DE2209018A1

DE2209018A1 - Neues Antibioticum A-4696

Info

Publication number: DE2209018A1
Application number: DE19722209018
Authority: DE
Inventors: Robert L. New Rose; Stark William Max Indianapolis; Ind.; Hamill (V.StA.); DeLong, Donald Clifford, Canberra (Australien). C07c 103-52
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1971-02-25
Filing date: 1972-02-25
Publication date: 1972-09-07
Also published as: NL7202390A; HK28077A; BE778901A; DK137863B; IL38693A; NL175196B; IL38693A0; GB1345676A; CY896A; CH567572A5; DE2209018C2; PL88977B1; JPS5749181B2; YU35621B; JPS5592660A; NL175196C; IE36094B1; SE379053B; PH9416A; AR193848A1

Description

Eli Lilly and Company, Indianapolis/ Indiana, V.St.A. Neues Antibioticum A-4696

Die Erfindung betrifft das neue Antibioticum A-4696 und dessen pharmazeutisch annehmbare Säureadditionssalze.

Zahnfäule und Zahnfleischerkrankungen gehören zu den wichtigsten Gesundheitsprobleraen, mit denen die Menschheit ständig zu kämpfen hat. Es gibt überzeugende Beweise dafür, daß Dentalbakterienbeläge zu Zahnkaries oder Zahnfleischschäden oder beiden führen. Es besteht daher ein Bedarf an prophylaktischen Methoden, mit denen die Bildung von Dentalbakterienbelägen bekämpft oder solche Beläge unter dem Wert gehalten werden, bei dem toxische Reaktionen stattfinden. Zwar sind bereits Antibiotica entwickelt worden, welche das Wachstum von belagbildenden Microorganismen hemmen, es besteht jedoch weiter ein Bedarf an wirksameren Mitteln, die zur Verhütung und Behandlung von Zahnfäule und Zahnfleischerkrankungen geeignet sind.

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Ein ständiges Problem in der Landwirtschaft ist die rationelle Produktion von tierischen Proteinen für den menschlichen Verzehr. Es sind viele Mittel, darunter zahlreiche Antibiotica, gefunden worden, die als Futterzusätze zur Erzielung weiterer Gewichtszunahmen bei wachsenden Küken und Schweinen wirksam sind. Es besteht ein nie versiegender Bedarf an verbesserten Mitteln, die sicher und wirtschaftlich sind und als Zusatz zu Tierfutter zur Steigerung der Gewichtszunahme und Verbesserung der Futterverwertung verwendet werden können. Mittel, mit denen dieser Zweck erreicht wird, bedeuten einen echten Fortschritt.

Das erfindungsgemäße Antibioticum wird durch Züchten des Microorganismus Actinoplanes sp., Stamm ATCC 23342 in einem wässrigen Nährmedium unter submers-aeroben Fermentationsbedingungen erzeugt. Das Antibioticum wird aus der filtrierten Ferraentationsflüssigkeit durch Adsorption an einem aktivierten Adsorbens und Eluieren mit einem sauren Lösungsmittel abgetrennt. Antibioticum A-4696 wird durch Adsorption an einem angesäuerten chromatographischen Adsorbens und Eluieren mit einem sauren Lösungsmittel als gereinigte kristalline Verbindung gewonnen. Vorzugsweise wird das Antibioticum in einer wässrigen Methanollösung in das Hydrochlorid- oder Sulfatsalz übergeführt und durch Zusatz von Aceton und Abfiltrieren des entstandenen Niederschlags als reines kristallines Salz erhalten. Antibioticum A-4696 zeichnet sich durch antibakterielle und wachstumsfördernde Wirkung aus.

Das neue Antibioticum nach der Erfindung ist eine basische Verbindung, die mit geeigneten Säuren Salze zu bilden ver mag. Die unten angegebenen Kennzeichnungswerte gelten für das Antibioticum A-4696 in Form seines Hydrochloridsalzes. Das Antibioticum wird zweckmäßig als Hydrochloridsalz

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isoliert und identifiziert, es können aber auch andere pharmazeutisch annehmbare Salze nach bekannten Methoden hergestellt werden.

Antibioticum A-4696 als Hydrochloridsalz ist eine weiße, kristalline Verbindung mit einem Schmelzpunkt von über 22O⁰C. Es ist löslich in Wasser und unlöslich in Lösungsmitteln wie Methanol, Aceton, Äther, Chloroform, Pyridin, Benzol, aliphatischen Kohlenwasserstoffen und dergleichen. Es ist in Lösung über einen pH-Bereich von etwa 1,0 bis etwa 10,0 bei Temperaturen bis zu etwa 27°C sehr beständig.

Die elektrometrische Titration von A-4696-Hydrochlorid in Wasser oder in einer Mischung aus Dimethylformamid und Wasser (2:1), ergibt eine Kurve, die sich im Bereich von pH 6,0 bis 13,0 einer geraden Linie mit einer Steigung von etwa 0,14 nähert.

Ein Mittelwert aus mehreren Microanalysen ergibt für A-4696-Hydrochlorid etwa folgende Elementarzusammensetzung in %: C 51,33; H 5,79; N 5,46; 0 30,96; Cl 6,72. Das aus dem osmotischen Dampfdruck bestimmte Molekulargewicht beträgt 1158.

Der spezifische Drehwert (^alpha/_D) von A-4696-Hydrochlorid bei 25°C beträgt -42,3° (C = 1, H₃O).

Das Ultraviolettabsorptionsspektrum von A-4696-Hydrochlorid in sauren und neutralen Lösungen zeigt ein einziges Absorptionsmaximum bei 276 nm mit einem Extinktionskoeffizienten E* von 45. In basischer Lösung zeigt A-4696-Hydrochlorid

ein einziges Absorptionsmaximum bei 300 nm mit einem

1%

Extinktionskoeffizienten E₁ von 65.

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Das Infrarotabsorptionsspektrum von A-4696-Hydrochlorid in einer Mineralölanreibung zeigt Fig. 1 der beigefügten Zeichnung. Im Bereich von 2,0 bis 15,0 Micron lassen sich folgende Absorptionsmaxima unterscheiden: 3,0, 5,8, 5,9,

6.03, 6,15, 6,28, 6,63, 6,85, 7,27, 7,75, 8,1, 8,25, 8,9,

9.4, 9,9, 10,1 Micron.

Das papierchromatographisehe Profil von A-4696-Hydrochlorid zeigen die in der folgenden Tabelle I angegebenen R_f-Werte. Die Werte wurden in jedem Fall mit Whatman-Papier Nr. 1 und dem angegebenen Lösungsmittelsystem erhalten. Die Lage des Antibioticums auf dem Chromatogramm wurde durch Bioautographie mit Bacillus
subtilis als Testorganismus ermittelt.

Tabelle I

Papierchromatographie von A-4696-Hydrochlorid Lösungsmittelsystem R_f -Werte*

1 . . 0,88

2 0,72

3 0,80

4 0,59

5 0,35

6 0,77

7 0,80

8 0,74

9 0,87

10 0,59

11 0,77

der R_f-Wert ist als das Verhältnis der von dem Antibioticum von der Ursprungsstelle aus zurückgelegten Strecke zu der Strecke, die die Lösungsmittelfront von der Ursprungsstelle aus zurückgelegt hat, definiert.

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Erläuterung der Lösungsmittelsysteme:

1. Mit Butanol gesättigtes Wasser plus 1 % p-Toluolsulfonsäure.

2. Mit Methylisobutylketon gesättigtes Wasser plus 1 % p-Toluolsulfonsäure.

3. Mit Methylisobutylketon gesättigtes Wasser plus 1 % p-Toluolsulfonsäure und 1 % Piperidin.

4. Wasser/Methanol/Aceton (12:3:1). Die Lösung wird mit NH.OH auf pH 10,5 eingestellt und dann wird mit H-PO. auf pH 7,5 vermindert.

5. Methanol/0,1 η HCl (3:1).

6. 1 % Methylisobutylketon plus 0,5 % NH₄OH in Wasser.

7. 7 % Natriumchlorid plus 2,5 % Methylisobutylketon in Wasser.

8. 10 % Propanol in Wasser.

9. Butanol/Äthanol/Wasser (150:15:13,5)

10. Propanol/Pyridin/Essigsäure/Wasser (15:10:3:12)

11. Wasser/Äthanol/Essigsäure (70:24:6).

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Die pharmazeutisch annehmbaren Salze von Antibioticum A-4696 können mit Mineralsäuren wie Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoff säure, Schwefelsäure, Phosphorsäure und dergleichen und auch mit organischen Säuren wie Zitronensäure, Weinsäure, Maleinsäure, p-Toluolsulfonsäure, Salicylsäure, Fumarsäure, Essigsäure, Propionsäure und dergleichen hergestellt werden. Die Antibioticumsalze solcher Säuren können beispielsweise durch Ansäuern einer Lösung der freien Antlbioticumbase mit der gewünschten Säure und Ausfällen des so erzeugten Salzes durch Versetzen der Lösung, die das A-4696-Säuresalz enthält, mit 10 Volumenteilen Aceton erzeugt werden. In manchen Fällen können die Salze auch durch Ionenaustausch in einer Ionenaustauschersäule hergestellt werden. Andere übliche Methoden für die Herstellung von Antibioticumsalzen können ebenfalls angewandt werden.

Das neue Antibioticum nach der Erfindung hat hemmende Wirkung auf das Wachstum vieler Microorganismen, die für Menschen, Tiere und Pflanzen pathogen sind, und ist deshalb zur Unterdrückung des Wachstums solcher Microorganismen vorteilhaft. Die Konzentrationen, in denen A-4696-Hydrochlorid das Wachstum verschiedener beispielhafter Microorganismen hemmt, sind unten in Tabelle II angegeben. Die Hemmkonzentrationen wurden entweder mit dem Agarverdünnungstest oder dem Brüheverdünnungstest ermittelt und sind als minimale Hemmkonzentration (MIC) in Microgramm pro ml (meg./ml.) angegeben. (Die angewandte Bestimmungsmethode ist in Tabelle II durch die Buchstaben "ad" für Agarverdünnungstest bzw. "bd" für Brüheverdünnungstest bezeichnet).

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Bei dem Agarverdünnungstest wird der Testorganismus auf Agarplatten, die verschiedene Konzentrationen A-4696-Hydrochlorid in dem Agar enthalten, aufgestrichen oder in diese injiziert. Die Testplatten werden 48 Stunden bei 37°C inkubiert. Die MIC entspricht der Platte mit der niedrigsten Konzentration des Antibioticums, mit der das Wachstum des Testorganismus gehemmt wird.

Bei dem Brüheverdünnungstest wird eine Reihe von Reagensgläsern, die Nährbrühe und verschiedene Konzentrationen an A-4696-Hydrochlorid enthalten, mit dem Testorganismus beimpft und 24 Stunden bei 37°C inkubiert. Die MIC entspricht dem Reagensglas mit der niedrigsten Antibioticumkonzentration, bei der kein Wachstum vorhanden ist.

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Tabelle II Testorganismus
Staphylococcus aureus 3055

Bacillus subtilis Mycobacteriuia avium Streptococcus faecalis Trichophyton mentagrophytes Vibrio coil Mycoplasma gallisepticum

Staphylococcus aureus (penicillinresistent)

Staphylococcus aureus (methicillinresistent)

Oiplococcus pneumoniae

Clostridium perfringens Clostridium tetani Corynebacterium gravis Lactobacillis casei Leuconostoc citrovorum Escherichia coli Proteus sp. Pseudomonas sp. Salmonella sp. Vibrio metschnikovii Saccharomyces pastorianus Candida albicans

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minimale Hemmkonzentration (mcg./ml.)	ad bd
12,5 6,25	ad
0,78	ad
0,4	ad
3,12	ad
0,2	bd
12,5	bd
50,0	bd
10,0	bd
5,0	bd
3,12	bd
1,25	bd
2,5	bd
1,25	ad
>100	ad
>100	ad
>100	ad
>100	ad
> 100	ad
>100	ad
y ίσο	ad
^100	ad
\ 100

Antibioticum-A-4696-Hydrochlorid zeigt bei Verabreichung an Mäuse durch subcutane Injektion in vivo antimicrobielle Aktivität gegen infektiöse Organismen. Beispielsweise werden bei Anwendung von zwei Dosen folgende ED-Q-Werte (wirksame Dosis zum Schutz von 50 % der Prüftiere) für beispielhafte Infektionen gefunden: Staphylococcus aureus, 9,2 mg/kg, Streptococcus pyogenes, 0,68 mg/kg und Diplococcus pneumoniae, 0,76 mg/kg.

Das neue Antibioticum nach der Erfindung ist auch zur Hemmung des Wachstums von Microorganismen wirksam, die zur Entwicklung von Zahnfleischerkrankungen und Zahnfäule beitragen.Beispielsweise weist eine Lösung von A-4696-Hydrochlorid antimicrobielle Aktivität gegen belagbildende Microorganismen auf, wie sich bei folgender Testmethode zeigt: Reagensgläser mit Nährbrühe, die 5 % Saccharose enthält, werden mit einem kariogenen Microorganismus beimpft. In das Medium werden Glasstäbe getaucht, und die Reagensgläser werden über Nacht bei 37°C inkubiert, worauf sich auf der Oberfläche der Stäbe die Belagschicht (hauptsächlich Zellen und Dextran) bildet. Die Stäbe werden dann in Lösungen überführt, die verschiedene Konzentrationen an A-4696-Hydrochlorid enthalten, und 5, 10 und 15 Minuten in Berührung mit dem Antibioticum belassen. Nach Verstreichen der betreffenden Zeitdauer werden die Stäbe mit sterilem deionisiertem Wasser gespült und in nicht beeimpftes Medium, das Saccharose enthält, getaucht. Nach Inkubieren über Nacht bei 37°C wird jedes Medium mit Bromthymolblau versetzt. Ein Wachstum wird durch die Farbänderung von blau nach gelb infolge der Säureproduktion der Organismen, wenn diese in einem saccharosehaltigen Medium wachsen, nachgewiesen.

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Eine Lösung von A-4696-Hydrochlorid in einer Konzentration von 0,01 % war bei 10 Minuten langem Kontakt mit dem von Belag umhüllten Stäben gegen eine nichtidentifizierte kariogene Streptococcus-Art wirksam. Das Wachstum dieses Microorganismus wurde durch A-4696-Hydrochlorid in einer Konzentration von 0,1 % verhindert, wenn die Lösung 5 Minuten mit dem Teststab in Berührung stand.

Ausserdem wird durch A-4696-Hydrochlorid das Wachstum des belagbildenden Microorganismus Odontomyces viscosus bei einer Konzentration von 0,25 mcg/ml in einem Brüheverdünnungstest gehemmt.

Das Einbringen von A-4696 oder eines seiner Säureadditionssalze in eine geeignete Zahnpaste, ein Gel, einen Puder oder dergleichen oder ein geeignetes Mundwasser oder ein anderes orales Hygienepräparat kann eine wirksame Methode zur Hemmung der Entwicklung von Zahnkaries und Zahnfleischerkrankungen darstellen. Alternativ kann eine Lösung von A-4696 oder eines "einer Säureadditionssalze in geeigneter Konzentration auf die Oberfläche des Zahnfleischs und der Zähne mit einem geeigneten Lappen, Bausch oder Schwamm aufgebracht werden.

Antibioticum A-4696 hat sich ferner zur Wachstumsförderung von Tieren als wirksam erwiesen. Wenn A-4696-Hydrochlorid dem Grundfutter von wachsenden Küken in einer Menge von 45,4 g/907 kg (1 ton) zugesetzt wird, zeigt sich, daß die Gewichtszunahme und die Futterverwertung im Vergleich zu Küken, die kein Antibioticum erhalten, verbessert wird. In der folgenden Tabelle III sind die Ergebnisse von vier getrennten Versuchen zur Bestimmung der Wirksamkeit von A-4696-Hydrochlorid bezüglich der Gewichtszunahme von Küken aufgeführt. Alle Tests wurden in Kükenbatterien durchgeführt, die sich in Räumen befanden,

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die bei etwa 25°C gehalten wurden. Das Alter der in den verschiedenen Tests verwendeten Tiere betrug bei Versuchsbeginn 1 bis 5 Tage. Die Dauer der Tests betrug 10 bis 17 Tag? Während der Tests wurde ununterbrochene Beleuchtung und Futtergabe ad libitum angewandt.

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Tabelle

III

Gewichtszunahme und Futterverwertunq von Küken, deren Futter A-4696-Hvdrochlorid enthielt

Futter

A-4696-Hydro- Behänd- Zahl der be- durchschnittl. Futterverchlorid, g/907 kg lungsdauer, handelten Zunahme, Wertung,kg (pound)/ (1 ton) Futter Tage Tiere g/Tier kg (pound) Zunahme

Grundfutter	O	10	40	147	1,53	ro rs. ^
Grundfutter plus A-4696-Hydrochlorid	45,4	10	40	146	1,47	1090
Grundfutter	O	10	2O	146	1,50
Grundfutter plus A-4696-Hydrochlorid	45,4	10	2O	153	1,45
Grundfutter	O	17	80	295	1,56
Grundfutter plus A-4696-Hydrochlorid	45,4	17	80	320	1,46
Grundfutter	O	17	80	300	1,51
Grundfutter plus A-4696-Hydrochlorid	45,4	17	80	318	1,43
Grundfutter	O	17	80	287	1,58
Grundfutter plus	45,4	17	8O	307	1,47
A-4696-Hydrochlorid

Die Wirkung der Verfütterung von A-4696-Hydrochlorid an Ferkel und sein Einfluß auf die durchschnittliche tägliche Gewichtszunahme und Putterverwertung wurde geprüft. Vier bis fünf Wochen alte Ferkel erhielten etwa 1 Woche lang vor Beginn des Versuchs ein Futter, das keine Antibiotica enthielt. Dann wurden die Ferkel gewogen und aufgrund von Gewicht und Wurf Versuchsgruppen zugeteilt. Die Ferkel wurden in geschlossenen Gebäuden mit ausreichender Wärme und Belüftung gehalten und Futter und Wasser standen jederzeit ad libitum zur Verfügung. Bei jedem Test wurden die Ferkel in zwei Gruppen aufgeteilt, von denen eine Gruppe das Grundfutter ohne zugesetztes Antibioticum und die andere Gruppe das gleiche Grundfutter plus Antibioticum A-4696-Hydrochlorid erhielt. Aus der folgenden Tabelle IV ist die Verbesserung der durchschnittlichen täglichen Gewichtszunahme und Futterverwertung bei solchen Schweinen, an die das A-4696-Hydrochlorid verfüttert wurde, im Gegensatz zu den Ferkeln, die nur das Grundfutter erhielten, zu ersehen.

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Tabelle IV

Mittlere tägliche Gewichtszunahme und Futterverwertung von Ferkeln bei Verabreichung von Antibioticum A-4696-Hydrochlorid als Teil des täglichen Futters

Futter

A-4696-Hydro- mitti. tägl. Zu-

chlorid, Zahl der Zahl der nähme, g/907 kg (1 ton) Prüftiere Testtaqe g (pounds)

Futterverwertung, . kg (pound) Futter/ kg (pound) Zunahme

N) O CO OO

Grundfutter

^ Grundfutter plus _, A-4696-Hydro- ^ chlorid

11

28

(0,67)

(0,95)

1,91 1,77

Grundfutter Grundfutter plus

A-4696-Hydro-

chlorid

11

34

(1,10)

(1,23)

2,41 2,17

Die akute Toxizität von A-4696-Hydrochlorid, angegeben als LD₅₀, für Mäuse bei intraperitonealer Verabreichung beträgt 2400 mg/kg.

Das neue Antibioticum nach der Erfindung wird erzeugt, indem ein neu aufgefundener Stamm einer Actinoplanesspecies unter aeroben Bedingungen in einem geeigneten Kulturmedium so lange gezüchtet wird, bis das Kulturmedium beträchtliche antibiotische Aktivität enthält. Das Antibioticum kann durch Anwendung verschiedener bekannter und üblicher Isolier- und Reinigungsmethoden gewonnen werden. Wenn das Antibioticum in Tierfutter verwendet werden soll, ist ein geringerer Reinheitsgrad erforderlich, als wenn das Antibioticum für medizinische Zwecke verwendet werden soll.

Der Microorganismus, der erfindungsgemäß zur Produktion von Antibioticum A-4696 verwendet wird, wurde als Stamm einer Species von Actinoplanes aus der Familie Actinoplanaceae

identifiziert. Die Actinoplanaceae bilden eine neue

Familie von Microorganismen der Ordnung Actinomycetales und wurden erstmals von Dr. John N. Couch, Jour. Elisha Mitchell Sei. Soc., 65, 315-318 (1949); und 66, 87-92 (1950); Trans. New York Acad. Sei., 16, 315-318 (1954); Jour. Elisha Mitchell Sei. Soc, 71, 148-155 und 269 (1955); Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 7. Auflage, 825-829 (1957); und Jour. Elisha Mitchell Sei. Soc., 79, 53-70 (1963) beschrieben.

Der Actinoplanes-Stamm, der für die Produktion von Antibioticum A-4696 geeignet ist, wurde bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, hinterlegt und in deren ständige Kulturensammlung aufgenommen und ist dort für jedermann ohne Freigabebeschränkung unter der Nummer ATCC 23342 erhältlich.

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Der für die Produktion von A-4696 geeignete Actinoplanes-Stamm wurde aus einer Bodenprobe isoliert, die

aus dem Cascadengebirge-Gebiet im Staat Washington stammte,

Dieser Microorganismus wurde in der Sammlung von

Dr. John N. Couch an der Universität von North Carolina

mit der Nummer 581 bezeichnet.

Actinoplanes sp., Stamm ATCC 23342 ist durch die in den folgenden Abschnitten angegebenen physikalischen Eigenschaften und Kultureigenschaften gekennzeichnet. Für die Bezeichnung der Farben wurde das System von Ridgeway, Color Standards and Nomenclature, (1912) verwendet .

Mikroskopische Morphologie und allgemeine Kulturmerkmale von Actinoplanes sp. ATCC 23342

Mikroskopische Morphologie; Mycel ziemlich spärlich auf Pollen von Liquidambar (Sweet gum tree; amer. Amberbaum) in Wasser. Die Hyphen sind verzweigt und septiert und haben einen Durchmesser von 0,2 bis 1,5 Micron. Die Hyphen füllen das Pollenkorn aus und erstrecken sich bis zu einer Strecke, die etwa dem Durchmesser des Korns gleich ist, in das Wasser. Sporangiophoren ragen über die Wasseroberfläche empor; Sporangienstiele, gewöhnlich einzeln, manchmal verzweigt, so daß sie zwei oder selten mehr Sporangien an dem gleichen Sporangiophor tragen; Stiele 1,0 bis 1,5 Micron dick, septiert. Sporangien sind ziemlich klein, Durchmesser 4 bis 11 Micron, angenähert kugelartig, selten kugelförmig, gewöhnlich mit einer unregelmäßigen Wand. Reife Sporen sind in einer oder mehreren undeutlichen Wendeln in dem Sporangium angeordnet. Das Aufplatzen und die Entleerung des Sporangiums erfolgt durch

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Quellung einer Sporenzwischensubstanz, die dazu führt, daß sich das Sporangium vergrößert und eine fast glatte sphärische Gestalt annimmt. Die Sporen sind beweglich, Durchmesser etwa 1,0 bis 1,5 Micron; kugelförmig bis angenähert kugelförmig.
Kulturmerkmale auf;

Czapek-Agar (S.A. Waksman, The Actinomycetes, (1950). Wachstum gut; die punktförmige Impfstelle hat nach 8 Wochen einen Durchmesser von etwa 2 cm. Das Mittelstück ist aufgewölbt; der Fleck ist abgeflacht und hat geringe Unebenheiten. Die Farbe des Mycels ist ein leuchtendes Zinkorange; das Agar ist blaßlederbraun bis deutlich gelb. Sporangien werden selten gebildet. Pepton-Czapek-Agar ( 5 g Pepton anstelle von 2 g Natriumnitrit) . Ähnliches Wachstum wie auf Czapek-Agar, Furchen, Grate und Höcker sind jedoch deutlicher als auf Czapek-Agar. Es werden keine Sporangien gebildet.

Wie erwähnt, kann Actinoplanes sp., Stamm ATCC 23342 zur Erzeugung von Antibioticum A-4696 in einem Kulturmedium gezüchtet werden. Als Kulturmedium kann eine Reihe von verschiedenen Medien verwendet werden. Für eine wirtschaftliche Produktion, maximale Ausbeute und leichte Isolierung des Antibioticums werden jedoch bestimmte Kulturmedien bevorzugt. So ist beispielsweise Stärke eine der bevorzugten Kohlenhydratquellen und Sojabohnenmehl eine der bevorzugten Stickstoffquellen. Zu anderen verwendbaren Kohlenhydratquellen gehören beispielsweise Melasse, Glucose, Dextrin und Glycerin. Zu weiteren Stickstoffquellen gehören beispielsweise Aminosäuremischungen und Peptone.

Zu anorganischen Nährsalzen, die die Kulturmedien enthalten sollen, gehören die üblichen Salze,die bei-

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spielsweise Ionen wie Natrium, Kalium, Ammoniak, Calcium, Phosphat, Chlorid, Sulfat, Acetat, Kohlenhydrat und dergleichen zu liefern vermögen. Bei der Produktion von Antibioticum A-4696 können ferner Quellen für Wuchsfaktoren wie Distillers' Solubles und Hefeextrakte verwendet werden. Wie es für das Wachstum und die Entwicklung anderer Microorganismen erforderlich ist, soll das Kulturmedium für die Züchtung des erfindungsgemäß verwendeten Microorganismus Actinoplanes sp. auch wesentliche Spurenelemente enthalten. Solche Spurenelemente werden gewöhnlich bei Zugabe der anderen Bestandteile des Mediums als zufällige Verunreinigungen zugeführt.

Der zur Produktion von A-4696 verwendete Microorganismus kann in einem verhältnismäßig breiten pH-Bereich gezüchtet werden. Es ist jedoch zweckmäßig, das Kulturmedium vor Beimpfen mit dem Microorganismus auf einen Wert zwischen etwa pH 6,5 und pH 7,2 einzustellen. Wie bei anderen Actinomyceten verändert sich allmählich der pH-Wert des Wuchsmediums während der Wachstumsdauer. Am Ende der Fermentationsdauer liegt der pH-Wert gewöhnlich im Bereich von etwa 7,0 bis 7,8.

Für die Produktion von A-4696 werden submers-aerobe Kulturbedingungen bevorzugt. Verhältnismäßig kleine Mengen des Antibioticums können mit Schuttelkolbenkulturen erzeugt werden. Für die Herstellung großer Mengen wird jedoch eine Züchtung unter submers-aeroben Bedingungen in sterilen Tanks bevorzugt. Das Kulturmedium in dem sterilen Tank kann mit einer Sporensuspension oder Mycelfragmentsuspension beimpft werden, wegen der Zeitverzögerung bei Verwendung einer Sporensuspension wird jedoch als Inoculum die vegetative Form der Kultur bevorzugt. Indem die Zeitverzögerung in dem Wachstumscyclus vermieden wird, wird die Fermentationsvorrirhtung besser ausgenutzt.

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Es ist daher zweckmäßig, ein vegetatives Inoculum des Microorganismus durch Beimpfen einer verhältnismäßig kleinen Menge Kulturmedium mit den Sporen oder Mycelfragmenten des Microorganismus zu erzeugen und, wenn ein junges aktives vegetatives Inoculum entstanden ist, dieses unter aseptischen Bedingungen in den großen Tank zu überführen. Das Medium, in dem das vegetative Inoculum gezüchtet wird, kann das gleiche Medium sein, das für die Fermentation von A-4696 in großem Maßstab verwendet wird, es können aber auch andere Medien verwendet werden.

Die A-4696 bildende Actinoplanes-Art, Stamm ATCC 23342, wächst bei Temperaturen zwischen etwa 20 und 40⁰C. Die größten Mengen A-4696 werden offenbar bei einer Temperatur von etwa 30 C erzeugt.

Bei dem submers-aeroben Kulturverfahren wird durch das Kulturmedium sterile Luft geblasen. Das Luftvolumen„ das in das Kulturmedium eingeleitet und darin verteilt wird, reicht von etwa 0,1 bis etwa 1,0 Volumenteilen Luft pro Minute und pro Volumenteil Kulturmedium. Wachstum und Antibioticum-Produktion erfolgen am wirksamsten, wenn das Luftvolumen wenigstens 1/2 Volumenteil Luft pro Minute und pro Volumenteil Kulturmedium beträgt.

Die Produktionsgeschwindigkeit von A-4696 und die Konzentration an antibiotischer Aktivität in dem Kulturmedium können während der Wachstumsdauer durch Prüfung von Proben der Fermentationsflüssigkeit auf antibiotische Aktivität gegen Microorganismen, die bekanntermaßen auf das Antibioticum ansprechen, verfolgt werden. Ein solcher für die erfindungsgemäßen Zwecke geeigneter Testorganismus ist Bacillus subtilis. Der biologische Test kann nach der üblichen turbidometrisehen oder Näpfchenmethode oder mit dem Papierscheiben-Test auf Agarplatten durchgeführt werden.

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Im allgemeinen findet bei Fermentationen mit Schüttelkolbenkultüren oder submers-aeroben Kulturen eine maximale Produktion des Antibioticums in etwa 4 bis 6 Tagen statt.

Antibioticum A-4696 kann durch Adsorptions- und Extraktionsmethoden aus dem Kulturmedium gewonnen und von anderen Substanzen getrennt werden. Adsorptionsmethoden werden bevorzugt, da bei solchen Methoden die Verwendung großer Volumenmengen von Lösungsmitteln vermieden wird, die bei Extraktionsverfahren erforderlich sind.

Nach der Fermentation ist die antibiotische Aktivität sowohl in der Fermentationsflüssigkeit als auch im Mycel enthalten. Das Kulturmedium wird zur Trennung der Fermentationsfliissigkelt von dem festen Mycel filtriert. Der Mycelkuchen wird mit Wasser gewaschen und dann in Wasser aufgeschlammt, das mit 5,0 η NaOH auf pH 10,5 eingestellt ist, 30 Minuten lang intensiv gerührt und filtriert. Die beiden Filtrate und das Waschwasser werden vereinigt und die antibiotische Aktivität wird daraus an einem geeigneten Adsorptionsmittel adsorbiert, zum Beispiel Aktivkohle, aktiviertes saures Aluminiumoxid, Polyamidharz, Cellulose, Kieselgel und dergleichen. Zur Durchführung der Adsorption kann die antibiotische Aktivität enthaltende Lösung über eine Füllung aus dem Adsorbens geleitet werden oder das Adsorbens kann der Lösung zugesetzt, 20 bis 30 Minuten gründlich vermischt und von dem erschöpften Lösungsmittel abfiltriert werden. Das an dem Adsorbens haftende Antibioticum kann durch übliche Eluiermethoden als unreines A-4696 gewonnen werden.

Das rohe Antibioticum A-4696 kann durch Herstellung des Picratsalzes und dessen Umwandlung in das Hydrochloridsalz oder durch Adsorption und Elution unter Verwendung

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eines geeigneten Adsorbens oder Ionenaustauschharzes gereinigt werden. Geeignete Adsorbentien sind beispielsweise Polyamidharz (M. WoeIm, Eschwege, Westdeutschland), saures Aluminiumoxid, neutrales Aluminiumoxid, basisches Aluminiumoxid, Kieselgel, Amberlite XAD-2 (Rohm and Haas, Philadelphia), Amberlite XAD-4 (Rohm and Haas, Philadelphia) und Dowex 50 (H⁺) (Dow Chemical, Midland, Michigan).

Durch die folgenden Beispiele wird die Erfindung näher erläutert.

Beispiel 1 A. Schüttelkolbenfermentation von Antibioticum A-4696.

Ein Nähragar-Schrägmedium mit folgender Zusammensetzung wird mit Mycelfragmenten von Actinoplanes sp., Stamm ATCC 23342 beimpft:

Bestandteil

vorgekochtes Hafermehl Hefe K-,HPO.

Z 4

getrocknete Distiller's Solubles Czapek's Mineralstammlösung Agar Wasser, deionisiert

Czapek's Mineralstammlösung:

KCl	7H₂O	gelöst)	100	g
MgSO₄.	7H₂O		100	g
PeSO.. 4	2 ml konz. HCl	2	g
(in	, deionisiert
Wasser		1

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Das Schrägmediuin wird mit ATCC 23342 beimpft und 6 Tage bei 3O°C incubiert. Die Kultur sporuliert auf diesem Medium normalerweise nicht und es ist erforderlich, die Mycelmatte mit einer abgeflachten geschärften Impfnadel aufzuschließen, um die Zahl von potentiellen Wuchszentren zu erhöhen. Die aufgeschlossene reine Kultur wird mit sterilem destilliertem Wasser bedeckt und zur Gewinnung einer Mycelsuspension vorsichtig mit einem sterilen Stab abgeschabt.

Die so erhaltene Suspension wird zum Beimpfen von 100 ml eines sterilen vegetativen Mediums mit folgender Zusammensetzung verwendet:

Bestandteil

Glucose Dextrin Soj abohnenmehl Hefeextrakt Calciumcarbonat Leitungswasser

Das beimpfte vegetative Medium wird auf einer mit 250 UpM betriebenen Rotationsschüttelvorrichtung 48 Stunden bei 3O°C incubiert.

100 ml eines sterilen "Zwischenmediums" mit der gleichen Zusammensetzung wie vorher werden mit 10 ml des incubierten vegetativen Mediums beimpft. Das beimpfte "Zwischenmedium" wird 24 Stunden bei 30⁰C unter konstantem Schütteln auf einer mit 250 UpM betriebenen Rotationsschüttelvorrichtung incubiert.

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Anteile eines Produktionsmediums mit der nachstehend angegebenen Zusammensetzung von 100 ml_f die in 500 ml Erlenmeyer-Kolben enthalten sind, werden 30 Minuten bei 120°C sterilisiert und mit 4/10 ml des incubierten "Zwischenmediums" beimpft.

Bestandteil %_

Dextrose 1,0

Dextrin 3,0

Pepton 1,5

Soj abohnenmehl 0,5

MgSO₄.7H₂O 0,2

Zuckerrübenmelasse 1,5

Maisquellwasser 0,5

Betain 0,1

K₂HPO₄ 0,05

Wasser, deionisiert ad 25 ml

Vor dem Sterilisieren wird der pH-Wert des Mediums mit 5 η Natriumhydroxidlösung auf 7,5 eingestellt. Nach dem Sterilisieren beträgt der pH-Wert etwa 6,9.

Die Produktionskultur wird etwa 96 Stunden bei einer Temperatur von 30°C auf einer mit 250 UpM betriebenen Rotationsschüttelvorrichtung geschüttelt. Am Ende des Fermentationscyclus beträgt der pH-Wert etwa 7,2.

B. 40 1 Tankfermentation von Antibioticum A-4696

Die Herstellung des Inoculums wird wie oben unter Abschnitt A beschrieben bis zur Incubierung des "Zwischen"-Mediums durchgeführt. 25 1 eines Produktionsmediums der oben beschriebenen Art mit einem Zusatz von

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0,02 % Dow Corning-Entschäumer werden im Autoklaven 30 Minuten bei 120⁰C sterilisiert und dann in einen 40 1 Fermentationstank gefüllt. Das sterile Produktionsmedium wird mit 1OO ml incubiertem "Zwischen"-Medium beimpft. Das beimpfte Produktionsmedium in dem 40 1 Tank wird 4 Tage bei 30 C fermentiert. Die Fermentationsmischung wird mit steriler Luft in einer Menge von etwa 1/2 Volumenteil Luft pro Volumenteil Kulturmedium und pro Minute belüftet. Während der Fermentation wird das Produktionsmedium mit einem Mischer unter Verwendung eines Propeller-Rührers geeigneter Größe gerührt, der mit entsprechender Umdrehungszahl betrieben wird, so daß eine angemessene Vermischung der Luft mit dem Medium gewährleistet ist. Der pH-Wert des Kulturmediums steigt mit fortschreitender
Fermentation von einem Anfangswert von etwa 6,9
auf etwa 7,2 an.

C. Isolierung von Antibioticum A-4696

Die gesamte Fermentationsflüssigkeit, die aus einer A-4696-Fermentation, wie sie vorher beschrieben wurde, erhalten wird, wird mit Hilfe einer handelsüblichen Filterhilfe filtriert. Das Filtrat wird beiseite gestellt. Der Mycelkuchen wird mit 32 1 Wasser gewaschen und das Waschwasser wird aufbewahrt. Dann wird der
Mycelkuchen in weiteren 32 1 Wasser suspendiert und der pH-Wert der Mischung wird mit 5 η Natriumhydroxidlösung auf 10,5 eingestellt. Die Mycelkuchen-Wasser-Suspension wird 45 Minuten lang gerührt und die Mischung wird filtriert. Dieses Filtrat und das Waschwasser werden mit dem ersten Filtrat der Fermentationsmischung vereinigt und der pH-Wert der vereinigten Filtrate wird mit H₃SO₄ auf 4,0 eingestellt. Die angesäuerten vereinigten Filtrate

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werden durch eine Kohlesäule mit 1 kg Aktivkohle (Pittsburgh, 12 χ 40) geleitet. Die Aktivkohlesäule wird gewaschen, bis der Abfluß farblos ist. Die A-4696-Aktivität ist an der Kohlesäule adsorbiert. Die A-4696-Aktivität wird aus der Kohlesäule mit einer 1-prozentigen H₂SO₄-Lösung in Aceton/H₂0 (1:1) eluiert. 2 1 der angesäuerten Aceton/Wasser-Lösung reichen zum Eluieren der A-4696-Aktivität aus der Kohlesäule aus. Das Eluat, das die A-4696-Aktivität enthält, wird mit gesättigter Barium-HydroxidlÖsung behandelt, um einen Niederschlag aus Bariumsulfat zu erzeugen und dadurch die Sulfationen aus der Lösung zu entfernen.

Die Mischung wird filtriert und der Bariumsulfatniederschlag wird verworfen. Das Filtrat, das die A-4696-Aktivität enthält, wird im Vakuum zur Trockne eingeengt. Der erhaltene Rückstand besteht aus etwa 80 g A-4696-Aktivität.

D. Umwandlung von A-4696 in rohes A-4696-Hydrochlorid

Die A-4696-Aktivität von etwa 80 g wird in einem Volumen von 5 1 Wasser aufgenommen und dann mit 500 g Aktivkohle (Darco G-60, Atlas Chemical, Wilmington, Del.) behandelt. Diese Mischung wird 1 Stunde lang gerührt und dann filtriert. Das Filtrat wird verworfen. Der Kohlefilterkuchen, der die A-4696-Aktivität enthält, wird mit 1 1 Wasser gewaschen und das Waschwasser wird verworfen. Dann wird der Kohlefilterkuchen mit 1 1 0,05 η Salzsäure gewaschen. Die saure Waschlösung wird verworfen. Der gewaschene Kohlekuchen wird durch 30 Minuten langes Rühren mit 500 ml Salzsäure-Aceton-Lösung (0,05 η HCl : Aceton /7:^/) eluiert. Die Mischung wird filtriert und das Filtrat wird aufbewahrt. Das Eluieren der Aktivkohle wird viermal in der gleichen Weise wiederholt.

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Jedesmal wird das Filtrat aufbewahrt. Die fünf Eluate, die die A-4696-Aktivität enthalten, werden vereinigt. Die vereinigten Eluate werden dann im Vakuum auf ein Volumen von etwa 100 ml eingeengt. Das wässrige Konzentrat, das die A-4696-Aktivität enthält, wird mit 200 ml Methanol versetzt. Zu dieser wässrigen Methanollösung werden 2 1 Aceton gegeben. In der wässrigen Methanol-Aceton-Lösung bildet sich ein Niederschlag aus rohem A-4696-Hydrochlorid. Nach Abfiltrieren und Trocknen des Niederschlags werden 60,9 g rohes A-4696-Hydrochlorid erhalten.

E. Herstellung von kristallinem A-4696-Hydrochlorid

25 g des A-4696-Hydrochlorids, das wie unter D beschrieben erhalten wurde, werden in 20 ml Wasser gelöst. Die A-4696-Hydrochloridlösung wird über eine mit Wasser gewaschene Füllung aus Polyamidharz (M. Woelm, Eschwege, Westdeutschland) geleitet, die in einer Glassäule mit etwa 7 χ 60 cm enthalten ist. Der Abfluß wird aufbewahrt. Die PolyamidharzsauIe wird mit Wasser mit einer Strömungsgeschwindigkeit von etwa 8 bis 10 ml pro Minute gewaschen. Die antimicrobielle Aktivität des Säulenabflußes wird nach üblichen Methoden gemessen. Abflüsse,die antimicrobielle Aktivität enthalten, werden vereinigt und im Vakuum zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wird in einer Mischung aus 25 ml Wasser und 50 ml Methanol gelöst. Diese wässrige Methanollösung von A-4696-Hydrochlorid wird mit 5 η HCl auf pH 2,0 angesäuert. Die wässrige Methanollösung wird mit etwa 1,5 1 Aceton versetzt, um das Hydrochloridsalz von A-4696 auszufällen. Der A-4696-Hydrochloridniederschlag wird durch Filtrieren der Mischung gewonnen.

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Der Filterkuchen, der das A-4696-Hydrochlorid enthält, wird in der Mindestinenge Wasser gelöst. Dann wird eine Äthanolmenge zugesetzt, die dem doppelten Wasservolumen entspricht und die Mischung wird auf etwa 6O⁰C erwärmt. Hierauf wird die Mischung abgekühlt, wobei das Hydrochloridsalz von A-4696 auskristallisiert. Die Kristalle werden abfiltriert und getrocknet. Es werden etwa 9 g kristallines A-4696-Hydrochlorid gewonnen.

Beispiel 2

Reinigung von A-4696 über mit Säure gewaschenem Aluminiumoxid

2,3 g rohes A-4696, das wie in Beispiel 1 bis Abschnitt D beschrieben erhalten wurde, werden in 20 ml 50-prozentigem wässrigem Methanol gelöst und durch eine 2x4 cm-Säule mit säuregewaschenem Aluminiumoxid (Alcoa) geleitet. Die Säule wird sofort mit Methanol gewaschen. Die Aktivität wird aus dem sauren Aluminiumoxid mit 50-prozentigem wässrigem Methanol eluiert. Das Eluat wird in aliquoten Fraktionen aufgefangen und die antimicrobielle Aktivität für jede Fraktion wird bestimmt. Die Fraktionen, die antimicrobielle Aktivität aufweisen, werden vereinigt, auf etwa 100 ml eingeengt und zur Abscheidung des A-4696 mit Aceton versetzt. Der Niederschlag wird abfiltriert und im Vakuum getrocknet, wodurch etwa 930 mg reines kristallines A-4696 erhalten werden.

Das für die oben beschriebene Reinigung verwendete mit Säure gewaschene Aluminiumoxid wird wie folgt hergestellt:

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Aktiviertes Aluminiumoxid (Alcoa F-20) wird mit Wasser, das mit H-SO₄ auf pH 3 eingestellt ist, durch 6 Stunden langes Rühren, wobei der pH-Wert bei 3,0 gehalten wird, gewaschen. Das Aluminiumoxid wird abfiltriert, mit
50-prozentigem wässrigem Methanol gewaschen und in einem Ofen bei 100⁰C getrocknet.

Beispiel

Reinigung von A-4696 durch Herstellung des
Picratsalzes und dessen Umwandlung in das Hydrochloridsalz

500 mg rohes A-4696, das wie in Beispiel 1 bis Abschnitt D beschrieben erhalten wurde, werden in 25 ml
Wasser gelöst und die Lösung wird unter Rühren mit 25 ml einer gesättigten wässrigen Lösung von Picrinsäure versetzt. Die Mischung wird über Nacht bei 5°C stehen gelassen. Der entstandene Niederschlag wird abzentrifugiert und getrocknet. Der getrocknete Niederschlag wird in
25 ml Methanol gelöst, der pH-Wert wird mit HCl auf
1,5 eingestellt und es werden 500 ml Diäthyläther zugesetzt, um das A-4696-Hydrochloridsalz abzuscheiden. Das Hydrochloridsalz wird abzentrifugiert, mit Diäthyläther gewaschen und im Vakuum getrocknet, wodurch etwa 305 mg
A-4696-Hydrochlorid als weißes kristallines Salz erhalten werden.

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Beispiel 4 Herstellung von A-4696-Sulfatsalz

2 g A-4696-Hydrochlorid, das wie in Beispiel 1 bis Abschnitt E beschrieben erhalten wurde, werden in 300 ml Wasser gelöst, der pH-Wert wird mit 5 η Natriumhydroxid auf 7,5 eingestellt und es werden 30 g Aktivkohle (Darco G-60) zugesetzt. Die Mischung wird 30 Minuten lang gerührt und dann unter Verwendung einer handelsüblichen Filterhilfe filtriert. Der Filterkuchen wird nacheinander mit jeweils 300 ml Wasser und 0,05 η H₃SO₄ gewaschen.

Um die Aktivität aus dem Filterkuchen zu eluieren, wird der Filterkuchen zu 500 ml einer Mischung aus 70 % 0,05 η H₂SO. und 30 % Aceton gegeben. Nach 30 Minuten langem Rühren wird die Kohle durch Filtrieren entfernt. Das . FiItrat wird auf etwa 10 ml eingeengt und mit etwa 20 ml Methanol versetzt und die so entstandene Lösung wird zur Abscheidung des A-4696-Sulfats zu 600 ml Aceton gegeben. Der Niederschlag wird abfiltriert, mit Aceton gewaschen und im Vakuum getrocknet, wodurch 862 mg A-4696-SuIfat als weißes kristallines Salz erhalten werden.

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Claims

Patentansprüche

/2.j Antibioticum nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es in Form seines Hydrochloridsalzes eine weiße kristalline Substanz ist, die in Wasser löslich und in den üblichen organischen Lösungsmitteln unlöslich ist, einen Schmelzpunkt von über 220⁰C aufweist, eine elektrometrische Titrationskurve in 66-prozentigem wässrigem Dimethylformamid ergibt, die sich im Bereich von pH 6,0 bis pH 13,0 einer geraden Linie mit einer Steigung von etwa 0,14 nähert, ungefähr eine Zusammensetzung aus 51,33 % Kohlenstoff, 5,79 % Wasserstoff, 5,46 % Stickstoff, 30,96 % Sauerstoff und 6,72 % Chlor hat, ein aufgrund des osmotischen Dampfdrucks bestimmtes Molekulargewicht von 1158 aufweist, einen spezifischen Drehwert von ^alpha/ von - 42,3 (c = 1, H₂O) hat, im Ultraviolettabsorptionsspektrum in sauren und neutralen Lösungen ein einziges Absorptionsmaximum bei 276 nm mit einem Extinktionskoeffizienten E. von 45 und in basischer Lösung

ein einziges Absorptionsmaximum bei 300 nm mit einem

1%

Extinktionskoeffizienten E.' von 65 hat und als

lern

Mineralölsuspension im Infrarotabsorptionsspektrum folgende unterscheidbare Banden aufweist: 3,0, 5,8, 5,9, 6,03, 6,15, 6,28, 6,63, 6,85, 7,27, 7,75, 8,1, 8,25, 8,9, 9,4, 9,9 und 10,1 Micron.

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BR - 31 -

3. Das Hydrochloridsalz von Antibioticum A-4696 nach Anspruch 1.

4. Das Sulfatsalz von Antibioticum A-4696 nach Anspruch 1.

5. Verfahren zur Herstellung des Antibioticums nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den Microorganismus Actinoplanes so. Stamm ATCC 23342 in einem flüssigen Kulturmedium, das assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthält, unter submers-aeroben Bedingungen züchtet, bis der Microorganismus in dem Kulturmedium eine beträchtliche Menge antibiotischer Aktivität erzeugt hat.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man die erzeugte antibiotische Aktivität an einem Adsorbens adsorbiert, die antibiotische Aktivität von dem Adsorbens mit einem sauren Lösungsmittel eluiert, die antibiotische Aktivität an einem sauren chromatographischen Adsorbens adsorbiert und das Antibioticum von dem chromatographischen Adsorbens eluiert.

7. Mittel zur Hemmung des Wachstums von Microorganismen, die zur Entwicklung von Zahnfleischerkrankungen und Zahnfäule beitragen, dadurch gekennzeichnet, daß es das Antibioticum nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und einen geeigneten Träger enthält.

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8. Tierfuttermittel, dadurch gekennzeichnet, daß es das Antibioticum nach einem der Ansprüche bis 4 und einen geeigneten Träger enthält.

9. Geflügelfuttermittel, dadurch gekennzeichnet, daß es das Antibioticum nach einem der Ansprüche bis 4 und einen geeigneten Träger enthält.

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