingungen kultiviert, bis sich das Antibiotikum B-5050 in wesentlichen Mengen in der Kultur-

ί brühe angehäuft hat, und das angehäufte Antibiotikum B-5050 aus der Kulturbrühe isoliert.

2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, ■ daß Streptomyces hygroscopicus als Mikroorganismus verwendet wird.

j

3) Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet,

daß der beim Institute for Fermentation, Osaka, Japan unter

J 15 der Nummer IFO-12995 hinterlegte Stamm Streptomyces hygros-

copious B-5050 als Mikroorganismus verwendet wird.

,

4) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Antibiotikum B-5050-A gewonnen wird.

5) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, ; 20· daß Antibiotikum B-5050-B gewonnen wird.

6) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Antibiotikum B-5050-C gevionnen wird.

7) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Antibiotikum B-5050-D gewonnen wird.

8) Verfahren nach Anspruch 1. dadurch gekennzeichnet, daß Antibiotikum B-5050-E gewonnen wird.

10 9 8 0 0/2286

9) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Antibiotikum B-5050-F gewonnen wird.

10) Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, ; daß als Antibiotikum B-5050 ein Gemisch von wenigstens zwei der folgenden Antibiotika gewonnen wird:

Antibiotikum B-5050-A, Antibiotikum B-5O5O-B, Antibiotikum B-505O-C, Antibiotikum B-5050-D, Antibiotikum B-5050-E und j Antibiotikum B-5050-F.

11) Antibiotikum B-5050-A, gekennzeichnet durch die 10 . ftdgenden Eigenschaften:

a) einen Kristallschmelzpunkt von etwa 129 bis 132°C (um- : kristallisiert aus einem Aceton-n-Hexan-Gemisch (VoIu-

menverhältnis 1:3)),

b) Elementaranalyse:

0..59,¹K) + 0,5; H. 8,15 + 0,3; N l,4o + 0,3,

c) Molekulargewicht 910 +_ 90» gemessen durch Dampfdruckosmose in Xthylacetat,

d) spezifische Drehung:/"aJ^x -72,3° ± 7° (c = 1, in Xtha.nol),

e) Farbreaktion:

aa) Dragendorff-Reaktion: positiv bb) Erythromycin-Test: positiv cc) Carbomycin-Test: negativ

f) löslich in Methanol, Äthanol, Aceton, Ke-thyläthylketon, Äthylacetat, Benzol, Diäthylather, Chloroform und wäßrigen 3ä.urelösun£en, schwerlöclich in η-Hexan oder ■neutralem V.'asser,

g) keine auG^epräpten Absorpt ionsmaxi rna im Ultraviolettr.poktrurri,

Ij) ausgeprägte Infrarotat^orpt.icnsbanden in Wellensah]en (om"^):

y\W, ?9^!H, 3 739, I¹^jP, 13T¹I, 3 293, 13 88, 3167,

3 K/G, JC8-^:, ]0^rÄ5, 1C33, i'73, 917, P62.

1 0 9 ν- c ρ ;- 7 η ti

BAD ORIGINAL

- 41 -

12) Antibiotikum B-5O5O-B, gekennzeichnet durch die folgenden Eigenschaften: ,

etwa

a) Kristallschmelzpunkt/134 bis 136 C nach Umkristallisation aus einem Gemisch von Aceton und n-Hexan, b) Elementaranalyse:

. C 58,67 + 1,0; H 8,02 + 0,5; N 1,8.6 + 0,5;

c) Molekulargewicht etwa 800 bis 900* gemessen durch Dampfdruckosmose in A'thylacetat,

d) spezifische Drehung ß-J^ : -71,9° + 7° (c = 1 in Äthanol);

e) Farbreaktion:

aa) Dragendorff-Reaktion: positiv
bb) Erythromyein-Test: positiv
cc) Carbomycin-Test: negativ

¹^ S) löslich in Methanol, Äthanol, Aceton, Methyläthylketon, | A'thylacetat, Benzol, Diäthyläther, Chloroform und : wässrigen Säurelösungen, schwerlöslich in η-Hexan oder \ neutralem Wasser; ^;

g) keine ausgeprägten Absorptionsmaxima im UQtraviolettspektrum;

h) ausgeprägte Infrarotabsorptionsbanden in Wellenzahlen (cm'¹):

3500, 2990, 296Ο, 1740, ΙΛ54, 1370, 1296, 1233, \ ' II88, 1166, 1120,· IO8O, IO52, 1025, 968, 916, j-25 858, 842.

ι

13) Antibiotikum B-5050-C, gekennzeichnet durch die folgenden Eigenschaften:

a) Kristallschmelzpunkt etwa 135 bis 138⁰C nach Umkristallisation aus einem Gemisch von Aceton und n-Hexan; b) EJementaranalyse:

C 57,93 + 1,0; H 8,18 +0,5; N 1,69 + 0,5; ' c) Molekulargewicht etwa 800 bis 900, gemessen durch Dampf-' druckosmose in Äthylacetat;

j d) spezifische Drehung βJ^'. -76,0° + 8° (c « 1, in ! 35 Äthanol); "

109808/22 8 8

e) Farbreaktion:

aa) Dragendorff-Reaktion: positiv bb) Erythromycin-Test: positiv cc) Carbomycin-Test: negativ; f), löslich in Methanol, Äthanol, Aceton, Methyläthylketon, ι Äthylacetat, Benzol, Diäthyläther, Chloroform und !wässrigen Säurelösungen, schwerlöslich in η-Hexan oder j neutralem Wasser;

g) keine ausgeprägten Absorptionsmaxima im Ultraviolett-Spektrum;

h) ausgeprägte Infrarotabsorptionsbanden in Wellenzahlen (cm"¹):

3460, 2980, 2940, 1735, 1455, 1375, 1357, 1295, 1270, 1240, II83, 1162, 1080, IO5O, IO28, IOI8, 972, 910, 862, 840.

14) Antibiotikum B-5050-D, gekennzeichnet durch die folgenden Eigenschaften:

a) Kristallschmelzpunkt etwa 143 bis l46°C nach Umkristallisation aus einem Gemisch von Aceton und n-Hexan; b) Elementaranalyse:

! C 57,^8 + 1,0; H 8,17 + 0,5; N 1,64 + 0,5; c) Molekulargewicht etwa 800 bis 900, gemessen durch Dampf- || . druckosmose in Xthylacetat;

! d) spezifische Drehung /<x_7Jp: -76,2° + 8° (c = 1, in : 25 Äthanol);

' e) Farbreaktion:

aa) Dragendorff-Reaktion: positiv bb) Erythromycin-Test: positiv cc) Carbomvcin-Test: nescativ;

f)ilöslich in Methanol, Äthanol, Aceton, Kethyläthylketon, j Äthylacetat, Benzol, Diäthyläther, Chloroform und 'wässrigen Säurelösungen, schwerlöslich in η-Hexan oder ■ neutralen Wasser;

g) keine ausgeprägten Absorptionsmaxima im Ultraviolett- ; 35 Spektrum; "

103808/2286

h) ausgeprägte Infrarotabsorptionsbanden in Wellenzahlen . (cm"¹): ·

3440, 29^6, 1735, 1^50, 1373,. 1357V 1296, I274, 1237, II63, 1127, IO83, 1047, IO31, 1012/ 972j 913, 862, 843.

5

15) Antibiotikum B-5050-E, gekennzeichnet durch die folgenden Eigenschaften:

a) Kristallschmelzpunkt etwa 2.44 bis l49°C nach Umkristallisation aus einem Gemisch von Aceton und n-Hexanj

b) Elementaranalyse:

10 c 57,34 + 1,0; H 8,25 ±0,5; N 1,34 + 0,5;

• c) Molekulargewicht etwa 800 bis 900, gemessen durch Dampfdruckosmose in Xthylacetatj

d) spezifische Drehung /üj/ψι -73*6° + 7° (c = 1, in : Äthanol);
j 15 e) Farbreaktion:

I aa) Dragendorff-Reaktion: positiv , ' j bb) Erythromycin-Test: !positiv j cc) Carbomycin-Test: negativ:

j f)]löslich in Methanol, Äthanol, Aceton, Methylethylketon, 20 Ithylacetat, Benzol, Diäthyläther, Chloroform und

/wässrigen Säurelösungen, schwerlöslich in.n-Hexan oder ι ;neutralem Wasser; '*

; . g) keine ausgeprägten Absorptionsmaxima im Ultraviolettj spektrumj

¹ 25 h) ausgeprägte Infrarotabsorptionsbanden in Wellenzahlen (cm"¹):

3430, 2920, 1732, 1450, 1373, 1354, 1296, 1239, II63, 1127, 1084, 1048, IO32, 1011, 970/ 914.. 862, 840.

- 30

16) Antibiotikum B-5050-F, gekennzeichnet durch die folgenden -Eigenschaften j
a) Eristallsshmelspiinkt etwa 149.bis 154°f; nach Urakristalli-

1 098G-e/2"2r, fi

- 44 - 203999Q

sation aus einem Gemisch von Aceton und n-Hexan;

b) Elementaranalyse:

C 58,59 + 0,5; H 7,82 + 0,3; N 1,62 + 0,3;

c) Molekulargewicht etwa 8OO bis 900, gemessen durch Darrpfdruckosmose in Xthylacetat;

d) spezifische Drehung /ä J^\ -77,7° + 8° (c = 1, in Xthanol);

e) Farbreaktion:

aa) Dragendorff-Reaktion: positiv ]0 bb) Erythromycin-Test: positiv

P cc) Carbomycin-Test: negativ;

f) löslich in Methanol, Äthanol, Aceton, Kothylii tbylke ton,

Äthylaoetat, Benzol, IHäthylather, Chloroform und wäüüri^en Söurelösun^en, schv;erlöslich in n-Hnxan οο-:γ ■ }5 ' neutralem Wasser;

g) keine ausgeprägten Abnorptionsmaxima im Ultraviolctt-Spektrum

h) ausgeprägte Inf rarotabeerptionsbanden in VJeII anzahl er

3425, -904, 37^3, 1730, ]46o, 1379, 2362, 1300, 3^2, II66, 1133, 3089, IO53, 1031, 973, 919, 864.

17) Antibiotische Substanz, bestehend im wesentlichen aus einem Gemisch von wenigstens zwei Antibiotika aus der Gruppe Antibiotikum B-5050-A, Antibiotikum D-5050-Ü, Antibiotikum B-5050-C, Antibiotikum n-5050-D, Antibiotikum B-5050-E und Antibiotikum B-5O5O-F gemäß Anspruch M b.i r.

18) Antibiotikum B-5050-Gemisch nach Anspruch 17, gekennzeichnet durch die folgenden Eigenschaften:

109808/2206

BAD ORIGINAL

a) Kristallschmelzpunkt etwa 137 bis l4l°Cj

b) Elementaranalyse für die aus Benzol umkristallisierten Kristalle;

C 58,14 + 0,5; H 7,88 + o,3i N 1,73 ± 0,3;

c) Molekulargewicht 880 + 90, gemessen durch Dampfdruckosmose in Äthylacetat;

d) spezifische Drehung βJ^ - 76,4° ± 8° (c = 1, in Äthanol);

e) Farbreaktion:

aa) Dragendorff-Reaktion: positiv bb) Erythromycin-Test: _; positiv cc) Carbomycin-Test: negativ
• f) löslich in Methanol, Äthanol, Aceton, Methyläthylketon,

j A'thylacetat, Benzol, DiäthylcVther, Chloroform und ι wässrigen Säurelösungen, schwerlöslich in η-Hexan oder

j neutralem Wasser;
g) keine ausgeprägten Absorptionsniaxima in dem in Methanol aufgenommenen Ultraviolettspektrumj

h) ausgeprägte Infrarotabsorptionsbanden bei den Wellenzahlen (cm" ):.

3448, 2924, 1736, 1453, 1376, 1295, 1239, 1167, IO81, 1050, 968, 912, 861, 840.

19) Antibiotisches Gemisch nach Anspruch 17, bestehend im wesentlichen aus einem Gemisch der Antibiotika B-5050-A ! 25 und Antibiotika B-5O5O-B.

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