DD202032A5

DD202032A5 - Verfahren zur herstellung von makroliden

Info

Publication number: DD202032A5
Application number: DD81234840A
Authority: DD
Inventors: Richard H Baltz; Herbert A Kirst; Gene M Wild; Eugene T Seno
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 1980-11-10
Filing date: 1981-11-10
Publication date: 1983-08-24
Also published as: IE812616L; GB2086902B; AR227563A1; IE51826B1; IL64240A; CA1169374A; EP0052005A1; PH17375A; ZA817718B; DK494381A; GB2086902A; US4304856A; FI813527L; PL233747A1; DE3168693D1; HU190360B; KR830007833A; JPS57108097A; EP0052005B1; AU7731381A

Abstract

Verfahren zur Herstellung der Makrolide 20-Dihydro-20-desoxy-23-demycinosyltylosin und 20-Dihydro-20-desoxy-5-0-mycaminosyltylonolid und deren pharmazeutisch unbedenklichen Estern sowie Saeureadditionssalzen durch an sich bekannte Zuechtung des Mikroorganismus Streptomyces fradiae ATCC 31733 oder einer Mutanten oder Rekombinanten hiervon unter Bildung von 20-Dihydro-20-desoxy-23-demycinosyltylosin, gegebenenfalls anschliessende hydrolytische Abspaltung der daran vorhandenen Mycarosylgruppe unter milden Hydrolysebedingungen unter Bildung von 20-Dihydro-20-desoxy-5-0-mycaminosyltylonolid und gegebenenfalls nachfolgende uebliche Veresterung oder Salzbildung des hierdurch jeweils erhaltenen Makrolids. Die hierdurch zugaenglichen neuen Makrolide sind wertvolle therapeutische Mittel, die in ihrer Wirksamkeit dem bekannten Tylosin aehnlich sind. Sie eignen sich daher als Antibiotika zur Bekaempfung der verschiedensten Mikroorganismen.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren .zur Herstellung von Makroliden,, die sich durch eine interessante antibiotische Wirksamkeit auszeichnen.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen:

Die vorliegend erhältlichen.Makrolide sind dem als Therapeut, ikum bekannten Tylosin ähnlich, und hierzu wird auf Tetrahedron Letters, 2339 {1970) hingewiesen...

Aufgabe der Erfindung;

Trotz der großen Bedeutung von Tylosin besteht immer noch Bedarf an der Entwicklung neuer Antibiotika, und zwar unter anderem auch infolge der Möglichkeit zur Bildung von Mikroorganismenstämmen, die' gegenüber diesem Antibiotikum resistent sind« Weiter kann auch eine strukturelle Abwandlung zu Veränderungen im Spektrum suszeptibler Mikroorganismen führen. Leider haben sich nun chemische Veränderungen der Struktur der tylosinähnlichen Makrolide als äußerst schwie-

rig erwiesen. So werden beispielsweise in J. Org. ehern= (12) 2050 bis 2052 (1979) die praktisch unüberwindlichen Probleme aufgezeigt, mit denen die Spaltung der Mycinosylglycosidbrücke von Tylosin auf chemischem Wege verbunden ist. Der hauptsächliche Forschungsaufwand im Zusammenhang mit der Untersuchung neuer Strukturen ist daher zwangsläufig mit der Suche nach neuen Mikroorganismen befaßt, und zwar entweder von natürlich vorkommenden oder synthetisch erzeugten Mikroorganismen, in der Hoffnung;, daß durch deren.Züchtung ähnliche Strukturen gebildet werden.

Infolge der Problematik des oben erwähnten bekannten TyIo-sins und anderer bekannter Makrolidantxbiotika liegt der Erfindung nun die Aufgabe zugrunde, neue Makrolidantibiotika zu schaffen, die in einfacher Weise zugänglich sind und die sich durch eine besondere antibiotische Wirksamkeit auszeichnen.

Darlegung des Wesens der Erfindung;

Die obige Aufgabe wird nun erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung von Makroliden der allgemeinen Formel I

©11 7® / \

CHs-ffis ef-CHa-CHs

18 ]

l 19 SO

²³ / /

HO-CHa-* 14

CHa-CHs-*,? s

17 1

i L 13 k Π 3 . - 3 -

worin Q für Wasserstoff oder einen Rest der allgemeinen Formel

OH _l „_.CH

CHg β"

steht und pharmazeutisch unbedenklichen Estern oder Säureadditionssalzen hiervon„

Diese neuen Makrolide stellen wertvolle therapeutische Mittel dar, die sich insbesondere durch eine Hemmung des Wachstums pathogener Mikroorganismen auszeichnen.

Bedeutet Q in obiger Formel einen Mycarosezuckerrest, dann .handelt es sich bei einer solchen Verbindung aus der alIgemeinen Formel I um 20-Dihydro-20~des'oxy-23-demycinosyltylo-Sin (DH-DO-DMT);

H₃

2348

Steht Q in obiger allgemeiner Formel für Wasserstoff, dann handelt es sich bei dieser Verbindung aus der allgemeinen Formel I um 20'-Dihydro-20-dssoxy-5-O-myGainincGyltylonoliä (DH-DO-OMT):

V-CHs

CHs-/ ' V-CH2-CH3 I CH₃ I

\> OH

JJ

ψ

CHs

Die Stereochemie der Verbindungen der oben angegebenen Strukturen ist identisch mit derjenigen des Tylosins, obwohl hierüber oben keine Angaben gemacht sind,, Der Neutralzucker ist Mycarοse, während es sich beim Aminozucker um My Camino se handelt=,

Die vorliegenden Verbindungen DH-DO-DMT und DH-DO-OMT hemmen, wie bereits oben erwähnt, das Wachstum von Mikroorganismen , welche Krankheitserreger für Tiere darstellen. Die Verbindungen DH-DÖ-DMT und DH-DO-OMT sind insbesondere antibakterielle Mittelf die gegenüber grampositiven Mikroorganismen und Spezies von Mycoplasma. wirksam sind»

Das DH-DO-DMT läßt sich an den in den Stellungen 2\ 4", 3", 23 und 3 befindlichen Hydroxylgruppen verestern, und das DH-DO-OMT kann an den in den Stellungen 2\ 4'_? 2 3 und

3 vorhandenen Hydroxylgruppen verestert werden, wodurch man zu interessanten Acylesterderivaten gelangt. Am einfachsten verläuft eine Veresterung der Hydroxylgruppen in den Stellungen 2^S und 4'. Beispiele solcher Ester sind die Ester mit einer Monocarbonsäure oder die Halbester mit einer Dicarbonsäure, die jeweils, über 2 bis 18 Kohlenstoffatome verfügen. . .

DH-DO-DMT, DH-DO-OMT und ihre Acylesterderivate sind basische Verbindungen _s deren Behandlung mit Säuren zu Säureadditionssalzen führt. Solche Säureadditionssalze gehören ebenfalls zur Erfindung»

Zur Erfindung gehört weiter auch ein neuer Mikroorganis- . mus, der als Stamm von Streptomyces fr.adiae klassifiziert worden ist.

Weiter gehört hierzu auch ein Verfahren zur Herstellung von DH-DO-DMT oder DH-DO-OMT durch Züchtung dieses Stamms unter submersen aeroben Fermentationsbedingungen bis zur Bildung eines wesentlichen /Ausmaßes an antibiotischer Aktivität. Aus dem dabei erhaltenen -und basischgestellten Filtrat der Fermentationsbrühe lassen sich durch Extraktion mit polarem organischem Lösungsmittel die gewünschten Verbindungen DH-DO-DMT und DH-DO-OMT extrahieren,,, und diese Verbindungen können dann gewünschtenfalls durch Extraktion, Chromatographie und/oder Kristallisation weiter gereinigt werden.

Schließlich gehört zur Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung von DH-DO-OMT,, das darin besteht, daß man DH-DO-DMT einer Hydrolyse mit einer schwachen Säure unterzieht,

Die Infrarot-Absorptionsspektren von DH-DO-DMT (freie Base) und DH-DO-OMT (freie Base) in Chloroform gehen aus der an-

η c - 6 -

j .J

liegenden Zeichnung hervor. In ihr zeigen:

Fig. 1 das Infrarot-Absorptionsspektrum von DH-DO-DMT und

Fig. 2 das Infrarot-Absorptionsspektrum von DH-DO-OMT.

Im.folgenden werden die Eigenschaften von DH-DO-DMT und DH-DO-OMT im einzelnen näher beschrieben.

Eigenschaften von DH-DQ-DMT

Die Struktur von DH-DO-DMT ergibt sich aus der oben angegebenen Formel I „

DH-DO-DMT stellt einen weißen kristallinen Feststoff dar, der bei etwa 198 bis 200⁰C schmilzt. DH-DO-DMT verfügt über folgende ungefähre prozentuale Elementarzusammensetzung-. ^:~63 % Kohlenstoff, 9 % Wasserstoff, 2 % Stickstoff und 26 % Sauerstoff. DH-DO-DMT hat die empirische Formel C^oH^t-NO-,ρ und weist ein Molekulargewicht von etwa 728 auf (727 aufgrund einer Bestimmung durch Feld-Massenspektrometrie). . ' ''"·.*

Das Infrarot-Absorptionsspektrum der freien Base von DH-DO-DMT in Chloroform geht aus Fig. 1 der Zeichnung hervor. Entsprechende Absorptionsmaxima lassen sich bei folgenden Frequenzen (cm ") beobachten; 3676 (schmal), 3598 (schmal), 3470 (groß-breit), 3010 (stark), 2974 (stark), 2938 (stark), 2925 (Schulter), 2880 (stark), 2799 (schmal), 2457-, (schmalbreit) , 1715 (stark),1676 (mittel), 1629 (schmal), 1595 . (sehr stark), 1456 (stark), 1411 (stark), 1380 (stark),· 1363*(Schulter), 1315 (stark), 1273 (schmal), 1263 (Schulter), 1220 (schmal-breit),· 1184 (stark), 1162 (stark), 114.4

/, H A Π h _ ₇

H* ^ ^o"t iJ «^ . <

(schmal), 1117 (mittel), 10 96 (Schulter), 1076 (starke Schulter), 1050 (sehr stark), 1015 (stark), 997 (mittel),

985 (mittel), 958 (mittel), 923 (mittel), 905 (mittel),

867 (schmal), 842 (mittel), 720 (breit) und 660 (schmal).

Das Ültraviolett-Absorptionsspektrum von DH-DO-DMT in 9 5 %-igern neutralem Ethanol zeigt ein Absorptionsmaximum bei 283 nm (ε = 21800) .

DH-DO-DMT (freie Base) zeigt folgenden spezifischen Drehwert: /§7q⁵ =-46,3° (c = 3,3, CH₁OH).

Eigenschaften von DH-DO-OMT

DH-DO-OMT stellt einen weißen kristallinen Feststoff dar, der bei etwa 214 bis 217⁰C schmilzt. DH-DO-OMT verfügt über folgende ungefähre prozentuale Elementarzusammenset™ zung: 64 % Kohlenstoff, 9 % Wasserstoff, 2,5 %. Stickstoff, und 24,5 % Sauerstoff» DH-DO-OMT hat die empirische Formel C,,H„N0q und weist ein Molekulargewicht von etwa 584 auf. (583 aufgrund einer Bestimmung durch Feld-Massenspektrometrie)_o

Das Infrarot-Absorptionsspektrum der freien Base von DH-DO-OMT in Chloroform geht, aus Fig. 2 der Zeichnung hervor, Entsprechende Absorptionsmaxima lassen sich bei folgenden Frequenzen (cm ) beobachten; 3677 (sehr schmal), 3601 (schmal) 3422 (breit), 300 6 (stark), 2 971 (stark),2937 (stark), 28 7 9 (stark), 2798 (schmal), 1714 (stark), 16 77 (stark),, 1627 (schmal), 1593 {sehr stark), 1457 (stark), 1407 (schmal), 1382 (mittel), 1362 (Schulter), 1315 (mittel), 1269 (schmal), 1181 (sehr stark), 1141 (schmal), 1115 (schmal), 1079 und 1058 (stark, Doublett), 1008 (mittel), 983 (mittel), 923 (schmal), 903 (schmal), 865 (schmal.), 835 (schmal),-(breit), 6 58 (schmal) und 62 9 (schmal).

έ£ ο &4

Das Ultraviolett-Absorptionsspektrum von DH-DO-OMT in 95 %-igem neutralem Ethanol zeigt ein Absorptionsmaximum bei 282 nm (ε = 22400).

DH-DO--0MT (freie Base) zeigt folgenden spezifischen Drehwert; /oT/^ =-7,35° (c = 6, CH₀OH).

Die H--kernmagnetischen Resonanzdaten (NMR-Werte) bei 360 MHz für DH-DO-OMT (freie Base) in CDCl₃ gehen aus der folgenden Tabelle I hervor.

TABELLE I 360 MHz-NMR-Daten für DH-DO-OMT

Stellung δ *

2. . 2,0/2,5

3 ~ 3,7~3,85

4 1,64

5 ; ^3,7-3,85

6 NB**

7 NB

8 .2,8 •10 -6,27

11 -7,27

13 . 5,78

14 2,91

15 4,96

16 NB/1,64

17 0-,96

18 . 1,05

19 -1,49

20 0_f89

21 1,18

22 1,82

^, -* -. » if*i

) 1 L B Λ Π h - 9 -

TABELLE I (Fortsetzung)

Stellung δ*

23

I⁵ ' 2^!

4» 5^s 6¹

NMe

^3f 7	-3,85
4	,31
3	,55
2	,40
3	,08
3	,22
1	,31
2	,51

* ppm nach dem inneren. Tetramethylsilan **NB = nicht bestimmt

-DH-DO-DMT und DH-DO-OMT lösen sich in Form der freien Basen in Wasser und den meisten polaren organischen Lösungsmitteln,, wie Aceton, Methanol. Ethanol, Chloroform, Dimethylformamid oder Dimethylsulfoxid„ Die Säureadditionssalze von DH-DO-DMT und DH-DO-OMT sind in Wasser besser löslich als die entsprechenden freien Basen»

DH-DO-DMT und DH-DO-OMT lassen sich voneinander durch Dünnschichtchromatographie unterscheiden. Die ungefähren Rf-Werte von DH-DO-DMT und DH-DO-OMT in einem dünnschichtchromatographischen System gehen aus der folgenden Tabelle II hervor. Zur Detektion wurde die Ultraviolettabsorption verwendet „

TABELLE II

Werte der Dünnschichtchromatographie '

Verbindung Rf_- Wert_

DH-DO-OMT 0_f53

DH-DO-DMT 0,64

/ Q / η C - ίο -

TABELLE II (Fortsetzung)

^aMedium; E.. Merck,'.Darmstadt - Silicagel 60 Lösungsmittels Ethylacetat t Diethylamin (95 : 5)=

Herstellung von DH-DO-OMT . .

Die Erfindung ist weiter auch noch auf ein Verfahren zur Herstellung von DH-DO-OMT durch Hydrolyse von DH-DO-DMT mittels einer schwachen Säure gerichtet. Solche schwach sauren Hydrolysebedingungen sind dem Fachmann bekannt. Eine derartige Hydrolyse läßt sich beispielsweise unter Verwendung entsprechender Lösungen durchfuhren, die über einen pH-Wert von etwa. 4 oder darunter verfügen. Bei diesem Verfahren kann unter Anwendung von. Temperaturen zwischen etwa 20 und 100⁰C gearbeitet werden. Die zur Durchführung der Hydrolyse erforderliche Reaktionszeit schwankt in Abhängigkeit vom pH-Wert des Reaktionsgemisches und der jeweiligen Arbeitstemperatur'. Bei höheren- pH-Werten ist die Reaktionsgeschwindigkeit langsamer,, und bei höheren Temperaturen ist die Reaktionsgeschwindigkeit höherο Die Umsetzung wird durchgeführt, indem man DH-DO-DMT so lange mit einer Lösung einer schwachen Säure behandelt, bis es zur gewünschten Abspaltung der Mycarosylgruppe unter Bildung von DH-DO-OMT gekommenist.

Wahlweise und gelegentlich auch vorzugsweise läßt sich DH-DO-OMT herstellen.» indem man DH-DO-DMT in der Fermentationsbrühe, in welcher es gebildet worden .-ist, so lange unter Anwendung schwach saurer Bedingungen der oben beschriebenen Art behandelt, bis es zu einer Umwandlung von DH-DO-DMT zu -DH-DO-OMT' gekommen ist. Das auf diese Weise erhaltene DH-DO-OMT läßt sich dann unter Anwendung der hierin im'einzelnen.näher beschriebenen Techniken aus der Fermentationsbrühe isolieren...

/, η κ

Esterderivete

DH-DO-DMT läßt sich an den in den Stellungen 2', 4% 3", und 3 befindlichen Hydroxylgruppen unter Bildung von Acylesterderivaten verestern, indem man es unter Anwendung bekannter Methoden mit geeigneten Acyiierungsmitteln behandelt» DH-DO-OMT kann unter Anwendung entsprechender Methoden an den in den. Stellungen 2' , 4\ 23 und 3 befindlichen. Hydroxylgruppen verestert werden. Als Acylierungsmittel eignen sich hierzu beispielsweise Anhydride, Halogenide (gewöhnlich in Kombination mit einer Base oder einem sonstigen Säureakzeptor) und aktive Ester organischer Säuren» Die Acylierung läßt sich ferner auch unter Verwendung eines Gemisches aus einer organischen Säure und einem Dehydrati- sierungsrnittel, wie N_PN^E-Dicyclohexylcarbodiimid erreichen. Ferner können solche Acylierungen auch enzymatisch nach dem in US-PS 4 092 473 beschriebenen Verfahren durchgeführt werden. Nach erfolgter Bildung können die jeweiligen Acylderivate durch Einsatz üblicher Methoden abgetrennt und gereinigt werden»

Die in den Stellungen 2^f und 4^E befindlichen Hydroxylgruppen lassen sich am leichtesten verestern« So lassen sich beispielsweise 2^!-Monoesterderivate von DH-DO-DMT herstell enf indem man eine solche Verbindung einer an- sich bekannten selektiven Veresterung unterzieht, beispielsweise einer Behandlung des Antibiotikums mit einer stöchiornetrisehen Menge (oder einer leicht überschüssigen Menge) eines Acylierungsmittels, wie eines Acylanhydrids _s etwa bei Raumtemperatur über eine Zeitdauer von etwa 1 bis 24 Stunden bis zur praktischen Beendigung der Veresterungsreaktion. Die hierdurch erhaltenen Derivate lassen sich aus dem Reaktionsgemisch durch übliche Verfahren isolieren, beispielsweise durch Extraktion, Chromatographie oder Kristallisation. Durch Veresterung von DH-DO-

τ 9 „

OMT unter ähnlichen Bedingungen gelangt man zu 2',4'-Diesterderivaten. 2^!-Monoester von DH-DO-OMT lassen sich herstellen, indem man die entsprechenden 2'-Monoester von DH-DO-DMT unter Anwendung der oben beschriebenen schwach sauren Bedingungen hydrolysiert= Gemischte" 2'/4'-Diester von DH-DO-OMT lassen sich bilden, indem man die 2'-Monoester von DH-DO-OMT in der oben beschriebenen Weise verestert«

Als Ester der oben beschriebenen Art eignen sich beispielsweise die Ester von organischen Säuren, beispielsweise die Ester von aliphatischen Carbonsäuren, cycloaliphatischen Carbonsäuren, Arylsäuren, Äralkylsäuren, heterocyclischen Carbonsäuren, Sulfonsäuren oder Alkoxycarbonsäuren mit jeweils 2 bis.18 Kohlenstoffatomen,, und von anorganischen Säuren, wie Schwefelsäure oder Phosphorsäure ο

Zu Beispielen für geeignete Ester gehören die Ester von Säuren, wie Essigsäure, Chloressigsäure, Propionsäure, Buttersäure,- Isovaleriansäure, Alkoxycärbonsäure, Stearinsäure, Cyclopropancarbonsaure„ Cyclohexancarbonsäuren ß-Cyclohexylpropionsäure, 1-Adarnantancarbonsäure, Benzoesäure, Phenylessigsäure, Phenoxyessigsäure, Mandelsäure oder 2-Thienylessigsäure sowie die Ester von Alkylsulfonsäuren, Ary!sulfonsäuren oder Aralkylsulfonsäuren. Die Arylsulfonsäuren oder Aralkylsulfonsäuren können an ihrem aromatischen Ring wahlweise auch Substituenten enthalten, wie-Halogen, Nitro oder Niederalkoxy. Zu geeigneten Estern gehören ferner auch die Halbester von Dicarbonsäuren, wie Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Malonsäure oder Phthalsäure.

Pharmazeutisch unbedenkliche Esterderivate stellen eine bevorzugte Verbindungsgruppe dar. Andere Esterderivate sind jedoch ebenso geeignet, wenn gegebenenfalls auch nur als Zwischenprodukte.

Π Κ - 13

Salze

DH-DO-DMT; DH-DO-OMT und ihre entsprechenden Derivate biluen auch Sciux'säd.ciii'.j-Oi'iSScilze. Die SctureüdcIitiuriSSciize von DH-DO-DMT und DH-DO-OMT und ihrer Acylderivate gehören ebenfalls zur Erfindung, Solche Salze eignen sich beispielsweise zur Abtrennung^ Reinigung und Kristallisation von DH-DO-DMTf DH-DO-OMT und ihren Acy!derivaten. Ferner verfugen derartige Salze auch über eine verbesserte Löslichkeit in Wasser«

Zu Beispielen für geeignete Salze gehören die durch übliche Reaktion mit sowohl organischen als auch anorganischen Säuren entstehenden Salze, beispielsweise Salze von Schwefelsäure,-Chlorwasserstoff säure, Phosphorsäure,. Essigsäure;, Bernsteinsäure j, Citronensäure;, Milchsäure* Maleinsäure, Fumarsäure, Palmitinsäure, Cholsäure, Pamoasäure, Muc-insäure, D-Glutaminsäure, d~Karnphersäure, Glutarsäure, Glykoisäure, Phthalsäure,, Weinsäure, Ameisensäure, Laurinsäure, Stearinsäure, Salicylsäure, Methansulfonsäure, Benzolsulfonsäuren Sorbinsäure _t Pikrinsäure_P Benzoesäure oder Zimtsäure,

Pharmazeutisch unbedenkliche Säureadditionssalze stellen eine besonders bevorzugte Gruppe von erfindungsgemäßen Salzen dar. Hierbei handelt es sich um Salze, die warmblütigen Tieren sicher und wirkungsvoll verabreicht werden können.

Herstellung von DH-DO-DMT und DH-DO-OMT durch Streptomyces fradiae

DH-DO-DMT und DH-DO-OMT lassen sich durch Züchtung eines Stammes von Streptomyces fradiae herstellen,, wie beispielsweise von Streptomyces fradiae ATCC 31733, der diese Verbindungen unter submersen aeroben Fermentationsbedingungen

J 4 Ö 4 if Jl - 14 -

in einem geeigneten Kulturmedium bildet, wenn man diese Züchtung so lange fortführt,, bis eine wesentliche anti-biotische Aktivität erzeugt worden ist. Für das Wachsenlassen von Streptomyces fradiae ATCC 31733 läßt sich irgend eines der hierzu üblichen Kulturmedien verwenden« Aus Gründen einer wirtschaftlichen Produktion, optimalen Ausbeute und leichten Isolierbarkeit des erhaltenen Produkts werden jedoch bestimmte Kulturmedien bevorzugt. Zu bevorzugten Kohlenstoffquellen bei einer großtechnischen Fermentation gehören daher beispielsweise Kohlehydrate, wie Dextrin, Glucose, Stärke oder Maismehl, sowie Öle, wie Sojabohnenöl. Zu bevorzugten Stickstoffquellen gehören Maismehl , Sojabohnenmehl, Fischmehl oder Aminosäuren« Als anorganische Nährsalze, die in den Kulturmedien enthalten sein können, eignen sich die üblichen herkömmlichen Salze, die Ionen von Eisen, Kalium, Natrium, Magnesium, Calcium, Ammonium, Chlorid, Carbonat, Sulfat, Nitrat und ähnliche Ionen ergeben»

Im Kulturmedium sollen ferner auch essentielle Spurenelemente vorhanden sein, die für das Wachstum und die Entwicklung des jeweiligen Organismus erforderlich sind» Solche Spurenelemente kommen gewöhnlich als Verunreinigungen in anderen Bestandteilen des Mediums in Mengen vor, wie sie für die Wachstumsbedürfnisse.des Organismus ausreichend sind. Bereitet in großtechnischen Fermentationsmedien die Schaumbildung ein Problem, dann kann der Zusatz eines Antischaummittel s wie Polypropylenglykol.(mit einem Molekulargewicht von etwa 2000) in kleinen Mengen, beispielsweise in Mengen von 0,2 ml/1) erforderlich sein.

Für eine Bildung wesentlicher Mengen an DH-DO-DMT oder DH-DO-OMT wird eine submerse aerobe Fermentation in Tanks bevorzugt. Kleine Mengen an DH-DO-DMT oder DH-DO-OMT lassen sich auch durch Schüttelkolbenkultur bilden. Bei einer Be-

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impfung großer Tanks mit der Sporenform des Organismus kommt es bezüglich der Bildung des Antibiotikums gewöhnlich zu einer zeitlichen Verzögerung, und in einem solchen Fall wird daher vorzugsweise mit einem vegetativen Inokuiurn gearbeitet. Die Herstellung des hierzu benötigten vegetativen Inokulums erfolgt durch Beimpfung eines kleinen Volumens an Kulturmedium mit der Sporenform oder mit Mycelbruchstücken des Organismus, wodurch man zu einer frischen und aktiv wachsenden Kultur des Organismus gelangt. Anschließend wird das vegetative Inokulum in einen größeren Tank übertragen» Für das vegetative Inokulum läßt sich das gleiche Medium verwenden wie für größere Fermentationen, es kann jedoch auch mit anderen Medien gearbeitet werden»

Man kann Streptornyces fradiae ATCC 31733 bei Temperaturen zwischen etwa 10 und 40° C wachsen lassen. Zu einer optimalen Produktion an Antibiotikum scheint es bei einer Temperatur von etwa 2 8⁰C zu kommen*

Wie bei aeroben submersen Züchtungsverfahren üblich, so kann man auch beim \^rorliegenden Verfahren in das Kulturmedium sterile Luft einleiten. Für eine entsprechend wirksame Bildung an Antibiotikum soll die prozentuale Luftsättigung, bei einer Ta.nkprodukti.on etwa 30% oder mehr ausmachen {bei einer Temperatur von 28⁰C und 1 Atmosphäre Druck). '

Die Bildung an Antibiotikum läßt sich während der Fermentation verfolgen, indem man. Proben der Fermentationsbrühe gegenüber Mikroorganismen untersucht _g von denen man weiß, daß sie gegenüber diesen Antibiotika sensitiv sind. Ein hierzu brauchbarer Versuchsorganismus ist Staphylococcus aureus ATCC 9144, Ein solcher Bioversuch wird am besten unter Anwendung der sogenannten automatischen turbidome-

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trischen Methode durchgeführt. Ferner läßt sich die Bildung an Antibiotikum auch ohne weiteres durch Hochleistungs-

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Nach erfolgter Bildung unter submersen aeroben Fermentationsbedingungen kann man DH-DO-DMT oder DH-DO-OMT aus dem Fermentationsmedium durch Anwendung üblicher Methoden gewinnen. Eine solche Gewinnung von DH-DO-DMT oder DH-DO-OMT läßt sich erreichen^ indem man die Fermentationsbrühe zuerst filtriert. Die filtrierte Brühe kann dann zur Bildung des gewünschten Antibiotikums.weiter gereinigt werden. Eine solche Reinigung kann unter Einsatz der verschiedensten Techniken durchgeführt v/erden= Eine bevorzugte Technik zur Reinigung der filtrierten Brühe besteht in einer Einstellung des pH-Werts der Brühe auf etwa 9_P Extraktion der Brühe mit einem geeigneten Lösungsmittel _f wie Ethylacetat, Amylacetat oder Methylisobuty!keton, Extraktion der organischen Schicht mit einer wäßrigen sauren Lösung und Ausfällung des Antibiotikums durch Basischstellen des wäßrigen Extrakts. Eine anschließende weitere Reinigung läßt sich durch Extraktion, Chromatographie und/oder Fällung erreichen. ·

Der neue Mikroorganismus_? der DH-DO-DMT und DH-DO-OMT bildet; wurde erhalten durch chemische Mutagenese eines Stammes von Streptomyces fradiae^ der Tylosin produziert. Der neue Mikroorganismus bildet lediglich minimale Mengen an Tylosin,.produziert DH-DO-^DMT und DH-DO-OMT in etwa gleichen Mengen, jedoch als überwiegende Komponente.

Der neue Mikroorganismus, der DH-DO-DMT und DH-DO-OMT prodxaziert, gehört· klassif izxerungsmaßig zu Streptomyces fradiae„ Eine Kultur dieses neuen Mikroorganismus ist bei The American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive., Rockville, Maryland, 20852 am 16, Oktober 1980 hinterlegt

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worden und bildet Teil der dortigen ständigen Kulturensammlung , und dieser Mikroorganismus kann daher hiervon unter der Nr. ATCC 31733 ohne Beschränkung über seine Verfügbarkeit frei bezogen werden. .

Die Eigenschaften von Streptomyces fradiae ATCC 3173 3 sind genau so wie bei anderen Organismen einer Variation zugänglich. So lassen sich beispielsweise durch Behandlung mit verschiedenen bekannten physikalischen und chemischen mutagenen Mitteln., wie Ultraviolettstrahlen, Röntgenstrahlen;. Gamma.strahlen oder N-Methyl-N'~nitro~N-nitrosoguanidin_f künstliche Varianten oder Mutanten des Stammes Streptomyces fradiae ATCC 31733 bilden. Alle natürlichen und künstlichen Varianten, Mutanten und Rekombinanten von Streptomyces fradiae ATCC 31733, die die Eigenschaften einer Bildung von DH-DO-DMT und/oder DH-DO-OMT- beibehalten, können natürlich erfindungsgemäß verwendet werden=

DH-DO-DMT und DH-DO-OMT hemmen das Wachstum pat'hogener Bakterien? und zwar insbesondere von grampositiven Bakterien und Arten von Mycoplasma. Aus der folgenden Tabelle III gehen die minimalen Heitimkonzentrationen (MlC-Werte) für DH-DO-DMT und DH-DO-OMT (in Form der freien Basen) · hervor, indem diese Verbindungen bestimmte Bakterien hemmen, und zwar bestimmt anhand der sogenannten Agar-Verdünnungs-Versuche.

TABELLE III

vitro-WirksamkeitvonDH-D0-DMT und DH-DO-QMT

Organismus MIC-Werte

DH-DO-DMT DH-DO-OMT

Stapj^lococcus^ aureus V41

Staohylococcus epidermidis EPI-I

Streptococcus pyogenes C203

Streptococcus pneumoniae Park 1

p ÄfCC 9790

Sjtrepto£occu£ ££= gioup D 9960

Shig-ella Escherichia

Escherichia coli TEM

128	4
128	4
>128	8
64	. 4
128	8
64	8.
>128	8
>128	8
>128	16
>128	16
>128	16
>128	16
>128	>L28
>128	>128
>128	>128
>128	"ö4
>128	4
>128	>128

DH-DO-OMT hemmt ferner auch bestimmte anaerobe Bakterien. Die MIC-Werte, in„denen DH-DO-OMT solche Bakterien hemmt, gehen aus der folgenden Tabelle IV.hervor«, Auch diese MIC-Werte sind wiederum unter Anwendung des hierfür üblichen Agar-Verdünnungs-Versuchs .ermittelt worden, wobei die Ablesung am Endpunkt nach 24 Stunden erfolgte.

ο ί

TABELLE IV

In vitro-Wirksamkeit von DH-DO-OMT gegenüber anaeroben

Bakterien_:

Organismus MIC-Werte

CIo^stridium perfr^irigens^ £lostridiuni £eptic_urn 112 Eubacterium aerofaciens 12

Si2£ SS Hi? asacFharoJ-Vticus 1302

^s P^⁶^^-^ 1281

Pe P_tos t r ep t ο C££C u s anaerob ius 1,42

Peptostreptococcus

<· ΜΙΙΙΙΙΙ ι JII Il I j I I I ρ Il HlI f|| Il I |l I Il Il | | I I I I *M I . 'P ! I Ml Itfpjrti ¹J-MJi TW^p"

Bact er ο i de s

Bacterpides

1856/28

273

i-£ 1211

Bacrteroictes^ corrodens 1874 Fusobacterium SYrabiosuin 1470 2 2 2 2

>8 >8

>8

>8 2

>8 >8

>8 >8 >8 >8

necrophoruin 6054A

DH-DO-OMT hemmt ferner auch das Wachstum von Chlamydia trachomatis in einer Zellkultur mit einem MIC-Wert von .-.— U, 5 μ9/ΐη1. Ferner hemmt DH-DO-OMT auch das Wachstum von Arten von Mycoplasma., DH-DO-OMT verfügt beispielsweise gegenüber Mycoplasma gallisepticurn und Mycoplasma synoviae über einen MIC-Wert von 12/5 μg/ml.

DH-DO-OMT hat sich auch in vivo gegenüber experimentell hervorgerufenen Bakterieninfektionen als antimikrobiell wirksam erwiesen. Durch Verabreichung von zwei Dosen der jeweils zu untersuchenden Verbindung an Mäuse mit experimentell hervorgerufenen Infektionen läßt sich beispielsweise die beobachtete Wirksamkeit in Form des ED^_n-Werts messen (wirksame Dosis in mg/kg,, die einen Schutz von 50 % der Versuchstiere ergibt), und dieses Verfahren ist in 'J. Bacteriol. 81, 233 bis 235 (1961) im einzelnen näher beschrieben» Die bei diesen Untersuchungen für DH-DO-OMT (freie Base) erhaltenen EDr_n-Werte gehen aus der folgenden Tabelle V hervor. . .

TABELLE V

En vivo-Wirksamkeit von DH-DO-OMT gegenüber experimentell hervorgerufenen Infektionen

.bei Mäusen

Organismus	3055	Weg dqr Verab reichung	Bakterien- einwirkung	(mgAg	χ .2)
Staphylococcus aureus	3055	oral	loo	44
Staphylococcus aureus	S 3 C203	subkutan	221	37	.3
Streptococcus Ex£gerie£	iae" Park I	oral	64	75	.3
Streptococcus oneumoni	oral	20.4	223	.6'

Die erfindungsgemäßen Makrolide werden therapeutisch normalerweise in Form von Veterinärformulierungen eingesetzt, die das jeweilige Makrolid in Verbindung mit einem oder mehreren nichttoxischen Träger enthalten.Die Art solcher Formulierungen und der hierfür geeignete Träger sind dem Fachmann geläufig, so daß darauf nicht näher eingegangen zu werden braucht»

Das DH-DO-DMT und seihe Derivate verfügen zwar ebenfalls über eine gewisse antibakterielle Wirksamkeit. Am besten werden diese Verbindungen jedoch als Zwischenprodukte zur Herstellung der entsprechenden Verbindungen von DPI-DO-OMT verwendet. -

DH-DO-OMT, die Äcylesterderivate von DH-DO-OMT und die Säureadditionssalze hiervon eignen sich auch als Oberflächendesinfektionsmittel „ Lösungen mit einem Gehalt, von nur 0,01 Gew=-% solcher Verbindungen können daher für Desinfektionszwecke verwendet werden. Solche Lösungen, die vorzugsweise ferner auch ein'Detergens oder ein sonstiges Reinigungsmittel enthalten, eignen sich daher zum Desinfizieren von Gegenständen und Oberflachen,- wo die Beibehaltung steriler Bedingungen wichtig ist.

Ausführungsbeispiele;

Die Erfindung wird im folgenden anhand von Beispielen weiter erläutert» '. .

Beispiel 1

Ά. Schutteikolbenfermentation von DH-DO-DMT und DH-DO-OMT

Man dispergiert ein lyophilisiertes Pellet.von Streptomyces fradiae ATCC 31733 in 1 bis' 2 ml sterilisiertem Wasser.

Ό /'A

** ÜLllj 0 - 23 -

Einen Teil der so erhaltenen Lösung (0,5 ml) verwendet man"dann zum Inokulieren eines vegetativen Mediums (150 ml), das folgende Zusammensetzung aufweist:

Bestandteile

Menge (% >	5
O,	5
0,	3
o,	45
0,	25
97,

Maisquellwasser Hefeextrakt' Sojabohnenschrot CaCO₃

Sojabohnenöl (roh) Deionisiertes Wasse

Wahlweise taut man eine vegetative Kultur von Streptornyces fradiae ATCC 31733, die in Volumina von je 1 ml in flüssigem Stickstoff aufbewahrt ist, rasch auf und verwendet sie zur Inokulierung' des vegetativen Mediums.

Das inokulierte vegetative Medium wird in einem 500 ml fassenden Erlenmeyerkolben bei 29⁰C etwa 48 Stunden auf einer geschlossenen Schüttelbox bei 300 Umdrehungen pro Minute bebrütet ο „ '

Mit. "dem erhaltenen inkubierten vegetativen Medium (0,5 ml) beimpft man dann 7 ml eines Produktionsmediums_? folgende Zusammensetzung verfügt;

Bestandteile Menge ( % )

Rübenmelasse 2,0

Maismehl 1,5

Fischmehl 0,9

Maisgluten O₇9

NaCl 0,1

(NH₄J₉HPO₄ 0,04

CaCO^ . 0,2

Sojabohnenöl (roh) 3,0

Deionisiertes Wasser 91,36

Das inokulierte Fermentationsmedium bebrütet man dann in einem 50 ml fassenden Kolben bei 29⁰C über eine Zeitdauer von etwa 6 Tagen auf einer geschlossenen Schüttelbox bei 300 Umdrehungen/Minute»

B.. Tankfermentation von DH-DO-DMT und DH-DO-OMT

Zur Bildung eines größeren Volumens an Inokulum verwendet man 1200 ml an inkubiertem vegetativem Medium, welches in ähnlicher Weise wie oben unter Abschnitt A., hergestellt worden ist. zur Inokulierung von 946 1 eines vegetativen Wachstumsmediums der zweiten Stufe, das über folgende Zusammensetzung verfügt;

Bestandteile Menge ( % )

Maiequellwasser I₇O '

Sojabohnenölmehl 0,5

Hefeextrakt 0,5

CaCO₃ '0,3

Sojabohnenöl (roh) ' . 0,5

Lecithin (roh) ' 0,015

Wasser » . 97,185

Der pH-Wert wird mit 50 %-iger Natriumhydroxidlösung auf 8,5 eingestellte .

Dieses vegetative Medium der zweiten Stufe inkubiert man in einem 1325 1 fassenden Tank etwa 48 Stunden bei 28⁰C unter ausreichender Belüftung und Durchmischung.

Das auf diese Weise hergestellte inkubierte Medium der zweiten Stufe (547 1) verwendet man anschließend zur Beimpfung von 3785 1 sterilem Produktionsmedium, das über folgende Zusammensetzung verfügt?

Bestandteile Menge ( % )

Fischmehl 0,875

Maismehl "" 1,5

Maisgluten 0_f875

CaCO₀ ' . . 0,2

NaCl 0,1

(NH₄J₂HPO₄ . 0,04

Rübenmelasse 2,0

Sojabohnenöl (roh). . 3,0

Lecithin ' 0,09

Wasser ' ' 91,32

Der pH-Wert wird mit 50 %--iger Natriumhydroxidlösung auf 7,2 eingestellt.

Das inokulierte Produktionsmedium läßt man in einem 6060 fassenden Tank 8 bis 9 Tage bei einer Temperatur von 28⁰C fermentieren. Das Fermentationsmedium wird derart mit steriler Luft belüftetf daß der Gehalt an gelöstem Sauerstoff zwischen etwa 30 und- 50% bleibt, wobei man unter Verwendung herkömmlicher Rührer mit einer Geschwindigkeit von etwa 2 50 Umdrehungen/Minute rührt.

Beispiel 2

Isolierung von DH-DO-DMT und. DH-DO-OMT

Man filtriert Gesamtbrühe (38 1), hergestellt gemäß Abschnitt B von Beispiel 1, unter Verwendung einer Filterhilfe«, Der Mycelkuchen wird mit Wasser gewaschen,, und das Filtrat sowie die Waschflüssigkeit (30 1) stellt man mit 10 %-igem Natriumhydroxid auf einen pH-Wert von 9,-1 ein. Die erhaltene Lösung wird zweimal mit Ethylacetat (15 1 und 5,5 1) extrahiert. Die Ethylacetatextrakte werden vereinigt und zuerst mit 9 1 verdünnter Phosphorsäurelösung und dann mit. 3 1 verdünnter Phosphorsäurelösung eluiert

ι ί η - 26 -

(Einstellung der Wasserschicht auf einen pH-Wert von 4,1 durch Zugabe von 28 %-iger EUPCK). Die vereinigten wäßrigen Extrakte (8,8 1) v/erden mittels Natriumhydroxid auf einen pH-Wert von 9,2 eingestellt und dann zweimal mit Chloroform (jeweils 2 1) extrahiert. Die Chloroformextrakte werden getrocknet, wodurch man zu 32 g festem Material gelangt.,

Ein Teil dieses Materials (5 g) wird in Ethylacetat gelöst» und diese Lösung behandelt man dann unter Anwendung eines sechsstufigen Gegenstromverteilungsverfahrens mit Ethylacetat und 0,5 molarem Phosphatpuffer vom pH 6,1, wodurch man zu 2,5 g DH-DO-OMT gelangt» Durch ein zweites sechsstufiges Gegenstromverteilungsverfahren, das beim pH-Wert von 5,5 durchgeführt wird, gelangt man zu weiteren 0,1 g DH-DO-OMT. Das DH-DO-OMT wird aus trockenem Aceton umkristallisiert.

Die obigen Maßnahmen ergeben insgesamt 1,42 g unreines DH-DO-DMT. Dieses unreine DH-DO-DMT wird in einem Gegenstromsystem aus einer organischen Phase aus Ethylacetat und Heptan (1 : 2) und einer wäßrigen Phase aus 0,5 molarem Phosphatpuffer von pH 6,2 gereinigt. Durch eine sechsstufige Gegenstromverteilung gelangt man zu einer teilweise Abtrennung von DH-DO-DMT. Das'DH-DO-DMT wird aus wäßrigem Methanol kristallisierte Aus l.^; g Rohmaterial erhält man 400 mg gereinigtes DH-DO-DMT. '

Bei s p. i e 1 3 Herstellung von DH-DO-OMT aus DH-DO-DMT

Man löst DH-DO-DMT, hergestellt gemäß Beispiel 2, in einer verdünnten Chlorwasserstoffsäurelösung (Zusatz von HCl zu der Wasserlösung, bis die Lösung einen pH-Wert von 1,8.er-

reicht hat)„ Die erhaltene Lösung läßt man 24 Stunden bei Raumtemperatur stehen und stellt sie dann durch Zugabe von Natriumhydroxid avf pH 9_r0 ein. Die. basische Lösung wird mit Ethylacetat, Dichlormethan oder Chloroform extrahiert. Der Extrakt wird getrocknet und unter Vakuum eingedampft,, wodurch man zu DH-DO-OMT gelangt.,

Beispiel 4

Anderes Verfahren zur Herstellung von DH-DO-OMT

DH-DO-OMT wird ausgehend von DH-DO-DMT hergestellt, indem man DH-DO-DMT in der Fermentatiorisbrühe, in der es gebildet worden ist, wie in Beispiel 3 beschrieben mit einer schwachen Säure behandelt» Die Isolierung von DH-DO-OMT wird, in ähnlicher Weise wie bei Beispiel 2 durchgeführt»

Claims

O 4 U 3 - ²⁸ -

Erfxndungsansprüche;

1, Verfahren zur Herstellung von Makroliden der allgemeinen Formel 1

ψ Vena

i!

CHs™e VCH₂-CH_{3 m}

HO-CHs-/ -

CHa-CHs-*.

^χκιιχ/ y \

CHs 0-Q

worin Q für Wasserstoff oder einen Rest der' allgemeinen Formel . ·

stehtt oder von pharmazeutisch unbedenklichen Estern oder

Säureadditionssalzen hiervon,

dadurch gekennzeichnet, daß man

(a) Streptornyces fradiae ATCC 31733 oder eine Mutante oder Rekombinante hiervon in einem Kulturmedium, das assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthält„ unter submersen aeroben· Fer-

if.„ "Vf '""if W *> Vs*

mentationsbedingungen so lange züchtet, bis eine wesentliche Menge an antibiotischer Aktivität gebildet worden ist, oder

(b) die Mycarosylgruppe von einem Makroiici der Formel I, worin -Q nicht für Wasserstoff steht, durch Hydrolyse unter milden Bedingungen abspaltet und so zu einem Makrolid der Formel I gelangt, worin Q Wasserstoff ist, und

(c) gegebenenfalls ein nach der Verfahrensvariante (a) oder (b) erhaltenes Makrolid der allgemeinen Formel Ϊ in üblicher Weise verestert oder in ein Salz überführt .

2» Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß man 20-Dihydro-20-desoxy-23-demycinosyltylosin herstellt.

3» Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß man 2'0-Dihydro~2 0-desoxy-5~O-mycaminosyltylonolid herstellt.

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