DE2645528C3 - Antibiotisch wirksame Pyrrole [2,1c] -1,4benzdiazepine - Google Patents

Description

O R¹ R²

worin eine der Gruppen R¹ und R² Wasserstoff und die andere Hydroxyl oder Methoxyl bedeuten sowie deren pharmazeutisch annehmbare Salze.

2. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Neothramycin bildender Stamm der Art Streptomyces mit den identifizierenden Merkmalen von ATCC 31 123 bei einer Temperatur von 24" C bis 35° C unter aeroben Bedingungen in einem geeigneten Kulturmedium hierfür, das Quellen mit assimilierbarem Kohlenstoff und Stickstoff enthält, ausreichend lange zur Bildung und Ansammlung von Neothramycin A und Neothramycin B in dem Kulturmedium gezüchtet wird, und daß dann Neothramycin A und Neothramycin B, entweder als Gemisch oder getrennt, aus der Kultur gewonnen werden und anschließend gegebenenfalls das Neothramycin A und/oder Neothramycin B mit wasserfreiem Methanol zu Methylneothramycir. A und/oder Methylneothramycin B umgesetzt wird bzw. werden.

3. Arzneimittel, gekennzeichnet durch einen Gehalt wenigstens einer Verbindung gemäß Anspruch 1 oder deren pharmazeutisch annehmbaren Salze(s) als aktivem Bestandteil.

(D

worin eine der Gruppen R¹ und R² Wasserstoff und die andere Hydroxyl oder Methoxyl bedeuten sowie deren pharmazeutisch annehmbare Salze.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen werden als »Neothramycin A bzw. Neothramycin B« bezeichnet.

Nachfolgend bedeutet »Neothramycin« sowohl Neothramycin A als auch Neothramycin B oder deren Gemische, falls nichts anderes angegeben ist.

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Die Erfindung bezweckt die Bereitstellung neuer Substanzen, die als Antitumormittel wirksam sind, eine »tarke Hemmaktivität auf das Wachstum von Leukimiezellen haben, jedoch eine schwache antibakterielle Aktivität sowie eine geringe akute Toxizität aufweisen und dabei weitgehend frei von schädlichen Nebenwirkungen sind.

Dies gelingt erfindungsgemäß durch die Verbindun- so gen der allgemeinen Formel I

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60 Die Verbindung Neothramycin der obigen Forme! I umfaßt somit

(i) Neothramycin A der folgenden Formel:

HO

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(Ia)

O OH H

sowie dessen pharmazeutisch annehmbare Salze und
(ii) Neothramycin B der folgenden Formel:

(Ib)

O H

sowie dessen pharmezeutisch annehmbare Salze.

Hierin bedeutet (S), daß das Kohlenstoffatom in 3-StelIung des Neothramycins A die (S) Konfiguration besitzt, und (R) bedeutet, daß das Kohlenstoffatom in 3-Stellung des Neothramycins B die (R)-Konfiguration besitzt

Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Herstellung der vorgenannten Verbindungen, das sich dadurch auszeichnet, daß ein Neothramycin bildender Stamm der Art Streptomyces mit den identifizierenden Merkmalen von ATCC 31 123 bei einer Temperatur von 24 bis 35° C unter aeroben Bedingungen in einem geeigneten Kulturmedium hierfür, das Quellen mit assimilierbarem Kohlenstoff und Stickstoff enthält, ausreichend lange zur Bildung und Ansammlung von Neothramycin A und Neothramycin B in dem Kulturmedium gezüchtet wird, und daß dann Neothramycin A und Neoihramycin B, entweder als Gemisch oder getrennt, aus der Kultur gewonnen werden und anschließeend gegebenenfalls das Neothramycin A und/oder Neothramycin B mit wasserfreiem Methanol zu Methylneothramycin A und/oder Methylneothramycin B umgesetzt wird bzw. werden.

Beim Versuch, neben den bekannten, zur therapeutischen Behandlung der Leukämie brauchbaren Antitumormitteln wie Daunomycin, Adriamycin, Anthramycin, Dextrochrysin, Sibiromycin usw. weitere neue, vorteilhafte Antitumormittel des Antibiotika-Typs zu finden, wurden zahlreiche Bodenproben gesammelt und die Stoffwechselprodukte untersucht, die durch aerobes Kultivieren der isolierten Mikroorganismen gebildet werden. Aus einer Bodenprobe, die vom Gelände der Biseibutso Kagaku Kenkyusho in Shinagawa-ku, Tokio, Japan, stammt, wurde ein neuer Mikroorganismus isoliert, der als Stamm MC916-C4 bezeichnet wird. Es wurde bestätigt, daß dieser Stamm MC916-C4 zur Art Streptomyces gehört. Dabei wurde weiter gefunden, daß zwei neue Antibiotika mit geringer antibakterieller Aktivität, jedoch mit starker Hemmaktivität auf das Wachstum von Zellen der Leukämie L-1210 bei Mäusen und auf das Wachstum bestimmter Arten von Tumorzellen in einem Kulturmedium des Stammes MC916-C4 erzeugt und angereichert werden. Erfindungsgemäß ist es möglich geworden, diese als Neothramycin A bzw. Neothramycin B bezeichneten

neuen Antibiotika aus der Nährlösung zu isolieren.

Geeignete Beispiele für pharmazeutisch annehmbare Salze von Neothramycin umfassen nichttoxische Metallsalze wie das Natrium-, Kalium-, Calcium- und Aluminiumsalz, das Ammoniumsalz und substituierte Ammoniumsalze, z. B. Salze von nicuitoxischen Aminen, wie Trialkylaminen einschließlich Triäthylamin, Procain, Dibenzylamin, N-Benzyl-ß-phenäthylamin, 1-Ephenamin, Ν,Ν'-Dibenzyläthylendiamin, Dehydroabietylamin, N.N'-Bis-dehydroabietyläthylendiamin, N-(Nieder)-alkylpiperidin, z.B. N-Äthylpiperidin und andere Amine, die zur Bildung von Salzen mit Benzylpenicillin verwendet wurden.

Die Erfindung betrifft sowohl die Substanzen Neothramycin A wie auch Neothramycin B, entweder alleine oder im Gemisch, die als gereinigter Feststoff, in Form der freien Säure oder in Form eines Salzes hiervon mit einem Metall oder einem organischen Amin vorliegen können. Neothramycin A wurde ais farbloses Pulver erhalten, das keinen definierten Schmelzpunkt besitzt, allmählich in der Nähe von 105⁰C schmilzt und sich bei 132-147°C unter Schäumen zersetzt, und das eine spezifische, optische Drehung [α]?=+272° ^c= 0,52, Dioxan) aufweist. Die Elementarnalyse für Neothramycin A ergab:

Analyse auf Ci₃Hi₄N₂O₄ · 1/2 H₂O:

Gef.: C = 57,46, H = 5,76, N= 9,84, 0=26,94%;

ber.: C = 57,56, H = 5,57, N = 10,33, 0 = 26,54%.

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Neothramycin A zeigt ein Molekulargewicht von 250 bis 300 bei der Messung mit der Barger-Akiya-Methode. Aus den Ergebnissen der Elementaranalyse und der Bestimmung des Molekulargewichts ist es wahrscheinlich, daß Neothramycin A eine empirische Formel von

C₁₃Hi₄N₂O₄ · 1/2 H₂O

besitzt. Diese Formel wurde durch hochauflösende Massenspektrometrie bestätigt, wobei gefunden wurde:

m/e 262,0934.

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Das berechnete Molekulargewicht Ci₃Hi₄N₂O₄ ist 262,0952.

Das UV-Absorptionsspektrum von Neothramycin A in einer alkalischen Lösung zeigt eine Verschiebung nach längeren Wellenlängen, wie in der F i g. 3 gezeigt ist. Wie sich aus der Tabelle I ergibt, zeigt das NMR-Spektrum (NMR = kernmagnetische Resonanz) von Neothramycin A die Anwesenheit von 14 Protonen.

Neothramycin B ist in seinen Eigenschaften Neothramycin A sehr ähnlich und es wurde als farbloses Pulver ohne definierten Schmelzpunkt erhalten, das sich bei 144⁰C unter Schäumen zersetzt und vollständig bei 15TC schmilzt. Es weist eine spezifische, optische Drehung [a]if = +314° (e=0,48; Dioxan) auf. Die Elementaranalyse von Neothramycin B ergab:

Elementaranalyse auf Ci₃HI₄N₂O₄ · 1'2H₂O:

Gef.: C = 57,00, H = 5,58, N= 9,75, 0 = 27,67%;
ber.: C = 57,56, H = 5,57. N = 10,33, 0 = 26,54%. ^b0

Aus den Ergebnissen der Elementaranalyse und der Bestimmung des Molekulargewichtes war es wahrscheinlich, daß Neothramycin B in gleicher Weise die empirische Formel e,5

C₁₃Hi₄N₂O₄ · 1/2 H₂O
besitzt. Diese empirische Formel wurde durch hochauflösende Massenspektrometrie bestätigt, wobei gefunden wurde:

m/e = 262,0.939,

berechnetes Molgewicht für Ci₃Hi₄N₂O₄ = 262,0952. Das UV-Absorptionsspektrum von Neothramycin B in alkalischer Lösung zeigt eine Verschiebung nach längeren Wellenlängen auf, wie in der F i g. 4 gezeigt ist. Wie sich aus der Tabelle Ϊ ergibt, zeigt das NMR-Spektrum von Neothramycin B die Anwesenheit von 14 Protonen wie Neothramycin A. Neothramycin A und B sind für eine Zeitspanne von etwa einem Monat oder mehr bei der Lagerung in Form eines festen Pulvers in einem Exsiccator aus braunem Glas bei 5° C stabil.

Jedoch sind Neothramycin A und B in 50%igem wäßrigem Äthanol von pH=2,5 instabil, und die Aktivitäten werden auf 25 bzw. 22% bei Zimmertemperatur während 16 Stunden reduziert In 50%igem wäßrigem Äthanol von pH = 6,5 oder pH = 8,0 bei Zimmertemperatur für 16 Stunden bleiben 80-90% der Aktivität von Neothramycin A und 70-80% der Aktivität von Neothramycin B erhalten, jedoch tritt eine Gleichgewichtsumwandlung von Neothramycin A zu B oder von B zu A auf, wie durch dünnschichtchromatografische Analyse gezeigt wurde.

Neothramycin A und Neothramycin B sind dadurch einander ähnlich, daß sie eine Hemmaktivität auf das Wachstum von Zellen von Leukämie L-1210 bei Mäusen und eine schwache antibakterielle Aktivität aufweisen. Sie besitzen eine saure Funktion in ihrem Molekül, sind in Methanol, Äthanol, Propanol, Chloroform und Dioxan löslich und in Wasser schwach löslich, jedoch in Äthyläther und η-Hexan kaum löslich oder praktisch unlöslich. Sie sind gegenüber der Rydon-Smith-Reaktion und der Tetrazoliumrotreaktion positiv, schwach positiv bei der Ninhydrinreaktion jedoch negativ gegenüber der Ehrlich-Reaktion und der Sakaguchi-Reaktion. Bei der Elementaranalyse werden praktisch nur Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff und Sauerstoff gefunden. Sie weisen eine relative Beweglichkeit dieser Substanz gegenüber Alanin (1,0) auf, die 0,17 bei der Hochspannungselektrophorese auf Filterpapier (3500 V, 35 Minuten) unter Anwendung von Ameisensäure-Essigsäure-Wasser (25 : 75 :900 in Volumen) als Elektrolytlösung beträgt

Neothramycin A zeichnet sich weiter dadurch aus, daß es ein IR-Spektrum in einer Kaliumbromidtablette besitzt, das dem in der F i g. 1 der Zeichnung wiedergegebenen Spektrum entspricht, und das durch Absorptionsspitzen bei 3450,2950,1630 (Schulter), 1600, 1510,1460,1440, 1410,1280,1200,1180, 1120,1080,1010, 870, 790 und 760 cm-¹ gekennzeichnet ist Es besitzt ein UV-Absorptionsspektrum, das dem in der F i g. 3 der Zeichnung wiedergegebenen Spektrum entspricht, das sich durch Absorptionsmaxima bei 223 nm (E 11855), 240 nm (Schulter), 265 nm (Eil 290) und 318 nm (E !!"„ 156) in einer Lösung hiervon in 10% Wasser-Methanol, durch Absorptionsmaxima bei 223 nm (E'1 885), 240 nm (Schulter), 265 nm (E 1*290) und 320 nm (E Il139) in einer Lösung hiervor. in N/10 HCl-Mcthanol (1 :9) und durch Absorptionsmaxima bei 228 nm ("El* 635), 254 nm (Eil 566), 291 nm (ElI 422) und 324 nm (Eil 412) in einer Lösung hiervon in N/10 NaOH/Methanol (1 :9) auszeichnet. Bei der Dünnschichtchromatografie auf Kieselerdegel mit Chloroform-Methanol (10:1 in Volumen) als Entwicklungslösungsmittel ergibt es einen R_f-Wert von 0,57.

Neothramycin B zeichnet sich weiter dadurch aus, daß es ein IR-Absorptionsspektrum in einer Kaliumbromidtablette aufweist, das dem in der F i g. 2 der Zeichnung wiedergegebenen Spektrum entspricht, das sich durch Absorptionsspitzen bei 3400, 2960, 1630 (Schulter), 1600,1510,11440,1400,1280,1200,1120,1080, 1010, 990, 940, 870, 790 und 760 cm-' auszeichnet. Es besitzt ein UV-Absorptionsspektrum, das dem in F i g. 4 der Zeichnung wiedergegebenen Spektrum entspricht, das sich durch Absorptionsmaxima bei 224 nm (E !1935), 240 nm (Schulter), 265 nm (Schulter) und 318 nm (£!1167) in einer Lösung hiervon in 10% Wasser/Methanol (1 :9), durch Absorptionsmaxima bei 224 nm (E\» 1000), 240 nm (Schulter), 265 nm (Schulter) und 320 nm (E\** 156) in einer Lösung hiervon in N/10 HCl-Methanol (1 :9) und durch Absorptionsmaxima bei 228 nm (E\l 800), 254 nm (E\l 725), 291 nm (Eil 456) und 324 nm (ß'u* 466) in einer Lösung hiervon in N/10 NaOH-Methanol (1 :9) auszeichnet Bei der Dünnschichtchromatografie auf Kieselerdegel mit Chloroform-Methanol (10 :1 in Volumen) als Entwicklungslösungsmittel ergibt es einen Rf-Wert von 0,50.

Neothramycin A oder B werden leicht in ein Gemisch von Methylneothramyein A (Rf=0,71 beim Kieselerdegel-Dünnschichtchromatogramm mit Chloroform-Methanol [10:1 Volumina]) und Methylneothramyein B (Rf=0,61 im gleichen Kieselerdegel-Dünnschichtchromatogramm) in wasserfreiem Methanol bei Zimmertemperatur für 16 Stunden umgewandelt Methylneothramyein A kristallisiert aus einem Gemisch aus Aceton und Benzol in Form von farblosen Mikrokristallen mit F.= 137- 140⁰C (Zers.); [«]? = +640° (c=024; Dioxan) ergibt bei der Massenspektroskopie m/e = 276,1089 (berechnetes Molgewicht für C₁₄Hi₆N₂O* = 276,1108).

Methylneothramyein B wird als farbloses Pulver erhalten mit F.=61-69°C (Zers.); [oc]? =+778° (c=0,22; Dioxan), ergibt bei der Massenspektroskopie m/e = 276,1071.

Die UV-Spektren der Methylneolhramycine sind denen der Neothramycine ähnlich und die chemischen Verschiebungen im NMR-Spektrum sind in der Tabelle 1 angegeben. Eine milde Hydrolyse von Methylneothramyein A oder B in 0,01 N HCl-Dioxan (1 :1 in Volumen) bei Zimmertemperatur für 1 Stunde mit anschließender Säulenchromatografie auf Kieselerdegel ergibt die Neothramycine A und B in guter Ausbeute.

Daher kann Methylneothramyein A als Ausgangsmaterial zur Herstellung von Neothramycin A durch milde Hydrolyse eingesetzt werden, während Methylneothramyein B als Ausgangsmaterial zur Herstellung von Neothramycin B brauchbar sein kann. Methylneothramyein A besitzt folgende Formel:

N=N

HO
CH₃O-V

(II)

Methylneothramyein B besitzt folgende Formel:

O H OCH₃

Aus diesen Daten ergibt sich, daß Neothramycin A und B Isomere sind, die eineinander umwandelbar sind und zur Anthramycingruppe der Antibiotica, welche eine Benzodiazepinstruktur besitzen, gehören. Sie unterscheiden sich von Anthramycin, Dextrochrysin und Sibiromycin durch ihre UV-Spektren. Die UV-Spektren von Tomamyein und Neothramycinen sind sehr ähnlich, jedoch unterscheiden sie sich hinsichtlich ihrer Molekülformeln und der anderen Spektren.

Tabelle I

Chemische Verschiebungen im NMR-Spektrum von Neothramycinen und deren Methylderivaten

Proton	Neothramycin A	Neothramycin B	Methyl	Methyl
			neothramyein A	neothramyein B
CH2- 2	1,7-2,5	1,7-2,5	1,8-2,6	1,8-2,6
OCH3			3,28 s	3,44 s
CH	3,80 m	3,78 m	3,72 m	3,80 dd
arom. OCH3	3,90 s	3,88 s	3,90 s	3,88 s
OH	5,00d	5,1Od
CH	5,69 dd	5,78 m	5,56 d	5,35 dd
arom. H	6,70 s	6,69 s	6,75 s	6,64 s
arom. H	7,43 s	7,40 s	7,48 s	7,36 s
CH	7,62 d	7,7Od	7,73 d	7,54 d
phenol. OH	8,00 s	7,98 s	8,04 s	7,94 s

Chem. Verschiebungen, δ (ppm) wurden in Deuterodioxan unter Verwendung von TMS als internen Standard gemessen.

Die folgenden Strukturen können für die allgemeine Wiedergabe von Neothramycin A (R¹= OH, R² = H), Neothramycin B (R¹ = H, R²=OH), Methylneothramycin A (R^OCH₃, R² = H) und Methylneothramycin B (R¹ = H, R²=OCH₃) angegeben werden:

HO-

CH,O

O R¹ R²
Im folgenden wird die Zeichnung näher erläutert:
Fig. 1 zeigt eine Kurve des !R-Absorptionsspektrums einer authentischen, reinen Probe von Neothramycin A, die in Kaliumbromid zu einer Tablette geformt war;

Fig.2 zeigt eine Kurve des IR-Absorptionsspektrums einer authentisch reinen Probe von Neothramycin B, die in Kaliumbromid zu einer Tablette geformt war;

Tabelle II

10

F i g. 3 zeigt Kurven des UV-Absorptionsspektrums einer authentisch reinen Probe von Neothramycin A, aufgelöst in 10% Wasser-Methanol, in N/10 NaOH-Methanol(l :9)bzw.inN/10HCl-Methanol(l :9);

Fig.4 zeigt Kurven des UV-Absorptionsspektrums einer authentisch reinen Probe von Neothramycin B, aufgelöst in 10% Wasser-Methanol, in N/10 NaOH-MethanolO :9)bzw.inN/10HCI-Methanol(l :9).

Die erfindungsgemäßen Substanzen Neothramycin A und Neothramycin B besitzen eine geringe antibakterielle und antifungizide Aktivität, wie sich aus den in der folgenden Tabelle II gezeigten, antibakteriellen Spektren dieser Substanzen ergibt. Die Mindesthemmkonzentratiop.er. {μ§Λη!} von. Neothramycin A und B gegenüber verschiedenen Bakterien wurden auf Nähragarplatten bestimmt, die 17 Stunden bei 37⁰C inkubiert wurden. Die Mindesthemmkonzentrationen gegenüber verschiedenen Pilzen wurden auf Nähragarplatten mit einem Gehalt von 1% Glucose nach einer Inkubation von 40 Stunden bei 27° C bestimmt.

Untersuchte Mikroorganismen Mindesthemmkonzentrationen ([ig/ml) Neothramycin A Neothramycin B

Staphylococcus aureus Smith
Staphylococcus aureus 209P
Klebsiella pneumoniae PCI 602
Escherichia coli NIHJ
Escherichia coli K-12
Pseudomonas aeruginosa Nr. 12
Bacillus subtilis PCI 219
Escherichia coli W677
Escherichia coli JR66/W677
Aeromonas salmonecida ATCC 14174
Vibrio anguillarum NCBM 6
Saccharomyces cerevisiae
Candida albicans 3147
Aspergillus niger
Piricularia oryzae
Xanthomonas citri
Xanthomonas oryzae

Wie zuvor beschrieben, besitzen die erfindungsgemäßen Substanzen Neothramycin A und B eine starke Hemmaktivität gegenüber dem Wachstum von Leukämiezellen, und sie werden als brauchbares Mittel zur therapeutischen Behandlung eines von Leukämie befallenen Lebewesens angesehen. Die chemotherapeutischen Wirkungen der Substanzen Neothramycin A und B gegenüber Leukämie L-1210 bei Mäusen wurden in folgender Weise untersucht Be: Mäusen vom CDF-I-S tamm mit einem Gewicht von 19 bis 22 g wurden Zellen der Leukämie L-1210 (10⁵ Zellen je Maus) intraperitoneal injiziert Zur Behandlung der derart infizierten Leukämie wurde die Verabreichung der Substanzen Neothramycin A und B unmittelbar nach derTumorbeimpfung begonnen. Die leukämischen Mäuse wurden in Gruppen von jeweils vier Mäusen für jede Dosis eingesetzt Wenn jeweils intraperitoneal 300, 150, 75,37,5 und 18,7 μg von Neothramycin A und B je Maus und je Tag zehn Tage lang einmal täglich injiziert 50

>100

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wurden, wurden in hohem Maße günstige Wirkungen auf das Ausmaß des Überlebensverhältnisses (in %) beobachtet, wie sich aus der folgenden Tabelle III ergibt

55 Tabelle ΙΠ	Neothramycin A	Neothramycm B
Mittel des Überlebensausmaßes (%)	tot	tot
Dosierung	(toxische Dosis)	(toxische Dosis)
(μg/Maus/Tag)	200	192
300	167	154
	154	128
150	122	103-
55 75
37,5
18,7

Das Oberlebensverhältnis (%) wird durch Division der Anzahl der Überlebenstage der behandelten Tiere (z.B. 10) durch die Zahl der Oberlebenstage der Kontrolltiere (z.B. 8) und Multiplikation mit 100 erhalten, z.B. 10/8x100=125. Überlebensgrade bzw. Verhältnisse größer als 125 werden im allgemeinen als signifikant angesehen.

Eine wirksame Verlängerung des Überlebensgrades (%) von mit Leukämie L-1210 beimpften Mäusen wurde ebenfalls durch Behandlung mit Methylneothramycin A oder Methylneothramycin B beobachtet, wie sich aus der Tabelle IV ergibt.

Tabelle IV

Mittel des Überlebensausmaßes (%)

Dosierung
(^Maus/Tag)

Methylneothramycin A

12,5

toxisch

128

103

toxisch

154

147

115

103

Die erfindungsgemäßen Substanzen Neothramycin A und B besitzen gegenüber Tieren und Menschen eine niedrige Toxizität, was dadurch gezeigt wird, daß Neothramycin A und Neothramycin B LD50-Werte von 20 — 30 mg/kg bzw. 20—30 mg/kg bei Mäusen besitzen, wenn eine Lösung von 0,25 — 0,5 Gew.-% von Neothramycin A oder B in 10% Dimethylsulfoxid-Wasser intraperitoneal bei Mäusen zum Zweck der Abschätzung der akuten Toxizität dieser Substanzen injiziert wird.

Wie aus der Beschreibung ersichtlich, sind Methylneothramycin A und B ebenfalls als Antitumormittel vorteilhaft.

Der zur Herstellung von Neothramycin verwendete Stamm MC916-C4 von Streptomyces wurde am 2. 2.

1974 bei der autorisierten Hinterlegungsstelle in Japan: »Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology«, Inage, Chiba-City, Japan, unter der Hinterlegungsnummer FERM-P 2452 hinterlegt. Dieser Stamm MC916-C4 wurde ebenfalls am 15.2.

1975 in den USA bei der American Type Culture Collection, Washington, D. C, USA, unter der Hinterlegungsnummer ATCC 31 123 hinterlegt

Die Züchtungseigenschaften und taxonomischen Eigenschaften des Stammes MC916-C4 werden im folgenden beschrieben.

1. Mikroskopische Morphologie

Der Stamm MC916-C4 hat ein verzweigtes Substratmycel, aus dem sich Lufthyphen in Form von Haken oder offenen Spiralen entwickeln. Es werden keine quirlartigen Verzweigungen beobachtet Reife Sporenketten weisen gewöhnlich über zehn ungeschlechtlich entstehende Sporen (Konidien) auf. Die Sporen besitzen Abmessungen von etwa 0,6—0,8 zu 1,0—1,2 μ und haben eine glatte Oberfläche.

2. Wachstumscharakteristika
auf verschiedenen Nährmedien

Die Bezeichnung der Farben in Klammern bezieht sich auf die Standardfarben in dem Buch »Color Harmony Manual«, das von der Container Corporation of America veröffentlicht worden ist.

(1) Auf Saccharose-Nitrat-Agar (Bebrütung bei 27⁰C):

blaßgelb bis rötlichgelb (3pc, bernsteinfarbig), gefärbtes Wachstum mit dünnen Lufthyphen von hellbräunlichgrauer bis blaßgrauer Farbe. Lösliches Pigment ist blaßgelb getönt.

(2) Auf Glucose-Asparaginsäure-Agar (Bebrütung bei 27° C):

Dunkelgelb-orange (3nc, bernsteinfarbig, bis 4pe, orangerostfarbig) gefärbtes Wachstum entwickelt Lufthyphen von hellgrauer bis hellbräunlichgrauer Farbe (2ih, gedecktes dunkelgrau). Lösliches Pigment ist schwachgelb getönt.

(3) Auf Glycerin-Asparaginsäure-Agar (ISP-Nr.

Methyl- 5-Medium, Bebrütung bei 27° C):

neothramycin B Dunkelgelborange bis gelblichbraun (3pi, gold-

braun) gefärbtes Wachstum entwickelt Lufthy-

phen von bräunlichgrauer (3ih, beigebraun) bis grauer (5ih, dunkelgetöntes Grau) Farbe. Es wird ein lösliches Pigment mit gelblicher bis gelblichbrauner Tönung erzeugt.

(4) Auf anorganisches-Salz-Stärke-Agar (ISP-Nr. 4-Medium, Bebrütung bei 27⁰C):

Blaßgelblichbraun bis gelblichbraun (3pi, goldbraun) gefärbtes Wachstum entwickelt Lufthyphen von hellbräunlichgrauer (3fe, silbergrauer) Farbe. Lösliches Pigment ist braun getönt. Die Rückseite des Wachstums ist von dunkelgelblichbrauner Farbe.

(5) Auf Tyrosin-Agar (ISP-Nr. 7-Medium, Bebrütung bei 27° C):

Dunkelgelb bis gelbiichbraun (4pg, dunkellederbraun) gefärbtes Wachstum mit Lufthyphen von heller bräunlichgrauer Farbe. Lösliches Pigment ist dunkelgelb bis gelblichbraun getönt

(6) Auf Nähragar (Bebrütung bei 27° C):

Das Wachstum ohne Entwicklung von Lufthyphen ist blaßgelblichbraun bis blaßbraun gefärbt.

Lösliches Pigment ist schwachbraun getönt.

(7) Auf Hefe-Extrakt-Malzextrakt-Agar (ISP-Nr. 2-Medium, Bebrütung bei 27⁰C):
Gelblichbraun (4pg, dunkellederfarben) bis gelborange (4pe, orangerostfarbig) gefärbtes Wachstum entwickelt Lufthyphen von hellgrauer (2fe, gedeckt grauer) bis hellbräunlichgrauer (2ih, gedeckt dunkelgrauer) Farbe. Es wird lösliches Pigment von gelblichbrauner bis brauner Farbe

so erzeugt Die Rückseite des Wachstums ist

dunkelgelblichbraun gefärbt

(S) Auf Hafermehi-Agar (ISP-Nr. 3-Mediurn, Bebrütung bei 27° C):
Rötlichgelb bis dunkelgelborange (4pe, orangerostfarbig) gefärbtes Wachstum mit Lufthyphen von hellgrauer (5fe, aschgrauer) bis bräunlichgrauer (3ih, beigegrauer) Farbe. Lösliches Pigment ist gelb getönt
(9) Auf Glycerin-Nitrat-Agar (Bebrütung bei 27° C):

Blaßgelb bis rötlichgelb (3pc, bernsteinfarbig) gefärbtes Wachstum weist schwachentwickelte Lufthyphen von bräunlichweißer bis hellbräunlichgrauer Farbe auf. Lösliches Pigment ist schwachgelb getönt

(10) Auf Stärke-Agar (Bebrütung bei 27° C):

Das Wachstum ist dunkelgelb bis gelblichbraun (2pi, senfbraun) ohne Entwicklung von Lufthyphen oder mit kaum entwickelten Lufthyphen von

weißer Farbe gefärbt. Lösliches Pigment ist schwachbraun getönt.

(11) Auf Calcium-malat-Agar (Bebrütung bei 27° C): Das Wachstum ist blaßgelb bis blaßoliv ohne Entwicklung von Lufthyphen oder mit schwacher Entwicklung von Lufthyphen von weißer Farbe getönt Lösliches Pigment ist schwachgelb getönt.

(12) Auf Cellulose (Bebrütung bei 27° C):

Farbloses Wachstum ohne Lufthyphen. Es wird kein lösliches Pigment erzeugt.

(13) Auf Gelatinestab:

Auf einem gewöhnlichen Gelatine-Medium (Bebriitung bei 20⁰C) ist das Wachstum farblos bis dunkelgelb gefärbt ohne Entwicklung von Lufthyphen. Es wird lösliches Pigment von schwachgelber Tönung erzeugt Auf einem Glucose-Pepton-Gelatine-Medium (Bebrütung bei 27° C) ist das Wachstum blaßgelb bis dunkelgelb. Es werden anfänglich keine, später jedoch gräulichweiße Lufthyphen entwickelt Es wird keine Erzeugung von löslichem Pigment beobachtet.

(14) Auf entrahmter Milch (Bebrütung bei 37°C):

Das Wachstum ist blaßgelb bis blaßorange gefärbt ohne Entwicklung von Lufthyphen. Lösliches Pigment ist sehr schwachorange getönt.

3. Physiologische Eigenschaften

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(1) Temperatur für das Wachstum:

Das Wachstum auf Glucose-Asparaginsäure-Agar wird bei 20, 24, 27, 30, 37 und 50⁰C geprüft. Der Stamm MC916-C4 wächst bei allen diesen untersuchten Temperaturen mit Ausnahme von 50⁰C. Die beste Temperatur für ein gutes Wachstum liegt um etwa 30° C.

(2) Gelatineverflüssigung:

Ein gewöhnliches Gelatine-Medium (15%) beginnt vom 5. Tag der Bebrütung bei 20⁰C an sich zu verflüssigen. Der Grad der Verflüssigung ist mittel. Die Gelatine (15%) im Glucose-Pepton-Medium beginnt vom 2. Tag der Bebrütung an sich zu verflüssigen, wenn sie bei 27° C bebrütet wird. Der Grad der Verflüssigung ist dann mittel bis stark.

(3) Stärkehydrolyse: Die Stärke in dem anorganisches-Salz-Stärke-Agar-Medium und im Stärke-Agar-Medium wird beginnend vom 5. Tag der Bebrütung an hydrolysiert, wenn sie bei 27° C bebrütet wird. Der Hydroiysegrad ist mittel bis stark.

(4) Koagulation und Peptonisierung von entrahmter Milch:

Wenn die entrahmte Milch bei 37° C bebrütet wird, beginnt die Koagulation vom 4. Tag der Bebrütung an, und es wird eine Peptonisation vom 5. Tag der Bebrütung nach vollständiger Koagulation beobachtet Der Koagulation- und der Peptonisierungsgrad ist mittel bis stark.

(5) Bildung von melanoiden Pigmenten:

Es wird keine Pigmentierung weder auf einer Trypton-Hefe-Extrakt-Kulturlösung (ISP-Nr. 1-Medium) noch auf einem Pepton-Hefe-Extrakt-Eisen-Agar (ISP-Nr. 6-Medium) noch auf einem Tyrosin-Agar (ISP-Nr. 7-Medium) beobachtet wenn die Bebrütung bei 27° C stattfindet

(6) Verwertung von Kohlenstoffquellen für das Wachstum:

Die Verwertung der nachstehenden Kohlenhydrate wird in einem Pridham-Gottlieb-Agar-Medium (ISP-Nr. 9-Medium) untersucht, wenn die Bebrütung bei 27°C durchgeführt wird.
Für das Wachstum werden Glucose und L-Rhamnose verwertet L-Arabinose, D-Fructose, Saccharose, Inosit und D-Mannit werden nicht verwertet. Die Verwertung von D-Xylose ist zweifelhaft Raffinose wird manchmal und manchmal nicht verwertet

(7) Verflüssigung von Calcium-malat:
Calcium-malat im Calcium-malat-Agar-Medium wird um das Wachstum herum beginnend am 9. Tag der Bebrütung verflüssigt, wenn die Bebrütung bei 27° C erfolgt Der Verflüssigungsgrad ist mittel bis stark.

(8) Nitrat-Reduktion:

Die Reduktion ΫΌη Nitrat wird in wäßriger Pepton-Lösung beobachtet, die 1,0% Natriumnitrat (ISP-Nr. 8-Medium) enthält, wenn die Bebrütung bei 27⁰C stattfindet

Unter Zusammenfassung der vorstehenden Charakteristika des Stammes MC916-C4 ist festzustellen, daß dieser Stamm zur Art Streptomyces gehört und daß die Lufthyphen offene Spiralen bilden, jedoch keine Quirle entwickeln. Die Sporenoberfläche sieht unter dem Mikroskop glatt aus. Auf verschiedenen Medien zeigt das Wachstum eine gelblichorange bis gelblichbraune Farbe sowie eine Entwicklung von Lufthyphen von leuchtendbräunlichgrauer bis bräunlichgrauer Farbe. Lösliches Pigment ist gelb bis braun oder gelblichbraun getönt. Es wird kein melanoides Pigment erzeugt Proteolyse- und Stärkehydrolysegrade sind stark.

Auf Grundlage der vorgenannten Eigenschaften wird der Stamm MC916-C4 mit bekannten analogen Streptomyces-Spezies unter Bezugnahme auf die Beschreibungen von »International Streptomyces Project« (ISP) verglichen. Es ist gefunden worden, daß der Stamm MC916-C4 dem Stamm Streptomyces naraensis ähnlich ist (vgl. »International Journal of Systematic Bacteriology«. 22 [1972], Seite 323). Jedoch ist festgestellt worden, daß der Stamm MC916-C4 vom Stamm Streptomyces naraensis ISP 5508 bezüglich der Verwertbarkeit von Kohlenstoffquellen verschieden ist. Streptomyces naraensis erzeugt Cycloheximid, ähnlich dem Stamm MC916-C4. Ferner ist unter den Cycloheximid erzeugenden Stämmen gefunden worden, daß Stämme der Gruppe C, die Streptomyces griseolus analog sind, wie in dem Aufsatz von T. Furumai und Mitarbeitern »On cycloheximide-producing microorganismus« (vgl. »Journal of Antibiotics«, Ser. B, Band 17 [1964], Nr. 4, Seite 181) berichtet wird, dem Stamm MC916-C4 sehr ähnlich sind.

Der Stamm MC916-C4 stimmt sehr gut in mancherlei Hinsicht mit den Stämmen der vorgenannten Gruppe C überein, obwohl der Stamm MC916-C4 nicht untersucht worden ist ob er Eigenschaften wie Hämolyse, Verflüssigung von Serum und Verwertung von Galactose und Lactose besitzt die die Stämme der Gruppe C zeigen. Jedoch sind die Stämme der Gruppe C gegenwärtig nicht verfügbar, denn sie sind alle tot In dieser Situation wird ein Vergleich des Stammes MC916-C4 jetzt mit dem Stamm Streptomyces IFO 3300 gemacht, der bekanntlich Fermicidin, ein dem Cycloheximid analoges Antibioticum, erzeugt und von dem T. Furumai und Mitarbeiter (a.a.O.) eine gute Übereinstimmung mit den Stämmen der Gruppe C angegeben.

Die Ergebnisse dieses Vergleichs sind in der Beschreibungen in »Journal of Antibiotics« angegeben.

Tabelle V

nachstehenden Tabelle V unter Bezugnahme auf die

Eigenschaften	Stamm MC916-C4	Streptomyces	Beschreibung des	Beschreibung der
		IFO 3300 (analog	Streptomyces	Gruppe C in der
		Streptomyces	IFO 3300 in der	Literatur**)
		griseolus)	Literatur*)

Bildung von Spiralen	+	±	(*)	+
Sporenoberfläche	glatt		glatt**)	glatt
Farbe der Lufthyphen	hell bräunlich grau	hell braungrau	grau	bräunlich grau
	bis bräunlich grau	bis bräunlich grau
Farbe des Wachstums	gelb-orange	farblos	cremfarben
	bis gelblich braun	bis blaß gelblich	bis braun getönt
		braun
Lösliches Pigment	gelb bis braun getönt	nicht beobachtet	nicht beobachtet
		oder braun getönt	oder bräunlich
Bildung von Melanin
artigem Pigment
auf ISP-Nr. 1	-	-	..**)	—
auf ISP-Nr. 6	—	-	-**)	—
auf ISP-Nr. 7	-	-	-**)	-
Stärkehydrolyse	+	+	+	+
Koagulation von Milch	+	+	-	+
Peptonisation von Milch	+	+	-	+
Gelatineverflüssigung
im reinen Gelatine-	+	+	schwach verflüssigt	+
Medium			±
im Glucose-Pepton-	+	+
Gelatine-Medium
Nitratreduktion	+	+	+	teils + teils
Verwertbarkeit von
Kohlenwasserstoffquellen:
Glucose	+	+
L-Arabinose	-	-
D-Xylose	±	±		teils + teils
D-Pructose	-	±		—
Saccharose	-	-
Inosit	-	-
L-Rhamnose	(+)	+
Raffinose	±	±
D-Mannit	-	-		—
Erzeugte Antibiotica	Cycloheximid und		Fermicidin	Cycloheximid
	Neothramycin A + E		(analog Cyclo-

heximid)

Bemerkungen:

*) = »Journal of Antibiotics« Ser. B, Band 7, Nr. 7, S. 221 (1954); **) = »Journal of Antibiotics« Ser. B, Bd. 17, Nr. 4, S. 181 (1964); ±) = wahrscheinlich keine Verwertung der Kohlenstoffquelle; (+) = wahrscheiniiche Verwertung der Kohlenstoffqnelle.

Aus dieser Tabelle V ist ersichtlich, daß der Stamm MC916-C4 mit dem in der vorgenannten Literatur beschriebenen Stamm der Gruppe C übereinstimmt, doch vom Stamm Streptomyces IFO 3300 bezüglich der Koagulation und Peptonisierung von Milch verschieden ist Ferner ist der Stamm MC916-C4 von Streptomyces griseolus (vgl. »International Journal of Systematic Bacteriology«, 18 [1968], Seite 122), dem eine Ähnlichkeit mit dem Stamm Streptomyces IFO 3300 nachgesagt wird, insofern unterschieden, daß Streptomyces griseolus keine offenen Spiralen bei den Lufthyphen bildet und auch etwas verschieden von dem Stamm MC916-C4 bezüglich der Verwertbarkeit von Kohlenstoffquellen ist. Ein weiterer Vergleich des Stammes MC916-C4 mit dem Stamm Streptomyces IFO 3300, mit Streptomyces griseolus ISP 5067 und dem Stamm Streptomyces naraensis ISP 5508 wurde durchgeführt. Es wurde gefunden, daß der Stamm MC916-C4 mit dem Stamm Streptomyces Sp. IFO 3300 und Streptomyces naraensis ISP 5508 und insbesondere mit dem erstgenannten

Stamm verwandt ist Der Stamm IFO 3300 unterscheidet sich von dem Stamm MC916-C4 jedoch etwas dadurch, daß er bei der Farbe des Wachstums eine orange Tönung besitzt Dsr Stamm MC916-C4 unterscheidet sich von dem genanten Stamm ISP 5508 im Hinblick auf die Reduktion von Nitrat und von dem genannten Stamm ISP 5067 hinsichtlich der Bildung von Spiralen, der Ausnutzung von Kohlenstoffquellen und der Reduktion von Nitrat deutlich.

Es findet häufig eine Mutation von Actinomyceten entweder unter künstlichen oder unter spontanen Bedingungen statt Demgemäß schließt die vorliegende Erfindung die Anwendung sowohl des Stammes MC916-C4 als auch die seiner Mutanten ein. Mit anderen Worten besagt dies, daß die Erfindung die Anwendung aller Stämme der Art Streptomyces umfaßt die Neothramycin erzeugen.

Neothramycin kann durch aerobe Züchtung von Sporen oder Mycel eines Neothramycin erzeugenden Stammes der Art Streptomyces, wie Streptomyces MC916-C4 identifiziert ais Streptomyces ATCC 31 123 erhalten werden. Bei der Durchführung des Verfahrens vorliegender Erfindung wird eine Sporen- oder Mycelmenge eines Neothramycin erzeugenden Stammes auf ein dafür geeignetes Nährmedium mit einem Gehalt an Nährstoffquellen überimpft und dann unter aeroben Bedingungen und vorzugsweise aeroben " Tauchbedingungen derart bebrütet daß man eine Nährlösung mit einem Gehalt an Neothramycin erhält. Im allgemeinen können die für die Züchtung gewöhnl· eher Actinomyceten in üblicher Weise angewendeten Bestandteile des Nährmediums für die Zwecke vorliegender Erfindung verwendet werden. Zum Beispiel können im Handel erhältliches Sojabohnenmehl, Erdnußpulver, Baumwollsamenpuiver, Trockenhefe, Pepton, Fleischextrakt, Casein, Maisquellwasser, N-Z-Amin, Ammoniumnitrat, Ammoniumsulfat und dergleichen als Stickstoffquellen vorteilhaft sein. Im Handel erhältliche Kohlenhydrate, wie Glucose, Stärke, Glycerin, Maltose, Dextrin, Saccharose, Lactose, Melasse und dergleichen sowie Fette oder Öle sind als Kohlenstoffquelle von Vorteil. Außerdem können als Salzergänzung in dem Nährmedium Natriumchlorid, Calciumcarbonat, Magnesiumsulfat mit 7 Mol Wasser, Manganchlorid, Natriumphosphat oder andere anorganische Salze verwendet werden. Zahlreiche Schwermetallsalze können gegebenenfalls in Spuren ebenfalls zugegeben werden. Beliebige Nährstoffe, die zur Züchtung von Actinomyceten bekannt sind, können beim erfindungsgemäßen Verfahren Verwendung finden, solange sie von dem Neothramycin erzeugenden Stamm zur Erzeugung von Neothramycin assimilierbar sind.

Zur Herstellung von Neothramycin im großen Maßstab wird eine Züchtung im flüssigen Zustand bevorzugt. Eine beliebige Temperatur, bei der der Neothramycin erzeugende Stamm wachsen und Neothramycin erzeugen kann, kann zur Züchtung angewendet werden. Jedoch bevorzugt man eine Züchtungstemperatur von 24 bis 35° C. Die Züchtung wird eine ausreichende Zeit fortgesetzt, um eine ausreichende Menge Neothramycin A und B im Nährmedium zu erzeugen. Zum Beispiel wird ein Nährmedium mit 2% Glucose, 2% Glycerin, 1,2% Sojabohnenmehl, 1,0% Baumwollsamenmehl, 0,32% Calciumcarbonat, 0,5% Natriumchlorid und 0,0005% Manganchlorid-tetrahydrat hergestellt und bei pH 6,8 sterilisiert. Dieses Medium wird dann mit von einer Schrägkultur des Stammes MC916-C4 geernteten Sporen oder Mycel beimpft Wenn dann die Kultur unter aeroben Bedingungen bei 28° C geschüttelt wird, erreicht die Erzeugung und die Ansammlung von Neothramycin in dem Nährmedium einen Höchstwert nach einer Bebrütung von drei bis fünf Tagen.

Die Prüfung von Neothramycin kann unter Verwendung von Staphylococcus aureus oder Escherichi coli als Testorganismen nach der Standard-Schalen-PIatten-Methode erfolgen, die gewöhnlich bei der Prüfung bekannter Antibiotica angewendet wird. Authentisch reines Neothramycin, das gemäß Beispiel 4 erhalten wurde, kann als Standardprobe verwendet werden, die eine Potenz von 1000 Einheiten je Milligramm zeigt Wenn andere antibiotische Substanzen, wie Cycloheximid, in der Kulturlösung des Stammes MC916-C4 zusätzlich zu Neothramycin gleichzeitig mit erzeugt werden, kann das Nährmedium mit Äthylacetat oder einem anderen geeigneten organischen Lösungsmittel gewaschen werden, um die anderen antibiotischen Substanzen durch Extrahieren zu entfernen.

Die verbleibende wäßrige Phase kann dann für die Prüfung des Gehalts an Neothramycin A und B nach der vorgenannten Standard-Schalen-Platten-Methode eingesetzt werden.

Zur Gewinnung von Neothramycin aus dem Nährmedium kann die Nährlösung mit dem Neothramycin erzeugenden Stamm entweder mit einem geeigneten organischen Lösungsmittel, wie n-Butanol, zur Gewinnung eines Extraktes von Neothramycin in diesem Lösungsmittel oder mit einem geeigneten Adsorptionsmittel, wie Aktivkohle, behandelt werden, um Neothramycin mittels des Adsorptionsmittels zu adsorbieren. Es wird die Verteilung von Neothramycin A oder B zwischen n-Butanol und Wasser geprüft, und man hat gefunden, daß bei einem pH-Wert von 2 bis 7 das Konzentrationsverhältnis von Neothramycin in n-Butanol/Wasser über 5 liegt. Demgemäß kann Neothramycin mit n-Butanol aus der wäßrigen Kulturlösung extrahiert werden, die auf einen pH-Wert von 2 bis 7, vorzugsweise auf etwa 6, eingestellt worden ist. Da Neothramycin 'praktisch unlöslich in Äthylacetat oder Chloroform und somit nicht extrahiert mit Äthylacetat oder Chloroform aus dem flüssigen Anteil der Kulturlösung ist, ist es deshalb erforderlichenfalls möglich, die Kulturlösung mit Äthylacetat oder Chloroform zu extrahieren, um mögliche Verunreinigungen aus der Kulturlösung zu entfernen. Um Neothramycin aus der Kulturlösung abzutrennen, behandelt man die Kulturlösung vorzugsweise mit Aktivkohle als Adsorptionsmittel. Neothramycin, das mittels Aktivkohle adsorbiert worden ist, kann davon mittels eines Gemisches von Methanol und Wasser, eines Gemisches von Propanol und Wasser oder eines Gemisches von Aceton und Wasser usw. eluiert werden. Die Wirksamkeit des Eluierens kann verbessert werden, wenn das Eluieren unter schwach alkalischen Bedingungen durchgeführt wird.

Die Reinigung von Neothramycin kann unter Verwendung des vorgenannten Extraktionsverfahrens und des Adsorptions-Elutions-Verfahrens in einer zweckmäßigen Kombination oder zu wiederholten Malen erfolgen. Eine weitere Reinigung kann durch Anwendung einer Säulen-Chromatographie an einem vernetzten Dextran (»Sephadex LH-20«) oder an Kieselerdegel erfolgen. Das bekannte Antibiotica Cycloheximid, das häufig ebenfalls in der Kulturlösung des Stammes MC916-C4 vorliegt, kann in einfacher Weise von dem erfindungsgemäßen Neothramycin

030 20y/291

durch Extrahieren mit Äthylacetat oder durch Chromatographieren an einem vernetzten Dextran der vorgenannten Art abgetrennt werden.

Um Neothramycin A von Neothramycin B zu trennen, kann ein Gemisch von Neothramycin A und Neothramycin B einer Säulen-Chromatographie an Kieselerdegel mit einem Gemisch aus Chloroform und Methanol im Volumenverhältnis 30 :1 als Entwicklerlösung unterworfen werden. Das abgetrennte Neothramycin A oder das abgetrennte bzw. isolierte Neothramycin B kann durch Säulen-Chromatographie an Kieselerdegel unter Verwendung eines geeigneten Gemisches organischer Lösungsmittel als Entwicklerlösung gereinigt werden.

Die Gewinnung von Neothramycin A und Neothramycin B kann in typischer Weise wie folgt durchgeführt werden: Die Neothramycin enthaltende Kulturlösung wird zuerst filtriert und dann zentrifugiert, um Festsubstanzen zusammen mit Mycel zu entfernen. Das Filtrat der Lösung wird dann mit Aktivkohle behandelt, um Neothramycin daran zu adsorbieren, Die das absorbierte Neothramycin enthaltende Aktivkohle wird danach mit einem Gemisch aus Aceton und Wasser im Volumenverhältnis 1:1 bei pH 8,0 eluiert. Das Eluat wird in Fraktionen gesammelt Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und unter vermindertem Druck bei einer Temperatur bis zu 40° C zur Trockne eingedampft oder in anderer Weise gefriergetrocknet. Man erhält ein rohes Pulver, das Neothramycin enthält. Dieses rohe Pulver wird mit wäßrigem Äthanol derart extrahiert, daß der größere Teil der aktiven Bestandteile in den erhaltenen Extrakt gelangen. Dieser Extrakt wird unter vermindertem Druck bei einer Temperatur bis zu 40°C zur Trockne eingedampft oder in anderer Weise gefriergetrocknet. Man erhält eine weitere Fraktion rohes Pulver. Eine Lösung dieses rohen Pulvers in Methanol wird auf eine Säule mit einem vernetzten Dextran (»Sephadex LH-20«) gegeben. Anschließend wird die Säule mit Methanol entwickelt. Während der Chromatographie wird das möglicherweise mit vorliegende Cycloheximid in solche Fraktionen eluiert, die in der ersten Phase des Verfahrens anfallen, während das Gemisch von Neothramycin A und B in solchen Fraktionen eluiert werden, die in der späteren Phase des Verfahrens anfallen.

Die aktiven Fraktionen mit einem Gehalt an Neothramycin A und B werden vereinigt und dann unter vermindertem Druck bei einer Temperatur bis zu 40° C zur Trockne eingedampft. Man erhält ein rohes Pulver. Dieses Pulver wird in einer geringen Menge Methanol aufgenommen. Die methanolische Lösung wird gleichmäßig mit einer Menge von neutralem Kieselerdegel vermischt. Das Gemisch wird durch Eindampfen getrocknet und dann am Kopf einer mit neutralem, mit einem Gemisch aus Chloroform und Äthanol im Volumenverhältnis 30 :1 imprägniertem Kieselerdegel gefüllten Säule aufgegeben. Die Kieselerdegel-Säule wird anschließend mit einem Gemisch aus Chloroform und Äthanol im Volumenverhältnis 30 :1 entwickelt.

Während dieser Chromatographie wird Neothramy- eo ein A in die aktiven Fraktionen eluiert, die in der ersten Phase des Verfahrens anfallen, während Neothramycin IJ in solche aktive Fraktionen eluiert wird, die in der späteren Phase des Verfahrens anfallen. Die aktiven l-raktionen mit Neothramycin A und die aktiven b? Fraktionen mit Neothramycin B werden unter vermindertem Druck bei einer Temperatur bis zu 40°C zur Trockne eingedampft. Man erhält ein rohes Pulver, das Neothramycin A enthält bzw. ein rohes Pulver, das Neothramycin B enthält

Das derart erhaltene rohe Pulver mit Neothramycin A wird in einer geeigneten Menge Chloroform aufgenommen. Die Lösung wird durch eine Säule mit neutralem Kieselerdegel laufen gelassen, das mit Chloroform imprägniert worden ist Diese Kieselerdegel-Säule wird mit Chloroform gewaschen und dann bei 5° C mit einem Gemisch aus Chloroform und Äthanol im Volumenverhältnis 60 :1 entwickelt Das Eluat wird in Fraktionen aufgefangen. Die gewünschten aktiven Fraktionen, die nur Neothramycin A enthalten, werden unter Bezugnahme auf die Untersuchungsergebnisse einer biologischen Prüfung und der Dünnschicht-Chromatographie jeder Fraktion festgestellt. Die derart ausgewählten, erwünschten aktiven Fraktionen werden vereinigt und dann unter vermindertem Druck bei einer Temperatur bis zu 40⁰C zur Trockne eingedampft, wobei man ein farbloses, Neothramycin enthaltendes Pulver erhält Dieses Pulver kann weiter zu einem farblosen, Neothramycin A enthaltenden Pulver mit einer Zersetzungstemperatur von 110-122⁰C durch Wiederholung des zuvor beschriebenen Verfahrens der Kieselerdegelchromatographie oder durch Auflösen dieses farblosen Pulvers in einem kleinen Chloroformvolumen, Zugabe von Äthyläther zu der Chloroformlösung, Ab^filtrieren und Trocknen des erhaltenen Niederschlages gereinigt werden. Ein farbloses, Neothramycin B enthaltendes Pulver mit einer Zersetzungstemperatur von 139 —163° C kann aus dem zuvor beschriebenen, Neothramycin B enthaltenden rohen Pulver durch Reinigung in der gleichen Weise, wie für Neothramycin A beschrieben, erhalten werden. Es wird jedoch bevorzugt, daß eine Säulenchromatographie auf Kieselerdegel unter Verwendung eines Gemisches aus Chloroform und Äthanol (100:1 im Volumen) als Entwicklungslösungsmittel durchgeführt wird.

Das zuvor beschriebene, farblose, Neothramycin A enthaltende Pulver mit einer Zersetzungstemperatur von 110—122°C wird in einem kleinen Volumen Äthanol aufgelöst und erneut auf einer Säule von neutralem Kieselerdegel unter Verwendung von mit Wasser gesättigtem Äthylacetat als Entwicklungslösungsmittel Chromatographien. Das Eluat wird in Fraktionen aufgefangen, und die Neothramycin A enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und unter vermindertem Druck einer Temperatur bis zu 4O⁰C zur Trockne eingeengt, wobei ein authentisch reines, farbloses Pulver von Neothramycin A erhalten wird, das eine Zersetzungstemperatur von 132-147° C sowie eine spezifische, optische Drehung [λ]? = +272° (c= 0,52; Dioxan) erhalten wird. Das zuvor beschriebene, farblose, Neothramycin B enthaltende Pulver mit einer Zersetzungstemperatur von 139-163° C wird in einem kleinen Volumen Äthanol aufgelöst und erneut auf einer Säule von neutralem Kieselerdegel unter Verwendung von mit Wasser gesättigtem Äthylacetat als Entwicklungslösungsmittel chromatographiert. Das Eluat wird in Fraktionen gesammelt und die Neothramycin B enthaltenden Fraktionen werden miteinander vereinigt und unter vermindertem Druck einer Temperatur bis zu 40⁰C zur Trockne eingeengt, wobei ein authentisch reines, farbloses Pulver von Neothramycin B erhalten wird, das eine Zersetzungstemperatur von 144 —151⁰C und eine spezifische, optische Drehung von [«]? = +314° (c= 0,48; Dioxan) zeigt.

Im Hinblick auf die vorgenannten Eigenschaften von Neothramycin A und Neothramycin B wurde bestätigt,

daß diese Substanzen neue Antibiotica sind, die von bekannten Antibiotica verschieden sind.

Die Erfindung betrifft daher weiterhin Arzneimittel für die therapeutische Behandlung eines an Leukämie leidenden Lebewesens einschließlich Menschen, wobei 5 dieses Arzneimittel als aktiven Bestandteil wenigstens eine der Verbindungen Neothramycin A, Neothramycin B, Methylneothramycin A oder Methylneothramycin B oder pharmazeutisch annehmbare Salze hiervon in einer ausreichenden Menge enthält, um eine Erkrankung durch Leukämie in vivo zu mildern, wobei der aktive Inhaltsstoff in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger vorliegen kann.

Es wird betont, daß die gegenwärtig bevorzugten Mengen an Neothramycin nach der im einzelnen verwendeten Verbindung, der jeweiligen Arzneimittelformulierung, der Art der Applikation und nach dem jeweiligen zu behandelnden Organisms und dem entsprechenden Situs variieren. Es werden zahlreiche Faktoren, die die Wirkung des Arzneimittels modifizieren, vom Fachmann in Betracht gezogen, zum Beispiel Alter, Körpergewicht, Geschlecht, Diät, Zeit und Weg der Verabreichung, Ausscheidungsgeschwindigkeit, Arzneimittelkombinationen, Empfindlichkeitsreaktionen und Schwere der Erkrankung.

Die besten Anwendungsmengen für eine gegebene Anzahl von Bedingungen kann durch den Fachmann unter Anwendung der üblichen Dosierungsbestimmungsuntersuchungen im Hinblick auf die vorgenannten Richtlinien ermittelt werden.

Es wird angenommen, daß unter Anwendung der vorstehenden Beschreibung und ohne weitere Ausarbeitung der Fachmann das Gedankengut vorliegender Erfindung in vollem Umfange verwerten kann. Die nachstehenden bevorzugten spezifischen Ausführungsformen stellen deshalb lediglich veranschaulichende Beispiele dar und begrenzen die Offenbarung der vorliegenden Erfindung in keiner Weise.

Beispiel 1 _4Q

Eine Platinöse voll Streptomyces MC916-C4 (ATCC 31 123), der in einem Schrägagar-Medium bebrütet worden ist, wird in 125 ml eines sterilen flüssigen Züchtungsmediums vom pH 7,0 überimpft, das 2,5% Maltose, 0,75% Pepton, 0,75% Fleischextrakt, 0,3% Hefe-Extrakt, 03% Natriumchlorid und 0,1% MgSO₄ ■ 7 H₂O enthält Das beimpfte Medium wird 48 Stunden bei 28°C geschüttelt. Man erhäli die erste Keimkultur, die in einer Impfmaterialmenge 0,48 Volumenprozent auf 501 eines sterilisierten flüssigen Züchtungsmediums vom pH 7,0, das 3,5% Stärkesirup, 0,75% Pepton, 0,75% Fleischextrakt, 0,3% Hefe-Extrakt, 0,3% Natriumchlorid und 0,1% MgSO₄ · 7 H₂O enthält, in einen Fermentor aus rostfreiem Staiil und mit einem Fassungsvermögen von 130 Liter überimpft wird. Das überimpfte Medium wird 24 Stunden bei 28° C unter Belüftung und Rühren gezüchtet, um die zweite Keimkultur zu erzeugen, die in einer Impfmaterialmenge von 2 Volumenprozent (6 1) auf 300 I eines flüssigen ZüchtuhgsmeQliums vom pH 6.8 überimpft wird, das 2% eo Glucose, 2% Glycerin, 1,2% oojabohnenmehl, 1,0% BaumwollsaiT>\:npulver, 0,32% Calciumcarbonat, 0,5% Natriumchlor'tl und 0,0005% Manganchlorid-tetrahydrat enthält Und das 30 Minuten bei 120° C sterilisiert worden ist. Die Bebrütung .wird 92 Stunden bei 28° C unter Belüften und Rühren mit 250 Umdrehungen je Minute durchgeführt, während innerhalb der ersten 24 Stunden die Belüftungsgeschwindigkeit 150 l/min beträgt und dann für die restliche Dauer von 24 bis 92 Stunden der Bebrütung auf 3001/min erhöht wird.

Die erhaltenen 3001 Züchtungslösung vom pH 73 und einer Wirksamkeit von 88 Einheiten je Milliliter werden mit 24 kg einer Filtrierhilfe (Diatomeenerde, die im Handel unter der Bezeichnung »Hyflo-supercel« erhältlich ist) vermischt Das Gemisch wurd mittels eines Druckfilters filtriert und man erhält 3001 Filtrat der Züchtungslösung. Dieses Filtrat wird gut mit 3 kg Aktivkohle bei Raumtemperatur eine Stunde unter Rühren vermischt so daß die Antibiotica an die Aktivkohle adsorbiert werden.

Der Anteil Aktivkohle wird durch Zentrifugieren gesammelt und dann mit 1501 Wasser gewaschen. Die gewaschene Aktivkohle wird eine Stunde unter Rühren mit 701 eines Gemisches von Aceton und Wasser im Volumenverhältnis 1 :1 (pH 8,0) vermischt so daß die Antibiotica in das Lösungsmittel extrahiert werden. Diese Extraktion wird wiederholt Die derart erhaltenen Extrakte werden vereinigt und ergeben 118 Liter. Die Extraktlösung wird unter vermindertem Druck bei einer Temperatur bis zu 4O⁰C eingeengt Die eingeengte Lösung in einer Menge von 2,6 Liter wird gefriergetrocknet Man erhält 565 g eines braungefärbten Pulvers (Wirksamkeit 35 Einheiten/mg), das Neothramycin A und Neothramycin B enthält Dieses braungefärbte Pulver wird mit 11,6 Liter eines Gemisches von Äthanol und Wasser im Volumenverhältnis 4:1 extrahiert Unlösliches, das keine antibakterielle Wirksamkeit besitzt, wird durch Filtrieren entfernt Man erhält 11,2 Liter eines äthanolischen Extraktes. Dieser Extrakt wird unter vermindertem Druck bei einer Temperatur bis zu 40⁰C auf ein Volumen von 800 ml eingeengt Die eingeengte Lösung wird gefriergetrocknet, und man erhält 218,5 g eines Pulvers (Wirksamkeit 53 Einheiten/ mg). Dieses rohe Pulver wird in fünf gleiche Teile geteilt Jeder Teil wird in 20 ml Methanol gelöst Die methanolische Lösung wird durch eine Säule von 90 mm Durchmesser und mit einer Füllung von 4 Liter vernetztem Dextran (»Sephadex LH-20«) laufen gelassen, die im wesentlichen mit Methanol entwickelt wird. Das Eluat wird in 200-ml-Fraktionen gesammelt. Es wird festgestellt daß Cycloheximid im Eluat der Fraktionen 9 bis 11 vorliegt während ein Gemisch von Neothramycin A und Neothramycin B im Eluat der Fraktionen 12 bis 14 vorliegt Die Fraktionen 12 bis 14 werden vereinigt und unter vermindertem Druck bei einer Temperatur bis zu 40° C zur Trockne eingedampft Man erhält 47 g eines rohen Pulvers (Wirksamkeit 160 Einheiten/mg), das aus einem Gemisch von Neothramycin A und Neothramycin B besteht Die Ausbeute beträgt 28%, bezogen auf den Neothramycin-Gehalt in der Züchtungslösung.

Beispiel 2

33 g des rohen Pulvers, das aus dem nach Beispiel 1 erhaltenen Gemisch von Neothramycin A und Neothramycin B besteht, werden in einem geringen Volumen Methanol aufgenommen. Die Lösung wird gleichmäßig mit 60 g neutralem Kieselerdegel vermischt Nach anschließendem Trocknen unter vermindertem Druck wird die derart erhaltene trockene Masse oben auf eine Säule von 60 mm Durchmesser und mit einer Füllung von 660 g neutralem Kieselerdegel aufgebracht, die mit einem Gemisch von Chloroform und Äthanol im Volumenverhältnis 30 :1 imprägniert worden ist. Diese Kieselerdegel-Säule wird bei 5° C entwickelt, indem ein Strom eines Gemisches von Chloroform und Äthanol im

Volumenverhältnis von 30 :1 durch die Säule fließt. Das Eluat wird in 130-ml-Fraktionen gesammelt. Es wird festgestellt, daß Neothramycin A im Eluat der rraktionen 23 bis 31 vorliegt, während Neothramycin B im Eluat der Fraktionen 35 bis 49 vorhanden ist. Die vereinigten aktiven Fraktionen 23 bis 31 werden unter vermindertem Druck bei einer Temperatur bis zu 40⁰C zur Trockne eingedampft. Man erhalt 1,47 g gelbliches, rohes, Neothramycin A enthaltendes Pulver (Wirksamkeit 520 Einheiten/mg). Die Ausbeute beträgt 14%. Die vereinigten Fraktionen 35 bis 49 werden in der gleichen Weise zur Trockne eingedampft. Man erhält 1,03 g eines gelblichen rohen, Neothramycin B enthaltenden Pulvers (Wirksamkeit 450 Einheiten/mg). Die Ausbeute beirägi 9%.

Beispiel 3

1 g des nach Beispiel 2 erhaltenen, gelblichen, rohen Neothramycin A enthaltenden Pulvers wird in 20 ml Chloroform gelöst Die Lösung wird bei 5⁰C durch eine Säule von 13 mm Durchmesser und mit einer Füllung von 20 g neutralem Kieselerdegel des gleichen wie in Beispiel 2 verwendeten Grades laufen gelassen, das mit Chloroform imprägniert worden ist Die Säule wird mit 400 ml Chloroform gewaschen und anschließend mit einem Gemisch von Chloroform und Äthanol im Volumenverhältnis 60 :1 entwickelt Das Eluat wird in 8-ml-Fraktionen gesammelt Man findet, daß Neothramycin A im Eluat der Fraktionen 13 bis 27 vorliegt Die ■vereinigten Fraktionen 13 bis 27 werden unter vermindertem Druck bei einer Temperatur bis zu 40° C zur Trockne eingedampft Man erhält 320 mg eines schwachgelb gefärbten Pulvers. Dieses Pulver wird in einem minimalen Volumen Chloroform aufgenommen. Zu dieser Lösung wird Äthyläther gegeben, bis sich kein weiterer Niederschlag mehr bildet Der Niederschlag wird abfiltriert und getrocknet Man erhält 183 mg eines farblosen Neothramycin A enthaltenden Pulvers (Wirksamkeit 1000 Einheiten/mg) mit einer Zersetzungstemperatur von 110 -122° C. Die Ausbeute beträgt 35%.

Beispiel 4

Das farblose, Neothramycin A enthaltende Pulver (153 mg), das in Beispiel 3 erhalten wurde, wird in einem kleinen Volumen Äthanol aufgelöst und auf einer Säule aus neutralem Kieselerdegel (4,07 g) der gleichen Sorte, wie sie in Beispiel 2 verwendet wurde, erneut Chromatographien. Die Säule wird mit mit Wasser gesättigtem Äthylacetat bei 5° C entwickelt Das Eluat wird ir. 0,6-ml-Fraktionen gesammelt Die Fraktionen 52 bis 95, welche Neothramycin A enthalten, werden vereinigt und unter vermindertem Druck bei einer Temperatur bis zu 40° C zur Trockne eingeengt, wobei 53 mg eines farblosen Pulvers von authentisch reinem Neothramycin A mit einer Zersetzungstemperatur von 132-147° C (Wirksamkeit 1000 Einheiten/mg) erhalten werden. [<x]? = +272° (c=0,52, Dioxan), Ausbeute = 35%.

60

Beispiel 5

Das gelbliche, rohe, Neothramycin B enthaltende Pulver (810 mg), das in Beispiel 2 erhalten wurde, wird in 16 ml Chloroform aufgenommen und die Lösung bei 5°C durch eine Säule mit 13 mm Durchmesser und 16 g neutralem Kieselerdegel der gleichen Sorte, wie sie in Beispiel 2 verwendet wurde, wobei diese mit Chloroform vorher imprägniert worden war, durchgeschickt Die Säule wird mit 320 ml Chloroform gewaschen und dann mit Chloroform-Äthanol (100:1 in Volumen) entwickelt. Das Eluat wird in 6,4-mI-Fraktionen gesammelt, und es wird gefunden, daß das Neothramycin B in den Fraktionen 34-70 eluiert wird. Die vereinigten Fraktionen 34 — 70 werden unter vermindertem Druck bei einer Temperatur bis zu 40° C zur Trockne eingeengt, wobei 160 mg eines schwachgelb gefärbten Pulvers erhalten werden. Dieses Pulver wird in einem minimalen Volumen an Chloroform aufgenommen, und zu dieser Lösung wird Äthyläther zugesetzt, bis sich kein Niederschlag mehr ablagert. Der Niederschlag wird durch Filtration entfernt und getrocknet, wobei 85 g eines farblosen, Neothramycin B enthaltenden Pulvers mit einer Zersetzungsteniperaiur von 139-163°C (Wirksamkeit 620 Einheiten/mg) erhalten werden. Die Ausbeute beträgt 14,6%.

Beispiel 6

Das farblose, Neothramycin B enthaltende Pulver (74 mg), das in Beispiel 5 erhalten wurde, wird auf neutralem Kieselerdegel (2,53 g) erneut Chromatographien, wobei dieses mit einem mit Wasser gesättigten Äthylacetat in der gleichen Weise wie in Beispiel 4 entwickelt wird. Das Eluat wird in 035-ml-Fraktionen gesammelt Die Fraktionen 75 — 157, welche Neothramycin B enthalten, werden vereinigt und zur Trockne unter vermindertem Druck bei einer Temperatur bis zu 40° C eingeengt, wobei 36 mg eines farblosen Pulvers von authentisch reinem Neothramycin B mit einer Zersetzungstemperatur von 144-151°C (Wirksamkeit 835 Einheiten/mg) erhalten werden, [α]? =+314° (c= 0,48; Dioxan). Die Ausbeute beträgt 65%.

Beispiel 7

Eine primäre Impfkultur (jeweils 0,5 ml) von Streptomyces sp. MC916-C4, weiche in einer ähnlichen Weise wie in Beispiel 1 erhalten worden war, wird in jeweils 30 ml eines sterilisierten, flüssigen Züchtungsmediums von pH 6,8,. das 2% Glucose, 2% Glycerin, 1,2% Sojabohnenmehl, 1,0% Baumwoiisamenpulver, 0,32% Calciumcarbonat, 0,5% Natriumchlorid und 0,0005% Manganchlorid (4 H2O) enthält, in vier Erlenmeyer-Kolben eingeimpft Das beimpfte Medium wird bei 28⁰C für 92 Stunden auf einer Rotatäonsschütteleinrichtung (220 Upm) gezüchtet Die erhaltene Züchtungsbrühe (pH 6,5; 90 ml; Wirksamkeit 780 Einheiten/ml) wird mit 90 ml Butanol unter Eiskühlung extrahiert Der Butanolextrakt wird unter vermindertem Druck bei einer Temperatur bis zu 40⁰C zur Trockne eingeengt, wobei 242 mg eines bräunlichen. Neothramycin A und B enthaltenden Sirups (Wirksamkeit 100 Einheiten/mg) in einer Ausbeute von 44% erhalten werden.

Beispiel 8

Ein gelbliches, rohes Pulver (1,0 g; Wirksamkeit 765 Einheiten/mg), das Neothramycin A und Neothramycin B enthält und das nach einer ähnlichen Weise wie in den Beispielen 1 und 2 beschrieben, erhalten worden war, wird in 20 ml Methanol aufgelöst Die Methanollösung wird bei 25° C für 16 Stunden aufbewahrt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt, wobei 1,0 g eines Gemisches von Methylneothramycin A und Methylneothramycin B erhalten wird. Das Gemisch wird auf einer Säule aus Kieselerdegel (50 g, Wako-gel C-200, Wako Chemicals, Osaka) chromatographiert, wobei die Säule mit einem Gemisch aus Benzol und Methanol (20:1 in Volumen) entwickelt wird. Das Eluat wird in Fraktionen von 12^5ml aufgeteilt Hierbei

werden die Fraktionen 19-25, welche Methylneothramycin A enthalten, und die Fraktionen 26 — 38, welche ein Gemisch von Methylneothramycin A und Methylneothramycin B enthalten, erhalten. Die Fraktionen 26 — 38 werden zur Trockne eingeengt und der Rückstand wird auf einer Säule aus Kieselerdegel (18 g) nach der zuvor beschriebenen, gleichen Arbeitsweise erneut Chromatographien. Die Methylrieothramycin A enthaltenden Fraktionen, und die zuvor genannten, Neothramycin A enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und zur Trockne eingeengt, wobei ein farbloses Pulver (299 mg) erhalten wird. Das Pulver wird in einem Gemisch aus Aceton und Benzol kristallisiert, wobei 240 mg farblose Kristalle von Methylneothramycin A erhalten werden.

Die Methylneothramycin B enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und zur Trockne eingeengt, wobei 175 mg eines farbloses Pulvers von reinem Methylneothramycin B erhalten werden.

Beispiel 9

225 mg des in Beispiel 8 erhaltenen, kristallinen Methylneothramycins A werden in 45 ml von 0,01 N HCl-Dioxan (1 :1 in Volumen) aufgelöst, und die Lösung wird bei Zimmertemperatur (22° C) für 1 Stunde aufbewahrt. Die Lösung wird auf pH 6,0 mit 1 N NaOH eingestellt und zur Trockne unter vermindertem Druck eingeengt, wobei 216 mg eines farblosen, Neothramycin A und Neothramycin B enthaltenden Pulvers erhalten werden. Das Pulver wird auf einer Säule aus Kieselerdegel (20 g) nach der gleichen Weise, wie sie in Beispiel 2 angewandt wurde, Chromatographien. Es werden 87 mg reines Neothramycin A und 69 mg reines Neothramycin B erhalten.

Die Hydrolyse von 100 mg Methylneothramycin B in 20 ml 0,01 N HCl-Dioxan (1:1 in Volumen) bei Zimmertemperatur während 1 Stunde nach der gleichen Weise, wie sie zuvor beschrieben wurde, ergibt 95 mg eines farblosen, Neothrainycin A und Neothramycin B enthaltenden Pulvers.

Das in den vorangegangenen Beispielen verwendete, vernetzte Dextran (»Sephadex LH-20«), kann durch andere, gleichartige Gelfiltrationsmittel ersetzt werden, z. B. Produkte mit den Warenbezeichnungen Sephadex G 25 bis G 200, Sepharose 4B und 6B (Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Schweden) und Bio-Gel Al. 5m (Bio Rad Co.). Bevorzugte Gelfiltrationsmittel umfassen die carboxymethylsubstituierten, vernetzten Dextrange-Ie. wie sie in der US-Patentschrift 38 19 836, Spalten 3 und 4 beschrieben sind.

In der folgenden Vergleichsbetrachtung werden die beanspruchten Neothramycine mit den bekannten Antitumor-Antibiotika verglichen, wozu zur späteren Vereinfachung auf die folgenden Veröffentlichungen (A) bis (E) Bezug genommen wird:

■ (A): A rim a et al, »Studies on tomaymycin, a new antibiotic. I. Isolation and properties of tomaymycin«, Journal of Antibiotics, Bd. 25, Nr. 8, S. 437-444 (Aug. 1972).

(B): K a r i y ο η e et al, »The struchtures of tomaymycin and oxotomaymycin«, Chemical Pharmaceutical Bulletin, Bd. 19, Nr. 11, S. 2289-2293 (Nov. 1971).

(C): Brazhnikova et al, »Sibiromycin: isolation and characterization«, Journal of Antibiotics, Bd. 25,Nr-Il₁S. 668-673 (Nov. 1972).

(D): A o k i et al, »Dextrochrysin, a new antibiotic«, Journal of Antibiotics, Bd. 22, Nr. 5, S. 201 -206 (Mai 1969).

(E): Hurley, »Pyrrolo(l,4)benzodiazepine antitumor antibiotics. Comparative aspects of anthramycin, tomaymycin and sibiromycin«, Journal of Antibiotics, Bd.30, Nr.5,S.349-370(Mai 1977).

1. Aus biologischen Untersuchungen geht hervor, daß die erfindungsgemäßen Neothramycine gewisse Vorteile aufweisen und damit gegenüber den zuvor gekannten bekannten Antitumor-Antibiotika technisch fortschrittlich sind, weil die Neothramycine eine bemerkenswert geringe Toxizität (LD50) im Vergleich zu den bekannten Verbindungen zeigen.

So ist die bemerkenswert geringere Toxizität der erfindungsgemäßen Neothramycine im Vergleich zu der der bekannten Antitumor-Antibiotika aus den LD50-Werten der akuten Toxizität (in Mäusen) dieser Antibiotika zu erkennen, zusammengestellt in der folgenden Tabelle VI. Alle LD50-Werte wurden von der Anmelderin gemessen, mit Ausnahme derer, die mit einem Sternchen gekennzeichnet sind.

Tabelle VI

Antibiotika

Neothramycin A oder B
Methylneothramycin A
Methylneothramycin B

Anthramycin
Tomaymycin
Sibiromycin
Dextrochrysin
Adriamycin
Daunomycin

LD50 in Mäusen (mg/Kg)
i. v. i. p.

23- 27
25- 50
50-100

22- 28
25- 50
50-100

1,6- 3,1 -

0,058**)

0,75***)

9-10

17-20

3*)
0,032**)

*) Vgl. S. 442, die beiden letzten Zeilen in (A).
**) Vgl. S. 672, Zeilen 3-4 von unten in (C).
***) Vgl. S. 205, Zeilen 15-17 in (D).

2. Die Vergleichs-Antitumor-Antibiotika Anthramycin, Tomaymycin, Sibiromycin und Dextrochrysin werden derzeit in der klinischen Praxis aufgrund ihrer sehr hohen akuten Toxizität und bestimmter Nebeneffekte nicht verwendet Insbesondere Anthramycin und Sibiromycin zeigen wesentliche Nebeneffekte, beschrieben in (E), Seiten 364 bis 365. Tomaymycin ist eine der Verbindungen der Formel (1) für Y = NH-CH-OCH₃ derNL-Patentanmeldung6919 607(vgl.CPI[Derwent], 48 969R [1970]) im Vergleich zur chemischen Struktur der Tafel 1 auf Seite 2289 der Veröffentlichung (B). Die Proben der anderen Verbindungen der Formel (I) der genannten niederländischen Veröffentlichung, die hier als Tomaymycin-Derivate bezeichnet werden sollen, sowie Tomaymycin selbst stehen für die Öffentlichkeit nicht zur Verfügung, da sie weder im Handel sind noch derzeit klinisch getestet werden. Außerdem ist wenig über bilogische Tests von Tomaymycin und dessen Derivaten zu finden.

Dies zeigt, daß Tomaymycin und dessen Derivate, wie in der niederländischen Veröffentlichung offenbart, in der Therapie als Antitumor-Mittel praktisch nicht verwendet werden.

Im Gegensatz zu Anthramycin, Sibiromycin, Dex-

trochrysin und Tomaymycin (deren Derivate eingeschlossen), die als Antitumor-Mitlel keinen praktischen Wert haben, zeigen die erfindungsgemäßen Neothramycine eine vielversprechende praktische Brauchbarkeit aufgrund ihrer bemerkenswert geringen Toxizität, die ihren technischen Fortschritt in erheblichem Maße begründet.

3. Zu Vergleichszwecken wurde die Antitumor-Wirkung von Neothramycin (ein Gleichgewichtsgemisch

Tabelle VIl

von Neothramycin A und B in wäßriger Lösung), Daunomycin und Adriamycin gegen Leukämie L-1210 in CDFi-Mäusen durch Bestimmung der »Überlebensrate (%)« ähnlich wie in den vorne beschriebenen Tests ermittelt. Die Therapie wurde 2 h nach Einimpfen der L-1210-Zellen (1 χ 10⁵ Zellen/Maus) begonnen, und jede Dosis wurde intraperitoneal einmal täglich an 10 aufeinanderfolgenden Tagen injiziert. Die Testergebnisse sind in der folgenden Tabelle VlI zusammengefaßt.

Neothramycin	Ii. R. (%)*)	Daunomycin	U.	R.	(%)*)	Adriamycin	L).	R. (%)	*)
Dosis		Dosis				Dosis
(mg/kg)	(mg/kg)			(mg/kg)

alle nach
10 Tagen tot

205
164

137
123

2,0

1,0 0,5

alle nach
10 Tagen tot

>200 165 2,0

1,0
0,5

alle nach
10 Tagen tot

>200
171

V. R. (%)*) bedeutet die Überlebensrate (%).

Die obigen Ergebnisse zeigen, daß Daunomycin und Adriamycin erhebliche Wirksamkeit bei geringer Dosis von 0,5—1,0 mg/kg aufweisen, ihre letale Toxizität aber bereits bei einer so geringen Dosis wie 2,0 mg/kg liegt, während Neothramycin sehr viel weniger toxisch ist, aber erheblich wirksam und vor allem sicher bei einer höheren Dosis von bis zu 5,0 mg/kg bei Mäusen ist.

Daraus folgt, daß die erfindungsgemäßen Neothramycine in vorteilhafter Weise eine beträchtliche Antitumor-Wirkung und eine annehmbar geringere akute Toxizität aufweisen, so daß sie bequem in der therapeutischen Praxis ohne Vergiftungsgefahr eingesetzt werden können, im Gegensatz zu den obengenannten Antitumor-Antibiotika mit sehr viel höherer Toxizität.

Tabelle VIII

4. Neothramycin ist überraschend viel wirksamer gegenüber dem besonderen experimentellen Tumor-Stamm AH414 von acites hepatomas (Leber-Tumor) als die bekannten Antitumor-Antibiotika und hat ferner ein anderes Antitumor-Spektrum als die bekannten Antitu-

j5 mor-Antibiotika. Daraus folgt, daß das Neothramycin einen anderen Mechanismus der Antitumor-Aktivität als die bekannten Antitumor-Antibiotika hat, und ist damit insbesondere bei der Therapie von Tumoren brauchbar, denen gegenüber sich die bekannten Antitumor-Antibiotika als unwirksam oder wenig wirksam erwiesen haben.

Die Antitumor-Wirkung von Antitumor-Antibiotika gegenüber acites hepatomas ist in der folgenden Tabelle VIII aufgeführt.

Antibiotika
Neothramycin

AH 414

AH 41C

Düunamycin + -

Adriamycin + ±

Toyamycin ± -

Bleamycin - -

Mitamycin C - ±

Neocarzinostatin + ±

Acetylkidmycin + -

Dosen*) = Optimal-Dosen für maximales Überleben.

Testtiere waren 6 Donryu-Ratten (Männchen, 160—200 g Körpergewicht) pro Gruppe. Die Tumor- + +

Zellen wurden intraperitoneal mit einer Dosis von 10⁶ b5 + Zellen/Ratte eingebracht, und das Antibiotikum wurde + intraperitoneal 72 h danach verabreicht. Die Beurtei- — lung der Wirkung erfolgte nach folgender Skala:

AH 6OC	Dosen*) (mg/kg x Tage)
±	0,5 X 10
±	1 X 10
±	1 X 10
-	0,02 X 10
1+	7,5 X 10
±	0,25 X 10
±	0,5 X 10
-	2,5 X 10

bemerkenswert wirksam
wirksam
fast -.virksam
unwirksam

Hierzu 4 Blatt Zeichnungen

Claims (1)

Patentansprüche:

1. Pyrro!o[2,l-cj-l,4-benzd!azepine der allgemeinen Formel I

N=N

CH₃O

(I)