DE2140674A1 - Antibiotikum MYC 8003, seine Salze, Verfahren zu seiner Herstellung auf mikrobiologischem Wege, Arzneimittel und Futtermittel - Google Patents

Description

KONlNKLIJKS HEDERLiUiDSOHE G-IST- ESf SPIRITUSi¹ABRIEK U.V. Delft, Niederlande

" Antibiotikum MYG 8003, seine Salze, Verfahren zu seiner Herstellung auf mikrobiologischem Wege, Arzneimittel und Futter- - ·, mittel " j

Priorität: 14. August 1970, Grossbritannien, Nr. 39 367/70

Die Erfindung betrifft ein neues Antibiotikum, seine Salze, ein Verfahren zu seiner Herstellung und Arzneipräparate sowie Futtermittel mit einem Gehalt an diesem Antibiotikum.

Das als MYC 8003 bezeichnete neue Antibiotikum ist wegen seiner wachstumsfordernden Eigenschaften in der Viehzucht besonders wertvoll. Es weist auch eine beträchtliche in vitro-Aktivität gegen Mikroorganismen der Gattung Mycoplasma auf,

, und es ist gegen einige Bakterien, z.B. Actinobacillus equuli, wirksam. Es wird auf mikrobiologischem Wege durch Züchtung von Mikroorganismen der Gattung Strepto-

erhalten,
myces/ die im folgenden näher charakterisiert werden Die das Antibiotikum erzeugenden Mikroorganismen wurden bisher

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nicht beschrieben. Eine Kultur dieser Mikroorganismen wurde beim "Oentraal Bureau voor Schimmelcultures" in Baarn, Niederlande, unter der Nummer CBS 190.69 hinterlegt. Die neuen Mikroorganismen wurden als Streptomyces ramocissimus "bezeichnet.

Das Antibiotikum der Erfindung ist eine schwache Säure und "bildet Salze, wie Natrium-, Kalium-, Ammonium- und Aminsalze. Es hat folgende physikalische und chemische Eigenschaften:

Löslichkeit;

Das Antibiotikum ist gut löslich in Chloroform, Methylisobutylketon, Essigsäurebutylester, Essigsäureäthylester, Aceton, Methanol und alkalischen Lösungen. Es ist wenig löslich in Tetrachlorkohlenstoff und Benzol und unlöslich in Diäthyläther, Petroläther, Wasser und sauren Lösungen.

Stabilität;

Lösungen des Antibiotikums in 50 Prozent Methanol enthaltendem V/asser sind in einem pH-Bereich von 3 bis 12 bei 20⁰C etwa 4 Stunden stabil.

Die Lagerung des Antibiotikums in fester Form bei 25°C und 37°C bei niedriger relativer Luftfeuchtigkeit führt in einem Zeitraum von mindestens 5 Monaten zu keinem Aktivitätsverlust. Bei einer Lagerung bei 25°C und 100 Prozent relativer Luftfeuchtigkeit ist es 3 Monate und bei 37⁰C und 100 Prozent relativer Luftfeuchtigkeit 2 Monate stabil.

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Reaktionen auf mögliche funktioneile Gruppen;

Reagens;

Konzentrierte Schwefelsäure Aromatentest

(AlCl₅ + Chloroform)

Fehling-Reaktion (Aldehyde)

Tollens-Reaktion (Aldehyde)

Molisch-Reaktion (Saccharide)

Anthron-Reaktion (Saccharide)

Biuret-Reaktion (Proteine) Polin L-Reaktion

(Proteine + Aminosäuren)

Pauly-Reakt ion

(Aminosäuren + Phenole)

.FeCl,-Reaktion

(Enole + Phenole)

^L3

Bromierung in CHCl, Bromierung in Wasser

Ergebnis; Zersetzung und Rotfärbung

schwach positiv negativ negativ negativ negativ negativ

negativ dunkelbraune Färbung

dunkelrote Färbung und Trübung

negativ

Ausfällung aufgrund von Säurebildung

Optische Drehung;

^² = -60° (1 Prozent Methanol)

Schmelzpunkt;

Das Antibiotikum weist keinen scharfen Schmelzpunkt oder

Schmelzbereich auf. Bei 135 C tritt eine Gasentwicklung ein, wo·

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bei die Verbindung erweicht wird. Bei etwa 152⁰G tritt wiederum Gasentwicklung auf. Bei 164 bis 174⁰C ist das Antibiotikum geschmolzen.

UV-Spektrum;

Das Antibiotikum der Erfindung v/eist ein spezifisches Spektrum mit Absorptionsmaxima bei 233, 276, 286 und 327 nm auf. Bei verschiedenen pH-Werten erhält man verschiedene Spektren, wie aus Fig. 1 ersichtlich ist. Die durchgezogene Linie dieser Abbildung stellt das Spektrum einer Lösung von 13 mg/Liter des Antibiotikums in einem Gemisch aus gleichen Teilen Methanol und Wasser dar. Die gestrichelte Linie zeigt das Spektrum einer ähnlichen Lösung, bei der anstelle von Wasser 0,5 η Natriumhydroxidlösung verwendet wurde, während die punktierte Linie das Spektrum einer ähnlichen Lösung mit 0,5 η Salzsäure anstelle von V/asser zeigt.

Eine dünnschichtchromatographische Auftrennung des Antibiotikums zeigt, dass es aus drei Verbindungen besteht, die wahrscheinlich im Gleichgewicht miteinander stehen. Das Chromatogramm mit einem Gemisch aus 12 Teilen Aceton, 8 Teilen Essigsäureäthylester und 1 Teil Wasser auf Kieselgel ist in Pig. 2 zu sehen, wobei die punktierte Linie den Start anzeigt.

IR-Spektrum:

Das IR-Spektrum des Antibiotikums ist in Fig. 3 wiedergegeben. Die wichtigsten Absorptionsmaxima liegen bei 810, 860, 940, 980, 1090, 1215, 1355, 1455, 1540, 1650, 2930, 2970 und 3400 cm"¹.

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Elementaranalyse t

Durchschnittswerte: G HN O

63,8 io 7,6 fo 3,5 <f° 25,1 f°

(durch Differenzbildung)

Molekulargewicht t

Die Molekulargewichtsbestimmung wurde durch isotherme Destillation durchgeführt. Eine Lösung des Antibiotikums in Aceton und eine Lösung von Azobenzol (als Standard) wurden getrennt in ein verschlossenes und evakuiertes System gebracht. Wegen des unterschiedlichen Dampfdruckes über den Lösungen destilliert solange Aceton über, bis Gleichgewicht erreicht ist und beide Lösungen gleiche Molarität aufweisen. Das Verfahren wurde bei einer konstanten Temperatur von 23⁰O durchgeführt. Pur das Antibiotikum wurde ein Molekulargewicht von 714 berechnet. Eine Lösung des Antibiotikums in einem Gemisch aus gleichen Teilen Wasser und Methanol wies bei Titration mit 0,1 η IaOH ein Neutralisationsäquivalent von 817 auf.

Das mikrobiologische Wirkungsspektrum des Antibiotikums der Erfindung gegenüber einer Reihe von Mikroorganismen wurde durch ein übliches Verdünnungsverfahren bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle I wiedergegeben.

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- 6 Iafcelle I

Untersuchter Mikroorganismus Minimale Hemrakonzent rat i on /Ug/ml

Bacillus subtilis ATCC 6633 Bacillus cereus ATCC 9139 Staphylococcus aureus A 55 (ATCC 6558 S taphylococcus aureus A 321 Staphylococcus aureiis A 355¹) Staphylococcus aureus L 160a¹) Streptococcus haemolyticus A Streptococcus faecalis L 80 Micrococcus flayus A 5^ Sarcina lutea ATCC Brucella melitensis A 488 Pasteurella multocida A 723 Salmonella dublin P 43 Escherichia coli U 20 Escherichia coli H Erwinia carotovora V 9 Pseudomonas aeruginosa L 94 Pseudoiaonas aeruKinosa 2396 ") Proteus rettgeri A 821 Proteus mirabilis H 3 Proteus mirahilis L 93 Protetis morganii 22¹H ") Kaemophilus influenzae A 773 Actinobacillus equuli T 3 Candida albicans A 7

0,3 25 50

> 100

> 100

> 100 : 100

25 25

> 100 ·

> 100

> 100

> 100

> 100

50 50

> 100

> 100

209821/105;

Candida parapsilosis A 952 > 100

Torttlopsis glabrata A 420 > 100

S accharomyces cere vis iae D 160 > 100

Trichophyton ment'agrophytes R 177 > 100

Aspergillns niger D 184 > 100

Lactobacillus acidophilus D 218 > 100

Clostridium vdchii A 738 15

Vibrio coli 1846 100

Streptococcus agalactiae A £32 15

Streptococcus disgalactiae A 730 15

Mycoplasma gallisepticumK 51^ ca. 0,1..

^I) "bezeichnet JPenicillinase bildende Mikroorganismen

^II) bezeichnet kürzlich isolierten Krankenhausstamm.

Die labelle zeigt, dass das Antibiotikum eine hohe Aktivität gegen Macoplasma gallisepticum, aber fast keine Aktivität gegen eine Anzahl von humanpathogenen Mikroorganismen aufweist. In vivo ist es gegenüber Mycoplasma gallisepticum nicht aktiv«, Die ajoxizität des Antibiotikums wurde an verschiedenen Sieren tmtersucht. Die akute Toxizität ist sehr gering. Eine intraperitoneale Dosis von 1000 mg/kg ist für Mäuse nicht tödlich» Bei Batten und Hühnern führt eine orale Verabreichung in Konzentrationen bis zu 0,1 Prozent der Diät über 2 Monate hinv/eg zu keinen unerwünschten pharmakologisehen Wirkungen _β

Es wurde festgestellt, dass das Antibiotikum der Erfindung

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besonders als wachstumsforderndes Mittel in der Tierzucht, z.B. von Rindern, Schweinen und Geflügel, wertvoll ist. Es kann auf übliche Weise, z.B. als Zusatz im Futter, verabreicht werden. Das Antibiotikum eignet sich auch zur Bekämpfung von Krankheiten, die -von bestimmten Darmmikroorganismen, z.B. Vibrio coli oder Clostridium welchii, verursacht werden.

Die Erfindung betrifft somit auch Arzneimittel, die das Antibiotikum MYC 8003 als Wirkstoff und übliche Trägerstoffe und w Verdünnungsmittel enthalten.

Der Mikroorganismus Streptomyces ramocissimus (CBS 190.69)» der das Antibiotikum der Erfindung erzeugt, wird nachstehend charakterisiert.¹ Dazu wurde "Systematik der Streptomyceten" von R. Hütter (1957) und "International Journal of Systematic Bacteriology", Band 18, Hr. 2 (1968) verwendet und die von der International Streptomyces Project (im folgenden als ISP abgekürzt) zur Charakterisierung vorgeschriebenen Regeln berücksichtigt. ■

A. Vegetatives Mycel

Das Wachstum auf den meisten Medien ist gut. Die Kolonien besitzen das charakteristische Aussehen von Actinomycetes und sind lederartig, etwas gefaltet. Normalerweise ist die Farbe der Kolonien nicht sehr charakteristisch, da sie von im wesentlichen farblosen über hellgraue und hellbeige zu hellgelben Kolonien geht, mit Ausnahme bei der Züchtung auf Nährmedien, auf de.nen sich die Kolonien durch Melaninbildung braun bis dunkelbraun färben (Malz-Pepton-Agar, Hirn-Herz-Infusionsagar).

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B. Luftmycel

Auf den meisten Nährmedien ist ein Luftmycel makroskopisch kaum oder gar nicht zu sehen. Auf einigen Medien, wie Hefeextrakt -Malzextrakt -Agar, Hafermehl-Agar und insbesondere Stärke-Agar mit anorganischen Salzen, wird jedoch reichlich luftmycel gebildet. Zuerst ist ein solches Mycel weiss, wird, aber hei guter Entwicklung dunkelgrau und wird oft aus ziemlich kurzen, unregelmässig verzweigten Hyphen gebildet, die Sporenketten an kurzen Seitenachsen in Form einfacher Schlingen oder primitiver Spiralen mit nicht mehr als 2, 3 oder 4 Windungen (Abteilung: Spira) aufweisen. Manchmal spriessen 2, 3 oder 4- dieser Spiralen als Pseudowirbel im wesentlichen aus der selben Stelle an den Hauptachsen. Andere Sporenketten spriessen als primitive Spiralen direkt aus dem Substratmycel (auf ähnliche Weise wie Retinaculum-Apertum). Dazu werden im Luftmycel—oft sichtbar-viele flach gewölbte Körper gebildet, wahrscheinlich aufgrund einer Menge voii Sporen aus einer Primärspirale, die von einem Flüssigkeitsfilm umgeben ist.

C. Conidien

In den spiralenähnlxchen Hyphen werden Bänder von meistens mehr als zehn leicht elliptischen Conidien gebildet. Die Oberfläche der Conidien ist glatt. Die Masse sind ziemlich verschieden, aber der Durchschnitt liegt bei etwa 0,9 bis 1,3/u.

D. Einfluss der Temperatur auf das Wachstum

Das Wachstum ist bei 2O⁰C langsam, bei 26⁰C massig, bei 30⁰C

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gut, bei 37⁰C optimal und ausreichend bei 4O°C. Über 40⁰C hört das Wachstum auf (mesophyl).

E. Physiologische Eigenschaften

Die physiologischen Eigenschaften sind in Tabelle II wiedergegeben.

Tabelle II

Eigenschaft	Di agn ο s e-Nährme dium	Physiologische Reaktionen
Melaninbildung	Melanin-Medium nach Shinobu, 1958 (ISP med. 7)	stark positiv
H2S-Bildung	"Bacto-Pepton-Hefe- extrakt-Ei sen-Agar"	stark positiv i
	"Triple Sugar Iron agar" von Difco	stark positiv
Gelatineverflüs sigung	einfache Gelatine	nach 16 Tagen bei 300C vollkommen verflüssigt
Nitratreduktion	Nitratreduktion- Nährmedium nach Waksman	stark positiv
Diastatische Wirkung	Stärke-Agar	stark positiv
!Koagulation und jPeptonisierung von Milch	Lackmus-Milch	nach 16 Tagen koa guliert und zum grössten Teil peptonisiert · (PH 7,9) I

In den Tabellen III und IV ist ein Überblick über das Wachstum und das Aussehen des Mikroorganismus Streptomyces ramocissimus auf einer Anzahl von Substraten gegeben.

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Tabelle III Aussehen des Mikroorganismus nach 16-tägigem Wachstum bei 30^c

Substrat	Wachstum	Lösliches Pigment	Luftmycel	dunkelbraun	—	~	i Vegetatives Mycel
Malz-Pept on-Agar	gut	dunkelbrai	m -				schokoladebraun
				_			gefärbte Kolo
							nien
Emerson-Agar	gut	braun	_				hellbraun bis
							beige Kolonien
Nährr-Agar	gut	braun		—		hell braungelbe
						bis gelbbeige
						Kolonien
NähTi-Agar + 1#	gut	braun	—		sehr spar	hell braungelbe
lösliche Stärke					lieh am	bis gelbbeige
					Kolonien	Kolonien
Hafermehl-Agar	gut	hellbraun	anfängl.		rand	hellbeige bis
			weiss,		gelbbeige
			später
			hellgrau
Stärke-Agar	gut	hellgelb	-		hellgelb bis
				—	grau
Kartoffel-	gut	schmutzig	—		ziemlich tief ge
Glucose-Agar		schwarz	faltet, dunkel
		braun	braune Kolonien
Czapek-	recht		hellgelb bis
Glucose-Agar	gut .	grau
Czapek-Saccha-	recht	hellgräulich
rose-Agar	gut	bis weiss
Czapek-	recht	hellgrau
Glycerin-Agar	gut
Glucose-Aspara-		hellgelb ver
gin-Agar	guu	schmelzende
		Kolonien
Glycerin-Aspara-	gut	blass
gin-Agar		grünlich-grau
	gut
Glueose-Calcium-		hellgelb bis
Malat-Agar	massig	weiss
Natriumcitrat-		grau-beige
Agar	massig
Hirn-Herz-Infu-		schokoladebraun
sions-Agar

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	Portsetzung von Tabelle III	i Lösliches Pigment	Luftmycel	Vegetatives \ Mycel ;
Substrat	Wachstum	hellbraun hellbraun fast schwarz	sehr spär lich, grau-v/eiss sehr spär lich, vreiss	; sehr hell grün- j lich-beige ι hellbraun bis beige s ehwarzbraun, stark gefaltete Kolonien
Küster- Williams-Agar (vgl.Nature. Bd.202(1964) S.928) Bennet-Agar Kartoffel- scheiben	gut gut gut

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Tabelle IV

Beschreibung des Mikroorganismus nach 13—tägigem Wachstum auf vom ISP vorgeschriebenenen Nährmedien

! "Substrat

Wachstum

Lösliches Pigment ^;: Luftmycel

Vegetatives Mycel

A. "bei 30 G

Hefe-Mal 25-Extrakt-Agar
(ISP II)

Hafermehl-Agar
(ISP III)

Anorgan.Salze
Stärke-Agar
(ISP IV)

Glyeerin-Asparagin-Agar(ISP V)

gut

gut

gut

gut ziemlich reichlich,

!weiss, spä-

jter grau sehr spärlich, hauptsächlich ent lang d»Rande

reichlich, hellgrau später fast schwarz

recht reichlich,hellgrau, später dunkelgrau bis fast schwarz

hellbraun bis beige

j flache,blassgel- !be bis graue Ko-2lonien mit sehr Ttief ins Agar hin· "'einwachs .Rändern

flache,hellgraue bis blassgelbbeige Kolonien

hellgraue bis

hellgelbe

Kolonien

B. bei 37 G
ISP II

ISP III

ISP IV

ISP V

gut

gut

sehr gut

gut zieml.reichlich,
hellgrau

ziemlich reichlich,

weiss reichlich, dunkelgrau später in bestimmten KLecken fast schwarz

ziemlich reichlich, hellgrau später dunkelgrau bis fast schwarz

Kolonien mit tief ins Agar wachsenden Rändern

flache blassgraue

bis hellgelbgraue Kolonien mit tief ins Agai wachsenden Rand.

flache, hellbeige bis hellgelbbeige Kolonien

hellgraue bis

hellgelbe

Kolonien

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Ein Vergleich der Eigenschaften von Streptomyces ramocissimus CBS 190.69 mit denen verwandter Stämme von Streptomyoes, d.h. Streptomyces tendae CBS 432.59_f Streptomyoes tendae GBS 565.68 und Streptomyces collinus I. 301 (ETH 24.318), "bei Züchtung auf von der ISP empfohlenen Nährmedien "bei 30 und 37°C macht deutlich, dass Streptomyces ramocissimus von den bisher bekannten Streptomyces-Stämmen verschieden ist.

Das Luftmycel von Streptomyces collinus kann unter geeigneten Umständen zu deutlich langen, wenig verzweigten Hyphen, die mehr oder weniger horizontal über der Kolonie liegen, wachsen, wobei kurze, im allgemeinen sohleifenförmige Sporenketten eingepflanzt sind. Ganz im Gegensatz dazu ist das Luftmycel von Streptomyces ramocissimus ausgesprochen kurz und stark unregelmässig verzweigt. Die Farben der beiden Mycelien sind ebenfalls vollkommen verschieden. Das luftmycel von Streptomyces ramocissimus ist grau bis dunkelgrau, während das von Streptomyces collinus im allgemeinen weiss, hellgelb oder cremefarben bis nur hellgrau ist. Das Substratmycel, besonders bei Wachstum auf "Basal-Mineralsalze-Agar-Nährmedien" unter Zusatz von verschiedenen Kohlenstoffverbindungen, ist bei Streptomyces ramocissimus vorwiegend gräulich gefärbt, während daa von Streptomyces collinus hellbraun, braun-rot oder sogar dottergelb ist. Unterschiede treten auch in den physiologischen Eigenschaften, in der Nitratreduktion, in der Gelatineverflüssigung, in dem Ausmasβ der Stärkehydrolyse, und in der Zersetzung von Oalciumoxalat und Oxalsäure auf. Diese Unterschiede »eigen, daea die Mikroorganismen der Erfindung nicht zu Streptomyoea oollinue geaählt werden können»

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Die Unterschiede zwischen Streptomyces ramocissimus und den beiden genannten Streptomyces tendae sind geringer als zwischen Streptomyces ramocissimus und Streptomyces collinus. Zum Beispiel zeigt die Färbung des Luftmycels von Streptomyces ramocissimus nur einen geringen Unterschied zu dem von Streptomyces tendae, während die Sporenketten oft zu Haken oder zu Schleifen gebogen sind. Die Sporenketten der untersuchten Streptomyces tendae sind jedoch im allgemeinen länger als die von Streptomyces ramocissimus. Die Sporenketten von Streptomyces tendae erheben sich im allgemeinen direkt aus dem Agar, während die Sporenketten von Streptomyces ramocissimus im allgemeinen als monopode Seitenketten entlang der kurzen Lufthyphen angeordnet sind, wenngleich auch manchmal das gleiche Verhalten wie bei Streptomyces tendae beobachtet wird. Ein wichtigerer taxonomiseher Unterschied besteht in der Bildung eines melanoiden Pigments auf den ISP-Medien 6 und 7 (Melaninmedium nach Shinobu bzw. Pepton-Hefeextrakt-Agar). Die untersuchten Stämme von Streptomyces tendae bilden kein braunes Pigment auf diesen Iiährmedien, während Streptomyces ramocissimus ausgesprochen Melanin-positiv reagiert. Folgende Unterschiede in den physiologischen Eigenschaften wurden beobachtet:

Streptomyces Streptomyces ramocissimus tendae

Nitratreduktion positiv negativ

Gelatineverflüssigung ' positiv negativ

Ausmass der Stärkehydrplyse stark positiv schwach positiv

Zersetzung von Calcium- negativ Dositiv

oxalat und Oxalsäure negativ positiv

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Aufgrund der erwähnten Unterschiede ist Streptomyces ramocissimus nicht zu Streptomyces tendae zu rechnen.

Gegenstand der Erfindung ist somit auch ein Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums IiYC 8003, das dadurch gekennzeichnet .ist, dass man Mikroorganismen vom Stamm Streptomyces ramocissimus (CBS 190.69) oder Antibiotika erzeugende Mutanten davon in einem Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und anorganische Salze

wässrigen
enthaltenden/Nährmedium nach üblichen Methoden züchtet und das entstandene Antibiotikum isoliert.

Die Züchtung der Mikroorganismen kann mit flüssigen Nährmedien durchgeführt werden, die übliche Kohlenstoff-, Stickstoff-, Phosphor-, Calcium-, Eisen-, Schwefel-, Magnesium- und Kaliumquellen, Vitamine und Spurenelemente enthalten. Beispiele dafür sind Nährmedien, die z.B. Melassen, Malzbrei, Erdnussmehl, Lactose, Kartoffelstärke, Maisquellwasser oder Hefeextrakt enthalten.

Die Abtrennung des Antibiotikums aus der Gärmaische kann auf verschiedene Weise durchgeführt werden. Das Gärmaischefiltrat kann z.B. mit einem für das Antibiotikum geeigneten organischen Lösungsmittel extrahiert v/erden, wie Butanol, Chloroform oder

iso

vorzugsweise MethyLimtylketon. Das Antibiotikum geht in die organische Phase über. Die Lösung wird eingedampft oder die Verbindung wird mit einem das Antibiotikum schlecht lösenden Lösungsmittel, z.B. Petroläther, ausgefällt. Der pH-Wert für eine optimale Extraktion liegt bei etwa 5 bis 8. Die Reinigung des Antibiotikums kann durch Säulenchromatographie an ΑΙλΟ,, Ver-

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teilungschromatographie und bzw» oder Gegenstromverteilung unter Verwendung eines Gemisches aus Methylisobutylketon und Essigsäur eäthyle st er oder eines 1:1-Gemisches aus Essigsäureäthylester und Diäthyläther als bewegliche Phase und Dicarbonat-, Phosphat- oder Boratpuffer als unbewegliche Phase erfolgen.

Zur praktischen Verwendung als Futterzusatz in der Viehzucht kann das aus der Gärmaische durch Extraktion und Ausfällung isolierte Produkt direkt ohne weitere Reinigung verwendet werden.

Zur Verwendung als Arzneimittel werden das Antibiotikum der Erfindung oder seine Salze, z.B. das ITatriumsalz, in einem ausreichenden Verhältnis dem Futter von Rindern, Schweinen und Geflügel zugemischt. Das Antibiotikum oder seine Salze können auch mit allen geeigneten pharmakologisch verträglichen Trägerstoffen oder Verdünnungsmitteln, die dem Tier auf oralem Wege zu verabreichen sind, nicht mit dem Antibiotikum reagieren und bei der oralen Verabreichung den Tieren keinen Schaden zufügen, dispergiert oder vermischt werden. Das Antibiotikum oder seine Salze können nach einem üblichen Verfahren mit dem Futter, Trägerstoff oder Verdünnungsmittel vereinigt werden, z.B. durch Mahlen, Rühren oder Schütteln. Es können auch Konzentrate und Zusätze verwendet werden, die das Antibiotikum enthalten und mit anderen Futtermitteln vermischt werden. Im allgemeinen ergibt eine Konzentration von 5 bis 20 Gewicht steilen/Million des Antibiotikums oder seiner Salze in den Futterstoffen eine zufriedenstellende wachstumsfördernde Wirkung.

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Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Mikroorganismen des Stammes Streptomyces ramocissimus (CBS 190.69) wurden bei einem pH-Wert von etwa 7 unter Rühren und

2000 Gerstenmalzpaste,

Belüften in / Liter einer 20 g / 10 g Hefeextrakt und 5 g Maisquellwasser-Jeststoffe pro Liter enthaltenden Nährmedium gezüchtet. Nach der Züchtung wurde die Gärmaische mit etwa 2 Prozent Diatomeenerde als Piltrierhilfe versetzt und filtriert. Das Piltrat wurde mit 8 η Schwefelsäure auf den pH-Wert 6,0 angesäuert und zweimal mit je 1/5 seines Volumens Methylisobutylketon extrahiert. Die so gebildeten Emulsionen wurden mit schnell filtrierender Diatomeenerde als Filtrierhilfe gebrochen. Die organischen Phasen wurden vermischt und unter Verwendung eines Rotationsverdampfers unter vermindertem Druck auf etwa 1 Liter eingeengt. Das Konzentrat wurde langsam zu 5 Liter Petroläther (Siedebereich 40 bis 60⁰C) gegeben und der

dabei gebildete Niederschlag wurde mit einer Glasfilterfritte / abfiltriert, mit frischem Petroläther gewaschen und getrocknet. Man erhielt eine durchschnittliche Ausbeute von 78 g eines gelbgefärbten Pulvers.

Durch Verteilungschromatographie wurden 2 g rohes Antibiotikum (in der sauren Form) gereinigt. Die stationäre Phase bestand aus mit 0,1 m Na₂CO₃AaHCO₃-PUf f er vom pH-Wert 11 imprägnierter Diatomeenerde, und die bewegliche Phase bestand aus einem Gemisch aus Petroläther und Butylacetat. Man erhielt 0,828 g gereinigtes Antibiotikum mit den oben angegebenen physikalischen

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und chemischen Eigenschaften.

Eine gesättigte Lösung des Antibiotikums in Wasser unter Zusatz von 0,1 η Natriumhydroxid, bis der pH-Wert 9 erreicht war, wurde hergestellt. Die Lösung wurde filtriert und unter Zusatz von Butanol azeotrop eingedampft. Der Rückstand wurde in einer kleinen Menge wasserfreiem Butanol unter vermindertem Druck bei etwa 45°C aufgenommen. Die Lösung wurde gerührt und tropfenweise mit Petroläther versetzt, bis das Salz vollkommen ausfiel. Der riederschlag wurde abfiltriert, gewaschen und getrocknet. Man erhielt das Natriumsalz des Antibiotikums.

Beispiel2

Masthühnern wurde das Antibiotikum in Form des nach Beispiel 1 erhaltenen Natriumsalzes zusammen mit. dem Futter (Weizenmehl) verabreicht. Die Menge des im Futter enthaltenen Antibiotikums (bezogen auf das Gewicht des Futters) ist in Tabelle V zusammen mit dem Gewicht der Hühner nach 3, 5 und 7 Wochen aufgeführt.

Tabelle V

Alter	3 Wochen	5 Wochen	7 Wochen
Kontrolle 5 Teile/Million 10 Teile/JEuLlior 20 Teile/Million			* i
100 104 107 109	100 103 105 107	100 103 104 j I 105 ! i

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Die Tabelle zeigt, dass bei Hühnern nach Verabreichung des Antibiotikums eine Wachstumssteigerung eintritt. Eine Verbesserung

etwa

der Futterverwertung um/3 bis 5 Prozent wird bei Hühnern innerhalb von 7 Wochen erreicht, wenn die Nahrung 5 bis 20 Teile/Million Antibiotikum enthält.

Beispiel 3

Das nach Beispiel 1 erhaltene Natriumsalz des Antibiotikums ψ wurde Schweinen in Form eines Gemisches mit Putter (Weizenmehl) verabreicht. Die Antibiotikum-Konzentrationen des Futters (bezogen auf das Gewicht des Futters) sind in Tabelle VI zusammen mit den durchschnittlichen relativen Gewichten der Schweine nach 6 bzw. 12 Wochen angegeben.

Tabelle VI

6 Wochen

Antibiotikum

Wachstum (D

Futterumsatz (2)

12 Wochen

Wachstum
(1)

Futter urnsatz

0 Teile/Million^: (Kontrolle) j

j 5 Teile/Million· j 10 Teile/Million

100 107 108,5

100
95
92,5

100

104,5

104

100 98 99

(1)

(2) kg Futter zum Erreichen von einer Gewichtszunahme von 1 Ic

Die Tabelle zeigt, dass das Antibiotikum der Erfindung eine v/achstuDisfordernde '.M.juivjig aufweist.

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Claims (1)

1. 2U0674

   - 21 Patentansprüche

   ., Verfahren zur Herstellung eines Antibiotikums MYO 8003 und seiner Salze, dadurch gekennzeichnet, dass man Mikroorganismen des Stammes Streptomyces ramocissimus (OBS 190.69) oder Antibiotika herstellende Mutanten dieses Stammes in einem wässrigen, verwertbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und anorganische Salze enthaltenden ITährmedium nach üblichen Methoden züchtet und das entstandene Antibiotikum isoliert.

   Antibiotikum MYC 8003, ein gelb gefärbter, schwach sauer reagierender Peststoff oder dessen Salze, dadurch gekennzeichnet, dass es aus den Elementen Kohlenstoff, Sauerstoff, Stickstoff und Wasserstoff besteht, drei im Gleichgewicht miteinander stehende Bestandteile enthält, einen optischen Drehwert [^'J -q von -60 (1-prozentige Lösung in Methanol) aufweist, in ^tetrachlorkohlenstoff und Benzol wenig löslich und in Chloroform, Methylisobutylketon, Essigsäurebutylester, Essigsäureäthylester, Methanol und alkalischen Lösungen löslich ist, eine schwach positive Reaktion beim Test auf Aromaten zeigt, mit konzentrierter Schwefelsäure eine rote Färbung, bei der Pauly-Reaktion eine dunkelbraune Färbung, bei der Reaktion mit Eisen(III)-chlorid eine dunkelrote Färbung und Trübung- und bei der Behandlung mit Bromwasser einen Niederschlag bildet, beim Erhitzen auf 155⁰C eine Gasentwicklung, beim Erhitzen auf 152⁰C eine weitere Gasent-

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   Wicklung und beim Erhitzen auf 164 bis 174°C Zersetzung zeigt und ein UV-Spektrum mit Absorptionsmaxima bei 233, 276, 286 und 327 mn und ein IR-Spektrum mit Absorptionsbanden bei 810, 860, 940, 980, 1090, 1215, 1355, 1455, 1540, 1650, 2930, 2970 lind 3400 cm"¹ aufweist.

   3. Arzneimittel, bestehend aus dem Antibiotikum MYG 8003 oder . dessen pharmakologisch verträglichen Salzen und üblichen Trägerstoffen und/oder Verdünnungsmitteln.

   4. Futtermittel, gekennzeichnet durch einen Gehalt an dem gemäß Anspruch 1 hergestellten Antibiotikum.

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