DE2140674C3 - Mocimycin (Antibiotikum MYC 8003), seine Salze, Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung als Futtermittelzusatz - Google Patents

Mocimycin (Antibiotikum MYC 8003), seine Salze, Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung als Futtermittelzusatz

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DE2140674C3
DE2140674C3 DE19712140674 DE2140674A DE2140674C3 DE 2140674 C3 DE2140674 C3 DE 2140674C3 DE 19712140674 DE19712140674 DE 19712140674 DE 2140674 A DE2140674 A DE 2140674A DE 2140674 C3 DE2140674 C3 DE 2140674C3
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Description

\ OH
HO
OH
wiedergegeben werden kann, und seine Salze. *°
2. Verfahren zur Herstellung von Mocimycin (Antibiotikum MYC 8003) nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Mikroorganismen des Stammes Streptomyces ramocissimus CBS 190.69 oder nach üblichen Methoden daraus erhaltene, das Antibiotikum bildende Mutanten oder Varianten in einem wäßrigen, verwertbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und anorganische Salze enthaltenden Nährmediuni in an sich bekannter Weise züchtet und das entstandene Antibiotikum aus der Gärmaische durch Extraktion mit organischen Lösungsmitteln bei pH-Werten von etwa 5 bis 8 isoliert und gewünschtenfalls weiter reinigt und/oder in ein Salz überführt.
3. Verwendung des Antibiotikums NT1ZC 8003 gemäß Anspruch 1 als Futtermittelzusatz.
40
Die Erfindung betrifft den in den Ansprüchen gekennzeichneten Gegenstand. Die Bezeichnungen Mocimycin und Antibiotikum MYC 8003 sind beide in der Fachwelt eingeführt und werden in verschiedenen Publikationen benutzt. Der Strukturformel ist zu entnehmen, daß Mocimycin in drei miteinander in einem Gleichgewicht stehenden Tautomeren mit folgenden Grenzstrukturen vorkommen kann:
45 das ursprüngliche Gemisch gebildet. Die im Gleichgewicht vorkommenden Tautomeren können also zusammen als ein einziger Stoff betrachtet werden.
Das Antibiotikum der Erfindung ist eine schwache Säure und bildet Salze, z. B. Natrium-, Kalium-, Ammonium- und Aminsalze. Es hat folgende physikalische und chemische Eigenschaften:
Löslichkeit
Das Antibiotikum ist gut löslich in Chloroform. Methylisobutylketon, Essigsäurebutylester, Essigsäureäthylester, Aceton, Methanol und alkalischen Lösungen. Es ist wenig löslich in Tetrachlorkohlenstoff und Benzol und unlöslich in Diäthyläther, Petroläther, Wasser und sauren Lösungen.
Stabilität
Lösungen des Antibiotikums in 50% Methanol enthaltendem Wasser sind in einem pH-Bereich von 3 bis 12 bei 20' C etwa 4 Stunden stabil.
Die Lagerung des Antibiotikums in fester Form bei 25 und 37' C bei niedriger relativer Luftfeuchtigkeit führt in einem Zeitraum von mindestens 5 Monaten zu keinem Aktivitätsverlust. Bei einer Lagerung bei 25"C und 100% relativer Luftfeuchtigkeit ist es 3 Monate und bei 37"C und 100% relativer Luftfeuchtigkeit 2 Monate stabil.
Reaktionen auf funktionell Gruppen:
5° Reagens Ergebnis
O O
C) OH
- W-O
(III)
Die Tautomeren können chromatographisch getrennt werden, sind aber nicht stabil: es wild wieder (Proteine + Aminosäuren)
Konzentrierte Schwefelsäure Zersetzung und Rotfärbung
(11) 55 Aromatentest schwach positiv
(AICl3 + Chloroform)
Fehling-Reaktion negativ
(Aldehyde)
Tollens-Rcaktion negativ
(Aldehyde)
Molisch-Reaktion negativ
(Saccharide)
(IV) Anthron-Reaktion negativ
&5 (Saccharide)
Biuret-Reaktion (Proteine) negativ
Kolin L-Reaktion negativ
21
Fortsetzung
Reagens
Ergebnis
Pauly-Reaktion
(Aminosäuren + Phenole)
FeCl3-Reaktion
(Enole + Phenole)
Bromierung in CHCl3
Bromierung in Wasser
dunkelbraune Färbung
dunkelrote Färbung
und Trübung
negativ
Ausfällung auf Grund
von Säurebildung
Optische Drehung:
[«]" = -60° <c = 1
; Methanol).
Schmelzpunkt '5
Das Antibiotikum weist keinen scharfen Schmelzpunkt oder Schmelzbereich auf. Bei 135 C erfolgt Gasentwicklung, wobei die Verbindung erweicht. Bei etwa 152 C tritt wiederum Gasentwicklung auf. Bei 164 bis ί 74 C ist das Antibiotikum geschmolzen.
UV-Spektrum
Das Antibiotikum der Erfindung weist ein spezifisches Spektrum mit Absorptionsmaxima bei 233, 276.286 und 327 nm auf. Bei verschiedenen pH-Werten erhält man verschiedene Spektren, wie aus F i g. 1 ersichtlich ist. Die durchgezogene Linie dieser Abbildung stellt das Spektrum einer Lösung von 13 mg/1 des Antibiotikums in einem Gemisch aus gleichen Teilen Methanol und Wasser dar. Die gestrichelte Linie zeigt das Spektrum einer ähnlichen Lösung, bei der an Stelle von Wasser 0,5 n-Natriumhydroxidlösung verwendet wurde, während die punktierte Linie das Spektrum einer ähnlichen Lösung mit 0,5 η-Salzsäure an Stelle von Wasser zeigt.
Eine dünnschichtchroinatographische Auftrennung des Antibiotikums zeigt, daß es aus drei Verbindungen besteht, die im Gleichgewicht miteinander stehen. Das Chromatogramm mit einem Gemisch aus 12 Teilen Aceton, 8 Teilen Essigsäureäthylester und 1 Teil Wasser auf Kieselgel ist in F i g. 2 zu sehen, wobei die punktierte Linie den Start anzeigt.
1R-Spektrum
Das IR-Spektrum des Antibiotikums als Kaliumbromid-Preßling ist in Fig. 3 wiedergegeben. Die wichtigsten Absorptionsmaxima liegen bei 810, 860, 940. 980, 1090, 1215. 1355, 1455. 1540, 1650, 2930. 2970 und 3400 cm"1.
NMR-Spektrum
Das NMR-Spektrum des Antibiotikums ist in F i g. 4 wiedergegeben.
Tabelle A
Vergleich von MYC 8003 mit anderen Antibiotika
674 ψ
Das NMR-Spektrum wurde in einem Gemisch von Hexadeutero-dimethylsulfoxid und Deutero-Chloroform mit Tetramethylsilan als internem Standard mit einem 60-MHz-Kernresonanzspektrometer aufgenommen. Die A-Werte sind in ppm angegeben. Obwohl es bei dieser Auflösung nicht möglich ist, jedes Maximum mit einem Teil der Struktur in Zusammenhang zu bringen, können die folgenden Gruppierungen im Spektrum gefunden werden:
CH3 an gesättigtem Kohlenstoff, Λ 0,8—1,0
CH3 an doppelt gebundenem
Kohlenstoff 1,68—2,01
Singulett OCH3 3,18
Gesättigte CH und CH, nebst N
oder O * 3,2—4,5
H an doppelt gebundenem
Kohlenstoff 5,4—6,8
und 7.4
Amide NH 8,1
Das Maximum bei 7,73 ppm stimmt mit dem Signal von Spuren CHCI3 überein.
Elcmentaranalyse Tür C43H^0N2O,,
(durch Differenzbildung):
Berechnet ... C 63,8, H 7.6. N 3,5. O 25,1:
gefunden .... C 64,8, H 7.6. N 3,5. O 24.1.
Molekulargewicht
Die Molekulargewichtsbestimmung wurde durch isotherme Destillation durchgeführt. Eine Lösung des Antibiotikums in Aceton und eine Lösung von Azobenzol (als Standard) wurden getrennt in ein verschlossenes und evakuiertes System gebiacht. Wegen des unterschiedlichen Dampfdruckes über den Lösungen destilliert so lange Aceton über, bis Gleichgewicht erreicht ist und beide Lösungen gleiche Molariiät aufweisen. Das Verfahren wurde bei einer konstanten Temperatur von 23 C durchgeführt. Für das Antibiotikum wurde ein Molekulargewicht von 714 berechnet. Eine Lösung des Antibiotikums in einem Gemisch aus gleichen Teilen Wasser und Methanol wies bei Titration mit 0,1 η NaOH ein Neutralisationsäquivalent von 817 auf. Aus der Summenformel beträgt das Molekulargewicht 797.
Aus obigen Angaben läßt sich für Mocimycin, wie inzwischen gefunden wurde (vgl. Tetrahedron Letters 52 [1973], S. 5173 bis 5176), die in Anspruch 1 wiedergegebene Formel I ableiten.
Mocimycin unterscheidet sich, wie die folgenden Tabellen zeigen, von bekannten Antibiotika.
Antibioiikuni
MYC 8003
Erythromycin
Carbomycin
l.iteralurstdk·
DT-PS 9 20 934
I)T-PS 9 66 635
Natur Aussehen Elementare IJV-Maxi- Bemerkungen
Zusammen 111 um
setzung (nnii
Säure gelb N 3.5% 327
Base weiße N <2% 280
Kristalle
Base weiße N 1.5%
Kristalle
Fortsetzung
Antibiotikum Literaturstclle N, Kristalle wei ß lilenienlare 1. V-Miixi- Bemerkungen (nm) P-haltig Produkt Organismus Eigenschaften, bei Streptomyces 232
Zusammen- muin N 4,4% denen sich Unter ramocissimus 231
weiß selzung (C 45% < schiede zeigen
DT-OS 19 26 458 Base weiß DT-OS 17 17 111 Base weiß \N 8,9% Thiopeptin Süeptomyces Lufthyphen Normaler 245
Spiramycin atiir Aussehen DT-OS 19 29 355 Io 39,1% tateyamensis Querschnitt
Foromacidin Methobottromycin DT-OS 16 20027 N 13,8% Lufthyphen Spiralen 210 Anthron
DT-OS 18 00 363 Tabelle B Lufthyphen grau + Ninhvdrin
Prasinomycin Unterschiede ; Melaninbildung stark positiv + FeClj —
Taimycin DT-PS 10 19 052 Base weiß N 14,5% Methobottro- Sterptemyces Sporen oval 0.9 χ 1.3 μ 207 Mol. G. 1400
SF 767 DT-PS 1021 130 Base weiße S-haltig mycinamide: canadensis + Ninhydrin
S-haltig Amethobottro- MA-959 Stärkeagar hellgelb + Biuret
DT-OS 16 17 783 mycinamide lösliches Pigment 268 Ninhydrin
Tsushimycin DT-OS 17 70 558 wischen Streptomyces ramocissimus CBS 190.69 und anderen vegetatives hellgelb bis grau + Mol. G. 1600
Mikroorganismen Mycel
Druckschrift bzw. Nitratreduktion stark positiv-
Enduracidin ältere Patent Tsushimycin Streptomyces Sporen glatt Antibiotika bildenden
Thiopeptin anmeldung Z-237 Melaninbildung stark positiv
DT-OS Lufthyphen grau Organismus von Spalte 3
19 29 355 Lufthyphen primitive
Spiralen
SF-767-A; Streptomyces Sporen oval 0,9 χ 1,3 μ dick (charakteristisch)
SF-767-L microsporus
DT-OS ATCC 21 384 flüssige Kultur nur als ver keine Spiralen
16 20 027 zweigte Fäden weiß bis bräunlich
vvpiR
Lufthyphen grau W CiIJ
Czapek-Glycerin Kolonie hellgrau zylindrisch
Melaninbildung stark positiv LO X 1,7 μ
Taimycin Streptomyces- Sektion Spira cinereus hellbraun
michiganensis Gruppe stark positiv
DT-OS var. amylo- Melaninbildung stark positiv hellbraun
18 00 363 lyticus H2S-Bildung stark positiv
Carbomycin Streptomyces Melaninbildung stark positiv negativ
halstedii Glukose- kein Luftmycel stachlig
NRRL 2331 Asparagin-Agar —
DT-OS (nach oft bräunlich
19 26 458 Hütter*) gut entwickelte
synonym m. S. Spiralen
aureofaciens) rund 0,3—0,5 χ
0,5—0,7 α
auch stabförmig
(Nocardia-artig)
DT-OS blau
17 70 558 Kolonie dunkelgrün
—
Rectus flexibilis
DT-PS griseus
966 635 schwach
mäßig
—
reichliche Sporen
bildung, mausgrau,
bis dunkelgrüngrau
') H ü 11 e r. Systematik der Streptomyccten (1957).
Fortsetzung
Druckschrift b/w altere Patentanmeldung
DT-PS 920934
DT-PS 10 21
DT-OS 16 17
Produkt Organismus 1 igcnschaften. bei Streptomyces Organismus um Spalte 3
denen sich Unter ramocissimus
schiede /eigen
Erythromycin Streptomyces Sporen glatt (n. Hü t ler*)
erythreus Lufimycel aschgrau bis stachlig, zuerst
dunkelgrau gelbweiß oder gelb
grün, später rotbraun
oder hellgrau
Melaninbildung stark positiv
Foromacidin Streptomvces Substratmycel hellgrau bis gelbweiß bis goldgelt
A 8703 und hellbeige
A 9427 Kolonien auf hellgrau bis hellgelbrot bis
synthetischem sehr hellgelb dunkelbraun
Agar beige
Stärkeagar:
Wachstum gut schwach
Kolonien hellgelb bis grau rötlichgrau (A 8703)
braun (A 9427)
Hydrolyse stark schwach
Kartoffel Pigment kein Pigment
schwarzbraun
Nähr agar braunes Pigment kein Pigment
Prasinomycin Streptomyces H2S stark positiv
hirsutus u. NO3-Reduktion stark positiv —
Streptomyces Lufthyphen aschgrau bis grün
prasinopilosus Melaninbildung dunkelgrau
(nach stark positiv -
Hütter*)
synodym)
*l Hütte r. Systematik der Streptomyceten (1957).
Das mikrobiologische Wirkungsspektrum des Antibiotikums der Erfindung gegenüber einer Reihe von Mikroorganismen wurde durch die übliche Verdünnungsmethode bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle I wiedergegeben.
Tabelle I
Untersuchter Mikroorganismus
untersuchter Mikroorganismus Minimale 25 1.5
Hemm 25
konzentration 50 >100
(μ? ml) >100 >100
Bacillus subtilis ATCC 6633 5 >100 >100
Bacillus cereus ATCC 9139 0,3 >100
Staphylococcus aureus A 55 >100
(ATCC 6538 P) 25
Staphylococcus aureus A 321 25
Staphylococcus aureus A 355*)
Staphylococcus aureus L 160a*)
Streptococcus haemolyticus A 266
Streptococcus faecalis L 80
Micrococcus flavus A 54
Sarcina lutea ATCC 9341
Bruceila melitensis A 488
Pasteurella multocida A 723
Salmonella dublin P 43
Escherichia coli U 20
Escherichia coli H
Erwinia carotovora W 9
Pseudomonas aeruginosa L 94 Pseudomonas aeruginosa 2396**) Proteus rettgeri A 821
Proteus mirabilis H 3
Proteus mirabilis L 93
Proteus morganii 2241**)
Haemophilus influenzae A 773 Actinobacillus equuli T 3 Candida albicans A 7 Candida parapsilosis A 952 . Torulopsis glabrata A 420 Saccharomyces cerevisiae D 160 Trichophyton mentagrophytes R 177
Aspergillus niger D 184 Lactobacillus acidophilus D 218
Clostridium welchii A 738 Vibrio coli 1846
Streptococcus agalactiae A 732 Streptococcus disgalactiae A 730
Mycoplasma gallisepticum K 514
Minimale
Hemm-
konzentra
(ng. ml)
>!00
>100
>100 50 4 1,5
>100
>100
>100
>100
>100
>100
>100
100
etwa 0,
*) Bezeichnet Penicillinase bildende Mikroorganismen.
*) Bezeichne: kürzlich isolierten Krankenhausstamm.
Aus Tabelle 1 ist ersichtlich, daß das Antibiotikum eine hohe Aktivität gegen Mycoplasma gallisepticum, aber fast keine Aktivität gegen eine Anzahl von humanpathogenen Mikroorganismen aufweist. In vivo ist es gegenüber Mycoplasma gallisepticum nicht aktiv. Die Toxizität des Antibiotikums wurde an vei schiedenen Tieren untersucht. Die akute Toxizität ist sehr gering. Eine intraperitoneale Dosis von KX)O mg/kg ist für Mäuse nicht tödlich. Bei Ratten und Hühnern führt eine orale Verabreichung in Konzentrationen bis zu 0,1% des Futters über 2 Monate hinweg zu keinen unerwünschten pharmakologischen Wirkungen.
Es wurde festgestellt, daß das Antibiotikum der Erfindung besonders als wachstumsförderndes Mittel in der Tierzucht, z. B. von Rindern, Schweinen und Geflügel, wertvoll ist. Es kann auf übliche Weise, z. B. als Zusatz im Futter, verabreicht werden. Das Antibiotikum eignet sich auch zur Bekämpfung von Krankheiten, die von bestimmten Darmmikroorganismen, z. B. Vibrio coli oder Clostridium welchii, verursacht werden.
Versuchsbericht
Folgende Antibiotika wurden bisher als Fulteradditive in der Bundesrepublik zur Mästung von Vieh verwendet:
Additiv in Gramm pro Tonne Futter
(a| Oxytctracyclin Ferkel 30 ppm
Kälber 60 120 ppm
(b) Taomycin Ferkel 15 ppm
(el Chlortetracyclin Ferkel 30 ppm
Kälber 60--120 ppm
Schlacht- 5 7.5 ppm
hühnchen
Schlacht- 5 10 ppm
hühnchen
Ferkel ' K) -15ppm
Schlacht 12 ppm
hühnchen
(d) Virginiainycin
(e) Zinkbacitracin
(fl Nitrovin
35
40
45
(gl Moenomycin-Komplex
Kälber
S 15 ppm Schon seit längerer Zeit bestehen Bedenken gegei die Verwendung von Antibiotika als Futteradditive wenn diese Antibiotika auch in der humanen um Veterinären Therapie angewendet werden, da befürch tet wird, daß sich eine Bakterienflora bildet, die gegei diese Antibiotika resistent ist, und Mensch und Tie bedroht. Die Entdeckung, daß diese Resistcnzeigen schaft auf andere gefährliche Bakterienarten über tragen werden kann (z.B. von Escherichia coli au Salmonella typhimurium), hat diese Gefahr nod verstärkt. Es war zu erwarten, daß die Verwendimj bestimmter Antibiotika sowohl für die humane unc Veterinäre Therapie als auch für Futteradditive vcr boten werden würde.
Ein derartiges Verbot erfolgte insbesondere nucr Erscheinen des Swann Reports im November 1969 wobei verschiedene europäische Länder dieses Verbo nacheinander erließen (die Bundesrepublik Deutsch land am I.Januar 1974). Die oben unter (a). (b) unc (c)genannten Produkte fallen u. E. unter dieses Verbot
Es liegt jedoch klar auf der Hand, daß Antibiotika die nicht als Therapeutikum verwendet werden, wie Mocimycin (MYC 8003) einen erheblichen Vortei bei der Verwendung als Tierfutteradditiv aufweisen Dabei ist aber wesentlich (wie auch von verschiedener Ländern gefordert), daß das zu schlachtende Tiei lediglich eine Höchstmenge des verwendeten Additiv: und/oder der daraus im Körper gebildeten Umwand lungsprodukte enthält. Zwei Faktoren spielen dabe eine wichtige Rolle: erstens, inwieweit das Addili\ und oder die darin enthaltenen Verunreinigunizer vom Körper resorbiert werden, und zweitens, wie hoch die Konzentration des Additivs im Futur ist
Es ist bekannt, daß Virginiamycin (d) zu 15 bis 18% resorbiert wird (M.B. Rober fro id. P.A D u mont. J.Antibiot., Bd. 25 [1972], S. 30 bis 35). wodurch die Wahrscheinlichkeit, daß ein Rückstand im Körßer verbleibt, wesentlich höher ist als bei MYC 8003. wovon weniger als 2% resorbiert werden Dies stellt einen bedeutenden technischen Fortsehnt! dar. Darüber hinaus wurde durch einen Venileichsversuch. der an Testgruppen von je 36 Ferkel ^durchgeführt wurde (der Versuch wurde in einem unabhängigen Institut durchgeführt, nämlich dem Institut ILOB in Wageningen. Holland), festgestellt, daß schon vergleichbare Wachstumsdaten erzielt wurden bei einer Dosierung von MYC 8003. die nur ein Viertel derjenigen von Virginiamycin betruc.
t-crkel. Wochen -A
0 -6
0- -8
0- 10
0 12
0-
0
Blindversuch ohne Antibiotikum
2,8kg(= 100%)
9,0kg(= 100%)
16.3 kg (= 100%)
24,7 kg (= 100%)
34,3 kg (= 100%)
44,3 kg (= 100%)
Z5 ppm MYC 8003
10 ppm Virginiamycin
3,1kg
9,9 kg
17,9 kg
26,6 kg
36,2 kg
46,6 kg
110.7%
110,0%
109,8%
107,7%
105,5%
105.2%
3.0 kg
9,8 kg
17,6 kg
26.4 kg
36.4 kg
47.0 kg
107,1% 108.9% 108,0% 106,9% 106,1% 106,1%
Weitere Versuche wurden im Institut ILOB mit Schlachthuhnchen durchgeführt, wobei das mit MYC 8003 erhaltene Ergebnis mit dem von Zinkbacitracin verglichen wurde. Die ansesiebenen Daten sind Durchschnitts zahlen aus Versuchen mit je 270 Hühnchen. fc feinen uaten sind Durchschnitts-
Hühnchen. 4 W ochen Blindversuch 100%
O 7 611 g(- 100%
O 1445 g ( =
2.5 ppm MYC H(H)3
629 g 102,9%
1475 g 102.1%
IO ppm Zinkb;icimiein
620 g 101.5% 1471g 101.8%
Der gleiche Versuch mit Ferkeln (24 Tiere pro Versuchsgruppe) führte zu folgendem Ergebnis:
Kor kol. Wochen Blindversuch 100%) 2.5 ppm MYC mm 2(1 ppm /inkh.iciinic 102.6"/,,
0 -i 3,8 kg (= 100%) 4.1 kg 107.9% 3,9 kg 104.3%
0 4 9,3kg( = 100%) 10.1 kg 108,6% 9,7 kg 104.4%
0 6 16,0kg( = 100%) 17.0 kg 106.2",, !6.7 kg 103.8%
0 8 23,5 kü(-= 24.9 ki! 106.0% 24.4 k u
Die Vorteile von MYC 8003 über Zinkbacitracin sind ebenfalls klar ersichtlich: mit einer wesentlich geringeren Menge an Antibiotikum wird ein besseres Wachstum erzielt.
Ähnliche Ergebnisse wurden in Schweden bei einem Vergleichsversuch mit MYC 8003 und Nitrovin erhalten. Auch bei diesem Versuch zeigte sich, daß eine Dosis von 2,5 ppm MYC 8003 eine bessere Wirkung hat als 10 ppm Nitrovin.
Vergleichsversuche mit MYC 8003 und Flavomycin (Moenomycinkomplex in Form des Mycels) bei Kälbern können nicht durchgeführt werden, da Flavomycin 95% unwirksamen Stoff von wahrscheinlich wechselnder Zusammensetzung enthalt. Das Produkt wird nämüch als 5% aktives Material zusammen mit getrocknetem Mycelium verkauft. MYC 8003 wird dagegen rein aus dem Herstellungsverfahren erhalten und erst dann mit Trägern bekannter Zusammen-Setzung (z. B. Kreide oder Stärke) vermischt. Unter Bezugnahme auf die erzielten Ergebnisse von Versuchen mit MYC 8003 bei Kälbern ist jedoch anzunehmen, daß auch dabei günstige Werte erhalten werden.
Zusammenfassend ist festzustellen, daß MYC S003 im Vergleich mit anderen bekannten Viehfuiterantibiotika sehr große Vorteile aufweist.
Der Mikroorganismus Streptomyces ramoeissimus CBS 190.69, der das Antibiotikum der Erfindung erzeugt, wird nachstehend charakterisiert. Dazu wurde »Systematik der Streptomyceten« von R. H ü 11 e r (1957) und »International Journal of Systematic Bacteriology«, Bd. 18, Nr. 2 (1968), verwendet und die von der International Streptomyces Project (im folgenden als ISP abgekürzt) zur Charakterisierung vorgeschriebenen Regeln berücksichtigt. Eine Kultur dieser Mikroorganismen wurde in der öffentlichen Sammlung beim »Centraal Bureau voor SchimmelcuHures« in Baarn, Niederlande, unter der Nummer CBS 190.69 hinterlegt. Die neuen Mikroorganismen wurden als Streptomyces ramoeissimus bezeichnet
A. Vegetatives Mycel
Das Wachstum auf den meisten Medien ist gut. Die Kolonien besitzen das charakteristische Aussehen von Actinomycetes und sind lederartig, etwas gefaltet. Normalerweise ist die Farbe der Kolonien nicht sehr charakteristisch, da sie von im wesentlichen farblosen über hellgraue und hellbeige zu hellgelben Kolonien geht, mit Ausnahme bei der Züchtung auf Nährmedien, auf denen sich die Kolonien durch Melaninbildung braun bis dunkelbraun färben (Malz-Pcpton-Agar. Hirn-Herz-lnfusionsagar).
B. Lufimycel
Auf den meisten Nährmedien ist ein Luftnncel makroskopisch kaum oder gar nicht zu sehen. Aul einigen Medien, wie Hefeextrakl-Mal/extrakt-Agar. Hafermehl-Agar und insbesondere Stärke-Agar mit anorganischen Salzen, wird jedoch reichlich Luftmycel gebildet. Zuerst ist ein solches Mycel weiß, wird aber bei guter Entwicklung dunkelgraii und wird oft aus ziemlich kurzen, unregelmäßig verzweigten Hyphen gebildet, die Sporenketten an kurzen Seitenachsen in Form einfacher Schlingen oder primitiver Spiralen mit nicht mehr als 2, 3 oder 4 Windungen (Abteilung: Spiral aufweisen. Manchmal sprießen 2. 3 oder 4 dieser Spiralen als Pseudovvirbel im wesentlichen aus der selben Stelle an den Hauptachsen. Andere Sporenketten sprießen als primitive Spiralen direkt aus dem Substratmycel (auf ähnliche Weise wie Retinaculum-Apertum). Außerdem sind im Lufimycel häufig zahlreiche nahezu kugelförmige Körper sichtbar, wahrscheinlich auf Grund einei Menge von Sporen aus einer primitiven Spirale, die von einem Flüssigkeitsfilm umgeben ist.
C. Conidien
In der. spiralenähnlichen Hyphen werden Bändei von meistens mehr als zehn leicht elliptischen Conidier gebildet. Die Oberfläche der Conidien ist glatt. Die Größen sind ziemlich verschieden, der Durchschnitt liegt bei etwa 0,9 bis 1.3 μ.
D. Einfluß der Temperatur auf das Wachstum
Das Wachstum ist bei 20 C langsam, bei 26 C mäßig, bei 30 C gut. bei 37 C optimal und ausreichenc bei 40 C. über 40 C hört das Wachstum auf (meso phil).
E. Physiologische Eigenschaften
Die physiologischen Eigenschaften sind in Ta belle Il wiedergegeben.
Tabelle II
Eigenschaft
Melaninbildung
H2S-Bildung
Gelatineverflüssigung
Nitratreduktion
Diastatische Wirkung
Koagulation und Peptonisierung von Milch
Diagnose-Näh rmedi um
Melanin-Medium nach Shinobu, 1958 (ISP med. 7)
»Bacto-Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Agar« Eisen(111 )-Zucker-Agar einfache Gelatine
Nitratreduktion-Nährmedium nach Waksm an
Stärke-Agar Lackmus-Milch
Physiologische Reaktionen
stark positiv
stark positiv stark positiv nach 16 Tagen bei 30° C vollkommen verflüssigt stark positiv
stark positiv nach 16 Tagen koaguliert und zum größten Teil peptonisiert (pH 7.9)
In den Tabellen 111 und IV ist ein Überblick über das Wachstum und das Aussehen des Mikroorganismi Streptomyces ramocissimus auf einer Anzahl von Substraten gegeben.
Tabelle III
Aussehen des Mikroorganismus nach 16tätigem Wachstum bei 30 C
Substrat Wachstum Lösliches Pigment Luftmycel Vegetatives Mycel
Malz-Pepton-Agar gut dunkelbraun — schokoladebraun gefärbte
Kolonien
Emerson-Agar gut braun — X %. KJ1XJ11J ^ 11
hellbraun bis beige
Kolonien
Nähr-Agar gut braun hellbraungelbe bis gelb
beige Kolonien
Nähr-Agar + 1% lösliche gut braun — hellbraungelbe bis gelb
Stärke beige Kolonien
Hafermehl-Agar gut hellbraun anfänglich weiß. hellbeige bis gelbbeige
später hellgrau
Stärke-Agar gut hellge'.b — hellgelb bis grau
Kartoffel-Glucose-Agar gut schmutzig — ziemlich tief gefaltet,
dunkelbraun dunkelbraune Kolonien
Czapek-Glucose-Agar recht gut — — hellgelb bis grau
Czapek-Saccharose-Agar recht gut — — hellgräulich bis weiß
Czapek-Glycerin-Agar recht gut — — hellgrau
Glucose-Asparagin-Agar gut — — hellgelb verschmelzende
Kolonien
Glycerin-Asparagin-Agar gut — sehr spärlich am blaßgrünlichgrau
Kolonienrand
Glucose-Calcium-Malat-Agar gut hellgelb bis weiß
Natriumcitrat-Agar mäßig — graubeige
Hirn-Herz-Infusions-Agar mäßig schwarzbraun schokoladebraun
Küster-Williams-Agar (vgl. gut hellbraun sehr spärlich. sehrhellgrünlich beige
Nature, Bd. 202 [1964], grauweiß
S. 928)
Bennet-Agar gut hellbraun sehr spärlich, weiß hellbraun bis beige
Kartoffelscheiben gut fast schwarz — schwarzbraun, stark ge
faltete Kolonien
15 '!if.-*;.- 16
Tabelle IV
Beschreibung des Mikroorganismus nach 13tätigem Wachstum auf vom ISP vorgeschriebenen Nährmedien
Substrat
Wachs- Lösliches Luftmycel '.um Pigment
Vegetatives Myccl
A. bei 30° C
Hefe-Malz-Extrakt-Agar gut
(ISPII)
Hafermehl-Agar gut
(ISPlIl)
— ziemlich reichlich, weiß, später grau hellbraun bis beige
Anoruanische Salze
Stärke-Agar(ISPlV)
gut
Glycerin-Asparagin-Agar gut
(ISPV)
B. bei 37 C
ISPlI gul
ISP 111
ISPIV
ISPV
gut
sehr
gut
gut
sehr spärlich, hauptsächlich entlang
des Randes
reichlich, hellgrau, später fast schwarz
recht reichlich, hellgrau, später dunkelgrau bis fast schwarz
ziemlich reichlich, hellgrau
ziemlich reichlich, weiß
reichlich, dunkelgrau, später in bestimmten Flecken fast schwarz
ziemlich reichlich, hellgrau, später
dunkelgrau bis fast schwarz
flache, blaßgelbe
bis graue Kolonien
mit sehr tief ins Agar
hineinwachsenden
Rändern
flache, hellgraue bis
blaßgelbbeige
Kolonien
hellgraue bis hellgelbe
Kolonien
Kolonien mit tief ins Agar wachsenden Rändern
flache blaßgraue bis hellbelbgraue Kolonien mit tief ins Agar wachsenden Rändern flache, hellbeige bis hellgelbbeige Kolonien hellgraue bis hellgelbe Kolonien
Ein Vergleich der Eigenschaften von Streptomyces ramocissimus CBS 190.69 mit denen verwandter Stämme von Streptomyces, d. h. Streptomyces tendae CBS 432 59. Streptomyces tendae CBS 565.68 und Streptomyces collinus 1.301 (ETH 24.318), bei Züchtung auf von der ISP empfohlenen Nährmedien bei 30 und 37 C macht deutlich, daß Streptomyces ramocissimus von den bisher bekannten Streptomyces-Stämmen verschieden ist.
Das Luftmycel von Streptomyces collinus kann unter geeigneten Umständen zu deutlich langen, wenig verzweigten Hyphen, die mehr oder weniger horizontal über der Kolonie liegen, wachsen, wobei kurze, im allgemeinen schleifenförmige Sporenketten eingepflanzt sind. Ganz im Gegensatz dazu ist das Luftmycel von Streptomyces ramocissimus ausgesprachen kurz und stark unregelmäßig verzweigt. Die Farben der beiden Mycelien sind ebenfalls vollkommen verschieden. Das Luftmycel von Streptomyces ramocissimus ist grau bis dunkelgrau. während das von Streptomyces collinus im allgemeinen weiß. <*> hellgelb oder cremefarben bis nur hellgrau ist. Das Substratmycel. besonders bei Wachstum auf »Basal-Mincralsafze-Agar-Nährmedicn« unter Zusatz von verschiedenen Kohlenstoffverbindungen, ist bei Streptomyces ramocissimus vorwiegend graulich gefärbt. während das von Streptomyces collinus hellbraun, braunrot oder sogar dottergelb ist. Unterschiede treten auch in den physiologischen Eigenschaften, in der Nitratreduktion, in der Gelatineverflüssigung, in dem Ausmaß der Stärkehydrolyse und in der Zersetzung von Calciumoxalat und Oxalsäure auf. Diese Unterschiede zeigen, daß die Mikroorganismen der Erfindung nicht zu Streptomyces collinus gezählt werden können.
Die Unterschiede zwischen Streptomyces ramocissimus und den beiden genannten Streptomyces tendae sind geringer als zwischen Streptomyces ramocissimus und Streptomyces collinus. Zum Beispiel zeigt die Färbung des Luftmycels von Streptomyces ramocissimus nur einen geringen Unterschied zu dem von Streptomyces tendae, während die Sporenketten oft zu Haken oder zu Schleifen gebogen sind. Die Sporenketten der untersuchten Streptomyces tendae sind jedoch im allgemeinen lähger als die von Streptomyces ramocissimus. Die Sporenketten von Streptomyces tendae erheben sich im allgemeinen direkt aus dem Agar, während die Sporenketten von Streptomyccs ramocissimus im allgemeinen als monopode Seitenketten entlang der kurzen Lufthyphen angeordnet sind, wenngleich auch manchmal das gleiche Verhalten wie bei Streptomyces tendae beobachtet
wird. 1.1
Ein wichtigerer taxonomischcr Unterschied besteht in der Bildung eines melanoiden Pigments auf den ISP-Medien 6^ und 7 (Melaninmedium nach Shinobu bzw. Pepton-Hcfecxtrakt-Agar). Die untersuchten Stämme von Streptomyces tendae bilden
609 640/130
kein braunes Pigment auf diesen Näbrmedien, während Streptomyces ramocissimus ausgesprochen melaninpositiv reagiert. Folgende Unterschiede in den physiologischen Eigenschaften wurden beobachtet:
Strepto- Strepto
myces myces
ramocissi tendue
mus
Nitratreduktion positiv negativ
Gelatineverflüssigung positiv negativ
Ausmaß der Stärke stark schwach
hydrolyse positiv positiv
Zersetzung von Calcium- negativ positiv
10
oxalat und Oxalsäure
Auf Grund der erwähnten Unterschiede ist Streptomyces ramocissimus nicht zu Streptomyces tendae zu rechnen.
Die Züchtung der Mikroorganismen kann in flüssigen Nährmedien durchgeführt werden, die übliche Kohlenstoff-, Stickstoff-, Phosphor-, Calcium-, Eisen-. Schwefel-, Magnesium- und Kaliumquellen. Vitamine und Spurenelemente enthalten. Beispiele dafür sind Nährmedien, die z. B. Melassen. Malzbrei. Erdnußmehl, Lactose, Kartoffelstärke, Maisquellwasser oder Hefeextrakt enthalten.
Nach beendeter Züchtung wird die Gärmaische filtriert und das Filtrat mit einem organischen Lösungsmittel, wie Butanol, Chloroform oder vorzugsweise Methylisobutylketon. bei pH-Werten von etwa 5 bis 8 extrahiert. Der Extrakt wird eingedampft, oder die Verbindung wird mit einem das Antibiotikum schlecht lösenden Lösungsmittel, z. B. Petrolälher. ausgefällt. Die Reinigung des Antibiotikums kann durch Säulenchromatographie an Al2O3, Verteilungschromatographie und bzw. oder Gegenstromverteilung unter Verwendung eines Gemisches aus Methylisobutylketon und Essigsäureäthylester oder eines I : !-Gemisches aus Essigsäureäthylester und Diäthylester als bewegliche Phase und Dicarbonat-, Phosphat- oder Boratpuffer als unbewegliche Phase erfolgen. Gewünschtenfalls kann das Antibiotikum in ein Salz, z. B. das Natriumsalz, übergeführt werden.
Zur praktischen Verwendung als Futterzusatz in der Viehzucht kann das aus der Gärmaische durch Extraktion und Ausfällung isolierte Produkt auch direkt ohne weitere Reinigung verwendet werden.
Das Antibiotikum oder seine Salze werden als Futtermittelzusätze verwendet und können nach einem üblichen Verfahren mit dem Futter vermischt werden. t. B. durch Mahlen, Rühren oder Schütteln. Im allgemeinen ergibt eine Konzentration von 5 bis 20Gcwichtsteilen Million des Antibiotikums oder seiner Salze in den Futterstoffen eine zufriedenstellende wachstutnsfördernde Wirkung.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
nvdium gezüchtet. Nach der Züchtung wurde die Garmaische mit etwa 2% Diatomeenerde als Filtrierhilfe versetzt und filtriert. Das Filtrat wurde mit 8 η-Schwefelsäure auf den pH-Wert 6,0 angesäuert und zweimal mit je V5 seines Volumens Methylisobutylketon extrahiert. Die so gebildeten Emulsionen wurden mit schnell filtrierender Diatomeenerde als Filtrierhilfe gebrochen. Die organischen Phasen wurden vermischt und unter Verwendung eines Rotationsverdampfers unter vermindertem Druck auf etwa I 1 eingeengt. Das Konzentrat wurde langsam zu 51 Petroläther (Siedebereich 40 bis 60°C) gegeben, und der dabei gebildete Niederschlag wurde mit einer Glasfilterfritte(D3) abfiltriert, mit frischem Petroläther gewaschen ui:d getrocknet. Man erhielt eine durchschnittliche Ausbeute von 78 g eines gelbgefäibten Pulvers.
Durch Verteiluneschromatographie wurden 2 g rohes Antibiotikum (Tn der sauren Form) gereinigt. Die stationäre Phase bestand aus mit 0.1 m Na2CO;, NaHCO3-Puffer vom pH-Wert 11 imprägnierter Diatomeenerde, und die bewegliche Phase bestand aus einem Gemisch aus Petroläther und Butylacetat. Man erhielt 0,828 g gereinigtes Antibiotikum mit den oben angegebenen physikalischen und chemischen Eigenschaften.
Eine gesättigte Lösung des Antibiotikums in Wasser unter Zusatz" von 0,1 η-Natriumhydroxid, bis der pH-Wert 9 erreicht war, wurde hergestellt. Die Lösung wurde filtriert und unter Zusatz von Butanol azeotrop eingedampft. Der Rückstand wurde in einer kleinen Menge wasserfreiem Butanol unter vermindertem Druck bei etwa 45 C aufgenommen. Die Lösung wurde gerührt und tropfenweise mit Petroläther versetzt, bis das Salz vollkommen ausfiel. Der Niederschlag wurde abfiltriert, gewaschen und getrocknet. Man erhielt das Natriumsalz des Antibiotikums.
Beispiel 2
Masthühnern wurde das Antibiotikum in Form des nach Beispiel 1 erhaltenen Natriumsalzes zusammen mit dem Futter (Weizenmehl) verabreicht. Die Menge des im Futter enthaltenen Antibiotikums (bezogen auf das Gewicht des Futters) ist in Tabelle V zusammen mit dem Gewicht der Hühner nach 3. 5 und 7 Wochen aufgeführt.
50 Tabelle V
55
60
Beispiel I
Mikroorganismen des Stammes Streptomyces ramocissimus (CBS-190.69) wurden bei einem pH-Wert von etwa 7 unter Rühren und Belüften in 2000 I einer 20 g Gerstenmalzpaste, H) g Hefeextrakt und 5 g Maisquellwasser-Feststoffe pro Liter enthaltenden Nähr-Kontrolle
5 Teile/Million
10 Teile/Million
20 Teile/Million
Alter 5 Wochen 7 Wo
3 Wochen chen
1%) ("")
1%) 100 100
100 103 103
104 105 104
107 107 105
109
Die Tabelle zeigt, daß bei Hühnern nach Verabreichung des Antibiotikums eine WachsUimsslcigerung eintritt. Eine Verbesserung der Futterverwertuni;
um etwa 3 bis 5% wird bei Hühnern innerhalb von 7 Wochen erreicht, wenn die Nahrung 5 bis 20 Teile/ Million Antibiotikum enthält.
Bei s pi el 3
Das nach Beispiel 1 erhaltene Natriumsalz des Antibiotikums wurde Schweinen in Form eines Gemisches mit Futter (Weizenmehl) verabreicht. Die Antibiotikum-Konzentrationen des Futters (bezogen auf das Gewicht des Futters) sind in Tabelle VI zusammen mit den durchschnittlichen relativen Gewichten der Schweine nach 6 bzw. 12 Wochen angegeben.
/fZ
20
Tabelle VI
Antibiotikum
Teile/Million (Kontrolle)
Teile/Million Teile/Million
6 Wochen
!2 Wochen
Wachs- Futter- Wachs- Futtertum*) Umsatz*) turn*) umsatz")
100
100
100
107 95 104,5 108.5 92.5 104
•| ks! Futter zum Erreichen von einer Gewichtszunahme von lkg.
Die Tabelle zeigt, daß das Antibiotikum der Erfindung eine wachstumsfordernde Wirkung aufweist.
Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims (1)

"i\ Patentansprüche:
1. Mocimycin (Antibiotikum MYC 8003) mit einem optischen Drehwert [aj? von -60° (c =■ 1%,in Methanol), einem Neutralisationsäquivalent von 817 bei Titration mit 0,1 η-Natronlauge, einem b V-Absdrptionsspektrum mit Maxima bei 233, 276, 286 und 327 nm, einem IR-Spektrum (gemessen m Kaliumbromid) gemäß F i g. 3 und einem NMR-Spektrum gemäß F i g. 4, das aus drei miteinander in einem Gleichgewicht stehenden Tautomeren besteht und durch die Formel I
DE19712140674 1970-08-14 1971-08-13 Mocimycin (Antibiotikum MYC 8003), seine Salze, Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung als Futtermittelzusatz Expired DE2140674C3 (de)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB3936770 1970-08-14
GB3936770 1970-08-14

Publications (3)

Publication Number Publication Date
DE2140674A1 DE2140674A1 (de) 1972-05-18
DE2140674B2 DE2140674B2 (de) 1976-02-12
DE2140674C3 true DE2140674C3 (de) 1976-09-30

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