DE2455992C3

DE2455992C3 - methoxy-3-thiosulfatomethyl-3- cephem-4carbonsäure

Info

Publication number: DE2455992C3
Application number: DE2455992A
Authority: DE
Inventors: Shigeharu Inoue; Michio Tokio Kojima; Yasumitsu Kondo; Taro Niida; Yasuaki Ogawa; Kazuo Fujisawa Saito; Takashi Shomura; Hiroshi Watanabe; Yujiro Yamada; Kanagawa Yokohama
Original assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Current assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Priority date: 1973-11-28
Filing date: 1974-11-27
Publication date: 1978-08-10
Also published as: JPS5341233B2; GB1481529A; FR2252101B1; FR2252101A1; DE2455992B2; DE2455992A1; US4010155A; US4076588A; JPS5082291A; CA1028263A

Description

COOH einschließlich der nicht toxischen, pharmazeutisch akzeptablen Salze derselben.

Z Verfahren zur Herstellung der Alkalimetallsalze der Verbindung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Stamm von Streptomyces chartreusis, der unter der Bezeichnung FERM-P Na 2348 beim japanischen »Fermentation Research Institute« hinterlegt worden ist. in einem Kulturmedium, welches assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, unter aeroben Bedingungen in Gegenwart eines Alkalimetallthiosulfates bei einer Temperatur von 70 bis 37° C in 2 bis 6 Tagen züchtet und das in der Kultur angereicherte Alkalimetallsalz der Verbindung gemäß Anspruch 1 nach üblichen Methoden abtrennt.

30

Die Erfindung betrifft 7,3-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-7-<x-methoxy-3-thiosul. itomethyl-3-ce-

phem-4-carbonsäure (1), welche eine antibakterielle Wirkung hauptsächlich gegen gramnegative Bakterien entfaltet sowie ein Verfahren zur Herstellung dieses Antibioticums durch Züchtung eines Mikroorganismus, der zu einem Stamm der Gattung Streptomyces gehört. Die Anmelderin hat festgestellt, daß sich eine Substanz, die vorwiegend gegen gramnegative Bakterien eine antibakterielle Wirkung entfaltet, bildet und in der Kulturbrühe anreichert, wenn man einen Stamm der Gattung Streptomyces, der aus einer Bodenprobe aus Shimane Prefecture, Japan isoliert worden ist, züchtet Es ist jetzt gelungen, diese antibakterielle Substanz nach dem Züchten unter aeroben Bedingungen aus der Kultur zu isolieren und sie zu reinigen. Bei der Prüfung der chemischen, physikalischen und biologischen Eigenschaften der isolierten Substanz konnte festgestellt werden, daß es sich dabei um ein neues Antibiotikum handelt. Bei der weiteren Prüfung der neuen Substanz konnte dann festgestellt werden, daß ihr folgende chemische Struktur zukommt:

OCH₃

HOOC—CH-(CHz)₃-CO-NH NH₂

-Sv

^J—CH₂-S-SO₃H
COOH

Gegenstand der Erfindung ist infolgedessen 7/?-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-7-«-methoxy-3-thiosulfatomethyl-3-cephem-4-carbonsäure der vorstehenden Formel (I) einschließlich der nichttoxischen, pharmazeutisch akzeptablen Salze derselben. Diese Salze können 50 Formel dargestellt werden: in Form von Carboxylaten-Thiosulfaten vorliegen,

wobei das nichttoxische Kation aus Natrium, Kalium, Lithium, Ammonium oder Erdalkalimetallen wie Calcium oder Magnesium bestehen kann. Als Alkalimetallsalz oder Ammoniumsalz kann (J.) durch folgende

OCH₃

HOOC CH—(CH₂)₃ — CO—NH

NH₂

(H)

In der vorstehenden Formel (II) bedeutet Me ein Alkalimetallkation wie Natrium oder Kalium oder Ammonium. 1 (in Form der freien Säure) vermag auch Säureanlagerungssalze mit organischen Basen wie Aminen zu bilden. Für die Bildung von Säureanlagerungssalzen mit (I) kommen beispielsweise folgende Amine in Frage: Moroalkylamine wie Äthylamin. Isopropylamin, n-Butylamin, Isobutylamin und Äthylendiamin; Dialkylamine wie Diäthylamin, Di-n-butylamin, Di-iso-butylamin; tertiäre Alkylamine wie Trimethylamin, Triäthylamin; Arylamine wie Benzylamin und Tribenzyläfnin Und heterocyclische Amine wie Mörphölinund Piperidin.

Zur weiteren Erläuterung der Erfindung wird nun auf die Zeichnungen verwiesen. In diesen Zeichnungen bedeutet

Fig. 1 ein Infrarot-Absorptionsspektrum des Natriumsalzes des Antibioticums I, tablettiert in Kalium-

bromid,

F i g. 2 ein kernmagnetisches Rosonanz-Absorptionsspektrum des Natriumsalzes von I in Deuteriumoxid, gemessen bei 100 MHz.

Das erfindungsgemäße Antibioticum I (in Form der freien Säure) weist folgende Eigenschaften auf: es handelt sich um eine schwachgelbgefärbte pulverförmige Substanz, die in Wasser löslich, von saurer Natur und bei Temperaturen über 50°C verhältnismäßig instabil ist Das Natriumsalz (in der Carboxylat-Thiosulfat-Form) weist folgende physikalische und chemische Eigenschaften auf:

1) Aussehen:

farbloses Pulver

2) Schmelzpunkt:

Die Substanz besitzt keinen klaren Schmelzpunkt. Es wird in der Nähe von 140°C feucht, verfärbt sich dann langsam bräunlich und zersetzt sich schließlich b«i 160 bis 165° C.

3) Löslichkeit in Lösungsmitteln:

leicht löslich in Wasser, schwach löslich in gebräuchlichen organischen Lösungsmitteln.

4) Spezifische Drehung:

[<x]? = +36°(cl,0,H₂O).
5)Ultraviolett-Absorptionsspektrum:

Eine wäßrige Lösung zeigt einen Absorptions-Peak bei 266 um (E]?.= 165).

6) Infrarot-Absorptionsspektrum:

Die Kurve des Spektrums ist in F i g. 1 (tablettiert in Kaliumbromid) dargestellt. Eine Bande bei 1750cm-' ist dem /J-Lactam zuzuordnen und die Banden bei 1210 und 1025 cm -' der Thiosulfatgruppe.

7) Farbreaktion:

positiv gegenüber Jod, Ninhydrin und Kaliumpermanganat.

8) Elementaranalyse:

gefunden:
C 37,62, H 456, N 7,36, O 35,25, S 10,67%.

9) Molekulargewicht und im Molekül enthaltene Elemente:

Molekulargewicht 550, bestimmt nach der Titrationsmethode. Im Molekül liegen die Elemente Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff, Sauerstoff, Schwefel und Natrium vor.

10) Rf-Wert:

Bei der Silikage'-Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von »Kieselgel F254« (das ist ein Handelsprodukt der Firma Merck, Deutschland) als Silikagel. erscheint ein einzelner Fleck bei Rf 0,17, wenn zum Entwickeln ein Gemisch aus n-Butanol-Essigsäure-Wasser (2:1 : 1) verwendet wird und bei Rf 050, wenn zum Entwickeln n-Butanoi-Essigsäure-Methanol-10%iges wäßriges Ammoniumacetat-Wasser (8:2:2:1 :4) verwendet wird. Bei der Dünnschiciitchromatographie unter Verwendung von Aluminiumoxidplatten-Zellulose (ein Handelsprodukt der Firma Merck. Deutschland) erscheint ein einzelner Fleck bei Rf 0,33, wenn mit n-Butanol-Essigsäure-Wasser (2:1 : I) entwickelt wird.

11) Kernmagnetisehes Resonan7-Spektrum:

Die Kurve des Spektrums, gemessen in einer Lösung in Deuteriumoxid bei 100 MHz ist in F ig. 2 dargestellt. Ein charakteristischer Peak bei d 4,02 einer Zweiprotonenintensität wird der Methylengruppe zugeordnet, die an die Thiosulfatgruppe gebunden ist.

12) Beständigkeit:

Die Substanz ist in saurem oder neutralem Medium beständig, dagegen weniger beständig in alkalischer Umgebung.

Zur weiteren Charakterisierung des Antibioticums I dient die Umwandlung in das N-Acylderivat, beispielsweise in das N-Äthoxycarbonylderivat, welches sich gewinnen läßt, wenn man I mit Äthoxycarbonylchlorid in wäßriger Lösung umsetzt, d. h. also der üblichen und ίο bekannten Prozedur der N-Äthoxycarbonylierung von Aminosäuren unterwirft.

Das Natriumsalz des N-Äthoxycarbonyl-Derivats von I besitzt einen Schmelzpunkt von 180° C (unter Zersetzung), [et] f +46° (c = 1,0. H₃O) und UV (Ä_mJ„ £1^)241 nm(105),269(140)(H₂O).

Elementaranalyse für CiaHijNjOijSjNaj:

Berechnet: C 34,0, H 3,5, N 6,6, S 15,1%:
gefunden: C 34,47, H 439, N 6,31%.

Das erfirrtJungsgemäße Antibioticum (I) zeigt das antibakterielle Wirkungsspektrum, v/elches in der folgenden Tabellle I angegeben ist. Die Mii;dest-Hemmkonzentrationen (M.I.C.) des Natriumsalzes gegenüber verschiedenen Mikroorganismen wurden nach der bekannten Brühenverdünnungsmethode bestimmt: die Bestimmung erfolgte nach 24stündiger Bebrütung bei 37° C unter Verwendung verschiedener Bebrütungsmedien entsprechend den folgenden Angaben.

' Tabelle I

Antibakterielles Wirkungsspektrum des Antibioticums I (Natriumsalz)

35 Geprüfter Mikroorganismus	M I. C.	Bebrü-
		tungs-
		medium
	(mcg/ml)
⁴⁰ Vibrio percolans ATCC 8461	0,39	1
Alcaligenes faecalis ATCC 8750	6,25	1
Proteus vulgaris	25	1
Escherichia coli	100	1
Salmonella typhi	3.1?	1
⁴⁵ Xanthomonas oryzae	50	2
Micrococcus lysodeikticus	25	1
Bacillus stearothermophilus	25	3
Bacillus subtilis ATCC 6633	>200	1
Staphylococcus aureus 209 P	>20ü	1

In der vorstehenden Tabelle weisen die Zahlen in der letzten Spalte auf folgende Bebrütungsmedien hin:

1 = Bouillon-Medium;
2 = Natriumglutamat-Medium:
3 = Glukose-Trypton-Medium.

Aus der vorstehenden Tabelle I geht deutlich hervor, daß das erfindungsgemäße Antibioticum eine starke

_hn antibakterielle Wiikung vorwiegend gegen gramnegative Bakterien aufweist.

Aus Versuchen zur Bestimmung der akuten Toxizität durch intravenöse Verabreichung hai sich ergeben, daß das erfindungsgemäße Antibioticum eine geringe

(,-, Toxizität besitzt. Bei einem Versuch, bei welchem das Natriumsalz intravenös Mäusen injiziert wurde, überlebten alle Mäuse bei Dosierungen von 100 bis 200 mg/kg.

Der technische Fortschritt, der mil der Erfindung erzielt werden kann, liegt in der Auffindung neuer und wertvoller Antibiotica. für die ein dringender Bedarf besteht, weil bekanntermaßen in den letzten |ahrcn viele drogcnresistcnte Bakterien entstanden sind, die gegen die verschiedenen bekannten Aniibiotiea rcsislent sind, so dall neue Antibiotics erforderlich sind, die auch gegen solche drogenresistcnten Bakterien wirksam sind. Die Überlegenheit der erfindungsgemäßen Substanzen geht aus Vcrglcichsversuchen hervor, die nachfolgend tabellarisch zusammengestellt sind.

(Ergebnisse von Vcrglcichsversuchen)

Testorganismus

Klebsiella pncumonkic')

'roteus mirabilis')

'roteus mirahilis)

'roteus vulg.iris')

"'roteus vuigaris')

'roleus niorganiP)
Salmonella lyphimurium LT-2

Bemerkungen:

Hrfindungs-

BemäUe

Verbindung

25

3.2 12,5

3,2

(O

6,3

Mindesthcmmkon/entration ()/ml)
(IX Cl-I»-H Cl-T

12,5

Ein resistenter Stamm mit starker l'enieillinascwirkung. Kin resistenter Stamm mit schwacher l'enicillinasewirkung. Ein resistenter Stamm mit mäßiger Cephalosporinasewirkung. Ein resistenter Stamm mit schwacher Cephalosporinasewirkung. Ein resistenter Stamm mit starker Cephalosporinasewirkung Cl/

2(X)	6.3	3,2
1,6	25	25
400	4(X)	12.5
KK)	KX)	25
12,5	ii,3	■» -»
800	4(X)	25
6,3	0,8	0,8

Verglcichsvcrbimlungen: CKX ' Cefoxilin; CKP-B - Cephalosporin C-thiosulfatsalz; CET MCC ^ 7-Methoxycephalosporin C.

MCC
12,5

Ccfalotin; CV.'/. Ccfazolin:

Das erfinJungsgcmäßc Antibioticum kann hergestellt werden, indem man einen Stamm von Streptomyces chartreusis unter aeroben Bedingungen in der Art züchtet, wie dies bei der 1 lerstcllung auch der bekannten Antibiotica üblich, ist. die im allgemeinen durch Züchtung bekannter Stämme der Gattung Streptomyces erfolgt. Gegenstand der Erfindung ist infolgedessen auch das Verfahren zur Herstellung der Alkalimetallsalze der 7,^I?-(D-5-carboxyvaleramido)-7-ix-methoxy-3-thiosulfatomethyl-3-cephem-4-carbonsäure. welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen Stamm von Streptomyces chartreusis. der unter der Bezeichnung FERMP No. 2348 beim japanischen »Fermentation Research Institute« hinterlegt worden ist, in einem Kulturmedium, welches assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, unter aeroben Bedingungen in Gegenwart eines Alkalimetallthiosulfates bei einer Temperatur von 20 bis 37⁰C in 2 bis 6 Tagen züchtet und das in der Kultur angereicherte Alkalimetallsalz der Verbindung I nach üblichen Methoden abtrennt.

Der Stamm Streptomyces chartreusis FERM-P No. 2348 weist folgende Eigenschaften auf:

Morphologische Beobachtung: Luftmycelia werden reichlich auf Stärke-Agar. Hefe-Malz-Agar und Hafermehl-Agar erzeugt: die Bildung von Sporen ist reichlich.

Das Myccl erzeugt einästige (monopodiale) Verzweigungen, jedoch keine schneckenförmigen Verwindungen. Das Luftmycel trägt an den Spitzen Spiralen (hauptsächlich offene Spiralen). Die Bildung so spezieller Strukturen wie Sclerotium wurde nicht beobachtet. Bei der elektronenmikroskopischen Beobachtung zeigte sich, daß die Oberfläche der Sporen stachelig ist. Die Sporen weisen eine elliptische bis ovale Form auf und haben normalerweise eine Größe von 0,5 bis 0,8 Mikron χ 0,8 bis 1.0 Mikron. Im allgemeinen werden reife Sporenketten mit mehr als 10 Sporen pro Kette erzeugt.

Kultur-Charakteristika auf verschiedenen Kulturmedien sind in der folgenden Tabelle Il zusammengestellt.

Tabelle II

Kulturmedium

Wachstum (Farbe auf der Rückseite)

Luftmycel

Lösliches
Pigment

Sucrose-Nitrat-Agar

Glucose-Asparagin-Agar

schwachgelblichbraun bis gelblichbraun

cremefarbig bis schwachgelblichbraun

weiß bis graustichigweiß

knaDD. weiß

schwachbemsteinfarbig,
unbeeinflußt
durch den pH

keins

Kulturmedium

W iii-littum
(Farbe iiul" tier
Rückseite!

Glycerin-Asparagin-A gar ge I hl ic here mein rbig
Sliirkc-Agar gut. gelblichbraun

Hafcrmehl-Agiir

Niihr-Agar
Tvrnsin-Auar

KartolTel-Abschnitt

gut. gelblichcrcmc-

fiirbig

gut. tiefbraun

schwach, farblos gut. dunkelbraun bis schwarz

erhaben, gelblichbraun

l.liltniycel

knapp, weiß

reichlich, graustichigblau bis grünstichigblau

reichlich, blaustichiggrau

reichlich, graustichigblau bis grünstichigblau
keins

reichlich, graustichigblau

weil.!

Lösliches
l'igmont

keins
kcins

keins

braun.

unbeeinflußt
durch den pH

keins
braun,

unbeeinflußt
durch den pH
kcins

Zur Beachtung:

Die Behrülungslcmpcratur betrug durchschnittlich 28 ( soweit nicht etwas anderes angegeben ist.

Physiologische F.igenschaf ten:

1) Wachstumstemperaturbcreich: der Stamm FERM-P-2348 wächst in einem Temperaturbereich von IO bis 42^CC auf einem Hefc-Malz-Agar-Mcdium.

2) Verflüssigung von Gelatine: Gelatine wird bei der Bebrütung bei 20^cC in 30 Tagen leicht verflüssigt.

3) Stärkehydrolyse: positiv (intensiv bei 28° C).

4) Koagulation von Magermilch: positiv bei 37°C, negativ bei 28⁰C.

5) Peptonisierung von Magermilch: positiv bei 37°C. ebenfalls positiv bei 28" C.

6) Chromogenizität:positiv

Ausnutzung der Kohlenstoffquellen
(geschätzt in Pridham-Gottiebs Agar-Medium)

D-Glucose, D-Fructose. D-Mannitol. D-Xylose.

L-Arabinose, I-Inositol. Rhamnose, Sucrose

und Raffinose werden alle für das Wachstum

verwendet.

Entsprechend den Vorschriften von I.S.P. (International Streptomyces Project), in welchen auf die Veröffentlichungen in »International Journal of Systematic Bacteriology« Bd. 18, Seiten 69-189 und 279-392 (1968); Bd. 19, Seiten 391 -512 (1969) und Bd. 22, Seiten 265—394 (1972) bezug genommen wird, sowie unter Berücksichtigung der Vorschriften von B e η η e 11 (W.H. Trejo & R. E Bennett: »Journal of Bac teriology«, Bd. 85, Seiten 675-690 [1963]) kann gesagt werden, daß der Stamm FERM-P-2348 unter den verschiedenen Mikroorganismen der bekannten Art Streptomyces chartreusis am nächsten kommt. So deckt sich der Stamm FERM-P-2348 mit der bekannten Art Streptomyces chartreusis nicht nur vollständig hinsichtlich der Bildung von Spiralen und stacheligen Sporen, der Bildung von Luftmycel mit bläulicher Farbe und der Bildung eines melaninähnlichen Pigments als Charakteristika dieser beiden Arten, sondern auch hinsichtlich der Farbe des Wachstums und der Ausnutzung der Zucker. Wird der Vergleich weiter in die Einzelheiten κι geführt, so erkennt man, daß Unterschiede dahingehend bestehen, daß der Stamm FERM-P-2348 ein lösliches, bernsteinfarbiges Pigment auf Sucrose-Nitrat-Medium und ein lösliches braunes Pigment auf Tyrosin-Medium erzeugt, während die bekannte Art Streptomyces

r, chartreusis auf den beiden genannten Medien kein lösliches Pigment bildet.

Es dürfte folglich sinnvoll sein, den Stamm FERM-P-2348 als Stamm der bekannten Art Slreptomyces chartreusis zu identifizieren, weil er hinsichtlich der

an grundlegenden Eigenschaften mit diesen zusammenfällt, obwohl einige Abweichungen zu beobachten sind. Der neue Stamm ist bei der öffentlichen japanischen Hinterlegungsstelle »Fermentation Research Institute«. Chiba-city, Japan unter der Hinterlegungsnummer FERM-P Nr. 2348 hinterlegt worden (eine Kultur des Stammes ist bei F.R.I, am 5. November 1973 eingegangen). Desgleichen ist der Stamm bei der »American Type Culture Collection«. Washington D.C., USA unter der ATCC Nr. 21 999 hinterlegt worden.

,ο Die Eigenschaften des Stammes FERM-P-2348 unterliegen leicht gewissen Veränderungen, wie dies auch bei den anderen Arten von Streptomyces zu beobachten ist. So bildet der Stamm FERM-P-2348 beispielsweise eine Variante oder Mutante, wenn er mit verschiedenen Mutagenen wie Ultraviolettstrahlen, Röntgenstrahlen, radioaktiven Strahlen, hochfrequenten Elektromagnetstrahlen oder Chemikalien behandelt wird. Alle natürlichen oder künstlichen Varianten oder Mutanten des Stammes FERM-P-2348 können ebenfalls

bo für die Erzeugung des Antibioticums gemäß vorliegender Erfindung verwendet werden, solange sie überhaupt die Fähigkeit zur Bildung des Antibioticums besitzen.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren können als Nährstoffquellen solche Substanzen verwendet werden, die auch üblicherweise zur Züchtung bekannter Stämme von Streptomyces herangezogen werden. Als Kohlenstoffquelle eignen sich beispielsweise Glucose, Stärke, Glyzerin, Sucrose, Stärkesirup, Melasse, Sojabohnenöl;

als Stickstoffquclle eignet sich beispielsweise .Sojabohnenmehl, Weizenkeime, Fleischextrakt, Pepton, getrocknete Hefe, Maisweichwasscr, lösliche pflanzliche Proteine, Ammoniumsulfat, Natriumnitrat. Falls erforderlich, können auch anorganische Salze, wie Calcium -, carbonat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid. Eisensulfiit. Nickelchlorid oder Phosphate dem Kulturmedium zugesetzt werden.

Ein AlkalimeUlUhiosulfat, wie Natrium- oder Kaliumthiosulfat oder auch Ammoniumthiosulfat. muß von in Anfang an in dem Kulturmedium vorhanden sein oder der Kulturbrühe nachträglich während der Züchtung zugesetzt werden. Es ist günstig, daß die Gesamtmenge des Alkalimetallthiosulfates, die in dem Kulturmedium vorhanden ist oder diesem zugesetzt wird, wenigstens 0,05 Gew.-%, bezogen auf das Kulturmedium, beträgt. Die optimale Konzentration an Alkalimctallthiosulfat kann durch Vorversuche bestimmt werden.

Zur Züchtung des Stammes FERM-P-2348 eignen

SICM KukmeiuiigMiieiliuucM ifi Flüssigkeit UiIu inSbcsün- i<i dere Flüssigkeits-Kultivierungsmethoden unter subinersen aeroben Bedingungen, die denen entsprechen, die auch für die Gewinnung bekannter Antibiotica herangezogen werden. Die Züchtung wird unter aeroben Bedingungen und bei einer Bebrütungstemperatur _>, zwischen 20 und 37°C durchgeführt. Für die kommer zielle Produktion des Antibioticums I oder die Produktion im Laboratoriumsmaßstab zieht man es jedoch häufig vor, die Züchtung bzw. Bebrütung bei einer Temperatur in der Nähe von 28°C vorzunehmen, m Unter diesen Bedingungen erreicht die Konzentration an Antibioticum I in der Kulturbrühe nach zwei- bis sechstägiger Fermentierung ein Maximum, und zwar sowohl bei der Schüttelkultivierung als auch bei der ruhenden Kultivierung in Tanks. r>

Zur Prüfung des erfindungsgemäßen Antibioticums wurde folgende Methode verwendet: das Prüfkulturmedium enthielt 1,0% Polypepton, 0.5% Fleischextrakt, 0.5% Natriumchlorid und 2,0% Agar (pH 7,0). Als Prüf-Mikroorganismus wurde Vibrio percolans ATCC >n 8461 verwendet. Bei dieser Priifmethode kann bei einer Konzentration von 25,0 mcg/ml bis 200 mcg/ml Antibioticum I das Verhältnis zwischen Logarithmus der Konzentration und Durchmesser der Hemmzone linear aufgetragen werden, so daß sich eine Hemmzone von 4-> 13,0 bis 24,3 mm im Durchmesser ergibt (bestimmt nach der Papierscheibenmethode).

Da das Antibioticum I (das Alkalimetallsalz), wie bereits weiter vorn angegeben, eine wasserlösliche Substanz ist, kann es aus der Kulturbrühe durch >o Adsorption an einem Anionenaustauscherharz abgetrennt werden (z. B. an einem Polystyrol, welches Amingruppen als funktioneile Gruppen enthält oder an einem Styrol-Divinylbenzol-Mischpolymerisat, welches quaternäre Ammoniumhydroxidgruppen als funktionel-Ie Gruppen enthält). Aus dem Harz wird das Antibioticum mit Hilfe einer wäßrigen Lösung eines geeigneten Salzes eluiert.

Zur Abtrennung des Antibioticums I in Form seines Natriumsalzes aus der Kulturbrühe kann man beispiels- ω weise das Kulturbrühenfiltrat durch eine Kolonne mit einem Anionenaustauscherharz (Cl-Zyklus) leiten, so daß das Antibioticum an dem Harz adsorbiert wird; anschließend wird die Harzkolonne mit Wasser gewaschen, worauf das Eluieren mit wäßrigem Natri- b5 umchlorid durchgeführt wird. Auf diese Weise ethält man das Natriumsalz des Antibioticums I als Rohprodukt, welches chromatographisch weiter gereinigt werden kann. Das Chromatographieren kann über Aktivkohle. Cellulose. Silikagel. Aluminiumoxid, mit Epichlorhydrin vernetztem Dextrangel oder anderen Molekularsieben erfolgen (z. B. einem Anionen austauschenden Molekularsieb, welches aus einem Dextrangel mit Diäthylaminogruppen als basischen funktionellen Gruppen besteht). Durch diese Behandlung erhält man das Antibioticum I in Form seines Natriumsalzes als reines Produkt in Form eines farblosen Pulvers.

Das erfindungsgemäße Antibioticum ist als antibakterielles Mittel sowie als Therapeutikum bei Geflügel, Tieren und Menschen verwendbar und eignet sich insbesondere zur Behandlung von Infektionen und infektiösen Krankheiten, die durch gramnegative Bakterien hervorgerufen werden. Das erfindungsgemäße neue Antibioticum kann bei den genannten Infektionskrankheiten sowohl örtlich als auch parenteral verabreicht werden.

Zur Behandlung der durch gramnegative Bakterien

LJ'lf I C

ii!!;c iies criip.iJ

g g

gemäßen Antibioticums verabreicht man dem infizierten Patienten eine ausreichende Dosis des Antibioticums I selbst oder eines nichttoxischen, pharmazeutisch akzeptablen Salzes desselben.

Ebenso wie das bekannte Antibioticum Cephalosporin (' ist das erfindungsgemäße Antibioticum SF-1623 ein brauchbares Ausgangsmaterial oder auch ein Zwischenprodukt für die Herstellung von neuen halbsynthetischen Cephalosporin-Derivaten.

Die nun folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.

Beispiel I

Die in einer Schlinge enthaltene Menge an Sporen von Streptomyces chartreusis FF.RM-P-2348 wurde zum Impfen von 500 ml eines flüssigen Bebrütungsmediums verwendet, welches 1.0% Sucrose und 3,0% Sojabohnenmehl (pH 7,0) enthielt; die Bebrütung erfolgte unter Schütteln bei 28°C in 24 Stunden. Das auf diese Weise erhaltene Inoculum wurde dann in 20 I eines Inkubationsmediums derselben Zusammensetzung eingeimpft, welches anschließend unter Belüftung und Rühren 20 Stunden bebrütet wurde, um so eine Impfkultur herzustellen. Diese Impfkultur wurde wiederum zum Impfen von 200 1 eines wäßrigen Kulturmediums verwendet, welches 1,5% Glyzerin, 1,5% Dextrin, 2,0% Sojabohnenmehl, 0,15% Calciumcarbonat und 0,05% Natriumthiosulfat enthielt (pH 7.0). Das geimpfte Kulturmedium wurde unter Belüftung und unter Rühren bei 28°C bebrütet, wobei ein Gärgefäß mit einem Fassungsvermögen von 3001 verwendet wurde. 24 Stunden und noch einmal 48 Stunden nach dem Beginn der Bebrütung wurde eine sterile wäßrige Lösung von 25%igem Natriumthiosulfat in einer Menge von 0,15 bzw. 0,2 Gew.-% dem bebrüteten Kulturmedium zugesetzt Nach 72stündiger Bebrütung wurde die Kulturbrühe filtriert; auf diese Weise erhielt man 155 1 Kulturbrühenfiltrat mit einer Potenz von 80 mcg/ml.

Das Brühenfiltrat (pH 8,0) wurde durch eine 15-1-Kolonne mit einem synthetischen Adsorber geleitet, um das Filtrat zu entfärben. Die aus der Kolonne ausströmende Flüssigkeit (1501) wurde durch eine 7-1-Kolonne mit einem Anionenaustauscherharz (Polystyrol, welches Amingruppen als funktionelle Gruppen enthält; Cl-Zyklus) geleitet, so daß die aktive Komponente, d. h. das Antibioticum I an dem Anionenaustauscherharz adsorbiert wurde. Anschließend wurde die Harzkolonne mit Wasser gewaschen und dann mit 0,5-m

wäljrigtin Natriumchlorid eluiert. Der Vorlauf (5 I) des Eluates wurde verworfen, und cric danach ablaufende Menge von 25 I wurde über eine Kolonne mit 2,5 I Aktivkohle geleitet, so daß die aktive Komponente von der Aktivkohle adsorbiert wurde. Die KoKlekolonne wurde mit Wasser eluiert, und das entsalzte v. äßrige Eluat von der Kohlekolonne (101) wurde anschließend durch eine Kolonne mit 500 ml eines schwach basischen Dextran-Anionenaustauschers, der Diäthylaminoäthylgruppen als funktioneile Gruppen enthält (Cl-Zyklus) geleitet, so daß das Natriumsalz des Antibioiicums I an der Kolonne adsorbiert wurde. Die Kolonne wurde dann mit Wasser gewaschen, worauf das Eluieren mit 0,1-m wäßrigem Natriumchlorid durchgeführt wurde. Das Eluat wurde in 20-ml-Fraktionen aufgefangen. Die aktiven Fraktionen (die Fraktionen 71 bis 180) wurden vereinigt und ergaben eine Gesamtmenge von 2.2 I. Diese Gesamtmenge wurde unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft, wobei man 42 g pulverförmiges Rohprodukt des Antihintiriims I in Form des Natriumsalzes mit einer Potenz von 280 mcg/ml erhielt. Dieses pul crförmige Rohprodukt (1,2 g) wurde in 3 ml Wasser gelöst; die entstandene Lösung wurde durch eine Kolonne mit 50 ml eines schwach basischen Dextran-Anionenaustauschers, der Diäthylaminoäthylgruppen als funktionelle Gruppen enthält (Cl-Zyklus) geleitet. Die Kolonne wurde dann mit 250 ml Wasser gewaschen und anschließend mit 0,05 m wäßrigem Natriumchlorid eluiert. Das Eluat wurde in 15-ml-Fraktionen aufgefangen. Die Fraktionen Nr. 74 bis 109 wurden vereinigt und ergaben eine Gesamtmenge von 600 ml. Diese Gesamtmenge wurde über eine Kolonne mit 60 ml Aktivkohle geleitet, so daß die aktive Substanz von der Kohle adsorbiert wurde. Die Kohlekolonne wurde mit Wasser gewaschen und mit 500 ml 60%igem wäßrigem Aceton (d. h. Wasser, welches 60 Volumprozent Aceton enthielt) eluiert. Das Eluat wurde unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt, wobei man ein farbloses Pulver des Natriumsalzes des Antibioticums I erhielt, und zwar in einer Ausbeute von 310 mg.

Beispiel 2

1,5 g des gemäß Beispiel 1 erhaltenen Rohproduktes des Natriumsalzes des Antibioticums I wurden in 4 ml Wasser aufgenommen. Die erhaltene wäßrige Lösung wurde durch eine Kolonne mit 300 ml eines Dextran-Molekularsiebgels geleitet. Die Molekularsiebkolonne wurde anschließend mit Wasser eluiert, wobei das Eluat in 10-ml-Fraktionen aufgefangen wurde. Alle aktiven Fraktionen wurden mit Hilfe der Silikagel-Dünnschichtchromatographie (unter Verwendung von 2:1:1 n-Butanol-Essigsäure-Wasser als Entwicklungslösungsmittel) geprüft Die aktiven Fraktionen (Nr. 12 bis 16), die einen E'.nzelfleck (bei der Anfärbung mit Ninhydrin) ergaben, wurden vereinigt; die vereinigten Lösungen wurden unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft Man erhielt auf diese Weise in einer Ausbeute von 147 mg das Natriumsalz des Antibioticums I in Form eines farblosen Pulvers.

Beispiel 3

Die in einer Schlinge enthaltene Menge an Sporen von Streptomyces chartreusis FERM-P-2348 wurde in 500 ml eines flüssigen Mediums, welches 1,0% Stärke und 3,0% Sojabohnenmehl enthielt (pH 7,0), eingeimpft; das geimpfte Medium wurde unter Bewegung 30 Stunden bei 25° C bebrütet Die so gewonnene Kultur wurde als Impfkultur verwendet.

Diese Impfkultur wurde in 201 eines flüssigen Kulturmediums, welches 2,0% Dextrin, 1,0% Sucrose, 2,0% Sojabohnenmehl, 0.5% Maisweichwasser, 0,15% ϊ Calciumcarbonat, 0,05% Dikaliumphosphat und 0.2% Natriumthiosulfat enthielt (pH 7,0), eingeimpft: das geimpfte Kulturmedium wurde bei 28"C ur.ier Belüftung und Bewegung (unter Verwendung eines Gärkolbens mit einem Fassungsvermögen von 30 1) bebrütet.

in Am Ende der 50stündigen Bebrütungszeit wurde eine sterile wäßrige 25%ige Natriumthiosulfatlösung in einer Menge von 0,2% (Gewichtsprozent) der Kulturbrühe zugesetzt. Die Bebrütung wurde dann bis zu einer Gesamtdauer von 90 Stunden fortgesetzt. Danach

i> wurde die Kulturbrühe filtriert; man erhielt 1 ^ri I Brühenfiitrat mit einer Potenz von 65 mcg/ml.

Das so gewonnene Brühenfiitrat (pH 7,8) winde durch eine 1.5-1-Kolonne mit Aktivkohle geleitet, so daß die aktive Komponente, d. h. das Natriumsal/. des Antibioti-

¹H cums I. an der Kohle adsorbiert wurde. Die Kohlekolonne wurde mit Wasser gewaschen. Der Vorlauf (1,2 I) der ausströmendrn wäßrigen Lösung wurde verworfen; clic danach abfließende Menge (4,51) wurde durch eine 250-ml-Kolonne mit einem Anionenaustauschcrharz

i- (Styrol-Divinylbenzol-Mischpolymerisat, welches

quaternäre Ammoniumhydroxidgruppen als funktioneile Gruppen enthält) Cl-Zyklus. Feinheit entsprechend einem Prüfsieb mit etwa 450 bis 1.600 Maschen pro cm-', geleitet, so daß die aktive Komponente an dem Harz

in adsorbiert wurde. Die Harzkolonne wurde mit Wasser gewaschen und anschließend mit 0.5-m wäßrigem Natriumchlorid eluiert. Das Eluat wurde in 100 ml Fraktionen aufgefangen Die Fraktionen Nr 7 bis IO wurden vereinigt, und die vereinigten Lösungen (900 ml)

r, wurden entsalzt, indem man sie durch eine 90 ml Kolonne mit Aktivkohle leitete. Die aus der Kohlckolonne ausfließende Lösung wurde unter vermindertem Druck auf ein Volumen von 50 ml reduziert. Das entstandene Konzentrat wurde zweimal in derselben Weise wie in Beispiel 1 beschrieben chromatographisch mit einem schwach basischen Dextran-Anionenaustauscher (Cl-Zyklus) behandelt, wodurch man das Natriumsalz des Antibioticums 1 als farbloses Pulver in einer Ausbeute von 390 mg erhielt.

Beispiel 4

Das pulverförmige Rohprodukt (190 mg) des Natriumsalzes des Antibioticums I, welches gemäß Beispiel 1 erhalten worden war, wurde in 2 ml Wasser gelöst: die Lösung wurde durch eine Kolonne mit einem stark saueren Kationenau.->tauscher (H* Typ), welche eine Abmessung von 1,4 Mal 3 cm hatte, geleitet.

Die abfließenden sauren Lösungen und die Waschwasser wurden vereinigt und 3mal mit je 30 ml n-Butanol extrahiert; die verbleibende wäßrige Schicht wurde lyophilisiert, wodurch man 50 mg eines schwach gelben Pulvers erhielt. Dieses Pulver konnte als das Antibioticum I in Form der freien Säure identifiziert

e,o werden. Die Substanz besaß keinen definierten Schmelzpunkt, zersetzte sich jedoch bei 75 bis 80° C.

Beispiel 5

t,5 Der Versuch von Beispiel 3 wurde wiederholt, wobei jedoch Kaliumthiosulfat anstelle von Natriumthiosulfat und Kaliumchlorid anstelle von Natriumchlorid verwendet wurden.

24 55 13	992	14
Durch Entsalzen des O^-m-Kaliumchlorid-Eluales von der Dextran-Anionenaustauscher-Kolonne mit Aktivkohle und anschließendes Verdampfen des Lö sungsmittels konnte ein gelbliches Pulver gewonnen werden, welches aus dem Kaliumsalz des Antibioticums 5		I bestand. Die Ausbeute beil· Kaliumsalz entspricht der weiter Formel II, wenn Me K bedeul zersetzte sich bei einer Temperat 175°C
	Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

I. 7^-{D-5-Ainino-5-carboxyvaleramido)-7-in-methoxy-3-thiosulfatomethyl-3-cephem-4-carbonsäure der Formel

OCH₃ HOOC-CH- (CH₂J₃-CO-NH-I f

NH,

CHi S SOiH