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Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung zweier neuer stickstoffhältiger Antibiotika, die im Rahmen der Erfindung mit A-201A und A-201B bezeichnet werden.
Diese neuen Antibiotika werden durch Züchtung des Organismus Streptomyces capreolus, Stamm NRRL 3817, in einem wässerigen Nährmedium unter submersen aeroben Fermentationsbedingungen hergestellt. Die Antibiotika werden aus der Fermentationsbrühe durch Verteilung in einem üblichen nichtmischbaren Lösungsmittel, wie Chloroform, und Trennung der Mischung durch Säulenchromatographie über einem aktiven Adsorbens, wie Silicagel, sowie Eluierung daraus mit Aceton bzw. einem Aceton/Methanol-Gemisch (9 : 1) isoliert. Die Reinigung von A-201A wird durch Umkristallisation aus kaltem Aceton bewirkt. Antibiotikum A-201B stellt bei Zimmertemperatur ein Öl dar und wird durch Einengen des Etuierungsmittels aus Aceton/Methanol (9 : 1) erhalten.
Die neuen, erfindungsgemäss erhältlichen Antibiotika A-201A und A201B besitzen antibakterielle, Antifungus- und Antiamöbenaktivität.
Die neuen Antibiotika, wie sie gemäss der Erfindung erhältlich sind, sind stickstoffhältige Verbindungen, die keine titrierbaren Gruppen aufweisen. Die nachstehend angegebenen Kenndaten beziehen sich für Antibiotikum A-201A auf die kristalline Substanz und Antibiotikum A-201B auf die flüssige Substanz bei Raumtemperatur. Die Antibiotika werden zweckmässigerweise in diesen Formen isoliert und charakterisiert.
Antibiotikum A-201A stellt eine weisse kristalline Verbindung dar, die nach Umkristallisation aus Aceton bei etwa 170 bis 172 C schmilzt. Sie ist in Alkoholen gut löslich, in Aceton, Chloroform und Äthylacetat löslich. Sie ist in Wasser, Kohlenwasserstoffen und Äther unlöslich.
Die elektrometrische Titration von A-201A in 671obigem Dimethylformamid ergibt einen Anfangs-PH-Wert von 7,8 und lässt erkennen, dass innerhalb des pH-Bereiches von 3,5 bis 13,5 keine titrierbaren Gruppen vorliegen.
Die Mikroanalyse ergibt folgende angenäherte prozentuelle elementare Zusammensetzung von A-201A :
EMI1.1
spektrums, beträgt etwa 693.
Das Infrarotspektrum von A-201A als kristalline Verbindung in einer Chloroformlösung ist in Fig. 1 der
EMI1.2
Ein unter Verwendung eines Pulvers der kristallinen Verbindung A-201A aufgenommenes Röntgenbeugungsspektrum unter Verwendung von Vanadium-gefilterter Chromstrahlung und einer Wellenlänge von 2,2896 zur Errechnung der Ebenenabstände ergab die folgenden Werte :
EMI1.3
<tb>
<tb> d <SEP> : <SEP> I/I <SEP> :
<SEP>
<tb> 14, <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 20 <SEP>
<tb> 9,5 <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP>
<tb> 6,7 <SEP> 1, <SEP> 00 <SEP>
<tb> 5, <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 50 <SEP>
<tb> 4, <SEP> 5 <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP>
<tb> 4, <SEP> 2 <SEP> 0, <SEP> 10 <SEP>
<tb> 3, <SEP> 8 <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP>
<tb> 3, <SEP> 5 <SEP> 0, <SEP> 10 <SEP>
<tb>
Das Verhalten der kristallinen Verbindung A-201A bei papierchromatographischen Untersuchungen wird durch die nachstehend angegebenen Rf-Werte gezeigt. Die Rf-Werte wurden in den angegebenen Lösungsmittelsystemen erhalten, wobei in jedem Falle ein Whatman No. l-Papier verwendet wurde.
Die Lage des Antibiotikums im Chromatogramm wurde durch Bioautographie unter Verwendung von Sarcina lutea als Testorganismus bestimmt.
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EMI2.1
<tb>
<tb> Lösungsmittel- <SEP> Rf-Wert <SEP> a):
<tb> System <SEP> : <SEP>
<tb> 1 <SEP> 0, <SEP> 87 <SEP>
<tb> 2 <SEP> 0, <SEP> 89 <SEP>
<tb> 3 <SEP> 0, <SEP> 88 <SEP>
<tb> 4 <SEP> 0, <SEP> 44 <SEP>
<tb> 5 <SEP> 0, <SEP> 47 <SEP>
<tb> 6 <SEP> 0, <SEP> 48 <SEP>
<tb> 7 <SEP> 0, <SEP> 70 <SEP>
<tb> 8 <SEP> 0, <SEP> 87 <SEP>
<tb> 9 <SEP> 0,88
<tb> 10 <SEP> 0,13
<tb> 11 <SEP> 0,83
<tb>
a) = der Rf-Wert ist als das Verhältnis der Strecke, welche vom Antibiotikum vom Ausgangspunkt an ge- messen zurückgelegt worden ist, zur Strecke, die durch die Lösungsmittelfront vom Ausgangspunkt an zurückgelegt worden ist, definiert.
Die angegebenen Zahlen bedeuten folgende Lösungsmittelsysteme : 1. Butanol, gesättigt mit Wasser ;
EMI2.2
4. Methylisobutylketon, gesättigt mit Wasser ;
5. Methylisobutylketon, gesättigt mit Wasser plus 2% p-Toluolsulfonsäure ;
6. Methylisobutylketon, gesättigt mit Wasser plus 2% Piperidin ;
7. Wasser : Methanol : Aceton (12 : 3 : 1). Diese Lösung wird mit NH4OH auf einen pH-Wert von 10, 5 eingestellt und dann wird der PH-Wert mit H3PO4 auf 7,5 erniedrigt ;
8. 80% Äthanol mit l, 5% NaCl. Das Papier wird mit 1-molarer Natriumsulfatlösung imprägniert ;
9. Methanol : 0, 1n-HCl (3 : 1) ;
10. Benzol, gesättigt mit Wasser ;
11. Wasser : Äthanol : Essigsäure (70 : 24 : 6).
Dünnschichtchromatogramme der kristallinen Verbindung A-201A, die auf Silicagelplatten (Brinkman- - Silicagel F-254-Platten) entwickelt wurden, zeigten die folgenden Rf-Werte :
EMI2.3
<tb>
<tb> Lösungsmittelsystem <SEP> : <SEP> Rf-Wert <SEP> : <SEP> Detektoren <SEP> : <SEP>
<tb> Äthylacetat <SEP> : <SEP> Äthanol <SEP> 0, <SEP> 49 <SEP> (Naphthoresorcin- <SEP>
<tb> (4 <SEP> : <SEP> 1) <SEP> (reagens,
<tb> Äthylacetat <SEP> : <SEP> Äthanol <SEP> 0,83 <SEP> (HSO, <SEP> UV-Licht <SEP> oder
<tb> (1 <SEP> : <SEP> 1) <SEP> (Bioautogramm
<tb>
EMI2.4
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Das Ultraviolettabsorptionsspektrum von A-201B in einer Lösung aus 951o Äthanol/Wasser zeigt ein Absorp- tionsmaximum bei etwa 222 mu mit einem Extinktionskoeffizienten E 10/0 = 515 ;
ein Absorptionsmaximum bei lcm
EMI3.1
Das Verhalten von A-201B bei papierchromatographischen Untersuchungen ist durch die nachstehend angegebenen Rf-Werte dargelegt. Die Rf-Werte wurden in den angegebenen Lösungsmittelsystemen erhalten, wobei in jedem Falle Whatman No. 1-Papier verwendet wurde. Die Lage des Antibiotikums im Chromatogramm wurde durch Bioautographie unter Verwendung von Sarcina lutea als Testorganismus bestimmt.
EMI3.2
<tb>
<tb> Lösungsmittelsystem <SEP> : <SEP> Rf-Wert <SEP> a):
<tb> 1 <SEP> 0,65
<tb> 2 <SEP> 0, <SEP> 92 <SEP>
<tb>
a) = Der Rf-Wert ist wie oben definiert.
Die Lösungsmittelsysteme waren die folgenden :
1. Mit Methylisobutylketon gesättigtes Wasser plus 2% p-Toluolsulfonsäure und 1% Piperidin ;
2. 80o Äthanol mit 1, älo NaCl. Das Papier war mit 1-molarer Natriumsulfatlösung imprägniert.
Die neuen Antibiotika, wie sie erfindungsgemäss erhältlich sind, haben eine Hemmwirkung gegenüber dem Wachstum von mikrobiellen Organismen, u. zw. sowohl Bakterien als auch Pilzen, die gegenüber lebenden Tieren und Pflanzen pathogen sind, und sie sind daher bei der Bekämpfung des Wachstums solcher Organismen von Wert.
Die minimale Hemmkonzentration der neuen Antibiotika, ausgedrückt in Mikrogramm/ml und bestimmt nach dem Röhrchen-Verdünnungstest, für eine Anzahl repräsentativer Organismen, ist in der nachstehenden Tabelle 1 angegeben.
Tabelle 1
EMI3.3
<tb>
<tb> Aktivität <SEP> der <SEP> Antibiotika <SEP> A-201A <SEP> und <SEP> A-201B <SEP> : <SEP>
<tb> Testorganismus <SEP> Minimale <SEP> Hemmkonzentration
<tb> in <SEP> Mikrogramm/ml
<tb> a) <SEP> A-201A <SEP> : <SEP> b) <SEP> A-201B <SEP> : <SEP> c) <SEP>
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> 1, <SEP> 56 <SEP> 6, <SEP> 25 <SEP>
<tb> Streptococcus <SEP> faecalis <SEP> 12,50 <SEP> 25, <SEP> 00 <SEP>
<tb> Erwinia <SEP> amylovora <SEP> 12,50 <SEP> 25, <SEP> 00 <SEP>
<tb> Botrytis <SEP> einerea <SEP> 100, <SEP> 00 <SEP> 0, <SEP> 39 <SEP>
<tb> Trichophyton <SEP> mentagrophytes <SEP> 25,00 <SEP> 3,12
<tb> Xanthomonas <SEP> phaseoli <SEP> 50, <SEP> 00 <SEP> 50, <SEP> 00 <SEP>
<tb> Lactobacillus <SEP> casei <SEP> 12,50 <SEP> N. <SEP> T. <SEP> a)
<tb> Leuconostoc <SEP> citrovorum <SEP> 0,20 <SEP> N. <SEP> T.
<tb>
Vibrio <SEP> metschnikovii <SEP> 25,00 <SEP> N. <SEP> T.
<tb>
Mycobacterium <SEP> avium <SEP> 1,56 <SEP> N. <SEP> T.
<tb>
Diplococcus <SEP> pneumoniae <SEP> 6,25 <SEP> N. <SEP> T.
<tb>
Neisseria <SEP> meningitidis <SEP> < <SEP> 25,00 <SEP> N. <SEP> T.
<tb>
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Tabelle l (Fortsetzung)
EMI4.1
<tb>
<tb> Testorganismus <SEP> Minimale <SEP> Hemmkonzentration
<tb> in <SEP> Mikrogramm/ml
<tb> a) <SEP> A-201A <SEP> : <SEP> b) <SEP> A-201B <SEP> : <SEP> c) <SEP>
<tb> Mycoplasma <SEP> gallisepticum <SEP> 0,78 <SEP> N. <SEP> T.
<tb>
Pasteurella <SEP> hemolytica <SEP> 50, <SEP> 00 <SEP> N. <SEP> T.
<tb>
Pasteurella <SEP> multocida <SEP> 3, <SEP> 12 <SEP> > <SEP> 100,00
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> 50,00 <SEP> > <SEP> 100, <SEP> 00
<tb> Escherichia <SEP> insidioa <SEP> 50,00 <SEP> N. <SEP> T.
<tb>
Salmonella <SEP> spp. <SEP> 50,00 <SEP> > <SEP> 100,00
<tb> Candida <SEP> tropicalis <SEP> N. <SEP> T. <SEP> 50,00
<tb> Ceratocystis <SEP> ulmi <SEP> N. <SEP> T. <SEP> 0,39
<tb> Fusarium <SEP> oxysporium <SEP> N. <SEP> T. <SEP> 50,00
<tb> Fusarium <SEP> lycopersici
<tb> Verticillium <SEP> albo-atrum <SEP> N. <SEP> T. <SEP> 12,50
<tb>
a) = N. T. bedeutet nicht getestet.
Das Antibiotikum A-201A zeigt in vivo Aktivität gegen Mycoplasma gallisepticum-Infektionen bei Küken.
Wenn beispielsweise 5 mg A-201A subkutan in den Hals von Küken injiziert werden, die mit dem Organismus infiziert sind, so wird die Aktivität durch Verminderung der Zahl der Luftsackläsionen demonstriert.
Erfolgt eine orale Verabreichung einer Dosis von 100 mg/kg, so erweist sich die Mischung der
EMI4.2
von Borrelia novyi-Infektionen bei der Maus wirksam.
Das Antibiotikum A-201A zeigt bei subkutaner Injektion bei Mäusen in vivo antimikrobielle Aktivität gegen infektiöse Organismen ; beispielsweise sind die ED50-Werte (wirksame Dosis, um 5rJ1/o der Testtiere zu schützen) bei zur Veranschaulichung angeführten Infektionen wie folgt, wenn eine Dosis angewendet wird : Staphylococcus aureus : 6,5 mg/kg ; Diplococcus pneumoniae : 100 mg/kg ; Streptococcus pyogenes C 203 : 12 mg/kg. Die Toxizität von A-201A ist wie folgt : LD50 (intraperitoneal) : 400 mg/kg bei der Maus.
Das Antibiotikum A-201A ist auch bei der Hemmung des Wachstums von Mikroorganismen wirksam, die zur Entwicklung periodentaler Krankheiten beitragen. Beispielsweise zeigt eine Lösung von A-201A antimikrobielle Aktivität gegen Zahnbelag bildende Organismen, wie in dem folgenden Testsystem veranschaulicht wird : Proberöhrchen mit Nährbrühen, enthaltend zo Saccharose, werden mit einem kariogenen Mikroorganismus beimpft. In das Medium werden Glasstäbe eingetaucht und die Röhrchen werden bei 370C über Nacht bebrütet, worauf sich eine Schichte von Belag (Primärzellen und Dextran) auf der Oberfläche des Stabes bildet. Der Stab wird dann in Lösungen überführt, die verschiedene Konzentrationen von A-201A enthalten und mit dem Antibiotikum während 5,10 und 15 min in Kontakt gehalten.
Nachdem die entsprechende Zeit verstrichen ist, werden die Stäbe zweimal mit sterilem, entionisiertem Wasser gewaschen und in unbeimpftes Medium eingetaucht, das So Saccharose enthält. Nach dem Bebrüten über Nacht bei 370C wird jedem Medium Bromthymolblau zugegeben. Es wird das Wachstum durch Beobachtung der Farbänderung von Blau nach Gelb festgestellt, welche auf der Säureproduktion des Organismus beruht, wenn dieser in einem saccharosehältigen Medium wachsen gelassen wird. Beim Test mit A-201A werden zwei kariogene Streptococcen spp., nämlich A-31036 und A-31037, verwendet. Das Wachstum beider Organismen wird durch A-201A bei einer Konzentration von 1, Wo verhindert, wenn die Lösung mit dem Teststab 5 min in Berührung war.
Im übrigen hemmt A-201A das Wachstum von kariogenen Mikroorganismen in einem Kultur-Verdünnungstest. Beispielsweise wurde die folgende Mindesthemmkonzentration (MIC) von A-201A für die beschriebenen Testorganismen gefunden.
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EMI5.1
<tb>
<tb>
Testorganismus <SEP> Minimale <SEP> Hemmkonzentration
<tb> in <SEP> Mikrogramm/ml
<tb> Streptococcus <SEP> mutans <SEP> NCPC <SEP> 10449 <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP>
<tb> (National <SEP> Collection <SEP> Type <SEP> Culture,
<tb> London)
<tb> Streptococcus <SEP> sp. <SEP> 2,0
<tb> (nicht <SEP> identifiziert) <SEP> ; <SEP>
<tb> Stamm <SEP> A-31036
<tb> Streptococcus <SEP> sp. <SEP> 1,5
<tb> (nicht <SEP> identifiziert) <SEP> ; <SEP>
<tb> Stamm <SEP> A-31037
<tb> fadenförmiges <SEP> Stäbchen <SEP> 2,5
<tb> (nicht <SEP> identifiziert) <SEP> ; <SEP>
<tb> Stamm <SEP> A-31038
<tb>
Die Einverleibung von A-201A in eine entsprechende Zahnpasta, in ein entsprechendes Gel, Pulver
EMI5.2
zur Hemmung der Entwicklung von Zahnkaries.
Alternativ kann eine Lösung geeigneter Konzentrationvon A-201A auf die Oberfläche des Gaumens und der Zähne mit einem geeigneten Tupfer aufgebracht werden.
Wie gefunden wurde, ist das Antibiotikum A-201A auch bei der Begünstigung des Wachstums von Tieren wirksam. Wird A-201A der Grundration von 4 Tage alten heranwachsenden Küken in einer Menge von 45, 4 g/t zugesetzt, so ist die Gewichtszunahme und die Futterauswertung während eines 10-tägigen Zeit- raumes verbessert. Küken, die das Antibiotikum A-201A zusammen mit der Grundration erhielten, nahmen um 160 g zu, während solche, denen nur die Grundration verabfolgt wurde, eine Gewichtszunahme von 148 g erzielten. Im übrigen war auch die Futterausnützung in einem solchen Ausmasse verbessert, dass jene Küken, welche das A-201A erzielten, nur 1, 38 kg Futter je kg Gewichtszunahme benötigten, während jene, die nur die Grundration erhielten, eine Futteraufnahme von 1, 52 kg je kg Gewichtszunahme verzeichneten.
Die neuen, erfindungsgemäss erhältlichen Antibiotika werden durch Züchtung eines A-201 bildenden Stammes eines Streptomycetenorganismus in einem geeigneten Kulturmedium unter submersen aeroben Bedingungen, bis das Kulturmedium wesentliche antibiotische Aktivität aufweist, gebildet. Die Antibiotika können unter Anwendung verschiedener Isolations- und Reinigungsverfahrensweisen, wie sie üblicherweise verwendet werden und an sich bekannt sind, gewonnen werden. Das antibiotikahältige Kulturmedium liefert ein antibiotisches Gemisch, das die Antibiotika A-201A und A-201B enthält. Die einzelnen Antibiotika können voneinander und von andern geringfügigeren Komponenten der Fermentationsmischung abgetrennt werden. Das Antibiotikum A-201A kann in kristalliner Form durch Chromatographieren und Kristallisation erhalten werden.
Das Antibiotikum A-201B kann man durch Chromatographie als Öl bei Zimmertemperatur erhalten.
Der gemäss der Erfindung für die Herstellung des Antibiotikagemisches verwendete Actinomycet wurde als Stamm des Streptomyces cepreolus Higgens identifiziert und wurde ohne Beschränkung bezüglich Verfügbarkeit der permanenten Kultursammlung des Northern Utilization Research and Development Laboratory, Agriculture Research Service, United States Department of Agriculture, Peoria, Illinois einverleibt und hat die Bezeichnung No. NRRL 3817 erhalten. Der Stamm wurde aus einer Bbdenprobe, die in Venezuela gefunden wurde, isoliert. Der Organismus wurde aus der Bodenprobe durch Suspendieren von Anteilen der Probe in sterilem destillierten Wasser und Ausstrich der Suspension auf Nähragar isoliert. Die beimpften Nähragarplatten wurden bei 25 bis 350C bebrütet, bis Wachstum beobachtet wird.
Am Ende der Bebrütungsperiode werden Kolonien des A-201 bildenden Organismus mittels einer sterilen Platinschlinge auf Schrägagar überführt. Die Schrägagarproben werden dann bebrütet, um geeignete Mengen Inokulat für die Bildung von A-201 zu gewinnen.
Die prinzipiellen morphologischen Kennmerkmale des A-201 bildenden Stammes von Streptomyces capreolus, der gemäss der Erfindung verwendet wird, sind wie folgt : Ovale bis schwach zylindrisch geformte glatte Sporen sind in langen gebogenen, miteinander verwobenen Ketten im allgemeinen in einer Anzahl von 10 bis 50 Sporen je Kette angeordnet, wobei einige Ketten über 50 Sporen je Kette aufweisen. Die Abmessungen der Sporen liegen zwischen 1, 005 bis 2, 01 lui mal 0,67 bis 1, 005 li. Die Sporen in der Masse zeigen auf verschiedenen Medien weisse bis gelbe oder rote Farbe (E. B. Shirling und Gottlieb, Inter. Bull. Systemic Bacteriol., Bd. 16, [1966] S. 313-340).
Diese Kultur kann in weisse, gelbe und rote Gruppen gemäss Tresner und Backus, Applied Microbiology, Bd. 11, [1963] S. 335-338 gebracht werden. Eine Zellwandanalyse auf
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Basis der Verfahrensweise von Becker und Mitarb., App. Microbiol., Bd. 12, [1964] S. 421-423 ergibt das
Vorliegen des Mesoisomers von Diaminopimelinsäure. Die Kultur ist melaminnegativ. Die Kultur zeigt gutes
Wachstum bei Bebrütungstemperaturen von 350C oder darüber.
Andere Streptomyceten, die ähnlich dem A-201 bildenden sind, sind Streptomyces alboflavus und
Streptomyces canescus. Streptomyces alboflavus bildet aber ein Melaminpigment und Streptomyces canescus bildet kugelförmige Sporen.
Die Methoden, welche bei den taxonomischen Studien des A-201 bildenden Stammes von Streptomyces capreolus NRRL 3817 angewendet wurden, sind jene, die für das International Streptomyces Projectforthe characterization of Streptomyces species (Shirling und Gottlieb, ibid. ) empfohlen werden sind. Die Ergebnisse der taxonomischen Studien sind in den folgenden Abschnitten zusammengefasst. Die Farbnamen wurden nach der Methode Inter Society Color Council, National Bureau of Standards (ISCC. NBS) (K. L. Kelly und D. B. Judd, U. S. Department of Commerce, Circ. 553 [1955]) zugeordnet. Die in Klammern gesetzten Buchstaben beziehen sich auf die Farbblöcke und die unterstrichenen Buchstaben und Nummern auf die Farbspiegel gemäss Tresner und Backus, ibid. Die in Klammern gesetzten Zahlen verweisen auf Farbblöcke in A.
Maerz und M. R. Paul, Dictionary of Color, McGraw-Hill, New York [1950]. Die ISP-Nummern verweisen auf International Streptomyces Project media, deren Zusammensetzung von Shirling und Gottlieb, ibid. angegeben worden ist. Die Beobachtungen wurden nach Bebrütung bei 300C nach 14 Tagen vorgenommen, falls nichts anderes angegeben ist.
Mikroskopische Morphologie, Kulturkennmerkmale und Physiologie des Streptomaces capreolus NRRL 3817
Mikroskopische Morphologie :-Die Sporen sind oval bis schwach zylindrisch in der Form und in langen, gebogenen, verwobenen Ketten mit 10 bis 50 oder mehr Sporen je Kette angeordnet. Die Oberfläche der Sporen ist glatt, wie im Elektronenmikroskop beobachtet wurde. Die Sporendimensionen betragen l, 005 bis 2, Op mal 0,67 bis 1, 005 je.
Kulturkennmerkmale
Tomatenpaste-Hafermehlagar :-Gutes Wachstum mit schwachem Luftmycel und Sporen (W), weiss b.
Rückseite hellgrau-gelb-lichtbraun [13B5]. Kein lösliches Pigment.
Czapek's Agar :-Gutes Wachstum mit spärlichem Luftmycel und Sporen (R), blassorangegelb 3ca, [10B3].
Rückseite blassgelb [10B2]. Kein lösliches Pigment.
Hefeextraktagar :-ReichlichesWachstum ohne Luftmycel oder Sporen. Rückseite stark gelblich-rosa [2F9].
Kein lösliches Pigment.
Bennett's Agar :-Reichliches Wachstum ohne Luftmycel oder Sporen. Rückseite mässig rot [3H10]. Kein lösliches Pigment.
Nähragar :-Mässiges Wachstum ohne Luftmycel oder Sporen. Rückseite hellgraubraun. Kein lösliches Pigment.
Emersonls Agar :-Gutes Wachstum ohne Luftmycel oder Sporen. Rückseite dunkelgraugelb [13K3]. Kein lösliches Pigment.
Glucose-Asparagin-Agar :-Gutes Wachstum ohne Luftmycel oder Sporen. Rückseite stark gelblichrosa.
Kein lösliches Pigment.
Kalzium-Malat-Agar :-Das Wachstum auf diesem Medium war so schwach, dass keine Farbermittlung vorgenommen werden konnte.
Tyrosinagar :-Mässiges Wachstum mit spärlichem Luftmycel und Sporen (Y), blassgelb 2db [llC1]. Rückseite blass gelbgrün [10B1]. Kein lösliches Pigment.
ISP Medium Nr. 2 :-Reichliches Wachstum ohne Luftmycel oder Sporen. Rückseite graurötlichorange [11A8). Kein lösliches Pigment.
ISP Medium Nr. 3 :-Mässiges Wachstum mit mässigem Luftmycel und Sporen (R), graugelblichrosa 5cb [4A9]. Kein lösliches Pigment.
ISP Medium Nr. 4 :-Spärliches Wachstum mit spärlichem Luftmycel und Sporen (W), weiss b, Rückseite blassgelbgrün [10B1]. Kein lösliches Pigment.
ISP Medium Nr. 5 :-Das Wachstum auf diesem Medium war so schwach, dass keine Farbermittlung vorgenommen werden konnte.
Physiologische Kennmerkmale :
Gelatineverflüssigung-negativ Nitratreduktion - positiv
Melaminpigmentbildung-
EMI6.1
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Reaktion der Substratfarbe auf pH-Wert-Änderung-unbeeinflusst.
In Tabelle 2 sind die Ergebnisse zusammengestellt, die bei Kohlenstoff-Verwertungstests erhalten wurden, welche mit einem A-201 bildenden Stamm des Streptomyces capreolus NRRL 3817 vorgenommen wurden. Die in der Tabelle angegebenen Symbole bedeuten :
EMI7.1
<tb>
<tb> + <SEP> = <SEP> positive <SEP> Verwertung
<tb> (+) <SEP> = <SEP> voraussichtliche <SEP> Verwertung
<tb> (-) <SEP> = <SEP> fragliche <SEP> Verwertung
<tb> - <SEP> = <SEP> keine <SEP> Verwertung.
<tb>
Tabelle 2
EMI7.2
<tb>
<tb> Kohlenstoffverwertung <SEP> des <SEP> S. <SEP> capreolus-Stammes <SEP> NRRL <SEP> 3817
<tb> Kohlenstoffquelle <SEP> Reaktion
<tb> L-Arabinose
<tb> Cellobiose <SEP> + <SEP>
<tb> Isoinosit <SEP> (-) <SEP>
<tb> D- <SEP> (+)-Xylose
<tb> D-Mannit
<tb> D- <SEP> (-)-Fructose <SEP> (-) <SEP>
<tb> D- <SEP> (+)-Raffinose
<tb> Saccharose <SEP> (-) <SEP>
<tb> L- <SEP> (+)-Rhamnose
<tb> Dextrose <SEP> + <SEP>
<tb> Vergleich <SEP> (kein <SEP> Kohlenstoff)
<tb>
Wie oben ausgeführt, kann Streptomyces capreolus, Stamm NRRL 3817 in einem Kulturmedium unter Bildung der Antibiotika A-201A und A-201B wachsen. Das Kulturmedium kann ein beliebiges aus einer Anzahl verschiedener Medien sein. Zur Erzielung wirtschaftlicher Produktion, maximaler Ausbeute und leichter Isolierung werden gewisse Medien bevorzugt.
Im allgemeinen liefert ein Mehrkomponentenmedium. in welchem mehrere Quellen für Kohlehydrat und Stickstoff verfügbar sind, das beste Wachstumsmedium, Kohlehydrat wird aus solchen Quellen, wie Dextrinen, Melassen, Glucose, Glyzerin u. dgl., erhalten, Aminosäuregemische, Peptone u. dgl. sind gute Stickstoffquellen. Sojabohnenmehl liefert sowohl Kohlehydrat als auch Stickstoff.
Als Nährstoff verwertbare anorganische Salze werden in die Kulturmedien einverleibt und umfassen die üblichen Salze, die Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Kalzium-, Phosphat-, Sulfat-, Chlorid-, Bromid-, Nitrat-, Carbonat-u. dgl.-Ionen liefern. Die Zufuhr von Magnesium- und Eisensalzen, vorzugsweise als Sulfate, hat einen besonders günstigen Effekt auf die Bildung des A-201-Antibiotikumgemisches. Wie es für das Wachstum und die Entwicklung anderer Mikroorganismen notwendig ist, sollen wesentliche Spurenelemente gleichfalls dem Kulturmedium für die Züchtung des erfindungsgemässen Organismus zugesetzt werden. Solche Spurenelemente werden üblicherweise zufällig als Verunreinigung mit dem Zusatz der andern Bestandteile des Kulturmediums zugegeben.
Der Organismus, der zur Bildung von A-201A und A-201B verwendet wird, ist befähigt, innerhalb eines umfassenden pH-Bereiches zu wachsen. Beispielsweise kann der pH-Wert der verschiedenen Medien, die zur Züchtung des Organismus benutzt werden können, im Bereich von 6,2 bis 7,2 liegen. Wie dies bei den meisten der Streptomyceten der Fall ist, wird das Medium allmählich stärker alkalisch und kann einen PH-Wert von etwa 6, 5 bis 8, 0 während der Züchtungsperiode erreichen. Der pH-Wert zum Zeitpunkt der Gewinnung am Ende der Züchtungsperiode beträgt üblicherweise 6, 8 bis 7,2.
Vorzugsweise wird eine submerse aerobe Fermentation in grossen Tieftanks für die Produktion grosser Mengen der A-201-Antibiotikummischung benutzt. Kleine Mengen der Antibiotikas können in Schüttelkolbenkultur erhalten werden. Bei der Produktion dieser Antibiotikamischung wird es bevorzugt, ein vegetatives Inokulat zu verwenden, weil bei der Beimpfung grösserer Tanks mit der Sporenform des Organismus eine Lagzeit oder
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EMI8.1
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Wie oben erwähnt, ist das A-201-Antibiotikagemisch gegen PPLO-Organismen und verschiedene Spezies von Pasteurella, Salmonella, Streptococci, Staphylococci u. dgl. aktiv und hat eine Hemmaktivität gegen verschiedene Pflanzenpathogene.
Demgemäss kann das gereinigte Antibiotikum A-201A in einer geeigneten Mischung verwendet werden, wie sie üblicherweise zur Behandlung infizierter Tiere oder Pflanzen angewendet wird. Beispielsweise kann A-201A als Lösung Schweinen injiziert werden, die mit Pasteurella spp. infiziert sind, oder es kann dem Tierfutter oder dem den Tieren gegebenen Wasser zur Behandlung der Infektion zugesetzt werden. Das Antibiotikum A-201B hat, wie oben gezeigt, antibakterielle Aktivität und kann zur Behandlung und Bekämpfung solcher Pathogene, wie Erwinia amylovora (Feuermehltau auf Birnen) durch Zugabe des A-201B zu üblichen Blattspraymischungen, wie sie üblicherweise auf Birnbäume zur Behandlung und Bekämpfung des Bakteriums verwendet werden, aufgebracht werden.
Ausserdem hat A-201B Antifungusaktivität und kann zur Bekämpfung von Pilzen, wie Botrytis cinerea, ein Pathogen, der verschiedene Zier- und Erntepflanzen infiziert, benutzt werden.
Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele näher veranschaulicht.
EMI9.1
Zusammensetzung aufweist :
EMI9.2
<tb>
<tb> Hefeextraktagar
<tb> Bestandteil <SEP> Menge
<tb> Glucose <SEP> 5 <SEP> g <SEP>
<tb> Hefeextrakt <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Agar <SEP> 20 <SEP> g <SEP>
<tb> destilliertes <SEP> Wasser,
<tb> Rest <SEP> auf <SEP> 11 <SEP>
<tb>
Der Schrägagar wird mit den Sporen von NRRL 3817 beimpft und 6 Tage bei 300C bebrütet. Die reifen Schrägkulturen werden dann mit sterilem destillierten Wasser überdeckt und mit einer sterilen Schlinge abgekratzt, um die Sporen zu lockern.
Die entstehende Sporensuspension wird kräftig gerührt, um eine gleichförmige Verteilung hervorzurufen, und 1 ml der Suspension wird zur Beimpfung von 100 ml eines vegetativen Nährmediums der folgenden Zusammensetzung verwendet :
EMI9.3
<tb>
<tb> Vegetatives <SEP> Impfmedium
<tb> Bestandteil <SEP> Menge
<tb> Dextrose <SEP> 15 <SEP> g
<tb> Sojabohnenmehl <SEP> 15 <SEP> g
<tb> Cornsteep-Feststoffe <SEP> 5g
<tb> Kalziumcarbonat <SEP> 2 <SEP> g <SEP>
<tb> Natriumchlorid <SEP> 5 <SEP> g <SEP>
<tb> Leitungswasser,
<tb> Rest <SEP> auf <SEP> 11
<tb>
Das vegetative Nährmedium wird durch Autoklavieren auf 1200C während 30 min vor der Beimpfung sterilisiert.
Das beimpfte vegetative Medium wird 48 h bei 300C unter kontinuierlichem Schütteln auf einer Rotationsschüttelmaschine, die mit 250 Umdr/min arbeitet, bebrütet.
100 ml-Anteile des Produktionsmediums, welches die gleiche Zusammensetzung aufweist wie oben für das vegetative Impfmedium angegeben, werden in 500 ml Erlenmeyerkolben gebracht und bei 1200C während 30 min sterilisiert. Nach dem Abkühlen werden die Kolben mit 5 ml-Anteilen des bebrüteten vegetativen Mediums, das wie im vorigen Absatz beschrieben bebrütet wurde, beimpft.
Die Produktionsfermentaüonskultur wurde 72 h bei 300C auf einer Rotationsschüttelmaschine geschüttelt, die mit 250 Umdr/min arbeitet. Der PH-Wert des unbeimpften Mediums betrug etwa 7, 0. Der pH-Wert stieg während des Fermentationszeitraumes allmählich an und im Zeitpunkt der Wirkstoffgewinnung betrug er etwa
<Desc/Clms Page number 10>
7, 5. Die antibiotische Aktivität wurde aus der Fermentationsbrühe unter Anwendung an sich bekannter Verfahrensweisen extrahiert.
Beispiel 2 : A. Fermentation von A-201-Antibiotika in einem 950 1 Tank
Sporen von Streptomyces capreolus NRRL 3817 wurden auf einen Schrägnähragar folgender Zusammensetzung aufgeimpft :
EMI10.1
<tb>
<tb> Bestandteil <SEP> Menge
<tb> Glucose <SEP> 5 <SEP> g <SEP>
<tb> Hefeextrakt <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Agar <SEP> 20 <SEP> g <SEP>
<tb> destilliertes <SEP> Wasser,
<tb> Rest <SEP> auf <SEP> 11 <SEP>
<tb>
Der beimpfte Schrägagar wurde bei etwa 30 C etwa 5 Tage bebrütet und dann wurde eine kleine Menge steril destillierten Wassers zugegeben und die Oberfläche des Agars mässig mit einer sterilen Platindrahtöse ge- kratzt, um den Organismus loszulösen und eine wässerige Suspension zu erhalten.
1/2 ml der so erhaltenen Suspension wurde verwendet, um 50 ml eines sterilen vegetativen Nährmediums mit der folgenden Zusammensetzung zu beimpfen :
EMI10.2
<tb>
<tb> Bestandteil <SEP> Menge
<tb> Dextrose <SEP> 15 <SEP> g <SEP>
<tb> Bactopepton <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Glycerin <SEP> 10 <SEP> g <SEP>
<tb> Amber <SEP> ALB <SEP> 1) <SEP> 10 <SEP> g <SEP>
<tb> Melassen <SEP> von <SEP> der
<tb> Herstellung
<tb> dunkler <SEP> Liköre <SEP> 5 <SEP> g <SEP>
<tb> Nadrisol <SEP> 2) <SEP> 10 <SEP> g <SEP>
<tb> destilliertes <SEP> Wasser,
<tb> Rest <SEP> auf <SEP> 11 <SEP>
<tb>
1) = Amber ALB ist eine Handelsbezeichnung für ein Milch-Albumin- produkt der Firma Amber Laboratories, Juneau, Wisconsin 55039j
2)
= Nadrisol ist eine Handelsbezeichnung für lösliche Trockenprodukte aus Maisdestillaten (der Firma National Distilliers Products
Company, New York).
Der pH-Wert dieses Nährmediums wurde mit 5n-Natronlauge vor der Sterilisation auf 7,0 bis 7,2 eingestellt. Der pH-Wert des Mediums nach der Sterilisation betrug 6,5 bis 6,6. Dieses beimpfte vegetative Kulturmedium wurde 72 h bei etwa 300C unter konstanter Bewegung auf einer Rotationsschüttelmaschine, die mit 250 Umdr/min arbeitet, bebrütet.
Ein 20 ml-Anteil des so hergestellten vegetativen Impfmaterials wurde in 400 ml eines vegetativen Nährmediums für die zweite Stufe mit derselben Zusammensetzung wie oben angegeben eingeimpft. Dieses Inokulat der zweiten Stufe wurde etwa 48h bei 300C unter konstanter Bewegung auf einer Rotationsschüttelmaschine, die mit 250 Umdr/min arbeitet, bebrütet.
42 I eines Impf-Übertragungsmediums, das wie oben für die erste Stufe des vegetativen Nährmediums angegeben zusammengesetzt war, wurde mit 0,2 g eines Antischaummittelzusatzes je l Medium zu einem Fermentationstank nach 30 min Sterilisation bei 1200C zugegeben. Etwa 400 ml des vegetativen Inokulats der zweiten Stufe wurden zu dem Impf-Übertragungsmedium gegeben. Die Fermentation des Impf-Übertragungsnährmediums wurde etwa 24 h bei etwa 300C unter Rühren mit einer Geschwindigkeit von 135 Umdr/min und einer Belüftungsgeschwindigkeit von 0,03 m3/min durchgeführt.
Nach etwa 24 h Fermentation wurden etwa 8, 0 1 der Impf-Übertragungstankkultur verwendet, um 950 l eines sterilen Produktionsmediums zu beimpfen, das wie folgt zusammengestellt war :
<Desc/Clms Page number 11>
EMI11.1
<tb>
<tb> Bestandteil <SEP> % <SEP> (Gew. <SEP> -/Vol.) <SEP>
<tb> Antischaummittel <SEP> 0, <SEP> 02 <SEP>
<tb> Dextrose <SEP> 5, <SEP> 00
<tb> Sojabohnenschrott <SEP> 1, <SEP> 50
<tb> Melassen <SEP> von <SEP> der
<tb> Herstellung
<tb> dunkler <SEP> Liköre <SEP> 0, <SEP> 30 <SEP>
<tb> Kalziumcarbonat <SEP> 0, <SEP> 25 <SEP>
<tb> destilliertes <SEP> Wasser,
<tb> Rest <SEP> auf <SEP> 100, <SEP> 0 <SEP>
<tb>
Die Temperatur des Fermentationsmediums wurde bei einer Rührgeschwindigkeit von etwa 250 Umdr/min und einer Belüftungsgeschwindigkeit von etwa 0,395 m3/min bei etwa 300C gehalten.
Die Fermentation wurde etwa 48 h ausgeführt, nach welcher Zeit eine sterile Lösung von 472 kg Dextrose in 42 l Wasser zugesetzt wurde. Die Fermentation wurde etwa weitere 48 h fortgesetzt und dann beendet, worauf mit dem Gewinnungsverfahren begonnen wurde.
B. Isolierung der Antibiotikamischung 900 I Fermentationsbrühe, die wie in A oben beschrieben erhalten worden ist, werden mit 27 kg eines handelsüblichen Filterhilfsmittels (Hyflo Super-cel) filtriert und das Filtrat wird mit einer 5n-Natronlauge auf einen pH-Wert von 8,5 eingestellt. Das alkalische Filtrat wird zweimal mit 0,5 Vol. -Teilen Chloroform extrahiert. Die Chloroformextrakte werden vereinigt und unter Vakuum zur Trockne eingedampft. Der entstehende Rückstand wird in 2 I Methanol aufgelöst und die unlöslichen Teilchen werden abfiltriert und verworfen. Das methanolische Filtrat wird zur Trockne unter Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird in 470 ml
EMI11.2
den.
C. Trennung des A-201-Antibiotikagemisches
63 g rohes Antibiotikum A-201-Gemisch, das wie unter B oben angegeben erhalten worden ist, werden in 500 ml Chloroform gelöst. Eine Chromatographiersäule mit den Abmessungen 7 cm x 60 cm wurde mit Silicagel (Grace 62, Davison Chemical Co.) gefüllt, das in einem Gemisch aus Aceton und Chloroform im Verhältnis 1 : 1 aufgeschlämmt ist. Das Trägerhilfsmittel wird abgezogen, wobei das Silicagel zusammenbackt. Die Chloroformlösung des rohen A-201-Antibiotikagemisches wird von oben auf die Säule aufgebracht und die Antibiotikalösung wird durch das Silicagelbett durchlaufen gelassen.
Nachdem 500 ml Chloroform von der Säule abgelaufen sind, wird das Silicagelbett mit 10 I eines Chloroform/Aceton-Gemisches im Verhältnis 1 : 1 gewaschen. Das ausfliessende Material und die Waschflüssigkeit werden verworfen.
Dann wird Aceton durch die Säule geführt und das Eluat wird auf antibiotische Aktivität geprüft. Die Fraktionen, welche antibiotische Aktivität aufweisen, werden vereinigt und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Etwa 500 ml Aceton werden dem so erhaltenen Rückstand zugesetzt. Die Lösung wird erwärmt und dann bei -200C über Nacht absitzen gelassen, um die Kristallisation des Antibiotikums A-201A zu ermöglichen. Die Kristalle werden abfiltriert und unter Vakuum getrocknet, wobei 13,3 g Antibiotikum A-201A mit einem F. von 170 bis 1720C erhalten werden.
Im Anschluss an die Eluierung des Antibiotikums A-201A wird ein Aceton/Methanol-Gemisch im Verhältnis 9 : 1 durch die Säule geführt und in Fraktionen aufgefangen, welche auf antibiotische Aktivität geprüft werden. Alle Eluatfraktionen, die antibiotische Aktivität zeigen, werden vereinigt und im Vakuum zur Trockne eingedampft, wobei etwa 5 g A-201B-Antibiotikum das ein gedeckt weisses bis hellbraunes Öl bei 250C ist, erhalten werden.