DE2140674B2

DE2140674B2 - Mocimycin (antibiotikum myc 8003), seine salze, verfahren zu seiner herstellung und seine verwendung als futtermittelzusatz

Info

Publication number: DE2140674B2
Application number: DE19712140674
Authority: DE
Inventors: Auf Nichtnennung Antrag
Original assignee: Koninklijke Nederlandsche Gist en Spiritusfabriek BV
Current assignee: DSM Delft BV
Priority date: 1970-08-14
Filing date: 1971-08-13
Publication date: 1976-02-12
Also published as: IL37500A; BR7105215D0; ES394218A1; FR2102269B1; IE36056L; DD97126A5; TR18758A; AU3235171A; NO134745B; IL37500A0; NL7111168A; SE396881B; JPS5124599B1; LU63715A1; DK130885B; AT317663B; BE771331A; IE36056B1; IT1061727B; DK130885C

Description

wiedergegeben werden kann, und seine Salze.

2. Verfahren zur Herstellung von Mocimycin (Antibiotikum MYC 8003) nach Anspruch i. dadurch gekennzeichnet, daß man Mikroorganismen des Stammes Streptomyces ramocissimus CBS 190.69 oder nach üblichen Methoden daraus erhaltene, das Antibiotikum bildende Mutanten oder Varianten in einem wäßrigen, verwertbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und anorganische Salze enthaltenden Nährmedium in an sich bekannter Weise züchtet und das entstandene Antibiotikum aus der Gärmaische durch Extraktion mit organischen Lösungsmitteln bei pH-Werten von etwa 5 bis 8 isoliert und gewünschtenfalls weiter reinigt und/oder in ein Salz überführt.

3. Verwendung des Antibiotikums MYC 8003 gemäß Anspruch 1 als Futtermittelzusatz.

35

40

Die Erfindung betrifft den in den Ansprüchen gekennzeichneten Gegenstand. Die Bezeichnungen Mocimycin und Antibiotikum MYC 8003 sind beide in der Fachwelt eingeführt und werden in verschiedenen Publikationen benutzt. Der Strukturformel ist zu entnehmen, daß Mocimycin in drei miteinander in einem Gleichgewicht stehenden Tautomeren mit folgenden Grenzstrukturen vorkommen kann:

50

(H)

(IV)

60

OH

das ursprüngliche Gemisch gebildet. Die im Gleichgewicht vorkommenden Tautomeren können also zusammen als ein einziger Stoff betrachtet werden.

Das Antibiotikum der Erfindung ist eine schwache Säure und bildet Salze, z. B. Natrium-. Kalium-. Ammoniuiii- und Aminsalze. Es hat folgende physikalische und chemische Eigenschaften:

Löslichkeit

Das Antibiotikum ist gut löslich in Chloroform. Methylisobutylketon, Essigsäurebutylester, Essigsäureäthylester, Aceton, Methanol und alkalischen Lösungen. Es ist wenig löslich in Tetrachlorkohlenstoff und Benzol und unlöslich in Diäthyläther. Petroläther, Wasser und sauren Lösungen.

Stabilität

Lösungen des Antibiotikums in 50% Methanol enthaltendem Wasser sind in einem pH-Bereich von 3 bis 12 bei 20^GC etwa 4 Stunden stabil.

Die Lagerung des Antibiotikums in fester Form bei 25 und 37^rC bei niedriger relativer Luftfeuchtigkeit führt in einem Zeitraum von mindestens 5 Monaten zu keinem Aktivitätsverlust. Bei einer Lagerung bei 25" C und 100% relativer Luftfeuchtigkeit ist es 3 Monate und bei 37° C und 100% relativer Luftfeuchtigkeit 2 Monate stabil.

Reaktionen auf funktioneile Gruppen:

Die Tautomeren können chromatographisch gerennt werden, sind aber nicht stabil; es wird wieder

Reagens	Ergebnis
Konzentrierte Schwefelsäure	Zersetzung und Rot
	färbung
Aromatentest	schwach positiv
(AlCl₃ + Chloroform)
Fehling-Reaktion	negativ
(Aldehyde)
Toilens-Reaktion	negativ
(Aldehyde)
Moiisch-Reaklion	negativ
(Saccharide)
Anthron-Reaktion	negativ
(Saccharide)
Biuret-Reaktion (Proteine)	negativ
Folin L-Reaktion	negativ
(Proteine + Aminosäuren)

21

Fortsetzung
Reagens

Pauly-Reaktion
(Aminosäuren 4- Phenole)
FeCl₃-Reaktion
(Enole + Phenole)
Bromierung in CHCl₃
Bromierung in Wasser

Ergebnis

Optische Drehunu:
[«]? = -60^r (C= I¹

dunkelbraune Färbung

dunkelrote Färbung und Trübung negativ

Ausfällung auf Grund von Säurebildung

; Methanol).

Schmelzpunkt '⁵

Das Antibiotikum weist keinen scharfen Schmelzpunkt oder Schmelzbereich auf. Bei 135 C erfolgt Gasentwicklung, wobei die Verbindung erweicht. Bei etwa 152°C tritt wiederum Gasentwicklung auf. Bei 164 bis 174° C ist das Antibiotikum geschmolzen.

UV-Spektrum

Das Antibiotikum der Erfindung weist ein spezifisches Spektrum mit Absorptionsmaxima bei 233. 276,286 und 327 nm auf. Bei verschiedenen pH-Werten erhält man verschiedene Spektren, wie aus F i g. 1 ersichtlich ist. Die durchgezogene Linie dieser Abbildung stellt das Spektrum einer Lösung von 13 mg/1 des Antibiotikums in einem Gemisch aus gleichen Teilen Methanol und Wasser dar. Die gestrichelte Linie zeigt das Spektrum einer ähnlichen Lösung, bei der an Stelle von Wasser 0,5 n-Natriumhydroxidlösung verwendet wurde, während die punktierte Linie das Spektrum einer ähnlichen Lösung mit 0,5 η-Salzsäure an Stelle von Wasser zeigt.

Eine dünnschichtchromatographische Auflrennung des Antibiotikums zeigt, daß es aus drei Verbindungen besteht, die im Gleichgewicht miteinander stehen. Das Chromatogramm mit einem Gemisch aus 12 Teilen Aceton, 8 Teilen Essigsäureäthylester und 1 Teil Wasser auf Kieselgel ist in F i g. 2 zu sehen, wobei die punktierte Linie den Start anzeigt.

IR-Spektrum

Das IR-Spektrum des Antibiotikums als Kaliumbromid-Preßling ist in F i g. 3 wiedergegeben. Die wichtigsten Absorptionsmaxima liegen bei 810. 860. 940, 980, 1090, 1215, 1355, 1455, 1540, 1650. 2930. 2970 und 3400 cm"¹.

NMR-Spektrum

Das NMR-Spektrum des Antibiotikums ist in F i g. 4 wiedergegeben.

Tabelle A

Vergleich von MYC 8003 mit anderen Antibiotika 45

674

Das NMR-Spektrum wurde in einem Gemisch von Hexadeutero-dimethylsulfoxid und Deulero-Chlo;oform mit Tetramethylsilan als internem Standard mit einem 60-MHz-Kernresonanzspektrometer aufgenommen. Die Λ- Werte sind in ppmangegeben. Obwohl es bei dieser Auflösung nicht möglich ist, jedes Maximum mit einem Teil der Struktur in Zusammenhang zu bringen, können die folgenden Gruppierungen im Spektrum gefunden werden:

CH₃ an gesättigtem Kohlenstoff, Λ 0.8—1,0
CH₃ an doppelt gebundenem

Kohlenstoff 1,68-2,01

Singulett OCH₃ 3.18

Gesättiete CH und CH-, nebst N

oder*O ' 3,2—4,5

H an doppelt gebundenem

Kohlenstoff 5.4—6,8

und 7.4
Amide NH 8.1

Das Maximum bei 7,73 ppm stimmt mit dem Signal von Spuren CHCl₃ überein.

Elementaranalyse für C₄₃H^₀N₂O₁₂
(durch Differenzbildung):
Berechnet ... C 63,8. H 7,6. N 3,5, O 25.1:
uefunden .... C 64,8. H 7,6, N 3.5. O 24.1.

Molekulargewicht

Die Molekulargewichtsbestimmung wurde durch isotherme Destillation durchgerührt. Eine Lösung des Antibiotikums in Aceton und eine Lösung von Azobcp.zol (als Standard) wurden getrennt in ein verschlossenes und evakuiertes System gebracht. Wegen des unterschiedlichen Dampfdruckes über den Lösungen destilliert so lange Aceton über, bis Gleichgewicht etreicht ist und beide Lösungen gleiche Molarität aufweisen. Das Verfahren wurde bei einer konstanten Temperatur von 23"C durchgeführt. Für das Antibiotikum wurde ein Molekulargewicht von 714 berechnet. Eine Lösung des Antibiotikums in einem Gemisch aus gleichen Teilen Wasser und Methanol wies bei Titration mit 0,1 η NaOH ein Neutralisationsäquivalent von 817 auf. Aus der Summenformel beträgt das Molekulargewicht 797.

Aus obigen Angaben läßt sich Tür Mocimycin, wie inzwischen gefunden wurde (vgl. Tetrahedron Letters 52 [1973], S. 5173 bis 5176), die in Anspruch 1 wiedergegebene Formel I ableiten.

Mocimycin unterscheidet sich, wie die folgenden Tabellen zeigen, von bekannten Antibiotika.

Antibiotikum

Lileruturstcllc

MYC 8003
Erythromycin

Carbomycin

DT-PS 9 20934 DT-PS 9 66 635

Natur	Aussehen	Elementare	UV-Maxi	Bemerkungen
		Zusammen	mum
		setzung
			(nm)
Säure	gelb	N 3,5%	327
Base	weiße	N <2%	280
	Kristalle
Base	weiße	N 1,5%
	Kristalle

5

2

19 052

17 783

1 40 674

Produkt

Organismus

Eigenschaften, bei

Melaninbildung

S.

J 6

(nm|

P-haltig

232

+ Ninhydrin

DT-PS 10 21 130

70 558

denen sich Unter

H₂S-Bildung

)

N 4,4%

231

+ FeCl,—

Fortsetzung

Literalursielli

26 458

schiede zeigen

> Melaninbildung

207 Mol. G. 1400

Antibiotikum

DT-OS 16

Natur Aussehen

Thiopeptin

Streptomyces

Lufthyphen

Glukose-

245

+ Ninhydrin

DT-OS 17

tateyamensis

Asparagin-Agar

+ Biuret

DT-OS 19

00 363

Lufthyphen

ülemenlarc UV-Maxi- Bemerkungen

[C 45% <210 Anthron

268 Ninhydrin

DT-PS 10

Lufthyphen

Zusammen- mum

SN 8,9%

+ Mol. G. 1600

Spiramycin

Base weiß

Mdaninbildung

sctzung

Io 39,1%

Foromacidin

DT-OS 18

17 111

Base weiße

Methobottro-

SterptomyceE

Sporen

N 13,8%

29 355

Kristalle

mycinamide;

canadensis

Antibiotika bildenden

Prasinomycin

20027

Amethobottro-

MA-959

Stärkeagar

Taimycin

DT-OS 17

weiß

mycinamide

lösliches Pigment

N 14,5%

Organismus von Spalte 3

SF 767

DT-OS 19

Base weiß

vegetatives

S-hallig

Methoboltromycin * DT-OS 16

Mycel

S-haltig

Tabelle B

Nitratreduktion

dick (charakteristisch)

Tsushimycin

Unterschiede 2

weiß

Tsushimycin

Streptomyces

; Sporen

)9 und anderen

Z-237

Melaninbildung

keine Spiralen

Lüifthyphen

Streptomyces

weiß bis bräunlich
weiß

Enduracidin

Base weiß

Lufthyphen

ramocissimus

Thiopeptin

zylindrisch

SF-767-A;

Streptomyces

> Sporen

Normaler

1.0 X 1.7 μ

SF-767-L

microsporus

Querschnitt

hellbraun

wischen Streptomyces ramocissimus CBS 19O.(

ATCC 21 38^

1 flüssige Kultur

Spiralen

Mikroorganismen

grau

hellbraun

Druckschrift bzw.

Lufthyphen

stark positiv

ältere Patent

Czapek-Glycerin

oval 0,9 χ 1,3 μ

negativ

anmeldung

Melaninbildung

stachlig

DT-OS

Taimycin

Streptomyces- Sektion

hellgelb

—

19 29 355

michiganensis Gruppe

oft bräunlich

var. amylo-

hellgelb bis grau

gut entwickelte

lyticus

Spiralen

Carbomycin

Streptomyce:

stark positiv

rund 0.3—0,5 χ

DT-OS

halstedii

glatt

0,5—0,7 μ

16 20027

NRRL 2331

stark positiv

auch stabförmig

(nach

grau

(Nocardia-artig)

Hütter*)

primitive

blau

synonym m.

Spiralen

Kolonie dunkelgrün

aureofaciens

oval 0,9 x 1,3 μ

—

Rectus fiexibilis

DT-OS

nur als ver

griseus

18 OO 363

zweigte Fäden

schwach

grau

mäßig

Kolonie hellgrau

—

stark positiv

reichliche Sporen

DT-OS

Spira cinereus

bildung, mausgrau.

19 26458

stark positiv

bis dunkelgrüngrau

stark positiv

kein Luftmycel

DT-OS

17 70 558

DT-PS

9 66 635

*l H ü t t c r. Systematik der Slrcptomycctcn (1957).

Fortsetzung

Druckschrift bzw.
ältere Patentanmeldung

DT-PS
10 21 130

Produkt

Organismus

Eigenschaften. Sv denen sich Lnici schiede zeigen

Erythromycin Streptomyces Sporen

erythreus Luftmycel

Streplomyccs
rninoeissimus

glatt

aschgrau bis
dunkelgrau

Foromacidin

Streptomyces A 8703 und A 9427

16 17 783

Prasinomycin

Streptomyces hirsutus u. Streptomyces prasinopilosus

(nach

Hütter*)

synodym)

·) H ü 11 e r. Systematik der Streptomycin (1957).

Das mikrobiologische Wirkungsspektrum des Antibiotikums der Erfindung gegenüber einer Reihevon Mikroorganismen wurde durch du: übliche Verdünnungsmethode bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle I wiedergegeben.
Tabelle I -

Melaninbildung Substratmycel

Kolonien auf

synthetischem

Agar

Stärkeagar:

Wachstum

Kolonien

Hydrolyse Kartoffel

Nähragar

H₂S

N O₃-Reduktion

Lufthyphen

Melaninbildung Organismus von Spalte .

(n. Hü ti er*) stachlig, zuerst gelbweiß oder gelbgrün, später rotbraun oder hellgrau

gelbweiß bis goldgelb

hellgelbrot bis dunkelbraun

stark positiv
hellgrau bis
hellbeige
hellgrau bis
sehr hellgelbbeige

gut hellgelb bis grau

stark

Pigment

schwarzbraun braunes Pigment kein Pigment

stark positiv —

aschgrau bis grün

dunkelgrau

stark positiv —

schwach

rötlichgrau (A 8703) braun (A 9427) schwach kein Pigment

Untersuchter Mikroorganismus

40 Minimale Hemmkonzentration

Ijig/ml)

Untersuchter Mikroorganismus

Bacillus subtilis ATCC 6633
Bacillus cereus ATCC 9139
Staphylococcus aureus A 55
(ATCC 6538 P)
Staphylococcus aureus A 321 Staphylococcus aureus A 355*) Staphylococcus aureus L 160a*) Streptococcus haemolyticus A 266 Streptococcus faecalis L 80
Micrococcus flavus A 54
Sarcina lutea ATCC 9341
Bruceila melitensis A 488
Pasteurella multoeida A 723 Salmonella dublin P 43
Escherichia coli U 20
Escherichia coli H

Minimale

Hemm-

konzcnlration

^g/ml)

0.3

25

50

>100 >100 >100 >100

25

25 1.5 25

>100 >100 > 100

•1 Rechnet Pcmcilhnasc bildende Mikroorganismen

Erwinia carotovora W 9 25

Pseudomonas aeruginosa L 94 > 100

Pseudomonas aeruginosa 2396**) > 100 Proteus retlgeri A 821 50

Proteus mirabilis H 3 50

Proteus mirabilis L 93 > 100 Proteus morganii 2241**) 50

Haemophilus influenzae A 773 4

Actinobacillus equuli T 3

Candida albicans A 7 > 100

Candida parapsilosis A 952 > 100

Torulopsis glabrata A 420 > 100

Saccharomyces cerevisiae D 160 > 100

Trichophyton mentagrophytes R 177 > 100

Aspergillus niger D 184 > 100

Lactobacillus acidophilus D 218 > 100 Clostridium welchii A 738 15

Vibrio coli 1846 100

Streptococcus agalactiae A 732 ] 5

⁶S Streptococcus disgalactiae A 730 15

Mycoplasma gallisepticum K 514 etwa

**) Bezeichnet kürzlich isolierten Krankenhausstamm.

10

Aus Tabelle I ist ersichtlich, daß das Aniihiotikum eine hohe Aktivität gegen Mycoplasma galiisqiucum, aber fast keine Aktivität gegen eine Anzahl von humanpathogenen Mikroorganismen aufweist. In vivo ist es gegenüber Mycoplasma gallisepticum nicht aktiv. Die Toxizität des Antibiotikums wurde an verschiedenen Tieren untersucht. Die akute Toxizität ist sehr gering. Eine intraperitoneale Dosis von 1000 mg/kg ist Tür Mäuse nicht tödlich. Bei Ratten und Hühnern führt eine orale Verabreichung in Konzentrationen bis zu 0,1% des Futters über 2 Monate hinweg zu keinen unerwünschten pharmakologischen Wirkungen.

Es wurde festgestellt, daß das Antibiotikum der Erfindung besonders als wachstumsförderndes Mittel in der Tierzucht, z. B. von Rindern, Schweinen und Geflügel, wertvoll ist. Es kann auf übliche Weise, z. B. als Zusatz im Futter, verabreicht werden. Das Antibiotikum eignet sich auch zur Bekämpfung von Krankheiten, die von bestimmten Darmmikroorganismen, z. B. Vibrio coli oder Clostridium welchii. verursacht werden.

Versuchsbericht

Folgende Antibiotika wurden bisher als Futteradditive in der Bundesrepublik zur Mästung von Vieh verwendet:

Additiv in Gramm pro Tonne Futter

(a) Oxytetracyclin Ferkel 30 ppm

Kälber 60—120 ppm

(b) Taomycin Ferkel 15 ppm

(c) Chlortctracyclin Ferkel 30 ppm

Kälber 60—120 ppm

(d) Virginiamycin

Schlachthühnchen

(e) Zinkbacitracin Schlachthühnchen

Ferkel

(0 Nitrovin Schlacht

hühnchen

(g) Moenomycin- Kälber
Komplex

5—7,5 ppm 5—10 ppm

10—15 ppm 12 ppm

8—15 ppm Schon seit längerer Zeit bestehen Bedenken gegen die Verwendung von Antibiotika als Futteradditive, wenn diese Antibiotika auch in der humanen una Veterinären Therapie angewendet werden, da befürchtet wird, daß sich eine Bakterienflora bildet, die gegen diese Antibiotika resistent ist, und Mensch und Tier bedroht. Die Entdeckung, daß diese Resistenzeigenschaft auf andere gefährliche Bakterienarten übertragen werden kann (z.B. von Escherichia coli auf ίο Salmonella typhimurium), hat diese Gefahr noch verstärkt. Es war zu erwarten, daß die Verwendung bestimmter Antibiotika sowohl für die humane und Veterinäre Therapie als auch für Futteradditive verboten werden würde.

Ein derartiges Verbot erfolgte insbesondere nach Erscheinen des Swann Reports im November 1969, wobei verschiedene europäische Länder dieses Verbot nacheinander erließen (die Bundesrepublik Deutschland am 1. Januar 1974). Die oben unter (a). (b) und (c) genannten Produkte fallen u. E. unter diese; Verbot. Es liegt jedoch klar auf der Hand, daß Antibiotika, die nicht als Therapeutikum verwendet werden, wie Nocimycen (MYC 8003) einen erheblichen Vorteil bei der Verwendung als Tierfutteradditiv aufweisen. Dabei ist aber wesentlich (wie auch von verschiedenen Ländern gefordert), daß das zu schlachtende Tier lediglich eine Höchstmenge des verwendeten Additivs und/oder der daraus im Körper gebildeten Umwandlungsprodukte enthält. Zwei Faktoren spielen dabei eine wichtige Rolle: erstens, inwieweit das Additn und/oder die darin enthaltenen Verunreinigungen vom Körper resorbiert werden, und zweitens, wie hoch die Konzentration des Additivs im Futter ist. Es ist bekannt, daß Virginiamycin (d) zu 15 bis 18% resorbiert wird (M.B. R ober fr ο id, P.A. D u mo nt, J.Antibiot., Bd. 25 [1972], S. 30 bis 35), wodurch die Wahrscheinlichkeit, daß ein Rückstand im Körßer verbleibt, wesentlich höher ist als bei MYC 8003, wovon weniger als 2% resorbiert werden. Dies stellt einen bedeutenden technischen Fortschritt dar. Darüber hinaus wurde durch einen Vergleichsversuch, der an Testgruppen von je 3ύ Ferkeln durchgeführt wurde (der Versuch wurde in einem unabhängigen Institut durchgeführt, nämlich dem Institut ILOB in Wageningen, Holland), festgestellt, daß schon vergleichbare Wachstumsdaten erzielt wurden bei einer Dosierung von MYC 8003, die nur ein Viertel derjenigen von Virginiamycin betrug.

Ferkel, Wochen	Blindversuch ohne Antibiotikum	2.5 ppm MYC 8003	110.7%	IO ppm Virginiamycin	107.1%
0—2	2.8kg(= 100%)	3.1 kg	110 0%	3,0 kg	108.9%
0-^1	9.0kg(= 100%)	9.9 kg	109.8%	9,8 kg	108.0%
0—6	16,3 kg ( = 100%)	17,9 kg	107.7%	17.6 kg	106.9%
0—8	24,7 kg ( = 100%)	26.6 kg	105,5%	26,4 kg	106.1%
0—10	34.3 kg (= 100%)	36,2 kg	105,2%	36,4 kg	106.1%
0—12	44.3 kg (= 100%)	46.6 kg	47,0 kg

Weitere Versuche wurden im Institut ILOB mit Schlachthühnchen durchgeführt, wobei das mit MYC 800J erhaltene Ergebnis mit dem von Zinkbacitracin verglichen wurde. Die angeaebenen Daten sind Durchschnitts zahlen aus Versuchen mit je 270 Hühnchen.

Hühnchen.	Wochen	Bliiulvcrsuch	100%)	2.5 ppm	MYC 8003	10 ppm	Zink bacitracin
0—4		6llg( =	100%)	629 g	102.9%	620 g	101,5%
0 ■■--7		1445 g ( =	1475 g	102,1%	1471 ι*	101.8%

Der gleiche Versuch mit Ferkeln (24Tiere pro Versuchsgruppe) führte zu folgendem Ergebnis:

Kcrkcl. Wochen	Blindversuch	2.5 ppm MYC 8003	20 ppm Zinkbacitracin	102,6%
0-2	3,8kg(= 100%)	4,1kg 107,9%	3,9 kg	104,3%
0—4	9,3kg(= 100%)	10,1kg 108,6%	9,7 kg	104,4%
0—6	16,0kg(= 100%)	17,0 kg 106,2%	16,7 kg	103.8%
0—8	23,5 kg (= 100%)	24,9 ke 106,0%	24,4 kg

Die Vorteile von MYC 8003 über Zinkbacitracin sind ebenfalls klar ersichtlich: mit einer wesentlich geringeren Menge an Antibiotikum wird ein besseres Wachstum erzielt.

Ähnliche Ergebnisse wurden in Schweden bei einem Vergleichsversuch mit MYC 8003 und Nitrovin erhalten. Auch bei diesem Versuch zeigte sich, daß eine Dosis von 2,5 ppm MYC 8003 eine bessere Wirkung hat als 10 ppm Nitrovin.

Vergleichsve suche mit MYC 8003 und Flavomycin (Molnonycinkomplex in Form des Mycels) bei Kälbern können nicht durchgeführt werden, da Flavomycin 95% unwirksamen Stoff von wahrscheinlich wechselnder Zusammensetzung enthält. Das Produkt wird nämlich als 5% aktives Material zusammen mit getrocknetem Mycelium verkauft. MYC 8003 wird dagegen rein aus dem Herstellungsverfahren erhalten und erst dann mit Trägern bekannter Zusammensetzung (z. B. Kreide oder Stärke) vermischt. Unter Bezugnahme auf die erzielten Ergebnisse von Versuchen mit MYC 8003 bei Kälbern ist jedoch anzunehmen, daß auch dabei günstige Werte erhalten werden.

Zusammenfassend ist festzustellen, daß MYC 8003 im Vergleich mit anderen bekannten Viehfutterantibiotika sehr große Vorteile aufweist.

Der Mikroorganismus Streptomyces ramocissimus CBS 190.69, der das Antibiotikum der Erfindung erzeugt, wird nachstehend charakterisiert. Dazu wurde »Systematik der Streptomyceten« von R. H ü 11 e r (1957) und »International Journal of Systematic Bacteriology«, Bd. 18, Nr. 2 (1968). verwendet und die von der International Streptomyces Project (im folgenden als ISP abgekürzt) zur Charakterisierung vorgeschriebenen Regeln berücksichtigt. Eine Kultur dieser Mikroorganismen wurde beim »Centraa! Bureau voor Schimmelcultures« in Baarn. Niederlande, unter der Nummer CBS 190.6·? hinterlegt. Die neue:. Mikroorganismen wurden als Streptomyces ramocissimus bezeichnet.

A. Vegetatives My eel

Das Wachstum auf den meisten Medien ist gut. Die Kolonien besitzen das charakteristische Aussehen von Actinomycetes und sind lederartig, etwas gefaltet. Normalerweise ist die Farbe der Kolonien nicht sehr

charakteristisch, da sie von im wesentlichen farblosen über hellgraue und hellbeige zu hellgelben Kolonien geht, mit Ausnahme bei der Züchtung auf Nährmedien, auf denen sich die Kolonien durch Melaninbildung braun bis dunkelbraun färben (Malz-Pepton-Agar, Hirn-Herz-Infusionsagar).

B. Luftmycel

Auf den meisten Nährmedien ist ein Luftmycel makroskopisch kaum oder gar nicht zu sehen. Auf einigen Medien, wie Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar. Hafermehl-Agar und insbesondere Stärke-Agar mit anorganischen Salzen, wird jedoch reichlich Luftmycel gebildet. Zuerst ist ein solches Mycel weiß, wird aber bei guter Entwicklung dunkelgrau und wird oft aus ziemlich kurzen, unregelmäßig verzweigten Hyphen gebildet, die Sporenketten an kurzen Seitenachsen in Form einfacher Schlingen oder primitiver Spiralen mit nicht mehr als 2, 3 oder 4 Windungen (Abteilung: Spira) aufweisen. Manchmal sprießen 2, 3 oder 4 dieser Spiralen als Pseudowirbel im wesentlichen aus der selben Stelle an den Hauptachsen. Andere Sporenketten sprießen als primitive Spiralen direkt aus dem Substratmycel (auf ähnliche Weise wie Retinaculum-Apertum). Außerdem sind im Luftmycel häufig zahlreiche nahezu kugelförmige Körper sichtbar, wahrscheinlich auf Grund einei Menge von Sporen aus einer primitiven Spirale, die von einem Flüssigkeitsfilm umgeben ist.

C. Conidien

In den spiralenähnlichen Hyphen werden Bändei von meistens mehr als zehn leicht elliptischen Conidier gebildet Die Oberfläche der Conidien ist glatt. Dk Größen sind ziemlich verschieden, der Durchschnit Heat bei etwa 0.9 bis 1,3 ti.

D Einfluß der Temperatur auf das Wachstum

Das Wachstum ist bei 20 C langsam, bei 26 C mäßig, bei 30 C gut. bei 37 C optimal und ausreichem bei 40 C. Über 40 C hört das Wachstum auf (meso phil).

E. Physiologische Eigenschaften

Die physiologischen Eigenschaften sind in Ta belle II wiedergegeben.

"abelle 11

Eigenschaft

Diagnose-Nährmedium

Molaninbildung
H,S-Bildung
Gelalineverflüssigung
Nitratreduktion

Diastatische Wirkung
Koagulation und Peptonisierung von Milch

Melanin-Medium nach Shinobu, 1958 (ISP med. 7)

»Bacto-Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Agar« Eisen(111 )-Zucker-Agar einfache Gelatine

Nitratreduktion-Nährmedium nach Waksman

Stärke-Agar Lackmus-Milch

Physiologische Rcikiionen

stark positiv

stark positiv stark positiv nach 16 Tagen bei 30 C vollkommen verflüssigt stark positiv

stark positiv nach 16 Tagen koaguliert und zum größten Teil peptonisierl (pH 7,9)

In den Tabellen 111 und IV ist ein Überblick über das Wachstum und das Aussehen des Mikroorganisnn Streptomyces ramocissimus auf einer Anzahl von Substraten gegeben.

Tabelle III

Aussehen des Mikroorganismus nach lotätigem Wachstum bei 30' C

Substrat	Wachstum	Lösliches Pigment	Luft mycel	Vegetatives Mycel
Malz-Pepton-Agar	gut	dunkelbraun	—	schokoladebraun gefärbte Kolonien
Emerson-Agar	gut	Hraun	—	hellbraun bis beige Kolonien
Nähr-Agar	gut	braun	—	hellbraungelbe bis gelb
				beige Kolonien
Nähr-Agar + 1 % lösliche	gut	braun	—	hellbraungelbe bis gelb
Stärke				beige Kolonien
Hafermehl-Agar	gut	hellbraun	anfänglich weiß,	hellbeige bis gelbbeige
			später hellgrau
Stärke-Agar	gut	hellgelb	—	hellgelb bis grau
Kartoffel-Glucose-Agar	gut	schmutzig	— ■	ziemlich tief gefaltet.
		dunkelbraun		dunkelbraune Kolonien
Czapek-Gi ucose-Aga r	recht gut	—	—	hellgelb bis grau
Czapek-Saccharose-Agar	recht gut	—	—	hellgräulich bis weiß
Czapek-Glycerin-Agar	recht gut	—	—	hellgrau
Glucose-Asparagin-Agar	gut	—	—	hellgelb verschmelzende Kolonien
Glycerin-Asparagin-Agar	gut	—	sehr spärlich am Kolonienrand	blaßgrünlichgrau
Glucose-Calcium-Malat-Agar	gut	—	X ^ VJ 1 Vj 1 ■ A^^il ι 1 Vl Λ ■ ^*	hellgelb bis weiß
Natriumcitrat-Agar	mäßig			graubeige
Hirn-Herz-I nfusions-Agar	mäßig	schwarzbraun	—	schokoladebraun
Küster-Williams-Agar (vgl.	gut	hellbraun	sehr spärlich,	sehrhellgrünlich beige
Nature, Bd. 202 [1964],			grauweiß
S. 928)
Ber.net-Agar	gut	hellbraun	sehr spärlich, weiß	hellbraun bis beige
Kartoffelscheiben	gut	fast schwarz	—	schwarzbraun, stark ge
				faltete Kolonien

st

Tabelle IV

Jeschreibung des Mikroorganismus nach 13täiigem Wachstum auf vorn ISP vorgeschriebenen Nährmedien

Substrat

Wachstum

Lösliches Luflmycel Pigment

Vegetatives Mycel

A. bei 30 C

Hefe-Malz-Extrakt-Agar «ut

Hafermehl-Agar gut

(ISPIlI)

Anorganische Salze gut

Stärke-Agar(ISPlV)

Glycerin-Aspaiacin-Aear gut
(ISPV)

B. bei 37 C

ISPIl gut

ISPIV
ISPV

ziemlich reichlich, weiß, später grau hellbraun bis beige

sehr spärlich, hauptsächlich entlang
des Randes

reichlich, hellgrau, später fast schwarz

recht reichlich, hellgrau, später dunkelgrau bis fast schwarz

— ziemlich reichlich, hellgrau

gut — ziemlich reichlich, weiß

sehr — reichlich, dunkelgrau, später in be-

gut stimmten Flecken fas: schwarz

gut — ziemlich reichlich, hellgrau, später

dunkelgrau bis fast schwarz flache, blaßgelbe

bis graue Kolonien

mit sehr tief ins Agar

hineinwachsenden

Rändern

flache, hellgraue bis

blaßgelbbeige

Kolonien

hellgraue bis hellgelbe Kolonien

Kolonien mit tief
ins Agar wachsenden
Rändern

flache blaßgraue bis
hellbelbgraue Kolonien mit tief ins Agar
wachsenden Rändern
flache, hellbeige bis
hellgelbbeige Kolonien hellgraue bis hellgelbe Kolonien

Ein Vergleich der Eigenschaften von Streptomyces ramocissimus CBS 190.69 mit denen verwandter Stämme von Streptomyces, d. h. Streptomyces tendae CBS 432.59, Streptomyces tendae CBS 565.68 und Streptomyces collinus 1.301 (ETH 24.318), bei Züchtung auf von der ISP empfohlenen Nährmedien bei 30 und 37°C macht deutlich, daß Streptomyces ramocissimus von den bisher bekannten Streptomyces-Stämmen verschieden ist.

Das Luftmycel von Streptomyces collinus kann unter geeigneten Umständen zu deutlich langen, wenig verzweigten Hyphen, die mehr oder weniger horizontal über der Kolonie liegen, wachsen, wobei kurze, im allgemeinen schleifenförmige Sporenketten eingepflanzt sind. Ganz im Gegensatz dazu ist das Luftmycel von Streptomyces ramocissimus ausgesprachen kurz und stark unregelmäßig verzweigt. Die Farben der beiden Mycelien sind ebenfalls vollkommen verschieden. Das Luftmycel von Streptomyces ramocissimus ist grau bis dunkelgrau, während das von Streptomyces collinus im allgemeinen weiß, hellgelb oder cremefarben bis nur hellgrau ist. Das Substfatmycel, besonders bei Wachstum auf »Basal-Mineralsalze-Agar-Nährmedien« unter Zusatz von verschiedenen Kohlenstoffverbindungen, ist bei Streptomyces ramocissimus vorwiegend gräulich gefärbt, während das von Streptomyces collinus hellbraun, braunrot oder sogar dottergelb ist. Unterschiede treten auch in den physiologischen Eigenschaften, in der Nitratreduktion, in der Gelatineverflüssigung, in dem Ausmaß der Stärkehydrolyse und in der Zersetzung von Calciumoxalat und Oxalsäure auf. Diese Unterschiede zeigen, daß die Mikroorganismen der Erfindung nicht zu Streptomyces collinus gezählt werden können.

Die Unterschiede zwischen Streptomyces ramocissimus und den beiden genannten Streptomyces tendae sind geringer als zwischen Streptomyces ramocissimus und Streptomyces collinus. Zum Beispiel zeigt die Färbung des Luftmycels von Slreptomyces ramocissimus nur einen geringen Unterschied zu dem von Streptomyces tendae, während die Sporenketten oft zu Haken oder zu Schleifen gebogen sind. Die Sporenketten der untersuchten Streptomyces tendae sind jedoch im allgemeinen langer als die von Streptomyces ramocissimus. Die Sporenketten von Streptomyces rendae erheben sich im allgemeinen direkt aus dem Agar, während die Sporenketten von Strepto myces ramocissimus im allgemeinen als monopod« Seitenketten entlang der kurzen Lufthyphen ange ordnet sind, wenngleich auch manchmal das gleich« Verhalten wie bei Streptomyces tendae beobachte wird.

Ein wichtigerer taxonomischer Unterschied be steht in der Bildung eines melanoiden Pigments au den ISP-Medien 6 und 7 (Melaninmedium nac Shinobu bzw. Pepton-Hefeextrakt-Agar). Die untei suchten Stämme von Streptomyces tendae bilde

A ι

kein braunes Pigment auf diesen Nährmedien, während Streptomyces ramocissimus ausgesprochen melaninpositiv reagiert. Folgende Unterschiede in den physiologischen Eigenschaften wurden beobachtet:

medium gezüchtet. Nach der Züchtung wurde die Gärmaische mit etwa 2% Diatomeenerde als Filtrierhilfe versetzt und filtriert. Das Fiitrat wurde _mj_t 8 η-Schwefelsäure auf den pH-Wert 6,0 angesäuert und zweimal mit je V₅ seines VolumensJvlethyljsobutylketon extrahiert. Die so gebildeten fcmulsionen wurden mit schnell filtrierender Diatomeenerde als Filtrierhilfe gebrochen. Die organischen Phasen wurden vermischt und unter Verwendung eines R_Ot_ationsverdampfers unter vermindertem Druck auf etwa 11 eingeengt. Das Konzentrat wurde langsam zu 51 Petroläther (Siedebereich 40 bis 60 C) gegeben, und der dabei gebildete Niederschlag wurde mit einer Glasfilterfritte(D3) abfiltriert, mit frischem Petroläther gewaschen und getrocknet. Man erhielt eine durchschnittliche Ausbeute von 78 g eines gelbgefärbten Puivers.

Durch Verteilungschromatographie wurden 2 g ro-Auf Grund der erwähnten Unterschiede ist Strepto- hes Antibiotikum (in der sauren Form) gereinigt. Die myces ramocissimus nicht zu Streptomyces tendae zu 20 stationäre Phase bestand aus mit 0,1m Na₁CO₃/ rechnen. NaHCO₃-Puffer vom pH-Wert 11 imprägnierter Di-

Die Züchtung der Mikroorganismen kann in flüssi- atomeenerde, und die bewegliche Phase bestand aus gen Nährmedien durchgeführt werden, die übliche einem Gemisch aus Petroläther und Butylacetat. Kohlenstoff-, Stickstoff-, Phosphor-, Calcium-, Eisen-, Man erhielt 0,828 g gereinigtes Antibiotikum mit den Schwefel-, Magnesium- und Kaliumquellen, Vitamine 25 oben angegebenen physikalischen und chemischen und Spurenelemente enthalten. Beispiele dafür sind Eigenschaften. "^=L '' " - --- - - - - Einegesättigte Lösung des Antibiotikums in Wasser

unter Zusatz von 0,1 η-Natriumhydroxid, bis der pH-Wert 9 erreicht war, wurde hergestellt. Die Lösung wurde filtriert und unter Zusatz von Butanol azeotrop eingedampft. Der Rückstand wurde in einer kleinen

	Slreptü-	Sireptc-
	myces	myces
	ramocissi-	lendae
	Ol JS
Nitratreduktion	positiv	negativ
Gelatineverflüssigung ·	positiv	negativ
Ausmaß der Stärke	stark	schwach
hydrolyse	positiv	positiv
Zersetzung von Calcium-	negativ	positiv
oxalat und Oxalsäure

Nährmedien, die z.B. Melassen, Malzbrei. Erdnußmehl, Lactose, Kartoffelstärke, Maisquellwasser oder Hefeextrakt enthalten.

Nach beendeter Züchtung wird die Gärmaische filtriert und das Fiitrat mit einem organischen Lösungsmittel, wie Butanol, Chloroform oder vorzugsweise Methylisobutylketon, bei pH-Werten von etwa 5 bis 8 extrahiert. Der Extrakt wird eingedampft, oder Menge wasserfreiem Butanol unter vermindertem Druck bei etwa 45⁰C aufgenommen. Die Lösung wurde gerührt und tropfenweise mit Petroläther ver-

die Verbindung wird mit einem das Antibiotikum 35 setzt, bis das Salz vollkommen ausfiel. Der Nieder

schlecht lösenden Lösungsmittel, z.B. Petroläther, ausgefällt. Die Reinigung des Antibiotikums kann durch Säulenchromatographie an Ai₂O₃, Verteilungschromatographie und bzw. oder Gegenstromverteilung unter Verwendung eines Gemisches aus Methylisobutylketon und Essigsäureäthylester oder eines 1: 1 -Gemisches aus Essigsäureäthylester und Diäthylester als bewegliche Phase und Dicarbonat-, Phosphat- oder Boratpuffer als unbewegliche Phase er-

40 schlag wurde abfiltriert, gewaschen und getrocknet. Man erhielt das Natriumsalz des Antibiotikums.

Beispiel 2

Masthühnern wurde das Antibiotikum in Form des nach Beispiel 1 erhaltenen Natriumsalzes zusammen mit dem Futter (Weizenmehl) verabreicht.

, —_. ~~,_u.._FU1„.i au Linucwcgiitiic riittsc ei- sammen mit dem Futter (Weizenmehl) verabreicht.

folgen. Gewünschtenfalls kann das Antibiotikum in 45 Die Menge des im Futter enthaltenen Antibiotikums ein Salz z B das Natil übfüh d (b f d Giht d Ftt) i i Tb

ein Salz, ζ. Β. das Natriumsalz, übergeführt werden.

Zur praktischen Verwendung als Futterzusatz in der Viehzucht kann das aus der Gärmaische durch Extraktion und Ausfällung isolierte Produkt auch direkt ohne weitere Reinigung verwendet werden.

Das Antibiotikum oder seine Salze werden als Futtermittelzusätze verwendet und können nach einem üblichen Verfahren mit dem Futter vermischt werden, z. B. durch Mahlen, Rühren oder Schütteln. Im allgemeinen ergibt eine Konzentration von 5 bis 20 Gewichtsteilen/Million des Antibiotikums oder seiner Salze in den Futterstoffen eine zufriedenstellende wachstumsfördernde Wirkung.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

(bezogen auf das Gewicht des Futters) ist in Tabelle V zusammen mit dem Gewicht der Hühner nach 3, 5 und 7 Wochen aufgeführt.

Tabelle V

55

60

Beispiel 1

Mikroorganismen des Stammes Streptomyces ramocissimus (CBS-190.69) wurden bei einem pH-Wert von etwa 7 unter Rühren und Belüften in 2000 1 einer 20 g üerstenmalzpaste, 10 g Hefeextrakt und 5 g Maisquellwasser-Feststoffe pro Liter enthaltenden Nähr-

	Alter	5 Wochen	7 Wo
	3 Wochen		chen
		1%)	(%)
	<%)	100	100
Kontrolle	100	103	103
5 Teile/Million	104	105	104
10 Teile/Million	107	107	105
20 Teile/Million	109

Die Tabelle zeigt, daß bei Hühnern nach Verabreichung des Antibiotikums eine Wachstumssteigerung eintritt. Eine Verbesserung der Futterverwertung

um etwa 3 bis 5% wird bei Hühnern innerhalb von 7 Wochen erreicht, wenn die Nahrung 5 bis 20 Teile; Million Antibiotikum enthält.

Beispiel 3

Das njich Beispiel 1 erhaltene Natriumsalz des Antibiotikums wurde Schweinen in Form eines Gemisches mit Futter (Weizenmehl) verabreicht. Die Antibiotikum-KonJientrationen des Futters (bezogen auf das Gewicht des Futters) sind in Tabelle Vl zusammen mit den durchschnittlichen relativen Gewichten der Schweine nach 6 bzw. 12 Wochen angegeben.

■

Tabelle VI	6 Wochen	Kutter umsatz*	12 Wochen	Fuiier- umsatz")
Antibiotikum	Wachs tum·)	100 95 92,5	vVachs- ) turn*)	100 98 99
	100 107 108,5		100 104.5 104
0 Teile/Million (Kontrolle) 5 Teile/Million 10 Teile/Million

*) kg Futter zum Erreichen von einer Gewichtszunahme von lkg.

Die Tabelle zeigt, daß das Antibiotikum der Erfindung eine wachstumsfördernde Wirkung aufweist.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

i. Mocimycin (Antibiotikum MYC 8Oü3j mit einem optischen Drehwert [<»]S' von —60 (c — 1% in Methanol), einem Neutralisationsäquivaient von 817 bei Titration mit 0,1 η-Natronlauge, einem UV-Absorptionsspektrum mit Maxima bei 233, 276, 286 und 327 nm, einem IR-Spektrum (gemessen in Kaliumbromid) gemäß F i g. 3 und einem NMR-Spektrum gemäß F i g. 4, das aus drei miteinander in einem Gleichgewicht stehenden Tautomeren besteht und durch die Formel 1