CH640269A5 - Verfahren zur herstellung des antibiotikums c-15003 p-4. - Google Patents

Description

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PATENTANSPRÜCHE capronsäure, oder Salze der erwähnten Verbindungen als Zu-

1. Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums C-15003 satzsubstanzen hinzugibt.

P-4 der Formel Ia durch Züchtung eines zur Gattung Nocar- 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dia gehörenden, das Antibiotikum C-15003 P-4 zu erzeugen dass als Mikroorganismus Nocardia sp. No. IFO 13726 ververmögenden Mikroorganismus in einem assimilierbare Koh- 5 wendet wird.

lenstoffquellen und verdaubare Stickstoffquellen enthalten- 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,

den Kulturmedium dadurch gekennzeichnet, dass man dem dass man als Zusatzsubstanz Leucin verwendet.

Kulturmedium Leucin und/oder einen Alkylester mit 1 bis 2 4. Nach dem Verfahren gemäss Anspruch 1 hergestelltes

Kohlenstoffatomen oder ein Amid des Leucins, a-Ketoiso- Antibiotikum C-15003 P-4 der Formel:

10

R

/CH3

worin R den Rest -CO-CH2-CH bedeutet.

^CH3

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums C-15003 P-4 der Formel Ia in industriell vorteilhafter Weise.

Das Antibiotikum C-15003 P-4, nachstehend kurz als «P-4» bezeichnet, ist eine neue Verbindung, welche durch Züchtung eines Mikroorganismus der Gattung Nocardia, welcher aus natürlichen Quellen isoliert wird, erhalten wird.

Die erfindungsgemäss verwendbaren Mikroorganismen erzeugen beim Züchten unter Anwendung üblicher Kulturmedien im allgemeinen gleichzeitig mehrere Komponenten des Antibiotikums C-l 5003. Zur Trennung einer jeden Komponente aus der Kulturbrühe bedarf man ausserordentlich komplizierter Verfahren, wodurch sich in unvermeidlicher Weise eine niedrige Ausbeute an gewünschter Komponente ergibt.

Zur Behebung dieses Nachteils wurde nach einem Verfahren für die Gewinnung von P-4 ausgiebig geforscht, wobei

30 nun festgestellt wurde, dass P-4 in einem beachtenswert hohen Ausmass, bezogen auf den Gesamtgehalt an Antibiotikum C-15003, dann erhalten werden kann, wenn das Kulturmedium eine spezifische Zusammensetzung aufweist.

35 Somit bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums C-15003 P-4 der Formel Ia, wobei dieses Verfahren darin besteht, dass man einen zur Gattung Nocardia gehörenden und das Antibiotikum C-15003 P-4 (nachstehend hin und wieder als «Antibiotikum 4o C-l 5003 P-4 erzeugender Stamm» bezeichnet) zu erzeugen vermögender Mikroorganismus in einem assimilierbare Kohlenstoffquellen und verdaubare Stickstoffquellen enthaltenden Kulturmedium züchtet, welchem man Leucin und/oder einen Alkylester mit 1 oder 2 Kohlenstoffatomen oder ein 45 Amid des Leucins, a-Ketoisocapronsäure, oder ein Salz der erwähnten Verbindungen als Zusatzsubstanzen hinzugibt.

In der vorliegenden Beschreibung bedeuten die Ausdrücke «Antibiotikum C-15003» oder «C-15003» im allgemeinen die vier Verbindungen der folgenden Formel I als eine so Gruppe oder eine Mischung von zwei oder drei der besagten Verbindungen oder irgendeine der besagten Verbindungen.

(I)

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worin R die Reste -CO-CH2-CH3,

/CH3

-CO-CH , -CO-CH2-CH2-CH3 oder

^CH3

-CO-CH,-CH

CH,

•CH,

bedeutet.

Unter Bezugnahme auf die obige allgemeine Formel I wird jene Verbindung, in welcher das Symbol R den Rest -CO-CH2--CH3 darstellt, in der vorliegenden Beschreibung als «Antibiotikum C-15003 P-2» oder kurz als «P-2» bezeichnet, während die Verbindung, in welcher R den Rest

^CH3 -CO-CH

~^-CH3

darstellt, nachstehend als «Antibiotikum C-15003 P-3» oder kurz «P-3» bezeichnet wird. Die Verbindung, in welcher R den Rest-CO-CH2-CH2-CH3 bedeutet, wird hier als «Antibiotikum C-15003 P-3'» oder kurz als «P-3'» bezeichnet. Schliesslich wird die Verbindung, in welcher R den Rest

-CO-CH,-CH

-CH,

-CH,

bedeutet, in der vorliegenden Beschreibung als «Antibiotikum C-15003 P-4» (Ia) oder kurz als «P-4» bezeichnet.

Als Beispiel des das Antibiotikum C-15003 erzeugenden Stammes eines Mikroorganismus kann man einen Actinomy-cetenstamm Nr. C-15003, nachstehend hin und wieder auch «Stamm Nr. C-15003» genannt, bezeichnen, welcher aus dem Boden oder anderen Proben bei der Sichtung von ein Antibiotikum erzeugenden Mikroorganismen isoliert worden ist.

Die mikrobiologischen Eigenschaften des Stammes No. C-15003 wurden in analoger Weise, wie dies von Schirling & Gottlieb [International Journal of Systematic Bacteriology 16,313-340 (1966)] vorgeschlagen wurde, erforscht. Die Resultate dieser Beobachtungen bei 28 °C in einer Zeitspanne von 21 Tagen finden sich nachfolgend.

1) Morphologische Eigenschaften

Das vegetative Mycel dehnt sich gut aus und entwickelt sich zu Verzweigungen und dies sowohl auf Agar als auch im flüssigen Medium. Manche der Hyphen haben einen Durchmesser von 0,8 bis 1,2 um und können sich in gewissen Fällen unter Bildung von Bruchstücken teilen, welche Stäbchenbakterien oder verzweigten kurzen Hyphen ähneln. Der Stamm zeigt ein gutes Wachstum auf verschiedenen taxonomischen Medien, wobei auf dem vegetativen Mycel sich ein Luftmycel anlagert. Häufig bilden sich auch coremiaähnliche Körper (50-200 x 200-1000 um), aufweichen weiteres Luftmycel wächst. Manche der Luftmycele sind gewunden, wobei hin und wieder auch gerade oder weite spiralähnliche Konfigurationen auftreten können. Die mikroskopische Untersuchung von älteren Kulturen zeigt, dass nur in wenigen Fällen die co-nidienartigen Zellen in Ketten vorliegen, während die aus den Oberflächen solcher Kulturen erhaltenen Zellsuspensionen bei der Betrachtung unter dem Mikroskop verschiedentlich verlängerte, ellipsoïdale (0,8-1,2 |im x 4,8-6,8 um) und ellipsoïdale

(0,8-1,2 (im x 1,0-2,0 |im) Körper, welche Arthrosporen ähneln, enthielten.

Beobachtungen unter dem Elektronenmikroskop ergaben, dass diese Körper glatte Oberflächen haben, s 2) Zellenzusammensetzung

Der Stamm wurde in einem modifizierten ISP No. 1-Me-dium während 66 bis 90 Stunden bei 28 °C unter Schütteln gezüchtet, worauf man die Zellen sammelte und spülte. Nach der Methode von B. Becker et al. [Applied Microbiology 12, 10421 (1964)] und der Methode nach M.P. Lechevalier [Journal of Laboratory and Clinical Medicine 71,934 (1968)] wurden die so erhaltenen, ganzen Zellen auf ihren Gehalt an Diami-nopimelinsäure und Zuckerzusammensetzung untersucht. Die Säure lag in der meso-Form vor, während Stellen beob-15 achtet werden konnten, welche auf Galactose und Arabinose deuteten.

3) Eigenschaften auf taxonomischen Medien Der Stamm zeigte ein verhältnismässig gutes Wachstum auf verschiedenen Medien, wobei das vegetative Mycel in den 20 Anfangsphasen der Züchtung farblos bis blassgelb und in den letzteren Phasen hellgelblich-lohfarben bis gelblichfarben war. Der Stamm erzeugte lösliche Pigmente, welche in verschiedenen taxonomischen Medien gelb bis gelblichlohfarben waren. Das Luftmycel war pulverig und zeigte im allgemeinen 25 ein mässiges Wachstum bei weisser bis gelber oder hellgelb-lichlohfarbener Färbung. Die Eigenschaften des Stammes in verschiedenen taxonomischen Medien finden sich in der folgenden Tabelle I.

30 Tabelle I

Züchtungseigenschaften des Stammes No. C-15003 auf taxonomischen Medien

(A) Saccharosenitrat-Agar:

Wachstum (G): mässig, leuchtendmelonengelb (3 ia)* bis bernsteinlohfarben (3 lc)*, Bildung von coremiaähnlichen Gebilden

Luftmycel (AM): spärlich, weiss Lösliches Pigment (SP): keines oder blass gelblichlohfarben

(B) Glycerinnitrat-Agar:

G: mässig, hellelfenbeinfarbig (2 ca)*, Bildung von coremiaähnlichen Gebilden AM: mässig, weiss SP: kein

(C) Glucose-Asparagin-Agar:

G: mässig, hellringelblumenfarbig (3 pa)* bis leuchtendgelb (2 pa)*

AM: spärlich, weiss so SP: leuchtendgelb (2 pa)*

(D) Glycerin- Asparagin-Agar:

G: mässig, hellelfenbeinfarbig (2 ca)*, Bildung von coremiaähnlichen Körpern AM: spärlich, weiss SP: kein

(E) Stärkeagar:

G: mässig, hellelfenbeinfarbig (2 ca)* bis hellweizenfarbig

(2 ea)*, Bildung von coremiaähnlichen Körpern AM: reichlich, elfenbeinfarbig (2 ca)*

SP: kein

(F) Nähragar:

G: mässig, hellelfenbeinfarbig (2 ca)* bis khakigelb

(2 ga)*, Bildung von coremiaähnlichen Körpern AM: spärlich, weiss SP: kein

(G) Calciummaleat-Agar:

G: mässig, hellelfenbeinfarbig (2 ca)* bis hellweizenfarbig

(2 ea)*, Bildung von coremiaähnlichen Körpern

40

55

60

640269

4

AM: mässig, weiss bis hellelfenbeinfarbig (2 ca)*

SP: kein

(H) Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar:

G: mässig, bernsteinfarbig (3 lc)* bis leuchtend gelb (3 la)*, Bildung von coremiaähnlichen Körpern AM: mässig, weiss bis hellelfenbeinfarbig (2 ca)*

SP: kein

(I) Hafermehl-Agar:

G: mässig, hellelfenbeinfarbig (2 ca)* bis khakigelb

(2 ga)*, Bildung von coremiaähnlichen Körpern AM: spärlich, weiss bis hellgelb SP: kein

(J) Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Agar:

G: mässig, khakigelb (2 ga)*

AM: kein

SP: khakigelb (2 ga)*

(K) Tyrosin-Agar:

G: mässig, hellelfenbeinfarbig (2 ca)* bis hellmelonengelb (3 ea)*, Bildung von coremiaähnlichen Körpern AM: mässig, weiss bis hellelfenbeinfarbig (2 ca)*

SP: kamelfarben (3 ie)*

*) Farbcode nach «Color Harmony Manual», 4. Auflage (Container Corporation of America, 1958)

4) Physiologische Eigenschaften Die physiologischen Eigenschaften des Stammes finden sich in der folgenden Tabelle II. Der Temperaturbereich für das Wachstum lag bei 12 bis 38 °C. Der Temperaturbereich, in welchem ein gutes Wachstum des Luftmycel auf Agar (ISP No. 2) eintrat, lag bei 20 bis 35 °C.

Tabelle III

Verwendung von Kohlenstoffquellen durch den Stamm No. C-15003

Tabelle II

Die physiologischen Eigenschaften des waren die folgenden: Temperaturbereich für das Wachstum: Temperaturbereich für das Wachstum des Luftmycels:

Verflüssigung von Gelatine:

Hydrolyse von Stärke:

Reduktion von Nitraten: Peptonisierung von Milch: Coagulierung von Milch:

Zersetzung von Casein:

Herstellung von Melanoid-Pigmenten:

Zersetzung von Tyrosin: Zersetzung von Xanthin: Zersetzung von Hypoxanthin: Toleranz in bezug auf Lysozym: Toleranz in bezug auf Natriumchlorid:

Stammes No. C-15003

12 bis 38 °C

20 bis 35 °C

positiv positiv positiv positiv negativ positiv negativ (Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Agar),

positiv

(Tyrosin-Agar)

positiv negativ negativ positiv

2%

5) Verwendung von verschiedenen Kohlenstoffquellen Die Verwendung von verschiedenen Kohlenstoffquellen wurde unter Verwendung eines Mediums, wie es in Pridham und Gottlieb [Journal of Bacteriology 56,107 (1948)] beschrieben ist, und eines Grundmediums gleicher Zusammensetzung plus 0,1 % Hefeextrakt untersucht. Dabei Hessen sich die in der folgenden Tabelle III wiedergegebenen Werte eruieren.

Kohlenstoffquelle

D-Xylose ioL-Arabinose D-Glucose D-Galactose D-Fructose L-Rhamnose 15D-Mannose Saccarose Lactose Maltose Trehalose

Wachstum

+

+ + + + + + + + + + + + + + + + + +

+ +

Kohlenstoffquellen

+ + * Raffinose Melibose i-Inositol D-Sorbitol D-Mannitol Glycerin lösliche Stärke Blindversuch

+ + + +

Wachstum

± ±*

+ +

+ + + + - ± + +

± +

+ + +

20 *) Grundmedium bei Zusatz von 0,1% Hefeextrakt Anmerkung: + + + : üppiges Wachstum + + : gutes Wachstum + : Wachstum ±: schlechtes Wachstum 25 — : kein Wachstum

6) Andere Eigenschaften

Die Zellen wurden nach der weiter oben unter 2) wiedergegebenen Methode gesammelt und DNA nach einer analo-30 gen Methode jener von J. Marmur et al. [Journal of Molecu-lar Biology, 3,208,1961] hergestellt. Der G-C(Guanin-Cyto-sin)-Gehalt des DNA betrug ungefähr 72 Mol-%.

Die Gramfärbung des vegetativen Mycels dieses Stammes war positiv.

35 Die obigen Eigenschaften des Stammes No. C-l 5003 wurden mit den Angaben in S.A. Waksman's «The Actinomyce-tes» Bd. 2 [The Williams and Wilkins Co., 1961]; R.E. Buchanan und N.E. Gibbons, «Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Ausgabe, 1974»; und anderen Literaturstel-40 len verglichen.

Es wurde angenommen, dass dieser Stamm zur Gruppe III der Gattung Nocardia gehören würde. Es konnte aber unter den bekannten Stämmen keine Art gefunden werden, welche die beschriebenen Eigenschaften aufwies. Daraus ist zu 45 schliessen, dass dieser Stamm eine neue Art von Mikroorganismen darstellt.

Der besagte Stamm No. C-15003 ist am 23. März 1977 beim «Fermentation Research Institute, Agency of Industriai 50 Science and Technology (FERM)» 1-3, Higashi 1-chome, Yatabemachi, Tsukuba-gun, Ibaraki-ken 305, Japan unter der Nummer FERM P-3992, am 22. März 1977 beim «Institute for Fermentation, Osaka, (IFO)» 17-85, Juso-honmachi 2-chome, Yodogawa-ku, Osaka 532, Japan unter der Num-35 mer IFO 13726 und am 31. März 1977 bei «The American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852-1776, USA unter der Nummer ATCC-31281 registriert worden.

Ein Mikroorganismus der Gattung Nocardia kann, wie 60 dies Mikroorganismen im allgemeinen tun, Variationen und Mutationen eingehen, und dies entweder spontan oder künstlich. So sollten beispielsweise die verschiedenen Varianten des Stammes, welche durch Bestrahlung mit Röntgenstrahlen, y-Strahlen, ultraviolettem Licht usw., durch Monozellen-Isolie-65 rang, durch Züchtung auf verschiedene Chemikalien enthaltenden Medien oder durch eine beliebige andere mutagene Behandlung erhältlich sind, sowie die Mutanten, die sich

5

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spontan aus dem Stamm ableiten, im wesentlichen nicht als Vertreter einer anderen bestimmten Art betrachtet werden. Irgendwelche die Antibiotika C-15003 P-2, P-3, P-3' und/oder P-4 zu bilden vermögende Varianten und Mutanten lassen sich für die Zwecke der vorliegenden Erfindung verwenden. So liefert beispielsweise der Stamm No. C-15003 durch verschiedene mutagene Behandlungen Mutanten, welche sozusagen keine löslichen Pigmente erzeugen, Mutanten mit Sub-stratmycelien, welche farblos, gelblichgrün, rötlichlohfarben oder orangerot sind, Mutanten, deren Hyphen sich leicht in bazillenartige Elemente oder verzweigte, kurze Hyphen aufteilen lassen, und Mutanten mit reichlichen, weissen Luftmy-celien oder im wesentlichen ohne Luftmycelien.

An Stelle des oder zusätzlich zum im Sinne der vorliegenden Erfindung als Zusatzsubstanz verwendeten Leucin kann man seine Alkylester mit 1 oder 2 Kohlenstoffatomen, z.B. die Methylester oder Äthylester von Leucin, Amide, wie z.B. das Amid, Alkylamide mit 1 oder 2 Kohlenstoffatomen, wie z.B. N-Methylamid oder N-Äthylamid von Leucin, dessen Ketosäure, d.h. die a-Ketoisocapronsäure, oder Salze der oben erwähnten Verbindungen, wie z.B. die Chlorhydrate, verwenden. Die L-Form von Leucin ist wünschenswert. Man kann auch Mischungen der freien Form des Leucins und dessen oben genannten Derivate oder Mischungen dieser Derivate verwenden.

Bei der Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens werden die vorgenannten Substanzen im allgemeinen in Mengen von ungefähr 0,01 bis 1,0% (Gew./Vol.) und vorzugsweise von ungefähr 0,1 bis 0,5% (Gew./Vol.) dem Medium in einem beliebigen Zeitpunkte der Züchtung von Nocardia sp. Nr. C-15003 hinzugegeben. Die Zugabe erfolgt vorzugsweise im Anfangsstadium der Züchtung.

Das Medium, welches für die Züchtung eines derartigen ein Antibiotikum C-15003 P-4 erzeugenden Stammes verwendet wird, kann ein beliebiges flüssiges oder festes Medium sein, vorausgesetzt, dass es durch den Stamm verwertbare Nährstoffe enthält. Vorzugsweise wird man aber zur Erzielung einer hohen Produktion ein flüssiges Medium verwenden.

Das Medium kann nebst den erfindungsgemäss verwendeten Zusatzsubstanzen, nämlich Kohlenstoffquellen und Stick-stoffquellen, welche durch den das Antibiotikum No.

C-l 5003 P-4 erzeugenden Stamm assimiliert und verdaut werden können, anorganische Stoffe, Spurennährmittel usw. enthalten. Als Beispiele von in Frage kommenden Kohlenstoffquellen kann man Glucose, Lactose, Saccharose, Maltose, Dextrin, Stärke, Glycerin, Mannitol, Sorbitol usw., Fette und Öle, z.B. Sojabohnenöl, Specköl, Hühneröl usw., und dergl. nennen. Als Stickstoffquellen seien beispielsweise Fleischextrakt, Hefeextrakt, getrocknete Hefe, Sojabohnenmehl, Maisquellflüssigkeit, Pepton, Baumwollsamenmehl, Melassen, Harnstoff, Ammoniumsalze, z.B. Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumnitrat, und Nitratsalze, z.B. Natriumnitrat oder Kaliumnitrat, und dergl. genannt. Das Medium kann ferner Natrium-, Kalium-, Calcium-, Magnesiumsalze usw., Eisen-, Mangan-, Zink-, Kobalt-, Nickelsalze usw., Salze der Phosphorsäure, Borsäure usw. enthalten. Ferner kann das Medium zusätzlich Vitamine, z.B. die Vitamine B|, B2, Nicotinsäure, BI2, C, E etc., Nucleinsäuren, z.B. Purin, Pyrimidin und Derivate davon, enthalten. Zur Einstellung des pH-Wertes des Mediums kann man auch eine Mineralsäure und/oder ein Alkalimetall oder Ammoniak sowie die entsprechenden Basen als den pH-Wert einstellende Mittel verwenden. Öle, Fette, oberflächenaktive Mittel und schaumverhindernde Mittel können gleichfalls zugesetzt werden.

Die Züchtung kann unter beliebigen stationären Bedingungen, unter Schütteln, unter submersen aeroben Bedingungen oder unter anderen Züchtungsbedingungen erfolgen. Um eine hohe Ausbeute zu erhalten, wird man vorzugsweise eine s submerse, aerobe Züchtung vornehmen. Die Züchtungsbedingungen hängen selbstverständlich vom Zustande und von der Zusammensetzung des Mediums, des Stammes, der Züchtungsmethode und anderen Faktoren ab. Normalerweise erfolgt sie bei 20 bis 35 °C bei einem anfänglichen pH-Wert von •o ungefähr 5,5 bis 8,5. Vorzugsweise wird man als Züchtungstemperatur eine solche von 23 bis 30 °C bei einem anfänglichen pH-Wert von 6,5 bis 7,5 anwenden. Auch die Züchtungsdauer schwankt je nach den oben erwähnten Faktoren, wobei man die Züchtung so lange fortsetzt, bis die Produkti-15 vität von P-4 einen Maximalwert erreicht hat. Im Falle von Schüttelkulturen oder aerob submersen Kulturen in einem flüssigen Medium liegt die normalerweise erforderliche Zeitdauer bei ungefähr 48 bis 240 Stunden.

20 Nachstehend findet sich ein konkretes Beispiel für die Herstellung von P-4.

Der Stamm Nr. C-l 5003 wurde in einem Kulturmedium I, welches sich aus 3% löslicher Stärke, 0,2% Ammoniumchlorid, 0,05% Magnesiumsulfat, 1,09% Kaliumdihydrogen-25 phosphat, 2,09% Dikaliumhydrogenphosphat, 0,001% Fer-rosulfat und der Zusatzsubstanz zusammensetzte, oder in einem Kulturmedium II, welches sich aus 5% Dextrin, 3% Maisquellflüssigkeit, 0,1% Pepton, 0,5% Calciumcarbonat und der Zusatzsubstanz zusammensetzte, inokuliert und wäh-30 rend 144 Stunden in einem rotierenden Schüttelbehälter (200 Umdrehungen pro Minute) oder einer Fermentiervorrichtung bei 28 °C gezüchtet.

Die Tabellen IV und V zeigen die Resultate bei Verwendung des Mediums I bzw. II.

35 Die Gesamtproduktivität an C-15003 wurde mit Talaro-myces avellaneus IFO 7721 als Testorganismus mittels der Papierscheibenmethode getestet. Das Testmedium bestand aus 3,5 g Dinatriumhydrogenphosphat, 0,5% Kaliumdi-hydrogenphosphat, 5 Hefeextrakt (Difco, USA), 10 g Glu-40 cose, 15g Agar und 1000 ml destilliertem Wasser (pH 7,0).

Die Bestimmung von in der Kulturbrühe vorhandenem P-2, P-3 und P-4 erfolgte in folgender Weise:

Die Kulturbrühe wurde mit dem gleichen Volumen Äthylacetat extrahiert. Die Lösungsmittelschicht wurde ein-45 geengt und getrocknet. Das getrocknete Material wurde der-massen in Äthylacetat gelöst, dass man 1/100 Volumen der Ausgangsbrühe erhielt. Die Produkte wurden durch Dünn- . Schichtchromatographie mittels Kieselgel (Kieselgelplatten 60F254, Merck, BRD) mit Hilfe von mit Wasser gesättigtem 50 Äthylacetat entwickelt. Die Menge an Antibiotikum und das Verhältnis der Komponenten wurden mit einem Shimazu TLC-Scanner Model CS-910 mit 2 Messwellenlängen (Shimazu, Ltd., Japan) auf der Basis der integrierten Dichten jedes einzelnen Fleckens auf dem Chromatogramm bei 254 nm 55 bestimmt. Das Verhältnis der Komponenten wurde in Gew.-%, bezogen auf sämtliche Produkte, nämlich P-2, P-3 und P-4, wiedergegeben.

Die erzeugte Menge an Antibiotikum P-3' erfährt keine wesentliche Änderung.

60 Wie sich aus den Tabellen IV und V ergibt, erzeugte der Stamm Nr. C-l 5003 das Antibiotikum P-4 in einem Verhältnis von 65 bis 84%, bezogen auf die Gesamtmenge, sofern man die erfindungsgemäss anvisierten Zusatzstoffe verwendete, wogegen die Werte bei 25% oder weniger in Abwesenheit solcher Zusatzstoffe lagen. Daraus ergibt sich, dass die Gewinnung von P-4 aus der Kulturbrühe im ersteren Falle wirksamer ist als im letzteren Falle.

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Tabelle IV Verhältnis der Komponenten (Gew.-%)

Zusatz zugesetzte

Dauer der

Verhältnis der

Totale substanz

Menge (%

Zugabe

Komponenten

Produk

(Std.)*

(%) P-2

P-3

P-4

tivität (Hg/ml)

keine

-

-

10

65

25

10

L-Leucin

0,1

0

5

28

67

13,5

L-Leucin

0,3

0

8

13

79

11,5

L-Leucin

0,1

72

5

30

65

10

*Die mit der Zahl 0 angegebene Dauer der Zugabe bedeutet, dass die Zusatzsubstanz im Medium zusammen mit den übrigen Bestandteilen zugegeben wurde.

Tabelle V Verhältnis der Komponenten (Gew.-%)

Zusatz zugesetzte

Dauer der

Verhältnis der

Totale substanz

Menge (%)

Zugabe

Komponenten (%)

Produk

(Std.)*

tivität

P-2 P-3 P-4

(Hg/ml)

keine

—

_

15 60 25

18

L-Leucin

0,3

0

7 21 72

20

L-Leucin

0,5

0

5 11 84

15

*Die mit der Zahl 0 angegebene Dauer der Zugabe hat die gleiche Bedeutung wie bei der Tabelle IV.

Da P-4, welches in dieser Weise in der Fermentierbrühe erzeugt worden ist, eine lipophile, neutrale Substanz darstellt, lässt sie sich leicht aus der Kulturbrühe nach an sich für die Gewinnung solcher Metabolite bekannten Trennungs- und Reinigungsmethoden gewinnen. P-4 liess sich leicht aus dem Züchtungsfiltrat in mit Wasser nicht mischbaren, organischen Lösungsmitteln, wie z.B. Fettsäureestern, wie Äthylacetat oder Amylacetat, Alkoholen, wie Butanol, halogenierten Kohlenwasserstoffen, wie z.B. Chloroform, und Ketonen, wie z.B. Methylisobutylketon, extrahieren. Die Extrahierung von P-4 aus dem Filtrat erfolgte bei einem möglichst neutralen pH-Wert und vorzugsweise mittels Äthylacetat bei einem pH-Wert von 7. Der Extrakt wurde mit Wasser gewaschen und unter vermindertem Druck eingeengt. Hierauf wurde ein nichtpolares Lösungsmittel, z.B. Petroläther oder Hexan, dem Konzentrat hinzugegeben und das rohe, die Wirksubstanz enthaltende Produkt als Niederschlag gewonnen. Das rohe Produkt wurde hierauf nötigenfalls einer üblichen Reinigungsmethode unterzogen. Als routinemässige Reinigungsmethode kann man die Adsorptionschromatographie nennen. Zu diesem Zwecke kann man übliche Adsorptionsmittel, wie z.B. Kieselgel, aktives Aluminiumoxyd, ein makroporöses, nicht ionogenes Adsorptionsharz usw., verwenden. Das im Rohprodukt enthaltende P-4 liess sich z.B. durch Kieselgelchromatographie mit beispielsweise einer Mischung von Petroläther und Hexan entwickeln und durch Zugabe eines polaren Lösungsmittels, wie z.B. Äthylacetat, Aceton, Äthanol oder Methanol, oder einem halogenierten Kohlenwasserstoff, wie z.B. Dichlormethan oder Chloroform, welches ein polares Lösungsmittel, wie z.B. einen Alkohol, wie Methanol oder Äthanol, ein Keton, wie z.B. Aceton oder Methyläthyl-keton oder dergl. enthielt, eluieren. Auf diese Weise liess sich P-4 eluieren, abtrennen und gewinnen.

Verwendete man für die Reinigung von P-4 ein makroporöses Adsorptionsharz, so wurde die Eluierung von P-4 aus der Säule mit einer Mischung von Wasser und einem niederen Alkohol, einem niederen Keton oder einem Ester durchgeführt. Als niederer Alkohol kommt beispielsweise Methanol, Äthanol, Propanol oder Butanol usw. und als niederes Keton 30 beispielsweise Aceton oder Methyläthylketon usw., in Frage. Der Ester kann beispielsweise Äthylacetat, Butylacetat usw. sein. Gemäss einem besonderen Verfahren wurde das Rohprodukt II in einer 60%igen Methanol-Wasser-Mischung gelöst und in einer Säule von Diaion HP-10 (Mitsubishi Chemi-35 cal Industries Ltd., Japan) adsorbiert. Die Säule wurde mit einer 70%igen Methanol-Wasser-Mischung gewaschen und das P-4 mit einer 90%igen Methanol-Wasser-Mischung eluiert.

Beim oben beschriebenen Verfahren wurden die P-4 enthaltenden Fraktionen gesammelt und unter vermindertem 4o Druck eingeengt. Das getrocknete Produkt wurde dann mit 5 bis 8 Volumina Äthylacetat versetzt und das Gemisch stehengelassen, wobei sich Kristalle vom P-4 ausschieden.

Beim erfindungsgemässen Verfahren erreichte man ein Produktionsverhältnis von P-4 in den C-15003 Produkten 45 von ungefähr 65% oder mehr, wobei man P-4 leicht aus der Kulturbrühe gewinnen konnte. Daher ist das erfindungsge-mässe Verfahren für die industrielle Herstellung von P-4 besonders interessant.

Die physikochemischen Eigenschaften des nach Beispiel 4 50 erhaltenen P-4 finden sich in der Tabelle VI.

Tabelle VI

Antibiotikum C-15003 P-4 55 C33H45C1N209 = 649,196

Schmelzpunkt ( °C) 177-180°

60

Spezifische Drehung r i22°

(a)D

-142° ± 10° (c=0,522CHCl3)

Elementaranalyse 65 Gef. (%)

C = 60,65 H = 7,05 N = 4,25 Cl = 5,23

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Tabelle VI Fortsetzung Elementaranalyse Ber. (%)

Ultra violett-absorptionsspektren nm (s)

(in Methanol)

Infrarotabsorptionsspektren (cm_1)KBr magnetische

Kernresonanzspektren

(ppm)

100 MHz in CDCI3 Massenspektren (m/e) Löslichkeit

C = 61,05 H = 6,99 N = 4,32 Cl = 5,46

233(29 900) 240(sh 28 240) 252(27 590) 280(5712) 288(5680)

1740,1730,1670,1580, 1445' 1385' 1340,1255, 1180,1150,1100,1080, 1038

Farbreaktionen l,03(d)(6H)

587,485,470,450

unlöslich in Petroläther, Hexan und Wasser, spärlich löslich in Benzol und Äther, löslich in Chloroform, Äthylacetat, Aceton, Äthanol, Methanol, Pyridin, Tetrahydrofuran und Di-methylsulfoxyd

Dragendorff: positiv Beilstein: positiv

Es darf angenommen werden, dass die Verbindungen P-3, P-3' und P-4 neue Verbindungen darstellen, dass aber P-2 die gleiche Verbindung wie Maytansinolpropionat ist, welches sich in «Kupchan et al's report» [The Journal of American Chemical Society 97,5294 (1975)] findet. Dies geht aus der Elementaranalyse, aus der spezifischen Drehung, aus der Ul-traviolettstrahlenabsorption, der Infrarotstrahlenabsorption, dem Massenspektrum usw. hervor.

Die biologische Wirkung von P-4 ist die folgende: A) Antimikrobielle Wirksamkeit: Mit Trypticase-Soja-Agar (BBL) als Versuchsmedium wurden die Hemmkonzentrationen gegenüber den weiter unten erwähnten Mikroorganismen mit Hilfe der Papierscheibenmethode festgestellt. Die Filterpapierscheiben (Toyo Sei-sakusho, dünne Qualität, mit einem Durchmesser von 8 mm) wurden jeweils mit 0,02 ml einer 300 ng/ml Lösung von P-4 imprägniert, worauf man diese Scheiben auf Agar-Platten anordnete, welche mit den weiter unten genannten Mikroorganismen beimpft waren. P-4 hatte keine Wirkung in bezug auf die folgenden Bakterien, nämlich Escherichia coli, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Sta-phylococcus aureus, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens und Mycobacterium avium.

Andererseits wurde mit Agar-Platten, welche aus 3,5 g Di-natriumhydrogenphosphat, 0,5 g Monokaliumdihydrogen-phosphat, 5 g Hefeextrakt (Difco), 10 g Glucose, 15 g Agar und 1.000 ml destilliertem Wasser bei einem pH-Wert von 7,0 bestanden, die Wachstumsverhinderung gegenüber Talaro-myces avellaneus getestet. Bei diesem Testversuch lagen die minimalen Hemmkonzentrationen bei 1,0 bis 1,5 (ig/ml für

P-4. Ferner wurde Tetrahymena pyriformis W auf einem Testmedium, bestehend aus 20 g Proteose-Pepton (Difco), 1 g Hefeextrakt, 2 g Glucose, 1.000 ml destilliertem Wasser und 10 ml 1-molarem Phosphatpuffer bei einem pH-Wert von 7,0 5 bei 28 °C während 44 bis 48 Stunden gezüchtet und hierauf die Hemmwirkung auf das Wachstum von P-4 in bezug auf Protozoen durch die Serienverdünnungsmethode bestimmt. Die Wachstumsinhibition trat bei 0,5 (ig/ml für C-15003 P-4 ein.

10 P-4 zeigte Wirkungen gegenüber den folgenden Mikroorganismen:

Fusicladium levieri, Helminthosporium sigmoidium var. irreguläre, Pyricularia oryzae, Cochlioborus miyabeanus, Sclerotinia screrotiorum, Pellicularia sasakii, Trichophyton rub-15 rum, Rhodotorula rubra und Cryptococcus neoformans.

B) Cytostatische Wirkung:

Die therapeutischen Wirkungen von P-4 nach einer 9-tägi-gen, intraperitonealen Dosierung in bezug auf P 388-Leukä-mie bei Mäusen (1 x 106 Zellen/Tiere) wurden bestimmt. P-4 20 wies bezüglich des lebensverlängernden Verlaufes eine cytostatische Wirkung auf, welche, verglichen mit einer Dosismenge von 0,00625 mg/kg/Tag, einem Wert von 180% entsprach.

25 C) Toxizität:

Bei einem akuten Toxizitätstest mit Mäusen als Testtiere, denen man intraperitoneal P-4 injizierte, ergab sich mit diesem Antibiotikum ein LD50-Wert von mehr als 0,313 mg/kg.

Wie bereits erwähnt, zeichnet sich P-4 durch eine starke 30 Hemmwirkung gegenüber Fungi und Protozoen aus und ist daher als fungizides Mittel oder als Antiprotozoenmittel sehr wertvoll. Da darüberhinaus P-4 bei mit Tumoren befallenen Säugetieren, z.B. Mäusen, eine lebensverlängernde Wirkung ausübt, darf man auch annehmen, dass diese Verbindung als 35 Cytostatikum wertvoll sein wird.

P-4 kann als fungizides Mittel und als Antiprotozoenmittel mit Vorteil auch im Zusammenhang mit der bakteriellen Ökologie im Boden, in Belebtschlämmen, in der tierischen Körperflüssigkeit oder dergl. verwendet werden. Wünscht 40 man daher wertvolle Bakterien aus einer Bodenprobe zu isolieren oder will man die Wirkungen von Bakterien unabhängig von jenen von Pilzen und Protozoen bei der Bearbeitung und Analyse von Belebtschlämmen, wie sie bei der Behandlung von Abwässern Verwendung finden, einschätzen, so 45 kann man das neue Antibiotikum dazu einsetzen, um ein selektives Wachsen der bakteriellen Flora zu fördern, ohne ein gleichzeitiges Wachsen der Pilze und Protozoen zu begünstigen. Gemäss einem besonderen Beispiel kann man eine Probe einem flüssigen oder festen Medium und überdies 0,1 ml einer 50 10 bis 100 ng/ml-Lösung von P-4 in einer 1 %igen wässrigen Methanollösung pro ml des Mediums zusetzen, worauf man eine Inkubation einleitet.

P-4 kann auch als antimikrobielles Mittel für die Behandlung von durch die oben erwähnten Mikroorganismen verur-55 sachten Pflanzenkrankheiten eingesetzt werden. Gemäss einer typischen Anwendung wird P-4 in Form einer 1 %igen methanolischen wässrigen Lösung, welche 0,5 (ig/ml bis 5 ng/ml des Antibiotikums enthält, verwendet. So kann man P-4 beispielsweise zum Bekämpfen von Mehltau, der durch Helmin-60 thosporium verursachten Blattfleckenkrankheit und des Blattscheidenbrandes von Reispflanzen verwenden.

Die folgenden Beispiele erläutern die vorliegende Erfindung, ohne sie einzuschränken. Die Teile sind jeweils Gew.-Teile, sofern nichts anderes ausgesagt wird. Das Verhältnis zwischen Teilen und Vol.-Teilen entspricht jenen zwischen g und ml. Der Ausdruck «%» bezieht sich auf «Gew./Vol.», sofern nichts anderes ausgesagt wird.

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Beispiel 1

40 Vol.-Teile eines Impfkulturmediums mit einem pH-Wert von 7,0, welches 1,0% Glucose, 2,0% Bacto-Trypton und 1,2% Bacto-Hefeextrakt enthielt, wurde in einem Erlen-meyerkolben mit 200 Vol.-Teilen Fassungsvermögen gebracht.

Nach dem Sterilisieren wurde das Medium mit Nocardia sp. No. C-15003 (IFO 13726; ATCC 31281: FERM-P No. 3992) geimpft. Das geimpfte Material wurde dann bei 200 Umdrehungen pro Minute in einem rotierenden Schüttelbecher inkubiert, wobei man die Impfkultur erhielt. Die in der Kultur vorhandenen Zellen wurden dreimal mit sterilisiertem, destilliertem Wasser gewaschen und die gewaschenen Zellen hierauf erneut in der ursprünglichen Brühe von sterilisiertem, destilliertem Wasser angeschlämmt.

1 Vol.-Teil des so erhaltenen Materials wurde in 40 Vol.-Teilen eines als Hauptbestandteil dienenden Kulturmediums, welches aus 3% lösliche Stärke, 0,2% Ammoniumchlorid, 0,05% Magnesiumsulfat, 1,09% Kaliumdihydrogenphos-phat, 2,09% Dikaliumhydrogenphosphat, 0,001% Ferrosul-fat und 0,1 % L-Leucin bestand, inokuliert und diese Hauptkultur bei 28 °C während 8 Tagen in einem rotierenden Schüttelbehälter, welcher mit 200 Umdrehungen pro Minute drehte, behandelt.

Die Gesamtproduktion an C-15003 betrug 12 ng/ml und das Verhältnis von P-4, bezogen auf das gesamte Material, lag bei 80 Gew.-%.

Dieses Filtrat wurde mit 50 x 103 Vol.-Teilen Wasser und 90 x 103 Vol.-Teilen Äthylacetat versetzt und das Gemisch gerührt und zweimal extrahiert.

s Die erhaltenen Äthylacetatschichten wurden vereinigt und zweimal mit jeweils 80 x 103 Vol.-Teilen Wasser gewaschen. Dann wurde die so erhaltene Äthylacetatschicht mit 1 x 103 Vol.-Teilen wasserfreiem Natriumsulfat versetzt, getrocknet und auf ein Volumen von 200 Teilen eingeengt. Das io Konzentrat wurde mit Petroläther versetzt und der gebildete Niederschlag durch Filtrieren gewonnen. Auf diese Weise erhielt man 35 Teile des rohen Produktes.

Das so erhaltene rohe Produkt wurde mit 50 Vol.-Teilen Äthylacetat versetzt und das Gemisch gerührt. 15 Die unlöslichen Bestandteile wurden dann durch Filtrieren entfernt und das Filtrat mit 10 Teilen Kieselgel (Merck, BRD, 0,05 bis 0,2 mm) versetzt. Nach dem Rühren des Gemisches wurde das Äthylacetat durch Destillation unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde oben einer Kie-20 selgelsäule (500 Vol.-Teile) zugegeben. Die Antibiotika wurden stufenweise mit 500 Vol.-Teilen n-Hexan, 500 Vol.-Teilen einer Mischung von n-Hexan und Äthylacetat im Mischungsverhältnis von 3:1,2.000 Vol.-Teilen einer Mischung von n-Hexan und Äthylacetat im Mischungsverhältnis von 1:1 und 25 2.000 Vol.-Teilen mit Wasser gesättigtem Äthylacetat eluiert. Das Eluat wurde jeweils in Fraktionen von 50 Vol.-Teilen gesammelt.

Beispiel 2

500 Vol.-Teile der gemäss Beispiel 1 erhaltenen Impfkultur wurden in einem Sakaguchikolben mit einem Fassungsvermögen von 2.000 Vol.-Teilen inokuliert und während 48 Stunden bei 28 °C in einer sich hin- und herbewegenden Schüttelvorrichtung (110 Hübe/Minute) gezüchtet, um zu einem Inokulum zu gelangen. Das Inokulum wurde dann zu 100 x 103 Vol.-Teilen eines Mediums hinzugegeben, welches aus 2,0% Glucose, 3,0% löslicher Stärke, 1,0% Maisquellflüssigkeit, 1,0% Sojabohnenmehl, 0,5% Polypepton (Daigo Nutritive Chemicals, Ltd., Japan), 0,3% Natriumchlorid und 0,5% Calciumcarbonat (Gew./Vol.) bestand, behandelt, wobei das ganze Material sich in einem rostfreien Stahlfermentierbehälter mit einem Fassungsvermögen von 200 x 103 Vol.-Teilen befand.

Die Züchtung erfolgte während 48 Stunden bei 28 °C bei einer Belüftung von 10 Liter/Minute und durch Schütteln bei 200 Umdrehungen pro Minute. Die Kulturbrühe (10 x 103 Vol.-Teile) wurde in einen rostfreien Stahlfermentierbehälter mit einem Fassungsvermögen von 200 x 103 Vol.-Teilen eingebracht, welcher 10 x 103 Vol.-Teile eines Fermentierungs-mediums enthielt, das aus 5% Dextrin, 3% Maisquellflüssigkeit, 0,1 % Pepton, 0,5% L-Leucin und 0,5% Calciumcarbonat (Gew./Vol.) bestand, wobei der pH-Wert bei 7,0 lag.

Die Fermentierung erfolgte während 4 Tagen bei 28 °C und einer Belüftung von 100 x 103 Vol.-Teilen/Minutebei Rühren mit 150 Umdrehungen pro Minute.

Die Gesamtproduktion an C-15003 betrug 12 |xg/ml. Das P-4 in C-15003 wurde in einer Gewichtsmenge von ungefähr 85% erhalten.

Beispiel 3

Zu 95 x 103 Vol.-Teilen der Kulturbrühe, wie sie gemäss Beispiel 2 erhalten worden war, wurden 50 x 103 Vol.-Teile Aceton hinzugegeben. Das Gemisch wurde mit 2 x 103 Vol.-Teilen Hyflo Super-Cel (Johnes and Manville Products, Ltd.) versetzt und das Gemisch gründlich gerührt.

Das Gemisch wurde unter Druck durch einen Filter filtriert, wobei man 135 x 103 Vol.-Teile eines Filtrats erhielt.

Ein Anteil von 1 Vol.-Teil einer jeden Fraktion wurde zur 30 Trockne eingeengt. Dieses Konzentrat wurde dann mit 0,1 Vol.-Teil Äthylacetat versetzt, wobei man zu einem Gemisch gelangte. Dieses Gemisch wurde bei 2,5 cm von der Bodenkante einer Kieselgel-Glasplatte (Merck, BRD, 60 F254, 0,25 mm, 20 x 20) aufgetragen und bei einer Laufstrecke von 35 ungefähr 17 cm mit mit Wasser gesättigtem Äthylacetat entwickelt. Nach der Entwicklung wurde der Nachweis mit ultraviolettem Licht (2.357Â) vorgenommen. Die aktiven Fraktionen von Rf 0,49 wurden gesammelt und unter vermindertem Druck auf ungefähr 2 Vol.-Teile eingeengt. Dieses Kon-40 zentrat wurde dann mit 20 Vol.-Teilen Petroläther versetzt, wobei man 1,08 Teile rohe Kristalle erhielt. Diese rohen Kristalle wurden in 20 Vol.-Teilen warmem Äthylacetat gelöst. Nach dem Kühlen gewann man 0,92 Teile P-4. Auf diese Weise erhielt man P-4-Kristalle in reinem Zustand in einer Menge von 94 Gew.-%. Der Schmelzpunkt der Kristalle lag bei 178 bis 180 °C.

Beispiel 4

In 400 Vol.-Teilen 50%igem Methanol wurden 20 Teile 50 des gemäss Beispiel 3 erhaltenen rohen Produktes gelöst. Dann wurde eine Säule (2,5 cm Durchmesser) mit 1.000 Vol.-Teilen Diaion HP-10 (Mitsubishi Chemical Industries Ltd., Japan) beschickt und mit 3.000 Vol.-Teilen 50%igem methanolischem Wasser behandelt. Die nach den obigen Angaben 55 erhaltene Probenlösung wurde dann durch die Säule hindurchgeleitet und mit 1.000 Vol.-Teilen 60%igem Methanol gewaschen und durch kontinuierliches Hinunterfliessenlassen unter Verwendung von 7.500 Vol.-Teilen 60%igem Methanol in Wasser und 7.500 Vol.-Teilen 95%igem Methanol in Was-60 ser eluiert.

Das Eluat wurde in Fraktionen von jeweils 75 Vol.-Teilen gesammelt und jede Fraktion nach den Angaben von Beispiel 3 der Kieselgel-Dünnschichtchromatographie unterworfen.

Die aktiven Fraktionen Nr. 182 bis 190 wurden gesam-65 melt und eingeengt. Das Konzentrat wurde dann mit 500 Vol.-Teilen Wasser und 1.000 Vol.-Teilen Äthylacetat versetzt.

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Das so erhaltene Gemisch wurde in einem Scheidetrichter geschüttelt und die wässrige Schicht abgetrennt. Nach zweimaligem Waschen mit jeweils 300 Vol.-Teilen Wasser wurde die Àthylacetatschicht über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, eingeengt und stehengelassen.

Die auf diese Weise erhaltenen Kristalle von P-4 wurden durch Filtrieren gesammelt und getrocknet (0,950 Teil P-4).

Die auf diese Weise erhaltenen reinen P-4-Kristalle betrugen 92 Gew.-% und wiesen einen Schmelzpunkt von 177 bis 179 °C auf.

Beispiel 5

5 Anstelle von L-Leucin, wie dies in Beispiel 1 der Fall war, wurde der Methylester von Leucin, das N-Methylamid von Leucin, die a-Ketoisocapronsäure oder das Chlorhydrat von Leucin verwendet. Auf diese Weise gelangte man zu ähnlichen Resultaten, d.h. man erhielt das gewünschte P-4 in io ähnlichen Ausbeuten.

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