DE2645528A1 - Neue antibiotica - Google Patents

Description

.7. Oktober 1976

ZAIDAN HOJIIi BISEIBUTSU EAGAEU ΚΕΝΚΥϋ KAI, Fo. 14-23, 3-chome, Kamiosaki, Shinagawa-ku, T ο k i ο , Japan

Heue Antibiotica

Die Erfindung betrifft zwei neue Antibiotica, die beide eine starke Hemaiaktivität auf das Wachstum von Leukaniiezellen haben und die vorteilhaft an Antitumormittel sind, jedoch eine schwache antibakterielle Aktivität aufweisen. Insbesondere betrifft die Erfindung neue Antibiotica, die als "ITeothramycin A bzw. Neothramycin B" bezeichnet werden, sowie ein Verfahren zur Herstellung dieser neuen Antibiotica durch Kultivierung eines Streptomyces-Stamoies. Die Erfindung betrifft weiterhin die Isolierung und Reinigung dieser spezifischen, neuen, antibiotisehen Substanzen und ihre Verwendung in Arzneimitteln.

Im folgenden bezeichnet der Ausdruck "Neothrarnycin" sowohl Neothramycin A als auch ITeothramycin B oder deren Gemisch, falls nichts anderes angegeben ist.

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Einige Antxbiotxca, die als Antitumormittel zur therapeutischen Behandlung der Leukämie brauchbar sind, sind z. B. Daunomycin, Adriamycin usw.. Beim Versuch, weitere neue Antitumorniittel des antibio tisch en Typs zu finden, wurden zahlreiche Bodenproben gesammelt und die metabolisehen Produkte untersucht, die durch aerobe Kultivierung der isolierten MikrοOrganismen gebildet werden. Aus einer Bodenprobe, die vom Gelände der Biseibutsu Kagaku Kenkyusho in Shinagawa-ku, Tokio, Japan, stammt, wurde ein neuer Mikroorganismus isoliert, der als Stamm MC916-C4 bezeichnet wird. Es wurde bestätigt, daß dieser Stamm MC916-C4- zur Art Streptomyces gehört. Es wurde weiter gefunden, daß zwei neue Antxbiotxca mit geringer antibakterieller Aktivität jedoch mit starker Hemmaktivität auf das Wachstum von Zellen der Leukämie L-1210 bei Mäusen und auf das Wachstum bestimmter Arten von Tumorzellen in einem Kulturmedium des Stammes MC916-C4 erzeugt und angereichert werden. Es ist nunmehr möglich geworden, diese neuen Antxbiotxca aus der Nährlösung zu isolieren und sie als Neothramycin A bzw. Neothramycin B zu bezeichnen.

Aufgabe der Erfindung sind neue Substanzen, die als Antitumormittel wirksam sind, nämlich Neothramycin A und Neothramycin B, entweder alleine oder in Gemisch miteinander als neue und vorteilhafte Antitumormittel sowie ein Verfahren zur Herstellung von Neothramycin A und Neothramycin B durch Züchten eines Stammes MC916-C4-.

Die Erfindung betrifft daher als neue Substanz Neothramycin der folgenden allgemeinen Formel:

CD

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worin R und E¹ jeweils Wasserstoff oder Hydroxyl sind mit der Maßgabe, daß ein Paar P. und E¹ das Paar Hydroxyl und Wasserstoff oder das Paar Wasserstoff und Hydroxyl bildet, sowie pharmazeutisch annehmbare Salze hiervon.

Die Verbindung Eeothramycin der oben angegebenen Formel umfaßt:

(i) ITeothramycin A der folgenden Formel:

HO

CH₃O

(Ia)

HO H

sowie pharmazeutisch annehmbare Salze hiervon, und

(ii) Neothramycin B der folgenden Formel

sowie pharmazeutisch annehmbare Salze hiervon.

Geeignete Beispiele von pharmazeutisch annehmbaren Salzen von Neothramycin umfassen nicht-toxische Metallsalze wie das Natrium-, Kalium-, Calcium- und Aluminiumsalz, das Ammoniumsalz und substituierte Ammoniumsalze, z. B. Salze von nicht-toxischen Aminen wie Trialkylaminen einschließlich Triäthylamin, Procain, Dibenzylamin, N-Benzyl-beta-phenäthylamin, 1-Ephenamin, NjiT'-Dibenzyläthylendiamin, Dehydroabietylamin, Ν,Ν'-Bis-dehydroabietyläthylendiarain, N-ClTieder)-alkylpiperidin, z. B. N-Äthylpiperidin und andere Amine,

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die zur Bildung von Salzen mit Benzylpenicillin verwendet wurden.

Die Erfindung "betrifft sowohl die Substanzen Neothramycin A wie auch Neothramycin B, entweder alleine oder im Gemisch, die als gereinigter Feststoff, in Form der freien Säure oder in Form eines Salzes hiervon mit einem Metall oder einem organischen Amin vorliegen können. Heothramycin A wurde als farbloses Pulver erhalten, das keinen definierten Schmelzpunkt "besitzt, allmählich in der Nähe von 105 C schmilzt und sich bei 132-14-7 °C unter Schäumen zersetzt, und das eine spezifische, optische Drehung Ca]-η = + 272° (c = 0,52, Dioxan) aufweist. Die Elementaranalyse für Neothramycin A ergab:

Analyse auf C^ ^K^ffgO^-1/2 H₂O:

gefunden: C = 57,4-6; H = 5,76; N = 9,84-; 0 = 26,94- % berechnet: C = 57,56; H = 5,57; H" =10,33; 0 = 26,54- %

Neothramycin A zeigt ein Molekulargewicht von 250 bis 300 bei der Messung mit der Barger-Akiya-Methode. Aus den Ergebnissen der Elementaranalyse und der Bestimmung des Molekulargewichts ist es wahrscheinlich, daß Neothramycin A eine empirische Formel von

C₁3H₁₄N₂O^1/2 H₂O

besitzt. Diese Formel wurde durch hochauflösende Massenspektrometrie bestätigt, wobei gefunden wurde:

m/e 262,0934·.
Das berechnete Molekulargewicht C^H^l^O^ ist 262,0952.

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Das UV-Absorptionsspektrum von Neothramycin A in einer alkalischen Lösung zeigt eine Verschiebung nach längeren Wellenlängen, wie in der Fig. 3 gezeigt ist. Wie sich aus der Tabelle I ergibt, zeigt das KMR-Spektrum (HMR = kernmagnetische Resonanz) von Neothramycin A die Anwesenheit von 14 Protonen.

ITeothramycin B ist in seinen Eigenschaften ITeothramycin A sehr ähnlich und es wurde als farbloses Pulver ohne definierten Schmelzpunkt erhalten, das sich bei 144 ⁰C unter Schäumen zersetzt und vollständig, bei 151 °C schmilzt. Es weist eine spezifische, optische Drehung Cct^-n = + 314 (c = 0,48; Dioxan) auf. Die Elementaranalyse von STeothramyein B ergab:

Elementaranalyse auf Ο^

gefunden: C = 57,00; H = 5,58; IT = 9,75; 0 = 27,67 % berechnet: C = 57,56; H = 5,57; ^ = 10,33; 0 = 26,54 %

Aus den Ergebnissen der Elementaranalyse und der Bestimmung des Molekulargewichtes war es wahrscheinlich, daß ITeothramycin B in gleicher Weise die empirische Formel C,.-JI-^N JD^* 1/2 HpO "besitzt. Diese empirische Formel wurde durch hochauflösende Massenspektrometrie bestätigt, wobei gefunden wurde:

ra/e = 262,0939,

berechnetes Molgewicht für C.,H^IL-jO^ = 262,0952. Das UV-Absorptionsspektrum von ITeothramycin B in alkalischer Lösung zeigt eine Verschiebung nach längeren Wellenlängen auf, wie in der Fig. 4 gezeigt ist. Wie sich aus der Tabelle I ergibt, zeigt das NMR-Spektrum von ITeothramycin B die Anwesenheit von 14 Protonen wie ITeothramycin A. ITeothramycin A und B

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sind für eine Zeitspanne von etwa einem Monat oder mehr "bei der Lagerung in Form eines festen Pulvers in einem. Exsiccator aus braunem Glas "bei 5 C stabil.

Jedoch sind iTeothramycin A und B in 50 %igem wäßrigem Äthanol von pH = 2,5 instabil, und die Aktivitäten werden auf 25 % bzw. 22 % bei Zimmertemperatur während 16 Stunden reduziert. In 50 %igem wäßrigem Äthanol von pH- =6,5 oder pE = 8,0 bei Zimmertemperatur für 16 Stunden bleiben 80-90 % der Aktivität von Neothramycin A und 70-80 % der Aktivität von Eeothramycin 3 erhalten, jedoch tritt eine Gleichgewichtsumwandlung von Neothramycin A zu B oder von B zu A auf, wie durch dünnschichtchromatografische Analyse gezeigt wurde.

Neothramycin A und Neothramycin B sind dadurch einander ähnlich, daß sie eine Hemmaktivität auf das Wachstum von Zellen von Leukämie L-1210 bei Mäusen und eine schwache antibakterielle Aktivität aufweisen. Sie besitzen eine saure Funktion in ihrem Molekül, sind in Methanol, Äthanol, Fropanol, Chloroform und Dioxan löslich und in Wasser schwach löslich, jedoch in Äthyläther und η-Hexan kaum löslich oder praktisch unlöslich. Sie sind gegenüber der Kydon-Smith-Eeaktion und der Tetrazoliumrotreaktion positiv, schwach positiv bei der Ninhydrinreaktion jedoch negativ gegenüber der Ehrlich-Eeaktion und der Sakaguchi-Reaktion. Bei der Elementaranalyse werden praktisch nur Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff und Sauerstoff gefunden. Sie weisen eine relative Beweglichkeit dieser Substanz gegenüber Alanin (1,0) auf, die 0,17 bei der Hochspannungselektrophorese auf Filterpapier (3500 7, 35 Minuten) unter Anwendung von Ameisensäure-Essigsäure-Wasser (25:75*900 in Volumen) als Elektrolytlösung beträgt.

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Neothrainycin A zeichnet sich weiter dadurch aus, daß es ein IR-Spektrum in einer Kaliumbromidtablette besitzt,· das dem in der !"ig. 1 der Zeichnung wiedergegebenen Spektrum entspricht ,und das durch Absorptionsspitzen bei 3^-50, 2950, 1630 (Schulter), 1600, 1510, 1460, 1440, 1410, 1280, 1200, 1180, 1120, 1080, 1010, 870, 790 und 760 cm"¹ gekennzeichnet ist. Es besitzt ein UV-Absorptionsspektrum, das dem in der Fig. 3 der Zeichnung wiedergegebenen Spektrum entspricht, das sich durch Absorptionsmaxima bei 223 nm (E '_ 855)»

λο/ ι cm y,o/.

240 nm (Schulter), 265 nm (E,]£_m 290) und 318 nm (E^_m 156)

in einer Lösung hiervon in 10 ^ Wasser-Methanol, durch Absorptions

maxima bei 223 nm (E^m 885), 240 nm (Schulter), 265 nm (^E1cm ²⁹°) ^{und 52}° ^nm (^E1cm ^Λ^ ^{in einer} Lösung hiervon in N/10 HCl-Methanol (1:9) und durch Ab sorptionsmaxima bei

²²⁸ ™ <^Ei°cm 6|5), 254 nm (E^ 566), 291 nm (E^ 422)

und 324 nm (E^_m 412) in einer Lösung hiervon in N/10 NaOH/ Methanol (1:9) auszeichnet. Bei der Dünnschichtchromatografie auf Kieselerdegel mit Chloroform-Methanol (10:1 in Volumen) als Entwicklungslösungsmittel ergibt es einen ^ E_f-Wert von 0,57.

Neothramycin B zeichnet sich weiter dadurch aus, daß es ein ΙΕ-Absorptionsspektrum in einer Kaliumbromidtablette aufweist, das dem in der Fig. 2 der Zeichnung wiedergegebenen Spektrum entspricht, das sich durch Absorptionsspitzen bei 34C0, 2960, 1630 (Schulter), 1600, 1510, 1440, 1400, 1280, 1200, 1120, 1080, 1010, 990, 9^0, 870, 790 und 760 cm"¹ auszeichnet. Es besitzt ein UV-Absorptionsspektrum, das dem in Fig. 4 der Zeichnung wiedergegebenen Spektrum entspricht, das · sich durch Absorptionsmaxima bei 224 nm (E¹^L 935), 240 nm (Schulter)', 265 nm (Schulter) und 318 nm (²^_m 167) in einer Lösung hiervon in 10 /? Wasser/ Methanol (1:9), durch Absorptionsmaxima bei 224 nm (E¹J_1n 1000), 240 nm (Schulter), 265 nm (Schulter) und 320 nm (E¹^ 156)

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in einer Lösung hiervon in N/10 HCl-Methanol (1:9) und durch

AC/ SlC/

Absorptionsaaxima bei 228 nm (E'' 800) , 254 nm (E/ 725) ,

/\o/ 'CDI λο· I CDI

291 nm (E\'° 456) und 324 nm (E^' 466) in einer Lösung hiervon in N/10 NaOH-Hethanol (1:9) auszeichnet. Bei der Dünnschichtchromatografie auf Kieselerdegel mit Chloroform-Methanol (10:1 in Volumen) als Entwicklungslösungsmittel ergibt es einen R~-Wert von 0,50.

Neothramycin A oder B werden leicht in ein Gemisch von Methylneothramycin A (R ~ = 0,71 beim Kieselerdegel-Dünnschichtchromatogramm mit Chloroform-Methanol (10:1 Yolumina)) und Methylneothramycin B (R« = 0,61 im gleichen Kieselerdegel-Dünnschichtchromatogramm) in wasserfreiem Methanol bei Zimmertemperatur für 16 Stunden umgewandelt. Methylneothramycin A kristallisiert aus einem Gemisch aus Aceton und 3enzol in Form von farblosen Mikrokristallen mit F. = 137-140 ⁰C (Zers.); Coc.3^ = +640 (c = 0,24; Dioxan) ergibt bei der riassenspektroskopie m/e = 276,1089 (berechnetes Molgewicht für C₁₄H₁₆N₂O₄ = 276,1108).

Methylneothramycin B wird als farbloses Pulver erhalten mit P. = 61-69 °C (Zers.); Ca]^⁶ = + 778 ° (c = 0,22; Dioxan), ergibt bei der Massenspektroskopie m/e.= 276,1071·

Die UV-Spektren der Methylneothramycine sind denen der Neothramycine ähnlich und die chemischen Verschiebungen im NMR-Spektrum sind in der Tabelle I angegeben. Eine milde Hydrolyse von Methylneothramycin A oder B in 0,01N HCl-Dioxan (1:1 in Volumen) bei Zimmertemperatur für 1 Stunde mit anschließender Säulenchromatografie auf Kieselerdegel ergibt die Neothramycine A und B in guter Ausbeute.

Daher kann Methylneothramycin A als Ausgangsmaterial zur Herstellung von Neothramycin A durch milde Hydrolyse eingesetzt werden, während Methylneothramycin B als Ausgangsmaterial zur Herstellung von Neothramycin B brauchbar sein

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kann. Hethylneothramycin A besitzt folgende Formel:

HO CH*O

Hethylneothramycin B "besitzt folgende Formel:

CnO

0 H OCH3

Aus diesen Daten ergibt sich, daß Neothramycin A und B Isomere sind, die ineinander umwandelbar sind und zur Anthramycingruppe der Antibiotica, welche eine Benzodiazepinstruktur besitzen, gehören. Sie unterscheiden sich von Anthramycin, Dextrochrysin und Sibiromycin durch ihre UT-Spektren. Die UY-Spektren von Tomaytnycin und JSFeothraniycinen sind sehr ähnlich, jedoch unterscheiden sie sich hinsichtlich ihrer rlolekülformeln und der anderen Spektren.

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Tabelle I

Chemische Verschiebungen iiri NMH-Spektrum von Neothramyeinen und deren

Methylderivaten

Proton Neothramycin A Neothramycin B Methylneothramycin A Methylneothramycin B

OCH-

1,7-2,5

CIl	OCIi, p	5,80	m
arom.		5,90	S
OH		5,00	d
CH	H	5,69	dd
arom.	H	6,70	S
arom.		7,45	S
CH	7,62	d

phenol.OH 8,00 s

1,7-2,5

5,78 ία 5,88 s 5,10 d 5,78 m

6.69 s 7,40 s

7.70 d 7,98 s

1,8-2	,6
5,28	S
3,72	m
5,90	S
5,56	d
6,75	S
7,48	S
7,75	d
8,04	S

1,8-2	,6
5,44	S
5,80	dd
•5,88	S
5,35	dd
6,64	S
7,56	S
7,54	d
7,94	B

ehem. Verschiebungen, S (ppm) wurden in Deuterodioxan unter Verwendung von TMS als internen Standard gemessen.

Die folgenden Strukturen können für die allgemeine Wiedergabe von Neothramycin A (E = OH, E² = H), Neothramycin B (R¹ = H, E² = OH), Methylneothramycin A (E¹ = OCH_x, E² = H)

1 Ρ und Methylneothramycin B (E = H, E = OCH₇,) angegeben werden:

im folgenden wird die Zeichnung näher erläutert: Fig. 1 zeigt eine Kurve des IE-Absorptionsspektrums einer authentischen, reinen Probe von Neothramycin A,'die in Kaliumbromid zu einer Tablette geformt war;

Fig. 2 zeigt eine Kurve des IE-Absorptionsspektrums einer authentisch reinen Probe von Neothramycin B, die in Kaliumbromid zu einer Tablette geformt war;

Fig. 3 zeigt Kurven des UV-Absorptionsspektrums einer authentisch reinen Probe von Neothramycin A, aufgelöst in 10 % Wasser-Methanol, in N/10 NaOH-Hethanol (1:9) bzw. in N/10 HCl-Methanol (1:9).

Fig. 4- zeigt Kurven des UV-Absorptionsspektrums einer authentisch reinen Probe von Neothramycin B, aufgelöst in 10 % Wasser-Methanol, in N/10 NaOH-Metha^ nol (1:9) bzw. in N/10 HCl-Methanol (1:9)-

Die erfindungsgemäßen Substanzen Neothramycin A und Ueothrainycin B besitzen eine geringe antibakterielle und antifungizide

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Aktivität, wie sich aus den in der folgenden Tabelle II gezeigten, antibakteriellen Spektren dieser Substanzen 'ergibt. Die Mindesthemmkonzentrationen (ug/ml) von Neothramycin A und B gegenüber verschiedenen Bakterien wurden auf Nähragarplatten bestimmt, die 17 Stunden bei 37 °C inkubiert wurden. Die Mindesthemmkonzentrationen gegenüber verschiedenen Pilzen wurden auf Nähragarplatten mit einem Gehalt von 1 % Glucose nach einer Inkubation von 40 Stunden bei 27 ⁰C bestimmt.

Tabelle II

untersuchte Mikroorganismen

Mindesthemmkonzentrationen Cjag/ml)

Ueothramycin A Neothramycin B

Staphylococcus aureus Smith Staphylococcus aureus 209? Klebsiella pneumoniae PCI Escherichia coli NIHJ Escherichia coil K-12 Pseudontonas aeruginosa Nr. Bacillus subtilis PCI 219 Escherichia coli V/677 Escherichia coli JR65/W677 Aeromonas salmonecida ATCC Vibrio anguillarum NCBM 6 Saccharomyces cerevisiae Candida albicans 31^7 •.Aspergillus niger Piricularia oryzae Xanthomonas citri Xanthorr.onas orysae /09816/1

50	100
>100	>100
50	100
100	100
100	100
>100	>100
100	>100
50	100
100	>100
25	50
50	100
50	>100
>100	>100
100	>100
50'	>100
>100	>100
.50	100

Wie zuvor beschrieben, besitzen die erfindungsgemäßen Substanzen Neothramycin A und B eine starke.Hemmaktivität gegenüber dem Wachstum von Leukämiezellen, und sie werden als brauchbares Mittel zur therapeutischen Behandlung eines von Leukämie befallenen Lebewesens angesehen. Die chemotherapeutischen Wirkungen der Substanzen Neothramycin A und B gegenüber Leukämie L-1210 bei Mäusen wurden in folgender Weise untersucht. Bei Mäusen vom CD3?-1-Stamm mit einem■Gewicht von 19 bis 22 g wurden Zellen der Leukämie L-1210 (1Cr Zellen je Maus) intraperitoneal injiziert. Zur Behandlung der derart infizierten Leukämie wurde die Verabreichung der Substanzen iTeothramycin A und B unmittelbar nach der Tumorbeimpfung begonnen. Die leukämischen Mäuse wurden in Gruppen von jeweils vier Mäusen für jede Dosis eingesetzt. Wenn jeweils intraperitoneal 300, 150, 75, 37,5 und 18,7 Mg von lfeothramycin A und B je Maus und je Tag zehn Tage lang einmal täglich injiziert wurden, wurden in hohem Maße günstige Wirkungen auf das Ausmaß des Überlebensverhältnisses (in °/o) beobachtet, wie sich aus der folgenden Tabelle III ergibt.

Tabelle III
Mittel des Überlebensausmaßes (%)

Dosierung Heothramycin A Ueothramycin B

(ug/Maus/Tag)

300 ' tot tot

(toxische Dosis) (toxische Dosis)

150 200 ' 192

75 - 167 15*

37,5 . 154 128

18,7 122 103

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Das Überlebensverhältnis (%) wird durch Division der Anzahl der Überlebenstage der behandelten Tiere (z. B. 10) durch die Zahl der Überlebenstage der Kontrolltiere (z. B. S) und Hultiplikation mit 100 erhalten, z. B. 10/8 χ 100 = 125. Überlebensgrade bzw. Verhältnisse größer als 125 werden im allgemeinen als signifikant angesehen.

Eine wirksame Verlängerung des überlegensgrades (%) von mit Leukämie L-1210 beimpften Mäusen wurde ebenfalls durch Behandlung mit Methylneothramycin A oder Methylneothramycin B beobachtet, wie sich aus der Tabelle IV ergibt.

Tabelle IV Mittel des Überlebensausinaßes (%)

Dosierung Methylneothramycin A Methylneothramycin B (^ig/Maus/Tag)

toxisch 154 147 115 103

Die erfindungsgemäßen Substanzen Neothramycin A und B besitzen gegenüber Tieren und Menschen eine niedrige Toxizitat, was dadurch gezeigt wird, daß Neothramycin A und Neothramycin B LDcQ-Werte von 20 - 30 mg/kg bzw. 20 - 30 Kg/kg bei Mäusen besitzen, wenn eine Lösung von 0,25 - 0»5 Gew.-% von EFeothramycin A oder B in 10 % Dirnethylsulfoxid-Wasser intraperitoneal bei Mäusen zum Zweck der Abschätzung der akuten Toxizität dieser Substanzen injiziert wird.

200	toxxsch
100	128
50	103
25	—
12,5	—

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Wie aus der Beschreibung ersichtlich, sind Methylneothraaycin A und 3 ebenfalls als Antitumormittel vorteilhaft. Die .Erfindung betrifft daher ebenfalls Verbindungen der folgenden Formel:

,N =■

N^

Cm)

Ö R¹ R²

A p

worin E Wasserstoff, Hydroxyl oder Methoxyl bedeutet, R Wasserstoff, Hydroxyl oder Methoxyl bedeutet, unter der Voraussetzung, daß ein Paar der Reste R und R ein Paar aus Hydroxyl und Wasserstoff, ein Paar aus Wasserstoff und Hydroxyl, ein Paar aus Methoxyl und Wasserstoff oder ein Paar aus Wasserstoff und Methoxyl ist, sowie pharmazeutisch annehmbare Salze hiervon. Die Verbindungen dieser Formel (HI) umfassen Heothramycin A, Neothramycin B, Methylneothramycin A und liethylneothrämycin B wie auch pharmazeutisch annehmbare Salze hiervon. Die pharmazeutisch annehmbaren Salze der Verbindung der oben angegebenen Formel (III) können die gleichen Salze sein, wie sie bereits zuvor für die Substanzen Neothramycin A und B genannt wurden.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Neothramycin A und Neothramycin B, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen Neothramycin erzeugenden Stamm der Art Streptomyces unter aeroben Bedingungen in einem hierfür geeigneten Nährmediuni, das assimilierbare Quellen für Kohlenstoff und Stickstoff enthält, für eine ausreichende Zeitspanne zur Bildung und Ansammlung von Neothramycin A und Neothramycin B in dem kulturmedium bzw. Nährmedium kultiviert und ein Gemisch von

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Neothramycin A und Neothramycin B aus der Kultur gewinnt und anschließend gegebenenfalls das gewonnene Gemisch in Neothramycin A und Neothramycin B in ihre isolierten Formen auftrennt. Für die Herstellung von Neothramycin nach dem erfindungsgemäßen Verfahren kann ein Stamm der Art Streptomyces verwendet werden, sofern dieser Stamm Neothramycin "bildet. Ein geeignetes Beispiel eines Stammes, der gemäß der Erfindung zur Esrstellung von Neothramycin verwendet werden kann, ist der zuvor genannte Stamm MC916-C4- von Streptomyces. Dieser Stamm MC916-C4 wurde am 2. 2. 1974- "bei der authorisierten Hinterlegungsstelle in Japan: "Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology", Inage, Chiba-City, Japan unter der Hinterlegungsnummer FESM-P 24^2 hinterlegt. Dieser Stamm MC916-C4- wurde ebenfalls am 15. 2. 1975 in cLen USA "bei der American Type Culture Collection, Washington, D.C, USA unter der Hinterlegungsnummer ATCC 31123 hinterlegt.

Die Züchtungseigenschaften und taxonomischen Eigenschaften des Stammes MC916-C4- werden im folgenden beschrieben.

1. Mikroskopische Morphologie

Der Stamm MC916-C4· hat ein verzweigtes Substratmycel, aus dem sich Lufthyphen in Form von Haken oder offenen Spiralen entwickeln. Es werden keine quirlartigen Verzweigungen beobachtet. Reife Sporenketten weisen gewöhnlich über zehn ungeschlechtlich entstehende Sporen (Konidien) auf. Die Sporen besitzen Abmessungen von etwa 0,6 - 0,8 zu 1,0 - 1,2 η und haben eine glatte Oberfläche.

2. Wachstuascharakteristika auf verschiedenen Nährmedien Die Bezeichnung der Farben in Klammern bezieht sich auf die

• Standardfarben in dem Buch "Color Harmony Manual", das von der Container Corporation of America veröffentlicht worden ist,

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(1) Auf Saccharose-Hitrat-Agar (Bebrütung bei 27 ⁰C): blaßgelb bis rötlichgelb (3pc, bernsteinfarbig), gefärbtes Wachstum mit dünnen Lufth.ypb.en von hellbräunlich grauer bis blaßgrauer Farbe. Lösliches Pigment ist blaßgelb getönt.

(2) Auf Glucose-Asparaginsäure-Agar (Bebrütung bei 27 ⁰G): Dunkelgelb-orange (3^-C, bernsteinfarbig, bis 4-pe, orangerostfarbig) gefärbtes Wachstum entwickelt Lufthyphen von hellgrauer bis hellbräunlich grauer Farbe (2ih, gedecktes dunkelgrau). Lösliches Pigment ist schwach gelb getönt.

(3) Auf Glycerin-Asparaginsäure-Agar (ISP-Nr. 5-Medium, Bebrütung bei 27 ⁰C):

Dunkelgelb-orange bis gelblich braun (3pi> goldbraun) gefärbtes Wachstum entwickelt Lufthyphen von bräunlich grauer (3ih, beige-brau) bis grauer (5ih, dunkelgetöntes Grau) Farbe. Es wird ein lösliches Pigment mit gelblicher bis gelblich brauner Tönung erzeugt.

(4·) Auf anorganisches-Salz-Stärke-Agar (ISP-ITr. 4-Medium, Bebrütung bei 27 ⁰C):

Blaßgelblich braun bis gelblich braun (3pi> goldbraun) gefärbtes Wachstum entwickelt Lufthyphen von hellbräunlich grauer (3fe, silbergrauer) Farbe. Lösliches Pigment ist braun getönt. Die Rückseite des Wachstums ist von dunkelgelblich brauner Farbe.

(5) Auf Tyrosin-Agar (ISP-Rr. 7-Medium, Bebrütung bei 27 ⁰C): Dunkelgelb bis gelblich braun (4-pg, dunkellederbraun) gefärbtes Wachstum mit Lufthyphen von heller bräunlich grauer Farbe. Lösliches Pigment ist dunkelgelb bis gelblich braun getönt.

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(6) Auf ITähragar (Bebrütung bei 27 ⁰C):

Das Wachstum ohne Entwicklung von Lufthyphen ist blaßgelblich braun bis blaßbraun gefärbt. Lösliches Figment ist schwachbraun getönt.

(7) Auf Eefe-Extrakt-Malzextrakt-Agar (ISF-Nr. 2-Medium, Bebrütung bei 27 ⁰C):

Gelblich braun (4· pg, dunkellederfarben) bis gelb-orange (Ape, orange-rostfarbig) gefärbtes Wachstum entwickelt Lufthyphen von hellgrauer (2fe. gedeckt grauer) bis hellbräunlich grauer (2ih, gedeckt dunkelgrauer) Farbe. Es wird lösliches Figment von gelblich brauner bis brauner Farbe erzeugt. Die Rückseite des Wachstums ist dunkelgelblich braun gefärbt.

(8) Auf Hafermehl-Agar (ISF-Kr. 3-Medium, Bebrütung bei 27°C): Rötlich gelb bis dunkelgelb-orange (4-pe, orange-rostfarbig) gefärbtes Wachstum mit Lufthyphen von hellgrauer (5fe, aschgrauer) bis bräunlich grauer (3ih, beige-grauer) Farbe. Lösliches Figment ist gelb getönt.

(9) Auf Glycerin-Hitrat-Agar (Bebrütung bei 27 ⁰C): Blaßgelb bis rötlich gelb (3pc, bernsteinfarbig) gefärbtes Wachstum weist schwachentwickelte Lufthyphen von bräunlich weißer bis hellbräunlich grauer Farbe auf. Lösliches Figment ist schwach gelb getönt.

(10) Auf Stärke-Agar (Bebrütung bei 27 ⁰C):

Das Wachstum ist dunkelgelb bis gelblich braun (2pi, senfbraun) ohne Entwicklung von Lufthyphen oder mit kaum entwickelten Lufthyphen von weißer Farbe gefärbt. Lösliches Figment ist schwach braun getönt.

(11) Auf Calcium-malat-Agar (Bebrütung bei 27 ⁰C):

Das Wachstum ist blaßgelb bis blaßoliv ohne Entwicklung von Lufthyphen oder mit schwacher Entwicklung von Lufthyphen

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von weißer Farbe getönt. Lösliches Pigment ist schwach gelb getönt.

(12) Auf Cellulose (Bebrütung bei 27 ⁰C):

farbloses Wachstuta ohne Lufthyphen. Es wird kein lösliches Pigment erzeugt.

(13) Auf Gelatinestab:

Auf einem gewöhnlichen Gelatine-Medium (Bebrütung bei 20 ⁰C) ist das Wachstum farblos bis dunkelgelb gefärbt ohne Entwicklung von Lufthyphen. Es wird lösliches Pigment von schwach gelber Tönung erzeugt. Auf einem Glucose-Pepton-Gelatine-Medium (Bebrütung bei 27 °C) ist das Wachstum blaßgelb bis dunkelgelb. Es werden anfänglich keine, später jedoch >
gräulich weiße Lufthyphen entwickelt. Es wird keine Erzeugung von löslichem Pigment beobachtet.

(14) Auf entrahmter Milch (Bebrütung bei 37 °):

Das Wachstum ist blaßgelb bis blaßorange gefärbt ohne Entwicklung von Lufthyphen. Lösliches Pigment ist sehr schwach
orange getönt.

3. Physiologische Eigenschaften

(1) Temperatur für das Wachstum:

Das Wachstum auf Glucose-Asparaginsäure-Agar wird bei 20 ⁰C, 24 ⁰C, 27 °C, 30 ⁰C, 37 ⁰C und 50 ⁰C geprüft. Der Stamm

MC916-C4 wächst bei allen diesen untersuchten Temperaturen mit Ausnahme von 50 ⁰C. Die beste Temperatur für ein gutes

Wachstum liegt um etwa 30 ⁰C.

(2) Gelatineverflüssigung:

Ein gewöhnliches Gelatine-Medium (15 %) beginnt vom 5-

der Bebrütung bei 20 ⁰C an sich zu verflüssigen. Der Grad der Verflüssigung ist mittel. Die Gelatine (15 %) im Glucose-Pepton-Medium beginnt vom 2. Tag der Bebrütung an sich zu

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verflüssigen, wenn sie bei 27 °C bebrütet wird. Der G-rad der "Verflüssigung ist dann mittel bis stark.

(3) Stärkehydrolyse:

Die Stärke in dem anorganisches-Salz-Stärke-Agar-Medium. und im Stärke-Agar-Medium wird beginnend vom 5- Tag der Bebrütung an hydrolysiert, wenn sie bei 27 C bebrütet wird. Der Hydrolysegrad ist mittel bis stark.

Koagulation und Peptonisierung von entrahmter Milch: Wenn die entrahmte Milch bei 37 °C bebrütet wird, beginnt die Koagulation vom 4-, Tag der Bebrütung an, und es wird eine Peptonisation vom 5· ^ag der Bebrütung nach vollständiger Koagulation beobachtet. Der Koagulations- und der Peptonisierungsgrad ist mittel bis stark.

(5) Bildung von melanoiden Pigmenten:

Es wird keine Pigmentierung weder auf einer Trypton-Hefe-Extrakt-Kulturlösung (ISP-ITr. 1-Medium) noch auf einem Pepton-Hefe-Extrakt-Eisen-Agar (ISP-Nr. 6-Medium) noch auf einem Tyrosin-Agar (ISP-ITr. 7-Medium) beobachtet, wenn die Bebrütung bei 27 ⁰C stattfindet.

(6) Verwertung von Kohlenstoffquellen für das Wachstum:

Die Verwertung der nachstehenden Kohlenhydrate wird in einem Fridham-Gottlieb-Agar-Medium (ISP-Nr. 9-Mediuni) untersucht, wenn die Bebrütung bei 27 ⁰C durchgeführt wird.

Für das Wachstum werden Glucose und L-Ehamnose verwertet. L-Arabinose, D-Fructose, Saccharose, Inosit und D-Mannit werden nicht verwertet. Die Verwertung von D-Xylose ist zweifelhaft. Raffinose wird manchmal und manchmal nicht verwertet.

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(7) Verflüssigung von Calcium-malat:

Calcium-malat im Calcium-malat-Agar-Medium wird um das · Wachstum herum "beginnend am 9· Tag der Bebrütung verflüssigt, wenn die Bebrütung bei 27 °C erfolgt. Der Verflüssigungsgrad ist mittel bis stark.

(8) Nitrat-Reduktion:

Die Reduktion von Nitrat wird in wäßriger Pepton-Lösung beobachtet, die 1,0 % Natriumnitrat (ISP-Nr. 8-Medium) enthält, wenn die Bebrütung bei 27 C' stattfindet.

Unter Zusammenfassung der vorstehenden Charakteristika des Stammes MC916-C4 ist festzustellen, daß dieser Stamm zur Art Streptomyces gehört und daß die Lufthyphen offene Spiralen bilden, jedoch keine Quirle entwickeln. Die Sporenoberfläche sieht unter dem Mikroskop glatt aus. Auf verschiedenen Medien zeigt das Wachstum eine gelblich orange bis gelblich braune Farbe sowie eine Entwicklung von Lufthyphen von leuchtend bräunlich grauer bis bräunlich grauer Farbe. Lösliches Pigment ist gelb bis braun oder gelblich braun getönt. Es wird kein melanoides Pigment erzeugt. Proteolyse- und Stärkehydrolysegrade sind stark.

Auf Grundlage der vorgenannten Eigenschaften wird der Stamm MC916-C4· mit bekannten analogen Streptomyces-Spezies unter Bezugnahme auf die Beschreibungen von "International Streptomyces Project" (ISP) verglichen. Es ist gefunden worden, daß der Stamm MC916-C4 dem Stamm Streptomyces naraensis ähnlich ist (vgl. "International Journal of Systematic Bacteriology" .22 (1972), Seite 323). Jedoch ist festgestellt worden, daß der Stamm MC916-C4· vom Stamm Streptomyces naraensis ISP 5508 bezüglich der Verwertbarkeit von Kohlenstoffquellen verschieden ist. Streptomyces naraensis erzeugt Cycloheximid, ähnlich

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dem Stamm KC916-C4-. ü'erner ist unter den Cycloheximid erzeugenden Stämmen gefunden worden, daß Stämme der Gruppe C, die Streptomyces griseolus analog sind, wie in dem Aufsatz von T. Furumai und Mitarbeitern "On cycloheximide-producing microorganisms" (vgl. "Journal of Antibiotics" Ser. B, Band 17 (1964), Nr., 4-, Seite 181) berichtet wird, dem Stamm MC916-C4 sehr ähnlich sind.

Der Stamm MC916-C4- stimmt sehr gut in mancherlei Hinsicht mit den Stämmen der vorgenannten Gruppe C überein, obwohl der Stamm MC916-C4- nicht untersucht worden ist, ob er Eigenschaften wie Hämolyse, Verflüssigung von Serum und Verwertung von Galactose und Lactose besitzt, die die Stämme der Gruppe C zeigen. Jedoch sind die Stämme der Gruppe C gegenwärtig nicht verfügbar, denn sie sind alle tot. In dieser Situation wird ein Vergleich des Stammes MC916-C4- jetzt mit dem Stamm Streptomyces IFO 3300 gemacht, der bekanntlich Fermicidin, ein dem Cycloheximid analoges Antibioticum, erzeugt und von dem T. Furumai und Mitarbeiter (a.a.O.) eine gute Übereinstimmung mit den Stämmen der Gruppe C angeben.

Die Ergebnisse dieses Vergleichs sind in der nachstehenden Tabelle V unter Bezugnahme auf die Beschreibungen in "Journal of Antibiotics" angegeben.

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	Tabelle V	Stamm	Strepto-	Beschrei	grau bis	bis blaß	cremfarben	bräunlich	Beschrei
		KG 916-G 4	myces	bung des	bräunlich	gelblich	bis braun		bung der
			IFO 33OC	Strepto-	grau	braun	getönt		Gruppe G
		+	(analog	myces	gelb-orange farblos	nicht be			in der . Literatur ++'
			Strepto-	IFO 3300	bis gelb	obachtet	nicht be
		glatt	myc e s	in der \	lich braun		obachtet	+
	griseolus)	Literatur"*"'			oder braun oder
Eigenschaften:			gelb bis		getönt	glatt
Bildung von	±	(+)	braun ge	bräunlich
Spiralen		glatt.++> ■	tönt	grau
Sporenober		hell bräun- hell braun- grau
fläche		lieh grau
Farbe der .	bis bräun
Lufthypheη	lich grau
Farbe des
Wachstums
lösliches
Pigment

Bildung von Melanin-artigem Pigment auf 13?-Hrο 1 auf ISP-Nr.6 auf ISP-Kr.7

Stärkehydrolyse

koagulation von Milch

Peotonisation von Ι··Ι1 lcIi

4-

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Tabelle V (Fortsetzung)

S t amra
.genschaften MC916-C4

Streptomyces IFO 3300 (analog Streptomyces Beschreibung de s Streptomyc e s IFO 3300 in der.

Beschreibung der Gruppe G in der

uijves χα aer. \ in aer \ griseolus) Literatur"¹"') Literatur."¹"⁴*·^

flussigung
is reinen
G-elatine-

im G-lucose-

Pepton-G-ela-

tine-Uedium

Nitratre duktion

von. Kohlenstoff-&u.ellen:

Glucose

1-Arabinose

D-ZyIose

D-Iructose

Saccharose

Inosit

L-Hhaninose

Eaffinose

D-Mannit

erzeugte Anti-"bio~ica

Cyclohexinid und ITeotliraniycin A + B schwach verflüssigt

teils + teils. -

teils + teils -■

Ferraicidin GjrclohexincLd (analog Cycloheximid)

^+J = "Journal of Antibiotics" 3er.B, Band 7, Nr. 7, S. 221(1954); "^t^; = "Journal of Antibiotics" Ser.B, Bd. 17, Nr. 4, So 181(1964); ί) = :vahrse heinlich keine Verwertung der Kohlenstoffquelle; (+) = v/ahr3cheinliche Verwertung der Kohlenstoffc[uelle.

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Aus dieser Tabelle V ist ersichtlich, daß der Stamm MC916-C4 mit dem in der vorgenannten Literatur beschriebenen Stamm der Gruppe C übereinstimmt, doch vom Stamm Streptorayces IPO 5300 bezüglich der Koagulation und Peptonisierung von Milch verschieden ist. Ferner ist der Stamm MC916-C4· von Streptomyces griseolus (vgl. "International Journal of Systematic Bacteriology" 18, (1968), Seite 122), dem eine Ähnlichkeit mit dem Stamm Streptomyces IFO 3300 nachgesagt wird, insofern unterschieden, daß Streptomyces griseolus keine offenen Spiralen bei den Lufthyphen bildet und auch etwas verschieden von dem Stamm KC916-C4- bezüglich der Verwertbarkeit von Kohlenstoffquellen ist. Ein weiterer Vergleich des Stammes MC916-C4 mit dem Stamm Streptomyces IFO 3300, mit Streptomyces griseolus ISP 5067 und dem Stamm Streptomyces naraensis ISP 5.508 wurde durchgeführt. Es wurde gefunden, daß der Stamm MC916-C4· mit dem Stamm Streptomyces Sp. IFO 3300 und Streptomyces naraensis ISP 5508 und insbesondere mit dem erstgenannten Stamm verwandt ist. Der Stamm IFO 3300 unterscheidet sich von dem Stamm MC916-C4 jedoch etwas dadurch, daß er bei der Farbe des Wachstums eine orange Tönung besitzt. Der Stamm MC916-C4 unterscheidet sich von dem genannten Stamm ISP 55Ο8 im Hinblick auf die Reduktion von Nitrat und von dem genannten Stamm ISP_V-5O67 hinsichtlich der Bildung von Spiralen, der Ausnutzung von Kohlenstoffquellen und der Heduktion von Nitrat deutlich.

Es findet häufig eine Mutation von Actinomyceten entweder unter künstlichen oder unter spontanen Bedingungen statt. Demgemäß schließt die vorliegende Erfindung die Anwendung sowohl des Stammes MC916-G4 als auch die seiner Mutanten ein. Mit anderen Worten besagt dies, daß die Erfindung die

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Anwendung aller Stämme der Art Streptomyces umfaßt, die Neothramycin erzeugen.

Neothramycin kann durch aerobe Züchtung von Sporen oder Mycel eines Neothramycin erzeugenden Stammes der Art Streptomyces, wie Streptotayces MC916-C4- identifiziert als Streptomyces ATCC 31123 erhalten werden. Bei der Durchführung des Verfahrens vorliegender Erfindung wird eine Sporenoder Mycelia enge eines Heothramycin erzeugenden Stammes auf ein dafür geeignetes Mahrmedium mit einem Gehalt an Nährstoff quellen überimpzt und dann unter aeroben Bedingungen und vorzugsweise aeroben Tauchbedingungen derart bebrütet, daß man eine Nährlösung mit einem Gehalt an Neothramycin erhält. Im allgemeinen können die für die Züchtung gewöhnlicher Actinomyceten'in üblicher Weise angewendeten Bestandteile des ITährmediums für die Zwecke vorliegender Erfindung verwendet werden. Zum Beispiel können im Handel erhältliches So^abohnenmehl, Erdnußpulver, Baumwollsamenpulver, Trockenhefe, Fepton, Fleischextrakt, Casein, Maisquellwasser_f IT-Z-Amin, Ammoniumnitrat, Ammoniumsulfat und dergleichen als Stickstoffquellen vorteilhaft sein. Im Handel erhältliche Kohlenhydrate, wie Glucose, Stärke, Glycerin, Haitose, Dextrin, Saccharose, Lactose, Melasse und dergleichen sowie Fette oder öle sind als Kohlenstoffquelle von Vorteil. Außerdem können als Salzergänzung in dem Nährmedium Natriumchlorid, Calciumcarbonat, Magnesiumsulfat mit 7 WoI Wasser, Manganchlorid, Natriumphosphat oder andere anorganische Salze verwendet werden. Zahlreiche Schwermetallsalze können gegebenenfalls in Spuren ebenfalls zugegeben werden. Beliebige Nährstoffe, die zur Züchtung von Actinorayceten bekannt sind, können beim erfindungsgemäßen Verfahren Verwendung finden, solange sie von dem Neothramycin erzeugenden Stamm zur Erzeugung von Heothramycin assimilierbar sind.

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Zur .Herstellung von Heothramycin im großen Maßstab wird eine Züchtung im flüssigen Zustand bevorzugt. Eine beliebige Temperatur, bei der der Neothramycin erzeugende Stamm wachsen und Beothramycin erzeugen kann, kann zur Züchtung angewendet werden. Jedoch bevorzugt man eine Züchtungstempe— ratur von 25 bis 35 °C. Die Züchtung wird eine ausreichende Zeit fortgesetzt, um eine ausreichende Menge Neothramycin A und B im Nährmedium zu erzeugen. Zum Beispiel wird ein Nährmedium mit 2 % Glucose, 2 % Glycerin, 1,2 % Sogabohnenmehl, 1,0 % Baumwollsamenmehl, 0,32 % Calciumcarbonat, 0,5 % Natriumchlorid und 0,0005 % Manganchlorid-tetrahydrat hergestellt und bei pH.6,8 sterilisiert. Dieses Medium wird dann mit von einer Schrägkultur des Stammes MC916-C4· geernteten Sporen oder My eel beimpft. Wenn dann die Kultur unter aeroben Bedingungen bei 28 ⁰C geschüttelt wird, erreicht die Erzeugung und die Ansammlung von Neothramycin in dem Hährmedium einen Höchstwert nach einer Bebrütung von drei bis fünf Tagen.

Die Prüfung von Neothramycin kann unter Verwendung von Staphylococcus aureus oder Escherichi coli als Testorganismen nach der Standard-Schalen-Platten-Methode erfolgen, die gewöhnlich bei der Prüfung bekannter Antibiotica angewendet wird. Authentisch reines Neothramycin, das gemäß Beispiel 4-erhalten wurde, kann als Standardprobe verwendet werden, die eine Potenz von 1000 Einheiten je Milligramm zeigt. Wenn andere antibiotische Substanzen, wie Cycloheximid, in der Eulturlösung des Stammes MC916-C4 zusätzlich zu Neothramycin gleichzeitig mit erzeugt werden, kann das ITährmedium mit Äthylacetat oder einem anderen geeigneten organischen Lösungsmittel gewaschen werden, um die anderen antibiotischen Substanzen durch Extrahieren zu entfernen.

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Die verbleibende wäßrige Phase kann dann für die Prüfung des Gehalts an Neothramycin A und B nach der vorgenannten Standard-Schalen-Platten-Methode eingesetzt werden.

Zur Gewinnung von Neothramycin aus dem Sahrmedium kann die Nährlösung mit dem ITeothramycin erzeugenden Stamm entweder mit einem geeigneten organischen Lösungsmittel, wie n-Butanol, zur Gewinnung eines Extraktes von Heothramycin in diesem Lösungsmittel oder mit einem geeigneten Adsorptionsmittel, wie Aktivkohle, behandelt werden, um ITeothramycin mittels des Adsorptionsmittel zu adsorbieren.·Es wird die Verteilung von ITeothramycin A oder B zwischen n-Butanol und Wasser geprüft, und man hat gefunden, daß bei einem pH-Wert von 2 bis 7 das Konzentrationsverhältnis von Feothramycin in n-Butanol/Wasser über 5 liegt. Demgemäß kann ITeothramycin mit n-Butanol aus der wäßrigen Eulturlösung extrahiert werden, die auf einen pH-Wert von 2 bis 7» vorzugsweise auf etwa G, eingestellt worden ist. Da ITeothramycin praktisch unlöslich in Äthylacetat oder Chloroform und somit nicht extrahierbar mit Äthylacetat oder Chloroform aus dem flüssigen Anteil der Kulturlösung ist, ist es deshalb erforderlichenfalls möglich, die Kulturlösung mit Äthylacetat oder Chloroform zu extrahieren, um mögliche Verunreinigungen aus der Kulturlösung zu entfernen. Um ITeothramycin aus der Kulturlösung abzutrennen, behandelt man die Kulturlösung vorzugsweise mit Aktivkohle als Adsorptionsmittel. ITeothramycin, das mittels Aktivkohle adsorbiert worden ist, kann davon mittels eines Gemisches von Methanol und Wasser, eines Gemisches von Propanol und Wasser oder eines Gemisches von Aceton und Wasser usw. eluiert werden. Die Wirksamkeit des Eluierens kann verbessert werden, wenn das Eluieren unter schwach alkalischen Bedingungen durchgeführt wird.

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Die Reinigung von Ne.othramycin kann unter Verwendung des vorgenannten Extraktionsverfahrens und des Adsorptions-Elutions-Verfahrens in einer zweckmäßigen Kombination oder zu wiederholten Malen erfolgen. Eine weitere Reinigung kann durch Anwendung einer Säulen-Chromatographie an einem vernetzten Dextran ("Sephadex LH-20") oder an Kieselerdegel erfolgen. Das bekannte Antibiotica Cycloheximid, das häufig ebenfalls in der Kulturlösung des Stammes MC916-C4-vorliegt, kann in einfacher Weise von dem erfindungsgemäßen Neothramycin durch Extrahieren mit Äthylacetat oder durch Chromatographieren an einem vernetzten Dextran der vorgenannten Art abgetrennt werden.

Um Neothramycin A von Neothramycin B zu trennen, kann ein Gemisch von Neothramycin A und Neothramycin B einer Säulen-Chromatographie an Kieselerdegel mit einem Gemisch aus Chloroform und Methanol im Volumenverhältnis JO:Λ als Entwicklerlösung unterworfen werden. Das abgetrennte Neothramycin A oder das abgetrennte bzw. isolierte Neothramycin B kann durch Säulen-Chromatographie an Kieselerdegel unter Verwendung eines geeigneten Gemisches organischer Lösungsmittel als Entwicklerlösung gereinigt werden.

Die Gewinnung von Neothramycin A und Neothramycin B kann in typischer Weise wie folgt durchgeführt werden: Die Neothramycin enthaltende Kulturlösung wird zuerst filtriert und dann zentrifugiert, um Festsubstanzen zusammen mit Mycel zu entfernen. Das Filtrat der Lösung wird dann mit Aktivkohle behandelt, um Neothramycin daran zu adsorbieren. Die das absorbierte Neothramycin enthaltende Aktivkohle wird danach mit einem Gemisch aus Aceton und Wasser im

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Voluaienverhältnis 1:1 bei pH S,0 eluiert» Das Eluat wird in Fraktionen gesammelt. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und unter vermindertem Druck bei einer Temperatur bis zu 40 C zur Trockne eingedampft oder in anderer Weise gefriergetrocknet. Man erhält ein rohes Pulver, das 5Teothramycin enthält. Dieses rohe Pulver wird mit wäßrigem Äthanol derart extrahiert., daß der größere Teil der aktiven Bestandteile in den erhaltenen Extrakt gelangen. Dieser Extrakt wird unter vermindertem Druck bei einer Temperatur bis zu 40 ⁰C zur Trockne eingedampft oder in anderer Weise gefriergetrocknet. Man erhält eine weitere Fraktion rohes Pulver. Eine Lösung dieses rohen Pulvers in Methanol wird auf eine Säule mit einem vernetzten Dextran ("Sephadex LH-20") gegeben. Anschließend wird die Säule mit Methanol entwickelt. Während der Chromatographie wird das möglicherweise mit vorliegende Cycloheximid in solche Fraktionen eluiert, die in der ersten Phase des Verfahrens anfallen, während das Gemisch von Keothramycin A und B in solchen Fraktionen eluiert werden, die in der späteren Phase des Verfahrens anfallen.

Die aktiven Fraktionen mit einem Gehalt an Neothramycin A und B werden vereinigt und dann unter vermindertem Druck bei einer Temperatur bis zu 40 ⁰C zur Trockne eingedampft. Man erhält ein rohes Pulver. Dieses Pulver wird in einer geringen Menge Methanol aufgenommen. Die methanolische Lösung wird gleichmäßig mit einer Menge von neutralem Kieselerdegel vermischt. Das Gemisch wird durch Eindampfen getrocknet und dann am Kopf einer mit neutralem, mit einem Gemisch aus Chloroform und Äthanol im Volumenverhältnis 30:1 imprägniertem Kieselerdegel gefüllten Säule aufgegeben. Die Kieselerdegel-Säule wird anschließend mit einem Gemisch aus Chloroform und Äthanol im Volumenverhältnis 30:1 entwickelt.

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Während dieser Chromatographie wird Neothramycin A in die aktiven Fraktionen eluiert, die in der ersten Phase des Verfahrens anfallen, während Neothraniycin B in solche aktive Fraktionen eluiert wird, die in der späteren Phase des Verfahrens anfallen. Die aktiven Fraktionen mit Eeothramycin A und die aktiven Fraktionen mit Neothramycin B werden unter vermindertem Druck "bei einer Temperatur "bis zu 40 ⁰C zur Trockne eingedampft. Man erhält ein rohes Pulver, das Neothramycin A enthält "bzw. ein rohes Pulver, das iieothramycin B enthält.

Das derart erhaltene rohe Pulver mit lieothramycin A wird in einer geeigneten Menge Chloroform aufgenommen. Die Lösung wird durch eine Säule mit neutralem Kieselerdegel laufen gelassen, das mit Chloroform imprägniert worden ist. Diese Zieselerdegel-Säule wird mit Chloroform gewaschen und dann "bei 5 C mit einem Gemisch aus Chloroform und Äthanol im Volumenverhältnis 60:1 entwickelt. Das Eluat wird in Fraktionen aufgefangen. Die gewünschten aktiven Fraktionen, die nur Itfeothramycin A enthalten, werden unter Bezugnahme auf die Untersuchungsergebnisse einer biologischen Prüfung und der Dünnschicht-Chromatographie jeder Fraktion festgestellt. Die derart ausgewählten, erwünschten aktiven Fraktionen werden vereinigt und dann unter vermindertem Druck bei einer Temperatur bis zu 4-0 °C zur Trockne eingedampft, wobei man ein farbloses, Heothramycin enthaltendes Pulver erhält. Dieses Pulver kann weiter zu einem farblosen, Neothramycin A enthaltenden Pulver mit einer Zersetzungstemperatur von 110 - 122 ⁰C durch Wiederholung des zuvor beschriebenen Verfahrens der Kieselerdegelchromatographie oder durch Auflösen dieses farblosen Pulvers in einem kleinen Chloroformvolumen, Zugabe von Äthyläther zu der Chloroformlösung, Abfiltrieren und Trocknen des erhaltenen Niederschlages e-ereinigt werden. Ein farbloses, Eeothramycin B enthaltendes

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Pulver mit einer Zersetzungstemperatur von 139 - 163 ⁰C kann aus dem zuvor beschriebenen, Neothramycin B enthaltenden rohen Palver durch Reinigung in der gleichen Weise, wie für Neothramycin A "beschrieben, erhalten werden. Es wird jedoch bevorzugt, daß eine Säulenchroniatographie auf Kieselerdegel unter Verwendung eines Gemisches aus Chloroform und Äthanol (100:1 im Volumen) als Entwicklungslösungsmittel durchgeführt wird.

Das zuvor beschriebene, farblose, Neothraniycin A enthaltende Pulver mit einer Zersetzungstemperatur von 110 - 122 C wird in einem kleinen Volumen Äthanol aufgelöst und erneut auf einer Säule von neutralem Kieselerdegel unter Verwendung von mit Wasser gesättigtem Äthylacetat als Entwicklungslösungsmittel chromatographiert. Das Eluat wird in Fraktionen aufgefangen, und die lieothramycin A enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und unter vermindertem Druck einer Temperatur bis zu 40 ⁰C zur Trockne eingeengt, wobei ein authentisch reines, farbloses Pulver von Neothramycin A erhalten wird, das eine Zersetzungstemperatur von 132 - 147 ⁰C sowie eine spezifische, optische Drehung La]-^⁰ = + 272 (c = 0,52; Dioxan) erhalten wird. Das zuvor beschriebene, farblose, Heothramycin B enthaltende Pulver mit einer Zersetzungstemperatur von 159 - 163 ⁰C wird in einem kleinen Volumen Äthanol aufgelöst und erneut auf einer Säule von neutralem Eieselerdegel unter Vervrendung von mit Wasser gesättigtem Äthylacetat als Entwicklungslösungsmittel chromatographiert. Das Eluat wird in Fraktionen gesammelt und die Neothramycin B enthaltenden Fraktionen werden miteinander vereinigt und unter vermindertem Druck einer Temperatur bis zu 40 ⁰C zur Trockne eingeengt, wobei ein authentisch reines, farbloses Pulver von Neothramycin 3 erhalten wird, das eine Zersetzungstemperatur von 144 - 151 ⁰C und eine spezifische, optische Drehung von ta]^° = +314 (c = 0,48; Dioxan) zeigt.

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Im Hinblick auf die vorgenannten Eigenschaften von Keothramycin A und Neothramycin B wurde bestätigt, daß diese Substanzen neue Antibiotica sind, die von bekannten Antibiotica verschieden sind.

Die Erfindung betrifft daher weiterhin Arzneimittel für die therapeutische Behandlung eines an Leukämie leidenden Lebewesens einschließlich Menschen, wobei dieses Arzneimittel als aktiven Bestandteil wenigstens eine der Verbindungen Neothramycin A, Neothramycin B, Methylneothramycin A oder ilethylneothramycin B oder pharmazeutisch annehmbare Salze hiervon in einer ausreichenden Menge enthält, um eine Erkrankung durch Leukämie in vivo zu mildern, wobei der aktive Inhaltsstoff in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger vorliegen kann.

Es wird betont, daß die gegenwärtig bevorzugten Mengen an Heothramycin nach der im einzelnen verwendeten Verbindung, der jeweiligen Arzneimittelformulierung, der Art der Applikation und nach dem jeweiligen zu behandelnden Organismus und dem entsprechenden Situs variieren. Es werden zahlreiche Faktoren, die die Wirkung des Arzneimittels modifizieren, vom Fachmann in Betracht gezogen, zum Beispiel Alter, Körpergewicht, Geschlecht, Diät, Zeit und Weg der Verabreichung, Ausscheidungsgeschwindigkeit, Arzneimittelkombinationen, Empfindlichkeitsreaktionen und Schwere der Erkrankung.

Die besten Anwendungsmengen für eine gegebene Anzahl von Bedingungen kann durch den Fachmann unter Anwendung der üblichen Dosierungsbestimmungsuntersuchungen im Hinblick auf die vorgenannten Richtlinien ermittelt werden.

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Es wird angenommen, daß unter Anwendung der vorstehenden Beschreibung und ohne weitere Ausarbeitung der Fachmann das Gedankengut vorliegender Erfindung in vollem Umfange verwerten kann. Die nachstehenden bevorzugten spezifischen Ausführungsformen stellen deshalb lediglich veranschaulichende Beispiele dar und begrenzen die Offenbarung der vorliegenden Erfindung in keiner Weise.

Beispiel 1

Eine Flatinöse voll Streptomyces MC916-C4 (A'TCC 31123), der in einem Schrägagar-Medium bebrütet worden ist, wird in 125 ml eines sterilen flüssigen Züchtungsmediums vom pH 7,0 überimpft, das 2,5 % Haitose, 0,75 % Pepton, 0,75 % Fleischextrakt, 0,3 % Hefe-Extrakt, 0,3 % Natriumchlorid, und 0,1 % MgSO^-7Η_Λ0 enthält. Das beimpfte Medium wird 48 Stunden bei 28 ⁰C geschüttelt. Man erhält die erste Keimkultur, die in einer Impfmaterialmenge 0,48 Volumenprozent auf 50 1 eines sterilisierten flüssigen Züchtungsmediums vom pH 7»0, das 3,5 % Stärkesirup, 0,75 % Pepton, 0,75 %. Fleischextrakt, 0,3 % Hefe-Extrakt, 0,3 % Natriumchlorid und 0,1 % MgS0^·7H₂O enthält, in einen Fermentor aus rostfreiem Stahl und mit einem Fassungsvermögen von I30 Liter überimpft wird. Das uberimpfte Medium wird 24· Stunden bei 28 ⁰C unter Belüftung und Rühren gezüchtet, um die zweite Keimkultur zu erzeugen, die in einer Impfmaterialmenge von 2 Volumenprozent (6 l) auf 300 1 eines flüssigen Züchtungsmediums vom pH 6,8 überimpft wird, das 2 % Glucose, 2 % Glycerin, 1,2 % Sojabohnenmehl, 1,0 % Baumwollsamenpulver, 0,32 % CaIciumcarbonat, 0,5 % Natriumchlorid und 0,0005 % Manganchlorid-tetrahydrat enthält und das 30 Minuten bei 120 ⁰C sterilisiert worden ist. Die Bebrütung wird 92 Stunden bei 28 ⁰C unter Belüften und Rühren mit 250 Umdrehungen je Minute durchgeführt, während innerhalb der ersten 24 Stunden die Belüftungsgeschwindigkeit 150 l/min beträgt und dann für die restliche Dauer

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von 24 "bis 92 Stunden der Bebrütung auf 3OQ 1/tain erhöht wird-

Die erhaltenen 300 1 Züchtungslösung vom pH 7»3 und einer Wirksamkeit "von 88 Einheiten je Milliliter werden mit 24 kg einer iiltrierhilfe (Diatomeenerde, die im Handel unter der Bezeichnung "Hyflo-supercel" erhältlich ist) vermischt. Das Gemisch wird mittels eines Druckfilters filtriert, und ian erhält 300 1 Filtrat der Züchtungslösung. Dieses Filtrat wird gut mit 3 kg Aktivkohle "bei Eaumtemperatur eine Stunde unter Rühren vermischt, so daß die Antibiotica an die Aktivkohle adsorbiert werden.

Der Anteil Aktivkohle wird durch Zentrifugieren gesammelt und dann mit 150 1 Wasser gewaschen. Die gewaschene Aktivkohle wird eine Stunde unter Rühren mit 70 1 eines Gemisches von Aceton und Wasser im Volumenverhältnis 1:1 (pH 8,0) vermischt, so daß die Antibiotica in das Lösungsmittel extrahiert werden. Diese Extraktion wird wiederholt. Die derart erhaltenen Extrakte werden vereinigt und ergehen 118 Liter. Die Extraktlösung wird unter vermindertem Druck "bei einer Temperatur "bis zu 4-0 C eingeengt. Die eingeengte Lösung in einer Menge von 2,6 Liter wird gefriergetrocknet, nan erhält 565 g eines "braun gefärbten Pulvers (Wirksamkeit 35 Einheiten/mg) _s das Neothramycin A und Neothramvcin B enthält. Dieses "braun gefärbte Pulver wird mit 11,6 Liter eines Gemisches von Äthanol und Wasser im Volumenverhältnis 4:1 extrahiert. Unlösliches, das keine antibakterielle Wirksamkeit besitzt, wird durch Filtrieren entfernt. Man erhält 11,2 Liter eines äthanolischen Extraktes. Dieser Extrakt wird unter vermindertem Druck bei einer Temperatur bis zu 40 ⁰C auf ein Volumen von 800 ml eingeengt. Die eingeengte Lösung wird gefriergetrocknet, und man erhält

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5 g eines Pulvers (Wirksamkeit 53 Einheiten/mg). Dieses rohe Pulver wird in fünf gleiche Teile geteilt.· Jeder 'Teil wird in 20 ml Methanol gelöst. Die methanol!sehe Lösung wird durch eine Säule von 90 mm Durchmesser und mit einer füllung von 4- Liter vernetztem Dextran ("Sephadex LH-20") laufen gelassen, die im wesentlichen mit Methanol entwickelt wird. Das Eluat wird in 200-ml-!Fraktionen gesammelt. Es wird festgestellt, daß Cycloheximid im Eluat der Fraktionen 9 "bis 11 vorliegt, während ein Gemisch von Neothraaiycin A und Neothramycin B im Eluat der Fraktionen 12 bis 14- vorliegt. Die Fraktionen 12 bis 14- werden vereinigt und unter vermindertem Druck bei einer Temperatur bis zu 40 ⁰C zur Trockne eingedampft. Man erhält 4-7 g eines rohen Pulvers (Wirksamkeit 160 Einheiten/mg), das aus einem Gemisch von Neothramycin A und Neothramycin B besteht. Die Ausbeute beträgt 28 %, bezogen auf den Neothramycin- Gehalt in der Züchtungslösung.

Beispiel 2

33 g des rohen Pulvers, das aus dem nach Beispiel 1 erhaltenen Gemisch von Neothramycin A und Neothramycin B besteht, werden in einem geringen Volumen Methanol aufgenommen. Die Lösung wird gleichmäßig mit 60 g neutralem Kieselerdegel vermischt. Nach anschließendem Trocknen unter vermindertem Druck wird die derart erhaltene trockene Masse oben auf eine Säule von 60 mm Durchmesser und mit einer Füllung von 660 g neutralem Eieselerdegel aufgebracht, die mit einem Gemisch von Chloroform und Äthanol im Yolumenverhältnis 30:1 imprägniert worden ist. Diese Kieselerdegel-Säule wird bei 5 C entwickelt, indem ein Strom eines Gemisches von Chloroform und Äthanol im Volumenverhältnis von 30:1 durch die.Säule fließt. Das Eluat wird in 130-ml-Fraktionen gesammelt. Es wird festgestellt, daß Neothramycin A im Eluat

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der Fraktionen 23 bis 31 vorliegt, während Neothramycin B im Eluat der Fraktionen 35 "bis 4-9 vorhanden ist. Die vereinigten aktiven Fraktionen 23 "bis 31 werden unter vermindertem Druck bei einer Temperatur "bis zu 40 C zur Trockne eingedampft. Man erhält 1,47 g gelbliches, rohes, Neothramycin A enthaltendes Pulver (Wirksamkeit 520 Einheiten/mg). Die Aus-" beute beträgt 14 %. Die vereinigten Fraktionen 35 "bis 49 werden in der gleichen Weise zur Trockne eingedampft. Men erhält 1,03 S eines gelblichen rohen, Neothramycin B enthaltenden Pulvers (Wirksamkeit 450 Einheiten/mg). Die Ausbeute beträgt 9 %.

Beispiel 3

1 g des nach Beispiel 2 erhaltenen, gelblichen,rohen Neothramycin A enthaltenden Pulvers wird in 20 ml Chloroform gelöst. Die Lösung wird bei 5 °^c durch eine Säule von 13 mm Durchmesser und mit einer Füllung von 20 g neutralem Kieselerdegel des gleichen wie in Beispiel 2 verwendeten Grades laufen gelassen, das mit Chloroform imprägniert worden ist. Die Säule wird mit 400 ml Chloroform gewaschen und anschließend mit einem Gemisch von Chloroform und Äthanol im VoIumenverhältnis 60:1 entwickelt. Das Eluat wird in 8-ml-Fraktionen gesammelt. Man findet, daß Neothramycin A im Eluat der Fraktionen 13 bis 27 vorliegt. Die vereinigten Fraktionen 13 bis 27 werden unter vermindertem Druck bei einer Temperatur bis zu 40 ⁰C zur Trockne eingedampft· Man erhält 320 mg eines schwach gelb gefärbten Pulvers. Dieses Pulver wird in einem minimalen Volumen Chloroform aufgenommen. Zu dieser Lösung wird Äthyläther gegeben, bis sich kein weiterer Niederschlag mehr bildet. Her Niederschlag wird abfiltriert und getrocknet. Man erhält 183 mg eines farblosen Neothramycin A enthaltenden Pulvers (Wirksamkeit 1000 Einheiten/mg) mit einer Zersetzungstemperatur von 110 - 122 ⁰C. Die Ausbeute beträgt 35 %·

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Beispiel-4

Das farblose, He οthramyein A enthaltende Pulver (153 ^s)> das in Beispiel 3 erhalten wurde, wird in einem kleinen Volumen Äthanol aufgelöst und auf einer Säule aus neutralem Kieselerdegel (4,07 s) der gleichen Sorte, wie sie in Beispiel 2 verwendet wurde, erneut chromatographyert. Die Säule wird mit mit Wasser gesättigtem Äthylacetat bei 5 ⁰C entwickelt. Das Eluat wird in 0,6-ml-Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen 52 bis 95 ₅ welche ITeothramycin A enthalten, werden vereinigt und unter vermindertem Druck bei einer Temperatur bis zu 40 ⁰C zur Trockne eingeengt, wobei 53 mg eines farblosen Pulvers von authentisch reinem ITeothramycin A mit einer Zersetaungstemperatur von 132 - 147 C (Wirksamkeit 1000 Einheiten/mg) erhalten werden. Ca]-J⁰ = + 272 ° (c = 0,52, Dioxan), Ausbeute = 35 %·

Beispiel 5

Das gelbliche, rohe, Ueothramycin B enthaltende Pulver (810 mg), das in Beispiel 2 erhalten wurde, wird in 16 ml Chloroform aufgenommen und die Lösung bei 5 C durch eine Säule mit 13 m» Durchmesser und 16 g neutralem Kieselerdegel der gleichen Sorte, wie sie in Beispiel 2 verwendet wurde, wobei diese mit Chloroform vorher imprägniert worden war, durchgeschickt. Die Säule wird mit 320 ml Chloroform gewaschen und dann mit Chloroform-Äthanol (100:1 in Volumen) entwickelt. Das Eluat wird in 6,4-ml-Fraktionen gesammelt, und es vrxvä gefunden, daß das ITeothramycin B in den Fraktionen 34 - 70 eluiert wird. Die vereinigten Fraktionen 34 - 70 werden unter vermindertem Druck bei einer Temperatur bis zu 40 C zur Trockne eingeengt, wobei 160 mg eines schwach gelb gefärbten Pulvers erhalten werden. Dieses Pulver wird in einem minimalen Volumen an Chloroform aufgenommen, und zu dieser Lösung x^ird Äthyläther zugesetzt, bis sich kein Niederschlag mehr ablagert. Der

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Niederschlag wird durch Filtration entfernt und getrocknet, wobei 85 g eines farblosen, Neothramycin B enthaltenden Pulvers mit einer Zersetzungstemperatur von 139 - 163 C (Wirksamkeit 620 Einheiten/mg) erhalten werden. Die Ausbeute beträgt 14,6 %.

Beispiel 6

Das farblose, Neothramycin B enthaltende Pulver (74- mg), das in Beispiel 5 erhalten wurde, wird auf neutralem Sieselerdegel (2,53 g) erneut chromatographiert, wobei dieses mit einem mit Wasser gesättigtem JLthylacetat in der gleichen Weise wie in Beispiel 4 entwickelt wird. Das Eluat wird in 0,35-Dil-5'raktionen gesammelt. Die Fraktionen 75 - 157» welche Neothramycin B enthalten, werden vereinigt und zur Trockne unter vermindertem Druck bei einer Temperatur bis zu 40 ⁰C eingeengt, wobei 36 mg eines farblosen Pulvers von authentisch reinem Neothramycin B mit einer Zersetzungstemperatur von 144 - 151 ⁰C (Wirksamkeit 835 Einheiten/mg) erhalten werden. Ca]^⁶ = + 314 ° (c = 0,48; Dioxan), Die Ausbeute beträgt 65 %·

Beispiel 7

Eine primäre Impfkultur (jeweils 0,5 ml) von Streptomyces sp. MC916-C4, welche in einer ähnlichen Weise wie in Beispiel 1 erhalten worden war, wird in jeweils 30 ml eines sterilisierten, flüssigen Züchtungsmediums von pH 6,8, das 2 % Glucose, 2 % Glycerin, 1,2 % Sojabohnenmehl, 1,0 % Baumwollsamenpulver, 0,32 % Calciumcarbonat, 0,5 % Natriumchlorid und 0,0005 % Manganchlorid (4H₂O) enthält, in vier Erlenmeyer-Kolben eingeimpft. Das beimpfte Medium wird bei 28 ⁰C für 92 Stunden auf einer Hotationsschütteleinrichtung (220 Upm) gezüchtet. Die erhaltene Züchtungsbrühe

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(pH 6,5; 90 ml; Wirksamkeit 780 Einheiten/ml) wird mit 90 ml Butanol unter Eiskühlung extrahiert. Der Butanolextrakt wird unter vermindertem Druck bei einer Temperatur bis zu 40 ⁰C zur Trockne eingeengt, wobei 242 mg eines bräunlichen, EFeothramycin A und B enthaltenden Sirups (Wirksamkeit 100 Einheiten/mg) in einer Ausbeute von 44 % erhalten werden.

Beispiel 8

Ein gelbliches, rohes Pulver (1,0 g; Wirksamkeit 765 Einheiten/mg), das Neothramycin A und Neothramycin B enthält und das nach einer ähnlichen Weise wie in den Beispielen 1 und 2 beschrieben, erhalten worden war, wird in 20 ml Methanol aufgelöst. Die Methanollösung wird bei 25 °C für 16 Stunden aufbewahrt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt, wobei 1,0 g eines Gemisches von Methylneothramycin A und Methylneothramycin B erhalten wird. Das Gemisch wird auf einer Säule aus Kieselerdegel (50 g, Wako-gel C-200, Wako Chemicals, Osaka) chromatographiert, wobei die Säule mit einem Gemisch aus Benzol und Methanol (20:1 in Volumen) entwickelt wird. Das Eluat wird in Fraktionen von 12,5 ml aufgeteilt. Hierbei werden die Fraktionen 19 - 25-, welche Methylneothramycin A enthalten, und die Fraktionen 26 - 38, welche ein Gemisch von Methylneothramycin A und Methylneothramycin B enthalten, erhalten. Die Fraktionen 26 - J8 werden zur Trockne eingeengt und der Rückstand wird auf einer Säule aus Kieselerdegel (18 g) nach der zuvor "beschriebenen, gleichen Arbeitsweise erneut chromatographiert. Die Methylneothramycin A enthaltenden Fraktionen, und die zuvor genannten, Neothramycin A enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und zur Trockne eingeengt, wobei ein farbloses Pulver (299 mg) erhalten wird. Das Pulver wird in einem Gemisch aus Aceton und Benzol kristallisiert, wobei 240 mg farblose Kristalle von Methylneothramycin A erhalten werden.

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Die Methylneothramycin B enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und zur Trockne eingeengt, wobei 175 mg eines farblosen Pulvers von reinem Methylneothramycin B erhalten, werden.

Beismel 9

225 mg des in Beispiel 8 erhaltenen, kristallinen Methylneothramycins A werden in 45 ml von 0,01F HCl-Dioxan (1:1 in Volumen) aufgelöst, und die Lösung wird "bei Zimmertemperatur (22 ⁰C) für 1 Stunde aufbewahrt. Die Lösung wird auf pH 6,0 mit 1 Ν HaOH eingestellt und zur Trockne unter vermindertem Druck eingeengt, wobei 216 mg eines farblosen, Seothramycin A und Neothramycin B enthaltenden Pulvers erhalten werden. Das Pulver wird auf einer Säule aus Kieselerdegel (20 g) nach der gleichen Weise, wie sie in Beispiel 2 angewandt wurde, chromatographiert. Es werden 87 mg reines Neothramycin A und 69 mg reines Meothramycin B erhalten.

Die Hydrolyse von 100 mg Methylneothramycin B in 20 ml 0,01 IT HCl-Dioxan (1:1 in Volumen) bei Zimmertemperatur während 1 Stunde nach der gleichen Weise, wie sie zuvor beschrieben wurde, ergibt 95 mg eines farblosen, NeothramyA und Neothramycin B enthaltenden Palvers.

Das in den vorangegangenen Beispielen verwendete, vernetzte Dextran ("Sephadex "LH-20"), kann durch andere, gleichartige Gelfiltrationsmittel ersetzt werden, z. B. Produkte mit den Warenbezeichnungen Sephadex G 25 "bis G200, Sepharose 4-B und 63 (Pharmacia Pine Chemicals AB, Uppsala, Schweden) und Bio-GeI Al.5m (Bio Had Co.). Bevorzugte Gelfiltrationsmittel umfassen die carboxymethylsubstatuierten, vernetzten Dextran gele, wie sie in der US-Patentschrift $ 819 836, Spalten 3 und 4- beschrieben sind.

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Claims (11)

1. Patentansprüche

   ■ Λ.)Verbindung der folgenden allgemeinen Formel:

   worin E Wasserstoff, Hydroxyl oder Methoxyl und

   ρ
   E Wasserstoff, Hydroxyl oder Methoxyl "bedeuten, voraus-

   Ί 2 gesetzt, daß ein Paar der Reste R und S ein Paar von Hydroxyl und Wasserstoff, ein Paar von Wasserstoff und Hydroxyl, ein Paar von Methoxyl und Wasserstoff oder ein Paar von Wasserstoff und Methoxyl "bildet, sowie pharmazeutisch annehmbare Salze hiervon.
2. 2. Ueothramycin A nach Anspruch 1 der folgenden allgemeinen Formel:

   oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz hiervon.

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3. 3. Heothramycin B nach. Anspruch 1 der folgenden allgemeinen Formel:

   HO-,

   H OH

   oder ein pharmazeutisch, annehmbares SaIa hiervon.
4. 4. Hethylneothramycxn A nach Anspruch 1 der folgenden allgemeinen Formel:

   oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz hiervon.
5. 5. Methylneothramycin B nach Anspruch 1 der folgenden Formel:

   HO—ι

   oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz hiervon.

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6. 6. Verfahren zur Herstellung von Neothramycin A und Neothramycin B, dadurch gekennzeichnet, daß ein Neothramycin bildender Stamm der Art Streptomyces unter aeroben Bedingungen in einem geeigneten Züchtungsmedium hierfür, welches Quellen mit assimilierbarem Kohlenstoff und Stickstoff enthält, für eine ausreichende Zeitspanne zur Bildung und Ansammlung von Neothramycin A und Neothramycin B in dem Züchtungsmedium gezüchtet wird, und daß ein Gemisch von Neothramycin A und Neothramycin B aus der Kultur gewonnen wird und anschließend gegebenenfalls das gewonnene Gemisch in Neothramycin A und Neothramycin B in ihren isolierten Formen aufgetrennt wird.
7. 7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß ein Neothramycin bildender Stamm von Streptomyces mit den identifizierenden Merkmalen von ATGC 51125 unter aeroben Tauchbedingungen in einem eine Kohlenstoffquelle und ein stickstoffhaltiges Nährsalz enthaltenden Nährmedium bis zur Bildung einer wesentlichen Menge von Neothramycin durch den Organismus in diesem Nährmedium gezüchtet wird.
8. 8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm von Streptomyces in einem Nährmedium bei einer Temperatur im Bereich von 24 ⁰C bis 35 ⁰C gezüchtet wird.
9. 9. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm von Streptomyces in einem Nährmedium bei einer Temperatur im Bereich von 25 ⁰C bis 29 ⁰C bei einem pH-Wert von 6 bis 8 gezüchtet wird.

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10. 10. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das in der Züchtungsbrühe gebildete Neothramycin durch Extraktion gewonnen und nach einem "Verfahren gereinigt wird, welches wenigstens eines der Stufen des Aussalzens, der Lösungsmittelausfällung, der Butanolextraktion, der Dialyse, der Ultrafiltration, der isoelektrischen Ausfällung, der Gelfiltration, der Elektrophorese, der Elektrofokussion oder Adsorption mit anschließender Elution aus einem Ionenaustauscherharz umfaßt·
11. 11. Arzneimittel, gekennzeichnet durch einen Gehalt an Neothramycin A, ITeothramycin B, Methylneothramycin A und/oder Methylneothramycin B oder einem pharmazeutisch annehmbaren Salz hiervon als aktivem Bestandteil, gegebenenfalls in Verbindung mit pharmazeutisch annehmbaren Trägern.

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