DE3134353A1

DE3134353A1 - Antibiotikum bmg162-af2, verfahren zu seiner herstellung und es enthaltende pharmazeutische zubereitung mit antitumorwirkung

Info

Publication number: DE3134353A1
Application number: DE19813134353
Authority: DE
Inventors: Hironobu Iinuma; Setsuko Tokyo Kunimoto; Hiroshi Naganawa; Tomio Takeuchi; Hamao Umezawa
Original assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Current assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Priority date: 1980-09-08
Filing date: 1981-08-31
Publication date: 1982-04-22
Also published as: CS226036B2; GB2084999A; DK157890B; CH655498B; IT8149237A0; US4416899A; BE890229A; SE450836B; GB2084999B; SE8105079L; HU188077B; AU7489281A; DE3134353C2; IT1209896B; FR2489819B1; DK394281A; NL8104069A; ES8302090A1; KR870001373B1; ATA386081A

Description

KRAUS & WElSERT

PATENTANWALT!; UND ZUGELASSENE VERTRETER VOR DEM EUROPÄISCHEN PATENTAMT

DR. WALTER KRAUS DIPLOMCHEMIKER· DR.-ING. ANN EKÄTE WEI SERT DIPL.-ING. FACHRICHTUNG CHEMIE IRMGARDSTRASSE15 · D-8OOO MÜNCHEN 71 · TELEFON O89/797O77-797O78 · TELEX O5-212156 kpatd

TELEGRAMM KRAUSPATENT

3026 AW/My

ZAIDAN HOJIN BISEIBUTSU KAGAKU KENKYU KAI Tokyo, Japan

Antibiotikum BMGi62-aF2, Verfahren zu seiner Herstellung und es enthaltende pharmazeutische Zubereitung mit

Antitumorwirkung

Beschreibung

Die Erfindung betrifft ein neues Antibiotikum BMGi62-aF2 der Formel

"C-NH- ( CH₉ K-CH-CH₉-CO

Il ^- ^" I ^t

NH OH NH

CH-OH

CO-NH-(CH₂)₄-NH-(CH₂)₃-

oder eines seiner pharmazeutisch annehmbaren Salze, ein Verfahren zu seiner Herstellung, eine Arzneimittelzubereitung mit Antitumorwirkung, die das Antibiotikum als aktiven Bestandteil enthält, und ein Verfahren zur Behandlung von Tumoren in warmblütigen Tieren, bei dem dem Tier eine pharmakologisch wirksame Menge des Antibiotikums verabreicht wird.

BMGi62-aF2 ist eine Substanz, die erhalten wird, indem man einen BMGi62-aF2 erzeugenden Stamm, der zum Genus Bacillus gehört, in einem Kulturmedium unter Bildung und Akkumulierung von BMGi62-aF2 züchtet und dann BMGi62-aF2 aus der jeweiligen Kultur gewinnt.

Als Beispiel eines BMGi62-aF2 erzeugenden Stamms, der zum Genus Bacillus gehört, kann ein Stamm Bacillus BMGi62^aP2 erwähnt werden, welcher aus einer Bodenprobe, die in dem Mt. Taihei in Tochigi Prefecture, Japan, im August 1978 gesammelt wurde, isoliert wurde.

Die kulturellen und taxonomisehen Eigenschaften des BMG162-aF2-Stamms werden im folgenden beschrieben.

(1) Mikroskopische Morphologie

BMGi62-aF2-Stamm ist ein Bacillus, der eine nicht konstante Gram-Reaktion zeigt und Sporen und Stäbchen aufweist im allgemeinen mit einer Größe mit den Maßen von 0,6 bis 0,8 χ 2 bis 3,5 Mikron. Er hat weiterhin Seitenflagella und zeigt aktive freie Beweglichkeit. Eine Spore ist elliptisch, der dominante Teil davon ist zentral und mißt 0,5 bis 0,7 x1,0 bis 1,5 Mikron in der Größe und ein Stäbchen ist eindeutig gequollen. Eine Spore hat an ihrem Seitenteil einen Teil (parasporaler Körper), der gut in kanu-förmiger Art mit Kristallviolett angefärbt wird und der wärmebeständig ist. Eine Spore wird mit säureechten Farbstoffen nicht angefärbt.

(2) Eigenschaften des Wachstums auf verschiedenen Kulturmedien

Alle Inkubationen mit Ausnahme derjenigen mit durchgestochener Nährgelatine werden bei 37°C durchgeführt.

(1) Auf einer Platte mit Nähragar: Die Kolonien sind opak, matt und rund geformt und ihr Rand ist unregelmäßig und bräunlich-weiß. :

(2) Auf einer Schrägkultur aus Nähragar: Das Wachstum ist diffus und auf der Oberfläche des Schrägagars verstärkt und die Oberfläche ist opak und trocken. Die Farbe des gewachsenen Materials ist bräunlich-weiß.

. 8-

(3) In Nährbrühe: Das Kulturmedium wird insgesamt am ersten Tag der Inkubation trübe und am zweiten Tag beginnt auf der Oberfläche ein Belag zu wachsen. Am dritten Tag bedeckt der Belag die Oberfläche, und das Medium wird klar und Mycelium scheidet sich am Boden des Reagenzglases ab.

(4) Auf einem Nährgelatinestich: Beim Inkubieren bei 20⁰C tritt eine Multiplizierung längs des Stiches am ersten Tag auf. Am zweiten Tag beginnt eine Drepression auf dem sich vermehrten Teil. Die Gelatine im Medium fängt an, sich vom sechsten Tag an zu verflüssigen. Andererseits beginnt, wenn man bei 30° C inkubiert, ein Belag am zweiten Tag zu wachsen, und das Medium beginnt, sich am vierten Tag zu verflüssigen. Die Verflüssigung der Gelatine in dem Medium ist am siebten Tag beendet.

(5) Auf BCP-Milch: Nach etwa dem fünften Tag Inkubierung wird das Bromcresol-purpur. (BCP) blau und vom zwölften Tag an beginnt eine Peptonisierung.

(6) Auf Sabouraud-Dextroseagar und in Sabouraud-Dextrosebrühe: Auf einer Schrägkultur aus Sabouraud-Dextroseagar (die 10 g Pepton, 40 g Dextrose, 15 g Agar und 1000 ml entionisiertes Wasser enthält und deren pH-Wert nicht eingestellt wurde) und in Sabouraud-Dextrosebrühe (die die gleichen Materialien, wie oben, aber keinen Agar enthält) wird bei 30° und 37°C kein Wachstum in flüssigem Medium und ein mäßiges Wachstum auf der Schrägkultur an ihrem unteren Teil beobachtet.

(3) Physiologische Eigenschaften

Sofern nicht anders speziell angegeben, erfolgt die Inkubierung bei 37⁰C.

(1) Nitratreduktion: Ein Nitratbrühenmedium (das 10 g Fleischextrakt, 10 g Pepton, 5 g NaCl, 1 g KNO, und 1000 ml entionisiertes Wasser enthält und einen pH-Wert

von 7,2 aufweist) wird Nitrit in der gesamten Kulturbrühe am ersten, dritten und fünften Tag der Inkubation nachgewiesen. Insbesondere wurde am fünften Tag eine beachtliche Reaktion beobachtet, und nachdem ein Reagens zu der Kulturbrühe zugegeben wurde, tritt ein rötlichbrauner Niederschlag auf.

(2) Denitrifikationsreaktion: Wird ein Deiiitrifikationsreaktions-Test gemäß dem Verfahren von Komagatä et al. (T. Hasegawa "Toxonomy and Identification of Microorganisms, Seite 223, The University of Tokyo Press, 1975) durchgeführt, so ist das Ergebnis negativ.

(3) MR-Test: In einem Kulturmedium,welches 5 g Glucose, 7 g Pepton, 5 g NaCl und 1000 ml entionisiertes Wasser enthält und dessen pH-Wert auf 7,5 bei 30°C eingestellt wurde, wurden am ersten, zweiten und fünften Tag Methylrot (MR)-Tests durchgeführt, und diese waren in allen untersuchten Fällen,positiv.

(4) VP-Test: Auf einem Kulturmedium, welches % g Glucose, 7 g Pepton, 5 g NaCl und 1000 ml entiönisiertes Wasser enthält und dessen pH-Wert auf 7,5 bei 30⁰C eingestellt wurde, wurde am ersten, zweiten und fünften Tag der Voges-Proskauer(VP)-Test durchgeführt, und man erhielt in allen geprüften Fällen negative Ergebnisse.

(5) Bildung von Indol: Auf einem Kulturmedium, welches 20 g Polypepton, 5 g NaCl und 1000 ml entionisiertes Wasser enthält und dessen pH-Wert 7,4 beträgt, wurde die Bildung von Indol am ersten und zweiten Tag nicht und am fünften Tag wurde sie beobachtet.

(6) Bildung von Schwefelwasserstoff: Auf TSI-Agar (dreifaches Zucker-Eisen-Agar: Rinderextrakt 3 Si Hefeextrakt 3 g, Pepton 15 g, Proteose-pepton 5g, Lactose 10 g, Saccharose 10 g, Dextrose 1g, Eisen(II)-sulfat 0,2 g, Natriumchlorid 5 g, Natriumthiosulfat 0,3 g, Agar 12 g, Phenolrot 0,024 g und destilliertes Wasser 1 1;

pH -S= 7,2) beobachtet man während einer Inkubationszeit

von .7 Tagen keine Bildung von Schwefelwasserstoff.

(7) Hydrolyse von Stärke: Auf einer Platte aus Nähragar, die 0,2% lösliche Stärke enthält, wird eine Züchtung durch Aufstreichen und eine Prüfung mit Jod-Kaliumjod-Lösung an dem 1.γ-2., 3·, 5·» 6., 13. und 15. Tag durchgeführt. Man beobachtet in allen Fällen keine Stärkezersetzung.

(8) Ausnutzung von Citronensäure: Auf Koser-Citratmedium und Christensen-Agar beobachtet man während

5 Tagen kein Wachstum auf beiden Medien.

(9) Ausnutzung anorganischer Stickstoffquellen für das Wachstum: Es wurden Versuche unter Zugabe von Stickstoffquellen [1 g NaNO₃, 0,78 g (NH^)₂SO₄ oder 1,7 g Natriumglutamat] zu dem Grundmedium (enthaltend 10 g Glucose, 1 g KH₂PO₄, 0,5 g MgSO₄^H₂O, 0,2 g KCl und

1000 ml entionisiertes Wasser; pH = 7,2) durchgeführt, und man beobachtet bei allen geprüften Stickstoffquellen kein Wachstum.

(10) Bildung von Pigment: Nach einer Über-Nacht-Inkubation auf King's A Agar (Pepton 20 g, Magnesiumchlorid 1,4 g, Ammoniumsulfat 10 g, Agar 15 g und destilliertes Wasser 1 1; pH = 7,2) läßt man die Kultur 6 Tage bei Zimmertemperatur stehen und auf King's B Agar (Pepton 20 g, Kaliumphosphat (zweibasisch) 1,5 g, Magnesiumsulfat 1,5 g, Agar 15 g und destilliertes Wasser 1 1; pH = 7,2) während

6 Tagen beobachtet man in beiden Fällen nicht die Bildung von löslichem Pigment.

(11) Urease: Auf einem Ureasemedium (Pepton 2g, Harnstoff 30 g, Natriumchlorid 5 g, monobasisches Kaliumphosphat 9 g, dibasisches Natriumphosphat 3 g» Phenolrot 0,01. g und destilliertes Wasser 1 1; pH = 6,2) ist während 24 Stunden das Ergebnis auf Urease negativ.

(12) Oxidase: Frische Kulturen aus einem Schrägnähragar zeigten über Nacht positive Oxidasereaktion mit Cytochrom-Oxidasepapier (hergestellt von Nissui Co.).

(13) Catalase: Eine frische Kultur auf einem Nähragar-Schrägmedium bildet über Nacht einen Schaum und zeigt ein positives Ergebnis bei dem Catalasetest unter Verwendung von 3%igem wäßrigem Wasserstoffperoxid.

(14) Wachstumsbedingungen! Während eines Tests von 24 Stunden auf Nährbrühe bei pH-Werten von 3*0, 4,0, 5,0, 6,0, 6,8, 7,8, 8,2 und 8,8 und nach der Sterilisation beobachtet man ein Wachstum bei pH 5»0 und pH 8,2. Der optimale pH-Wert für das Wachstum beträgt 6,0 bis 7,8.

Bei Prüfungen bei 9°, 15°, 20°, 24^P, 27°, 30°, 37°, 40°, 45° und 50°C während 24stündiger Inkubation beobachtet man ein Wachstum zwischen 15 und 40⁰C- Die optimale Temperatur für das Wachstum liegt in der Nachbarschaft von 37⁰C.

(15) Einfluß von Sauerstoff: Wird die Kultur in einem Nähragar mit einem Gehalt vc>n Λ% Glucose suspendiert und als Tiefschichtagar gehärtet, so beobachtet man um die Oberfläche des Mediums herum ein gutes Wachstum. Auf TEP-Agar (Pflanzenextrakt 7 g, Hefeextrakt 5 g, Fleischextrakt 3 g» Pepton 10 g, Tripton 10 g, Sojapepton 3 g, Dextrose 3 g» monobasisches Kaliumphosphat 2,5 g, Natriumchlorid 2 g, L-Cystein.HCl 0,3 g» Natriumthioglycollat 0,3 g, Agar 14 g und destilliertes Wasser 1 1; pH = 7,2) beobachtet man unter anaeroben Bedingungen ein Wachstum.

(16) OF-Test (Hugh-Leifson-Test): In beiden Fällen, d.h. unter aeroben und anaeroben Bedingungen, zersetzt sich Glucose und Säure wird gebildet.

(17) Ausnutzung von Kohlenstoffquellen: Die Ausnutzung von Kohlenstoffquellen wird unter Verwendung des Verfahrens von Iizuka und Komagata (T.Hasegawa "Toxonomy and Identification of Microorganisms, S. 230, The University of Toyko Press, 1975) geprüft. Glucose, Glycerin und Natriumsuccinat werden für das Wachstum ausgenutzt, während Natriumacetat, Natriumeitrat, Natrium-p-hydroxybenzoat nicht ausgenutzt werden.

-r-

(18) Bildung von Säure und Gas aus Zuckern: Der BGM162-aF2-Stamm wird auf Schrägkulturen ausgestrichen, welche hergestellt werden, indem man steril verschiedene Zucker, die getrennt sterilisiert wurden, zu dem Grundkulturmedium [enthaltend 1~"~g (NH^)₂ΗΡ0^, 0,2 g NaCl, 0,2 g MgSO^.7H₂O, 0,2 g Hefeextrakt, 15 g Agar, 4 ml 0,2frLge wäßrige Bromcresolpurpur-Lösung und 1000 ml entionisiertes Wasser; pH =7,2] in einer Endkonzentration von 1% des jeweiligen Zuckers zugibt und anschließend züchtet. Die Bildung von Säure wird während einer Zeit von 40 Tagen beobachtet. Säure bildet sich aus D-Glucose, D-Mannose, D-Fructose, D-Mannit, Maltose, Trehalose und Glycerin, aber nicht aus D-Xylose, L-Arabinose, D-Galactose, Rhamnose, D-Sorbit, Inosit, Lactose, Saccharose, Raffinose und Stärke.

Andererseits wird die Gasbildung unter Verwendung eines Durham-Rohrs untersucht, nachdem man verschiedene Zucker auf gleiche Weise, wie oben erwähnt, dem Grundmedium zugegeben hatte (welches enthält: 10g Pepton, 5 g NaCl, 0,008 g Bromthymolblau und 1000 ml entionisiertes Wasser; pH = 7,2). Die Untersuchung erfolgte während 2 Wochen. Bei allen geprüften Zuckern bildet sich kein Gas.

(19) Oxidationstest von Gluconsäure: Unter Verwendung eines Gluconatmediums (monobasisches Kaliumphosphat 2 g, Magnesiumsulfat 0,5 g, Natriumchlorid 5 g, Ammoniumsulfat 0,5 g, Kaliumgluconat 10 g und destilliertes Wasser 1 1; pH. = 6,3) ist der Test negativ.

(20) Bildung von Dihydroxyaceton: Nach Inkubation des Kulturmediums, welches 10 g Hefeextrakt, 20 g Glycerin, 15 g Agar und 1000 ml entionisiertes Wasser enthält und einen pH-Wert von 7,0 aufweist, wird in allen geprüften Fällen durch Fehling's Reagens die Bildung von Dihydroxyaceton nicht nachgewiesen. Die Inkubation erfolgte während 3, 5, 10 und 24 Tagen.

(21) Resistenz gegenüber Natriumchlorid: Naeh der Inokulation des Kulturmediums mit dem Stamm, Wobei das Kulturmedium durch Zugabe von Natriumchlorid zu dom Grundkulturmedium, welches 10 g Tryptiease (Trypticäse, BBL) und 1000 ml entionisiertes Wasser enthält (pH = 7,0), hergestellt wurde, auf solche Weise, daß die Konzentration von Natriumchlorid in jedem Kulturmedium 2, 5 und 796 beträgt, wird eine Vermehrung des Stamms auf der Oberfläche der Kultur während einer Zeit von 4 Tagen beobachtet* In dem Grundkulturmedium mit 2% Natriumchlorid wird eine Vermehrung des Stamms beobachtet, aber mit mehr als 2% Natriumchlorid wird kein Wachstum beobachtet*

(22) Zersetzungstest von HippuTsäure: Durch Inkubation eines Kulturmediums (pH 7,4), welches durch Zugabe von 10 g Natriumhippurat zu 1000 ml Herzinfusionsbrühe (Difco) gebildet wird, während 4 Tagen beobachtet man bei der Verwendung von Eiseh(Ill)-chloridlösung eine Zersetzung der Hippursäure.

(23) Phenylbrenztraubensäüre(PPA)-Testi Nach einer starken Inokulation an einer Schrägkultur, enthaltend 3 g Hefeextrakt, 2 g DL-Phenylalanin, 1 g NaHPO^, S g NaCl, 12 g Agar und 1000 ml entionisiertes Wasser (pH s 7,3), und dem anschließenden Inkubieren während 24 SttitV-den ist der Versuch, bei dem 10%ige Eisen(lll)-chloridlösung verwendet wurde, negativ.

(24) Auflösetest von Tyrosin: Nach der Inkubation auf Tyrosinagar (enthaltend 1000 mi Nähragar und 5 g Tyrosin, pH = 7,2) bei 30 und 37⁰C :beobachtet man ein Auflösen von Tyrosin nach 2- bis 4tägiger Inkubation.

Die oben erwähnten Eigenschaften können wie folgt zusammengefaßt werden. ν

BMG162-aF2-Stamm ist ein Bacillus,!der fakultativ anaerob ist und eine nicht konstante Gram-Reaktion zeigt, Sporen

-4H- . -■::--:■ '- -sr- ·■'"■■'

aufweist und Seitenflagella besitzt und Mobilität besitzt. Eine Spore ist elliptisch und zentral und enthält an ihrem Seitenteil einen Teil (parasporaler Körper), der in kanuartiger Form mit Kristallviolett gut gefärbt wird und der wärmebeständig ist. Die Stäbchen sind eindeutig gequollen und nicht säurebeständig, -und der Stamm diffundiert und vermehrt sich auf Agarmedium und bildet in fluidem Kulturmedium eine Haut. Er verflüssigt Gelatine und peptonisiert BCP-Milch nach der Verfärbung zu Blau. Auf Sabouraud-Brühe beobachtet man kein Wachstum, aber ein schwaches Wachstum wird auf Sabouraud-Dextroseagar beobachtet. Er reduziert Nitrat und seine Denitrifikationsreaktion ist negativ und der MR-Test ist positiv und der VP-Test ist negativ. Indol wird am fünften Tag nachgewiesen und Schwefelwasserstoff wird nicht gebildet. Er zersetzt Stärke nicht und nutzt Citronensäure nicht aus. Die Ergebnisse der Urease-* Oxida- und Catalase-Tests sind negativ bzw. positiv bzw. negativ. Wachstum wird innerhalb eines pH-Bereichs von 5,0 bis 8,2 beobachtet und der optimale pH-Wert für das Wachstum beträgt 6,0 bis 7,8. Das Wachstum wird ebenfalls innerhalb eines Bereichs von 15 bis 40⁰C beobachtet und die optimale Wachstumstemperatur beträgt etwa 37°C. Das Wachstum wird ebenfalls in aerobem Zustand beobachtet. Er zersetzt Glucose bei oxidativen und fermentativen Bedingungen und bildet Säure. Er bildet Säure und kein Gas aus D-Glucose, D-Mannose, D-Fructose, D-Mannit, Maltose, Trehalose und Glycerin. Er oxidiert weder Gluconsäure noch bildet er Dihydroxyaceton. Er zersetzt Hippursäure und Phenylalanin nicht und löst Tyrosin. Ein Wachstum wird in einem Kulturmedium mit mehr als 3% Natriumchlorid nicht beobachtet.

Aufgrund der obigen Eigenschaften des Stammes BMGi62-aF2 ist erkennbar, daß dieser Stamm zum Genus Bacillus und

45-

insbesondere Bacillus firmus, B. laterosporus, B. brevis oder B.sphaericus gehört, die eine Gruppe von Species sind, die gemeinsame Eigenschaften besitzen: Catalase positiv und Dihydroxyaceton wird nicht gebildet, wie in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, Eighth Edition, Seite 542 (R.E. Buchanan und N.E.Gibbons, The Williams & Wilkins Company, Baltimore, 1974) beschrieben. Zum Vergleich mit den obigen vier Species sind die Eigenschaften des Stamms BMGi62-aFe in der folgenden Tabelle 1 aufgeführt.

Aus Tabelle 1 ist erkennbar, daß der Stamm BMGi62-aF2 ähnlich dem Bacillus laterosporus ist. Der Unterschied zwischen dem Stamm BMGi62-aP2 und B. laterosporus ist der, daß er sich von dem anderen hinsichtlich der Art des Wachstums auf dem Sabouraud-Glucoseagar unterscheidet.

Tabelle 1

	B. firmus	B.latero sporus	B. brevis B.	sphaericus	i	_	BMGi62-aF2
Sporen					+
Form		E	E	S		elliptisch
Ausdehnung d.Sporangien					30-45
charakteristisch	-	+	+		5-15	4-
dominante Stellung	C	C	CT	T	C
Bildung aus Glucose
Säure	+(Woche)	+	+ oder -		+
Gas	-	-		_	_
Acetoin	-			_	_
Stäbchen
Breite, /um Länge, yum	0,6-0,9	0,5-0,8	0,6-0,9	0,6-1	0,6-0,8
Gram-Reaktion	1 ,2-4	2-5	1,5-4 .	i ,5-5	2-3,5
leicht anfärbbarer Körper an	+	d und ν	d und v.	d und ν	d und ν
einer Seite d.Spore vorhanden				■ ..
Motilität		+ ( + )^b	' -	+
Temperatur für d.Wachstum, C	d		+	⁺ S
Maximum				' I
Minimum	40-45	35-50	40-60	40 '
5-20	15-20	10-35	15

Säure aus Arabinose und Xylose Mannit

Hydrolyse von Stärke Wachstum in anaerobem Agar

790 NaCl Sabouraud Dextrosebrühe Sabouraud Dextroseagar

B. iirmus

Tabelle 1 (Fortsetzung)
B.laterosporus B. brevis B.sphaericus BMGi62-aF2

Produktion von

alkalischer Reaktion in

V-P Brühe
Bildung von Indol

nach 5tätiger Kultur

zu

Zersetzung von

Casein

Tyrosin
Deaminierung von Phenylalanin

d d

d +

a: E=elliptisch oder zylindrisch; S=sphärisch oder fast so; C=zentral;T=terminal oder subterminal; CT=zentral bis terminal} Variation innerhalb oder zwischen den Stämmen; + =
positiv für 90-100% der Stämme; - = negativ für 90-100% der Stämme; d=Reakticnen unterscheiden sich, positiv für 11-89% der Stämme; v=Charakter innerhalb eines Stammes nicht
konstant.

b: Versuchsergebnisse.

Nach dem Erhalt von Dr. Ryozo Azuma vom National Institute of Animal Health, Japan, eines Stamms von B. laterosporus verglichen die Erfinder ihren mit dem erhaltenen Stamm. Aus den Ergebnissen haben die Erfinder sichergestellt, daß beide Stämme einen kanu-förmi£sn Körper (ein Teil, der in Kanuform angefärbt wird; ein parasporaler Körper) an dem Seitenteil ihrer Sporen aufweisen, welches ein bemerkenswertes Merkmal dieser Species ist. Das Wachstum auf Sabouraud-Dextroseagar beider Stämme stimmt miteinander überein. Aufgrund dieser Tatsachen wird der Stamm BMGi62-aF2 als Bacillus laterosporus BMGi62-aF2 bezeichnet.

Dieser BMG162-aF2-Stamm wurde am 12. Oktober 1979 bei der japanischen Hinterlegungsstelle "Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Inage, Chiba-City, Japan unter der Hinterlegungsnummer FERM-P 5230 und am 31. Juli 1981 bei der American Type Culture Collection, Parklawn Drive, Rockville, Maryland, USA, unter der Hinterlegungsnummer ATCC 31932 hinterlegt.

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung aller Stämme des obigen Stamms und seiner Varianten und der Stämme, die zum Genus Bacillus gehören, welche BMGi62-aF2 bilden.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine neue antibiotisch wirksame Substanz zur Verfugung zu stellen.

Erfindungsgemäß soll weiterhin ein Verfahren zur Herstellung des neuen Antibiotikums zur Verfügung gestellt werden. Erfindungsgemäß soll weiterhin ein Antitumor-Arzneimittel zur Verfügung gestellt werden, das die neue,antibiotisch wirksame Substanz als aktiven Bestandteil enthält.

Erfindungsgemäß soll ein Verfahren zur Behandlung von Tumoren in Warmblütern einschließlich Menschen zur Verfügung gestellt werden.

Das Verfahren zur Herstellung von BMGi62-aF2 unter Verwendung der oben erwähnten Stämme wird im folgenden erläutert.

In den beigefügten Zeichnungen zeigen

Fig. 1 das ¹H-NMR-Spektrum von BMGi62-aF2-Hydrochlorid in (CIU)₂SO unter Verwendung von Tetramethylsilan als Innenstandard (100 MHz);

Fig. 2 das ¹⁵C-NMR-Spektrum von BMGi62-aF2-Hydrochlorid in D₂O unter Verwendung von Tetramethylsilan als Außenstandard (25 MHz);

Fig. 3 das¹⁵N-NMR-Spektrum von BMGi62-aF2-

15 Hydrochlorid in D₂O unter Verwendung von NH^ NO, als Außenstandard (10 MHz); und

Fig. 4 das Infrarot-Absorptionsspektrum von BMGi62-aF2-Hydrochlorid in Kaliumbromid.

BMGi62-aF2 kann durch aerobe Züchtung von Sporen oder Stäbchen eines BMGi62-aF2 erzeugenden Stamm oder seiner Mutanten des Genus Bacillus in einem Kulturmedium, welches Nährmaterialien enthält, hergestellt werden. Im allgemeinen können für die Zwecke der vorliegenden Erfindung die Nährbestandteile von Kulturmedien verwendet werden, die üblicherweise für die Züchtung normaler Bakterien verwendet werden. Beispielsweise kann man im Handel erhältliches Pepton, Fleischextrakt, Maisquellwasser, Baumwollsamenmehl, Erdnußmehl, Sojabohnenmehl, Hefeextrakt, N-Z-Amin, Hydrolysat von Casein, Natriumnitrat, Ammoniumnitrat, Ammoniumsulfat und dergl. als Stickstoffquelle verwenden. Im Handel erhältliches Glycerin, Saccharose, Stärke, Glucose, Maltose, Melassen und andere Kohlenhydrate wie auch Fett und Öl sind als Kohlenstoffquelle nützlich. Zu-

. so-

sätzlich können Natriumchlorid, Phosphate, Calciumcarbonat, Magnesiumsulfat und andere anorganische Salze als Salz-Additiv in dem Kulturmedium verwendet werden. Andere Metallsalze und andere Verbindungen können in Spurenmengen gegebenenfalls zugegeben werden, solange sie von dem BMGi62-aF2 erzeugenden Stamm ausgenutzt werden und für die Bildung von BMGi62-aF2 nicht nachteilig sind. Man kann irgendwelche Nährmaterialien, von denen bekannt ist, daß sie für die Züchtung von Bakterien nützlich sind, bei den erfindungsgemäßen Verfahren einsetzen, solange sie durch den BMGi62-aF2 erzeugenden Stamm bei der Bildung von BMGi62-aF2 assimilierbar sind.

Für die Erzeugung von BMGi62-aF2 in großem Maßstab ist eine Züchtung mit flüssigem Medium bevorzugt. Für die Züchtung kann irgendeine Temperatur, bei der der BMG162-aF2 erzeugende Stamm wachsen und BMGi62-aF2 bilden kann, verwendet werden, aber eine besonders bevorzugte Inkubationstemperatur liegt im Bereich von 20 bis 35°C. Der pH-Wert des Mediums beträgt 5,0 bis 8,2, und ein bevorzugter pH-Wert liegt im Bereich von 6,0 bis 7,8. Die Züchtung wird während einer Zeit durchgeführt, die ausreicht, eine genügende Menge an BMGi62-aF2 in dem Kulturmedium oder der Brühe zu bilden und zu akkumulieren. Beispielsweise beobachtet man die Bildung und Akkumulation von BMG162-aF2 nach eintägiger Inkubation, wenn ein flüssiges Kulturmedium, welches 2,0% Glycerin, 2,0% Glucose, 1,0% Pepton, 0,3% Hefeextrakt, 0,2% Calciumcarbonat enthält (der geeignetste pH beträgt etwa 7,4), hergestellt und sterilisiert wird und anschließend mit Sporen und Stäbchen inokuliert wird, die aus einer Schrägkultur von einem BMG162-aF2-Stamm isoliert werden, und wenn man die Züchtung bei 27°C unter aeroben Bedingungen und unter Rotationsschütteln durchführt.

Die Analyse von BMGi62-aF2 kann unter Verwendung von Bacillus subtilis PCI 219 als Testorganismus entsprechend dem Standard-Becher-Platten-Verfahren erfolgen, welches normalerweise für die Analyse bekannter Antibiotika verwendet wird.

Bei der Züchtung eines BMGi62-aF2 erzeugenden Stamms des Genus Bacillus werden außer dem oben erwähnten Schüttelkulturverfahren ein Kolben-Fermentations-Kulturverfahren oder ein Tank-Züchtungsverfahren, die im allgemeinen für die Züchtung unter Belüftung und Rühren eingesetzt werden, für die Produktion in großem Maßstab verwendet. Bei einer Züchtung in großem Maßstab wird das oben erwähnte, flüssige Kulturmedium während 20 bis 40 Stunden unter Schütteln gezüchtet und bevorzugt mit 0,5 bis 2,0 Vol-% eines Impfmediums inokuliert.

Die Gewinnung von BMGi62-aF2 aus dem fermentierten Brühenfiltrat erfolgt mittels einer Säulenchromatographie, zu der ein schwach kationisches Ionenaustauschharz, das Carbonsäuregruppen als aktive Gruppen enthält, verwendet wird. Als schwaches kationisches Austauschharz kann man Amberlite IRC-50^^R^ und CG-50^^R^ (Warenzeichen für Kationenaustauschharze, bei denen die Aktivität exklusiv auf die Carboxylgruppe zurückzuführen ist und die von Rohm & Haas Co. hergestellt werden), Lewatit CNP^ ' (Warenzeichen für ein Kationenaustauschharz, bei dem die Aktivität auf Carbonsäure- und Sulfonsäuregruppen zurückzuführen ist und welches von Bayer Ltd. hergestellt wird) oder CM-Sephadex*· ' (Warenzeichen für Carboxymethyldextran, ein Kationenaustauschharz, das von Pharmacia Fine Chemicals hergestellt wird), sofern verfügbar in der H-Form, der Na-Form, der NH^-Form und ihren gemischten Formen verwenden. Das an dem Harz adsorbierte BMGi62-aF2 wird mit wäßriger Säurelösung, wie Chlorwasserstoffsäure,

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Essigsäure, etc, oder einer wäßrigen Salzlösung, wie Natriumchloridlösung, ausgewaschen. Als Extraktions-, Trennungs- und Reinigungsverfahren kann man Gelfiltrations-, Ultrafiltrationsverfahren einschließlich der Verfahren, bei denen Harze verwendet werden, einsetzen, wobei man die reine Form von BMGi62-aF2 erhält. Man kann die oben erwähnten Verfahren auch auf geeignete Weise kombinieren oder wiederholen.

BMGi62-aF2 wird als Hydrochlorid erhalten, da es in freier Basenform instabil ist. Es ist so hygroskopisch, daß es ein Hydrat bildet. Die physikochemischen Eigenschaften von BMGi62-aF2-hydrochlorid-hydrat sind wie folgt.

¥egen seiner extremen Hydroskopizitat ist es unmöglich, seinen Schmelzpunkt zu bestimmen. Es zeigt Ca-In = -11° (c = 1,0, Wasser); Analyse für C₁,7H₃₇N₇O₄.3HCl.2Η_£0 berechnet: C 37,2096 H 8,08% N 17,86% Cl 19,38% gefunden : 37,55 7,89 17,52 18,61. Das H-NMR-Spektrum ist in Fig. 1 und das ^C-NMR-Spektrum

15
ist in Fig. 2 gezeigt. Das - N-NMR-Spektrum ist in Fig.3 dargestellt. Es werden 7 Stickstoffatome beobachtet (3 Stickstoffatome in der Guanidylgruppe werden als Signale von 2 Peaks beobachtet). Das Ultraviolett-Absorptionsspektrum zeigt nur eine Endabsorption. Das Infrarotspektrum ist in Fig. 4 dargestellt.

BMGi62-aF2-HydroChlorid ist in Wasser und Methanol leicht, aber kaum oder unlöslich in Äthanol, Äthylacetat, Chloroform und Benzol. Es zeigt positive Ninhydrin-, Sakaguchi- und Rydon-Smith-Reaktionen. Bei der Dünnschichtchromato-

(R) graphie unter Verwendung von Avicel^v ' (mikrokristalline Cellulose) unter Entwicklung mit Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (6:4:1:3) und Butanol-Äthanol-Wasser (4:1:2)

zeigt BMGi62-aF2-Hydrochlorid einen einzigen Flecken bei Rf = 0,14 bzw. Rf = 0,20. Bei der Hochspannungs-Papier-Elektrophorese (3500 V, 15 min) unter Verwendung von Ameisensäure-Essigsäure-Wapser (1:3:36) zeigt BMGi62-aF2 eine relative Beweglichkeit bei 1,70 bis 1,74 gegenüber Alanin als 1,00.

Die biologischen Eigenschaften von BMGi62-aF2 werden im folgenden aufgeführt. Wie im folgenden gezeigt wird, zeigt BMGi62-aF2-Hydrochlorid nur eine schwache Inhibitoraktivität gegenüber grampositiven und -negativen Bakterien und beachtenswerte Wirkungen bei der Heilung und der Ausdehnung der Überlebensperioden bei Versuchen unter Verwendung von Mäuse-Leukämie L1210, EL-4, Ehrlich ascites Tumor und Sarcoma 180, und es ist eindeutig, daß das Antibiotikum ein nützliches Antikrebsmittel ist.

(1) Antibakterielle Aktivität von BMGi62-aF2

BMGi62-aF2 zeigt eine schwache antibakterielle Aktivität und die minimale Hemmkonzentration gegenüber verschiedenen Bakterien auf Nähragar wird in den Tabellen 2-1 bis 2-3 angegeben. Die Versuche werden unter Verwendung des Agarverdünnungsverfahrens, bei dem BMG162-aF2-Hydrochlorid eingesetzt wird, durchgeführt. Aus Tabelle 2-1 folgt, daß BMGi62-aF2 schwach grampositive und -negative Bakterien inhibiert.

Tabelle 2-1 - Antibakterielle Aktivität Testorganismus

Minimale Hemm-

konzentfation

(mcg/ml)

1.	Staphylococcus aureus PDA209P	100
2.	Staphylococcus aureus Smith	12.5
3.	Micrococcus flavus FDA16	25
Ü.	Micrococcus lysodeikticus IPO3333	100
5.	Sarcina lutea PCIlOOl	100
6.	Bacillus anthracis	25
7.	Bacillus subtilis NRRL B-558	100
8.	Bacillus subtilis PCI219	6.25
9-	Bacillus cereus ATCC10702	>100
10.	Corynebacteriuni bovis l8l0	50
11.	Escherichia coli NIHJ	>100
12.	Escherichia coil K-12	100
13-	Escherichia coli ML1629	>100
14.	Shigella dysenteriae JS11910	100
15-	Shigella flexneri 4bJSll8ll	>100
16.	Shigella sonnei JSIl?*T6 ^:	>100
17.	Salmonella typhi T-63	>1OO
18.	Salmonella enteritidis	>100
19-	Proteus vulgaris 0X19	12.5

Tabelle 2-1 (Fortsetzung)

20.	Proteus mirabilis IPM OM-9	>100
21.	Proteus rettgeri GN311	>100
22.	Proteus rettgeri GN466	>100
23-	Serratia marcescens	>100
24.	Pseudomonas aeruginosa A3	>100
25.	Klebsieila penumoniae PCl602	>100
26.	Mycobacterium smegmatis ATCC6O7	>100

Verwendetes Medium: Nähragar bei 37°C

Tabelle 2-2 Antibakterielle Aktivität

Testorganismus

Minimale Hemmkonzentration (mcg/ml)

1. Aeromonäs punctata IAM1646	>100
2. Aeromonäs salmonecida ATCCl¹IIyIl	>100
3. Aeromoiaas sp. (KT-¹14 4)	>100
4. Vibrio anguillarum NCBM6	50
5- Pseudomonas fluorescens	>100
6. Pseudomonas lachrymans	50
7. Erwinia aroideae	50

Verwendetes Medium: Nähragar bei 27⁰C

Tabelle 2-5 Antibakterielle Aktivität

Te s to rgani smus

Minimale Hemmkonzentration (meg/ml)

1.	Candida tropicalis P-I	>100
2.	Candida pseudotropicalis NI7494	>100
3.	Candida albicans 3147	>100
4.	Candida Yu-1200	>100
5-	Candida krusei NI7492	>100
6.	Saccharomyces cerrevisiae	>100
7.	Cryptococcus neogormans	>100
8.	Helminthosporium oryzae	>100
9.	Pyricularia oryzae	>100
10.	Pellicularia filamentosa sasakii	>100
11.	Xanthomonas citri	>100
12.	Xanthomonas oryzae	>100
13.	Aspergillus niger	100
14.	Trichophyton asteroides 429	>100
15.	Trichophyton mentagrophytes	>100

Verwendetes Medium: Nähragar + 19^ Glucose bei 27°C

(2) Antikrebsaktivität von BMGi62-aF2

(a) Wirkung gegenüber Mäuse-Leukämie L1210(ip-ip-System)

Einer Gruppe, die 8 CDF₁-Mäuse (weiblich, 6 bis 7 Wochen alt) umfaßt, werden 10⁵ Zellen/0,25 ml/Maus von L1210-Leukämiezellen intraperitoneal inokuliert. Nach. 24 h wird

EMGi62-aF2-Hydrochlorid, gelöst in Salzlösung, intraperitoneal einmal am Tag während 9 Tagen kontinuierlich verabreicht und die Letalität und die Rate bei der Verlängerung der Überlebenszeit werden bestimmt. Wie aus Tabelle folgt, zeigt BMGi62-aF2 eine Heilwirkung und verlängert die Überlebenszeit von Mäusen mit Leukämie L1210.

Tabelle 3 - Einfluß von BMGi62-aF2 auf Mäuse-Leukämie

	L1210 (ip-ip-System)	Zahl der überleben
Dosis	Durchschn.Überlebenstage	den Tiere während
(mg/kg/	der behandelten Tiere _1Q0	60 Tagen
Tag)	Durchschn.Überlebenstage	Zahl der geteste
	der Vergleichstiere	ten Mäuse
		0/8
50	295⁺	0/8
25	334	4/8
12,5	586	8/8
6,25	732	3/8
3,13	441	1/8
1,56	301	0/8
0,78	107

es treten toxische Anzeichen auf

Die durchschnittlichen Überlebenstage der Vergleichstiere: 8,2 Tage.

(b) Einfluß auf Mäuse-Leukämie L1210 (sc-ip-System

Einer Gruppe von 5 CDF₁-Mäusen (weiblich, 6 bis 7 Wochen alt) werden Mäuse-Leukämiezellen L1210 (10^p Zellen/ 0,25 ml/Maus) subkutan an die Seite des Abdomens injiziert und nach 24 h wird mit BMG162-aF2-HydroChlorid in Salzlösung intraperitoneal einmal am Tag während 9 Tagen kontinuierlich behandelt. Dann werden die Letalität und die Rate bei der Verlängerung der Überlebenszeit bestimmt. Wie aus Tabelle 4 folgt, zeigt BMGi62-aF2 eine starke therapeutische Wirkung und eine Verlängerung der Überle-

- 25 -

benszeit wie bei Versuch (a).

Tabelle 4 - Einfluß von EMGi62-aF2 auf Mäuse-Leukämie

	L1210 (sc-ip-System)	Zahl der überle
Dosis	Durchschn.Überlebenstage	gen Mäuse während
(mg/kg/	der behandelten Tiere _1QQ	30 Tagen
Tag)	Durchschn.Uberlebenstage	Zahl der behandel
	der Vergleichstiere	ten Mäuse
		5/5
50	> 309	5/5
25	>309	5/5
12,5	>309	3/5
6,25	> 240	0/5
3,13	120	0/5
1,56	105

Durchschnittliche Überlebenstage der Vergleichstiere: 9,7 Tage.

(c) Wirkung auf Mäuse-Leukämie EL-4 Eine Gruppe von 5 CVyBL/o Mäusen (weibliche, 10 Wochen

alt) wird intraperitoneal mit Mäuse-Leukämiezellen EL-4 (10^ Zellen/0,25 ml/Maus) inokuliert und nach 24 h wird mit BMGi62-aF2-Hydrochlorid in Salzlösung intraperitoneal einmal am Tag während 9 Tagen kontinuierlich behandelt, und dann werden die Letalität und die Rate der Verlängerung der Überlebenszeit bestimmt. Wie aus Tabelle 5 folgt, zeigt BMG162-aF2 ebenfalls eine therapeutische Wirkung und eine Verlängerung der Überlebenszeit bei EL-4.

Tabelle 5 - Einfluß von BMGi62-aF2 auf Mäuse-Leukämie EL-4

Dosis Durchschn.Überlebenstage der

(mg/kg/ behandelten Tiere χ

Tag) Durchschn.Uberlebenstage der Vergleichstiere

5 193

2,5 164

1,25 159

0,625 130

0,313 131

Durchschnittliche Überlebenstage der Vergleichstiere: 11,0 Tage.

(d) Wirkung auf Ehrlich ascites Tumor bei Mäusen

Eine Gruppe von 4 ICR-Mäusen (weiblich, 6 Wochen alt) wird intraperitoneal mit Ehrlich ascites Tumorzellen (2 χ 10 Zellen/0,25 ml/Maus) inokuliert, und nach 24 h wird mit BMGi62-aF2-Hydrochlorid in Salzlösung durch intraperitoneale Injektion einmal am Tag während 9 Tagen kontinuierlich behandelt. Dann wird die Verlängerung bei der Überlebens zeit geprüft.. Wie aus Tabelle 6 folgt, zeigt BMGi62-aF2 eine Antikrebswirkung gegenüber Ehrlich ascites Tumor.

Tabelle 6 - Einfluß von BMGi62-aF2 auf Ehrlich ascites Tumor bei Mäusen

Dosis Durchschn.Überlebenstage d.behandelten Tiere _{x 1O}n

(mg/kg/ Durchschn.Überlebenstage d.Vergleichstiere

Tag)

50 54⁺

25 72⁺

12,5 17O⁺

6,26 236

3,13 188

1,56 133

es treten toxische Anzeichen auf.

- 25" - ■ ■ ■ .

Durchschnittliche Überlebenstage der Vergleichstiere: 13,8 Tage.

(e) Wirkung auf Sarcoma 180

Eine Gruppe von 4 ICR-Mäusen (weiblich, 6 Wochen alt) wird intraperitoneal mit Mäuse-Sarcoma.. 180-Zellen (2 χ 10 Zellen/0,25 ml/Maus) inokuliert, und nach 24 h wird mit BMG-i62-aF2-Hydrochlorid in Salzlösung mittels intraperitonealer Injektion einmal am Tag während 9 Tagen kontinuierlich "behandelt und die Rate der Verlängerung der Überlebenszeit wird getestet* Wie aus Tabelle 7 hervorgeht, zeigt BMGi62-aF2 ebenfalls Antikrebswirkung gegenüber Sarcoma 180.

Tabelle 7 - Wirkung von BMGi62-aF2 auf Sarcoma 180 bei Mäusen

Dosis Durchschn.Überlebenstage d.behandelten Tiere „ ₁₀₀ (mg/kg/ Durchschn.Uberlebenstage der Vergieichstiere Tag)

50 53⁺

12,5
6,25

3,13. 243

1,56 220

⁺ es treten toxische Anzeichen auf

Durchschnittliche Überlebenstage der Vergleichstiere: 13,8 Tage.

(3) Akute Toxizität von BMGi62-aF2

Wird BMG162-aF2-Hydrochlorid intravenös an ICR-Mäuse (weiblich, 4 Wochen alt) verabreicht, beträgt die LDc₀ mehr als 80 mg/kg.

Die physikochemischen und biologischen Eigenschaften von BMGi62-aF2 wurden oben im einzelnen erläutert. Aus der

Tatsache, daß Spermidin ein gemeinsamer Bestandteil des Moleküls ist, ähnelt BMGi62-aF2 Bleomycin, welches durch Streptomyces verticillus erhalten wird, LL-BM123ß, Y₁ und 72» welches durch Nocardia erhalten wird, Edenin, welches durch Bacillus brevis erhalten wird und Laterosporamin, welches durch Bacillus erhalten wird. Da die Struktur von BMG162-aF2 bereits, wie oben erwähnt, bestimmt wurde, unterscheidet sich BMGi62-aF2 eindeutig von Bleomycin, LL-BM123ß, Y₁ und γ^ und Edenin, deren Strukturen ebenfalls bestimmt wurden. Weiterhin unterscheidet es sich von Laterosporamin [The Journal of Antibiotics 2J?, 390 bis 393 (1976)] im Infrarotspektrum, in der Löslichkeit in Alkohol, im antibakteriellen Spektrum und in der Tatsache, daß eine Sakaguchi-positive Substanz, die ^C6^H13^N3° ^enthäl'^t» ^ein Bestandteil von Laterosporamin, nicht in den Zersetzungsprodukten von BMGi62-aF2 enthalten ist. Hierdurch wird bestätigt, daß BMGi62-aF2 ein neues Antibiotikum ist.

Aus den vorstehenden Ergebnissen folgt, daß BMGi62-aF2 eine charakteristische Antikrebswirkung gegenüber Leukämie von warmblütigen Tieren einschließlich des Menschen wie auch gegenüber Sarcoma und anderen Tumoren aufweist und eine relativ niedrige Toxizität besitzt. BMGi62-aF2 kann daher als ausgezeichnetes Antikrebsmittel verwendet werden.

Bei der Herstellung pharmazeutischer Zubereitungen und bei der Verabreichung unter Verwendung von BMGi62-aF2 als Antitumormittel können verschiedene, an sich bekannte Verfahren verwendet werden. Als Verabreichungsverfahren kann man die Verabreichung durch Injektion, oraißund rektale Verabreichung verwenden. Hinsichtlich der Zubereitung der Arzneimittelformen kann man Injektionen, Pulver, Granulate, Tabletten, Suppositoryen und dergl. herstellen.

Bei der Herstellung der pharmazeutischen Zubereitungen kann man jegliche Art von pharmazeutisch annehmbaren Trägern, wie feste Träger, flüssige Träger, Stabilisatoren, Antiseptika, schmerzstillende Mittel, Emulgiermittel, usw., je nach Bedarf verwenden, 'solange sie gegenüber BMGrI62-aF2 harmlos sind. Für die Herstellung pharmazeutischer Zubereitungen für die Injektion wird bevorzugt BMG162-aF2 als wasserlösliches Salz, wie das Hydrochlorid, verwendet, und Zucker, wie Mannit, werden in destilliertem Wasser gelöst und in kleine Behälter (Ampullen) gegeben oder die Lösung wird weiter lyophilisiert und in Salzlösung oder destilliertem Wasser gelöst, wobei man eine Lösung für eine Verabreichung mittels Injektion erhält.

In den pharmazeutischen Zubereitungen kann der Anteil an Gehalt innerhalb eines großen Bereichs entsprechend der Art der Zubereitung variieren, und er beträgt im allgemeinen 0,01 bis 100 Gew.%, bevorzugt 0,1 bis 70 Gew.%, BMGi62-aF2 und der Restgehalt, d.h. 0 bis 99,99 Gew.#, bevorzugt 99,9 bis 30 Gew.9f>, sind pharmazeutisch annehmbare Träger. Im Falle einer Zusammensetzung für die Injektion kann man folgende Rezeptur verwenden.

BMGi62-aF2 0,1 bis 95,0 Gew.%

Zucker 99,1 bis 5,0 Gew.$6

Natriumchlorid 0 bis 94,9 Gew.%.

Obgleich die Verabreichungsmenge an BMGi62-aF2 gemäß den Symptomen variiert, kann man 0,01 bis 800 mg/Tag/Erwachsener, bevorzugt 0,1 bis 600 mg/Tag/Erwachsener, verwenden. Sofern eine kontinuierliche Verabreichung erforderlich ist, sollte die tägliche Menge reduziert werden.

In den pharmazeutischen Zubereitungen wird BMGi62-aF2 im allgemeinen in Salzform, wie als Hydrochlorid, etc., die für die medizinische Verwendung geeignet ist, eingesetzt.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

5 1 eines flüssigen Mediums mit einem Gehalt von 2,0% Glycerin, 2,0% Dextrin, 1,C% Sojapepton (Bacto-soytone, hergestellt von Difco Laboratories), 0,3% Hefeextrakt (Daigo-Eiyo-Kagaku Co., Ltd.)» 0,2% Ammoniumsulfat und 0,2% Calciumcarbonat und mit einem pH-Wert von 7,4 werden in 125 ml-Teilen in Sakaguchi-Kolben mit einer Kapazität von 500 ml gegeben. Nach der Sterilisation wird der Kolben mit 1% Impfmedium, welches zuvor hergestellt worden ist, inokuliert [Bacillus laterosporus BMGi62-aF2 (FERM-P 5230, ATCC 31932) auf einer Schrägkultur aus Nähragar wurde in dem Medium der gleichen Zusammensetzung während 2 Tagen kultiviert]. Es wird dann 5 Tage bei 28°C gezüchtet. Das erhaltene Brühenfiltrat (4900 ml) wird auf eine Säule (500 ml, Durchmesser 5,2 cm) aus Amberlite IRC-SO^ [Rohm and Haas Co., Na⁺-Typ und H⁺-Typ (7:3) Gemisch] gegossen und die aktive Komponente wird adsorbiert. Die Säule wird mit Wasser gewaschen und die aktive Komponente wird mit 2000 ml 1,0N HCl eluiert und mit 1ON NaOH auf pH 6 neutralisiert. Die neutralisierte Lösung wird um das 4fache mit Wasser verdünnt und auf eine Säule

(R) (400 ml, Durchmesser 4,3 cm) aus CM-Sephadex C-25^V ^J

(Pharmacia Pine Chemicals, gequollen durch Vorbehandlung mit Wasser) gegeben, auf der die aktive Komponente adsorbiert ist. Die aktive Komponente wird mit 0,3M NaCl-H₂O eluiert. Die aktive Fraktion wird unter vermindertem Druck zur Trockene konzentriert. Der Rückstand wird zur Entfernung von NaCl-Kristallen durch Filtration in 5 ml Methanol gelöst. Das Filtrat wird auf eine Säule (445 ml, Durchmesser 2,6 cm) aus Sephadex LH-20^ ' (Warenzeichen für Dextran für die Gel-Filtration mit organischem Lösungsmittel , hergestellt von Pharmacia Fine Chemicals; gequollen durch Vorbehandlung mit Methanol) gegeben und

die Säule wird mit Methanol entwickelt. Die aktive Fraktion wird unter vermindertem Druck.getrocknet, wobei man 460 mg reines BMG162-aF2-Hydrochlorid als weißes Pulver erhält.

Beispiel 2

10 1 Medium mit einem Gehalt von 2,0% Glycerin, 2,0% Dextrin, 1,0% Sojapepton (Bacto-soytone^ ', hergestellt von Difco Laboratories), 0,3% Hefeextrakt (Daigo-Eiyo-Kagaku Co., Ltd.), 0,2% Ammoniumsulfat, 0,2% Calciumcarbonat und 0,03% Silikonöl als Antischaum-Mittel und mit einem pH-Wert von 7»4 werden in einen rostfreien Tank mit einer Kapazität von 30 1 gegeben Und 20 min bei 120°C sterilisiert. 125 ml einer 48 h-Schüttelkulturbrühe von BMGi62-aF2 erzeugendem Stamm, Bacillus laterosporus BMGi62-aF2, FERM-P 5230, ATCC 31932, werden verwendet, um den abgekühlten Tank aseptisch zu inokulieren. Die -Züchtung unter Belüftung und Rühren bei 28⁰C wird durchgeführt [man beginnt mit einer Belüftungsrate von 15 l/min und einer Rührgeschwindigkeit von 350 U/min, nach 16 h von 10 l/min und 350 U/min]. Nach 40 h werden 9500 ml Brühenfiltrat erhalten, welches an AmberIite IRC-50^^R^ und CM-Sephadex C-2 im wesentlichen auf gleiche Weise wie in Beispiel 1 der Säulenchromatographie unterworfen wird. Die Säule aus CM-Sephadex C-25^ wird mit 4 1 0,3M NaCl-H₂O entwickelt. 290 Teile des Eluats werden als ein Teil gesammelt und in zwei aktive Fraktionen geteilt: I (Teile Nr. 14-63);

11 (Teile Nr.64-154). Zu 1660 ml der aktiven Fraktion II, die keine Substanz enthält, die bei 280 nm absorbiert, gibt man 33 g Aktivkohle zur Adsorption des aktiven Bestandteils. Nachdem die Aktivkohle mit Wasser gewaschen wurde, wird BMGi62-aF2 mit 500 ml 0,05N HCl in 80%igem Methanol-Wasser eluiert. Das Eluat wird mit Amberlite IR-45^ ^J Rohm and Haas Co., OH -Typ) neutralisiert und

~2>5-

bei verringertem Druck getrocknet, wobei man 305 mg BMGi62-aF2-Hydrochlorid erhält. Die aktive Fraktion I, die eine Substanz mit einer Absorption bei 280 nm enthält, wird zur Trockene konzentriert, mit Methanol extrahiert, in 1 1 entionisiertem Wasser aufgelöst und erneut an einer Säule (400 ml, Durchmesser 4,3 cm.) aus CM-Sephadex C-25^V ' chromatographiert, wobei eine Gradientenelution unter Verwendung von 0-1M NaCl (4 1) durchgeführt wird. Man erhält eine aktive Fraktion, die zur Trockene eingedampft wird. Der Rückstand wird mit Methanol extrahiert und auf eine Säule (780 ml, Durchmesser 2,8 cm) aus Sephadex LH-20^ ' gegeben. Die Säule wird,um sie von NaCl zu befreien, mit Methanol entwickelt, und man erhält 670 mg reines BMGi62-aF2-Hydrochlorid. Man gewinnt insgesamt 975 mg BMG162-aF2-HydroChlorid.

Beispiel 3

Zu einer Lösung mit einem Gehalt an 150 mg BMGi62-aF2-Hydrochlorid, erhalten gemäß Beispiel 2, gelöst in.1 ml Methanol, gibt man 1 ml gesättigte Picrinsäure-Methanollösung und erhitzt zum Sieden. Nach dem Konzentrieren wird der Rückstand mit Benzol und Äthanol zur Entfernung von überschüssiger Picrinsäure gewaschen, und man erhält 62 mg Kristalle von BMG162-aF2-Picrat aus einer Lösung eines Gemisches auf Wasser und Äthanol.

Beispiel 4

Eine Injektion

30 Gew.Teile des in Beispiel 1 erhaltenen BMGi62-aF2-Hydrochlorids werden in 970 Teilen gereinigtem Wasser gelöst und filtriert, und zwar unter Verwendung von einem Millipore Filter-GS-Typ zur Herstellung einer keimfreien Lösung. 1 g Filtrat wird in eine Ampulle von 10 ml Kapazität gegeben und lyophilisiert. Man erhält eine gefrier-

I W ~t W ^S N^

getrocknete Injektion, die 30 mg BMG162-aF2-Hydrochlorid enthält.

Beispiel 5

Ein Granulat

50 Gew.Teile des in Beispiel 1 erhaltenen BMGi62-aF2-HydroChlorids, 600 Gew.Teile Lactose, 330 Gew.Teile kristalline Cellulose und 20 Gew.Teile Hydroxypropylcellulose werden gut vermischt, unter Verwendung einer Walzenkomprimiervorrichtung (Roller-Compactor^ ' komprimiert und unter Granulatbildung zerkleinert, welches auf eine Größe zwischen 16 und 60 Mesh (1,00 bis 0,25/um) gesiebt wird.

Beispiel 6

Eine Tablette

30 Gew.Teile des in Beispiel 1 erhaltenen BMGi62-aF2-HydroChlorids, 20 Gew.Teile kristalline Lactose, 147 Gew. Teile kristalline Cellulose und.3 Gew.Teile Magnesiumstearat werden unter Verwendung eines V-Form-Mischers vermischt, wobei Tabletten mit einem Gehalt von 300 mg BMGi62-aF2 erhalten werden.

Leerseite

Claims

Patentansprüche

3. Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibiotikums BMGi62-aF2, dadurch gekennzeichnet-, daß man einen BMGi62-aF2 erzeugenden Stamm, der zum Genus Bacillus gehört, in einem Kulturmedium unter Bildung und Akkumulation von BMGi62-aF2 züchtet und dann aus der Kultur das Antibiotikum BMGi62-aF2 der Formel

NHo

NH OH NH

CH-OH ■ CO-NH-(CH₂)₄-NH-(CH₂)

isoliert.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als BMGi62-aF2 erzeugenden Stamm Bacillus laterosporus BMG162-aF2, FERM-P 5230, ATCC 31932* verwendet. '

5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeich

net, daß das Kulturmedium ein Kulturmedium ist, welches Stickstoffquellen, Kohlenstoffquellen und anorganische Salze enthält.

6. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Züchtung aerob in einer flüssigen Kultur bei 15 Ms 40°C, bei einem pH-Wert von 5,0 bis 8,2 während einer Zeit durchgeführt wird, die ausreicht, eine ausreichende Menge an BMGi62-aF2 zu akkumulieren.

7. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Gewinnung von BMGi62-aF2 aus dem Kulturmedium mittels einer Säulenchromatographie unter Verwendung eines schwachen kationischen Ionenaustauscherharzes mit Carbonsäuregruppen als aktive Gruppen stattfindet.

8; Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das an dem Harz adsorbierte BMGi62-aF2 mit einer wäßrigen Säurelösung oder einer wäßrigen Salzlösung * eluiert wird.

9. Antitumormittel, dadurch gekennzeichnet, daß es eine pharmakologisch wirksame Menge des Antibiotikums BMGi62-aF2 der Formel

NH₂

^C-NH-(CH₀),-CH-CH--CO NH OH NH

CH-OH
C0-NH-(CH₂)₄-NH-(CH₂)₃-NH₂

oder eines seiner pharmazeutisch annehmbaren Salze und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger enthält.

10. Mittel nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Anteil an Antibiotikum BMGi62-aF2 und dem Träger

0,1 bis 70 Gew. % bzw. 99,1 "bis J50 Gew.% beträgt.

11. Mittel nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es in einer für die Injektion geeigneten Form, als Pulver, als Granulat, als Tabletten oder als Suppositojpien vorliegt.

12. Arzneimittel für die Injektion, dadurch gekennzeichnet, daß es 0,1 bis 95,0 Gew.% des Antibiotikums BMGi62-aF2 der Formel

c.·

C-NH-(CHoK-CH-CHp-CO NH OH NH

CH-OH

CO-NH-(CH₂)₄-NH-(CH₂)₃-NH₂

oder eines seiner wasserlöslichen .Salze, 5»0 bis 99,9 Gew.% Zucker und 0 bis 94,9 Gew.% Natriumchlorid enthält.

13. Mittel nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß es als Zucker Mannit enthält,

14. Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels für die Injektion, dadurch gekennzeichnet, daß man 0,1 bis 95,0 Gew.Teile des Antibiotikums BMGi62-aF2 der Formel

C-NH-(CH₅)/-CH-CH₉-CO

Il C. H- , C. t

NH OH NH

CH-OH

CO-NH-(CH₂)₄-NH-(CH₂)₃-NH₂

oder eines seiner wasserlöslichen Salze, 5,0 bis 99,9 Gew.Teile Zucker und 0 bis 94*9 Gew.Teile Natriumchlorid in destilliertem Wasser löst, die entstehende Lösung in einen kleinen Behälter gibt und dann die Lösung lyophilisiert.

N-* r ν τ v w v

Zaidan Hojin Biseibutsu XagaKu Renkyu" Kai

nachgereichtJ

15· Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß man als Zucker Mannit verwendet.