DE2654266C3

DE2654266C3 - Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von 5,10,11,1 la-Tetrahydro-9,1 ldihydroxy-e-methyl-Soxo-lH-pyrrolo [2,1-c] [1,4] benzodiazepin-2acrylamid

Info

Publication number: DE2654266C3
Application number: DE2654266A
Authority: DE
Inventors: Nobuhiko Tokio Komatsu
Original assignee: Green Cross Corp Japan
Current assignee: Mitsubishi Tanabe Pharma Corp
Priority date: 1975-12-25
Filing date: 1976-11-30
Publication date: 1979-07-12
Also published as: JPS5279082A; US4011140A; DE2654266B2; JPS5523079B2; GB1483325A; DE2654266A1

Description

Bekanntlich entsteht 5,10,11,1 la-Tetrahydro-9,11-dihydroxy-8-me Jiyl-5-oxo-1 H-pyrrolo[2,l -c] [1,4]ben2:odiazepin-2-acryfamid bei der Züchtung von Mikroorganismen der Gattung Streptomyces und der Art refuineus var. thermotolerans; vgl. US-PS 33 61 742 sowie J. Am. Chem. Soc, Bd. 87 (1965), S. 5791 bis 5793. Die Verbindung hat folgende Strukturformel
HO H

OH

H₁C

Diese Verbindung ist ein Antibiotikum, das auch zur Behandlung von malignen Neopiasien eingesetzt werden kann.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein neues Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung dieser Verbindung durch aerobe Züchtung von Mikroorganismen eines Stammes der Gattung Streptomyces in einem verwertbaren Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und anorganische Salze enthaltenden Nährmedium und Isolieren der Verbindung aus der Kulturbrühe zvi schaffen. Die Lösung dieser Aufgabe beruht auf dem überraschenden Befund, daß bei der aeroben Züchtung von Mikroorganismen eines Stammes der Gattung Streptomyces und der Art spadicogriseus KOMATSU FERM P-3275 diese Verbindung ebenfalls in guter

Tabelle I

Ausbeute gebildet wird. Der erfindungsgemäß verwendete Stamm ist auch bei der ATCC unter der Nummer 31179 hinterlegt Im erfindungsgemäßen Verfahren können auch nach üblichen Methoden aus Streptomyces spadicogriseus KOMATSU FERM P-3275 erhaltene, das Antibiotikum bildende Mutanten oder Varianten eingesetzt werden.

In Fig. 1 ist das UV-Absorptionsspektrum und in F i g. 2 das IR-Absorptionsspektrum der erfindungsgemaß hergestellten Verbindung wiedergegeben.

Die bekannten Stämme zur mikrobiologischen Herstellung der Verbindung sind Streptomyces refuineus var. thermotolerans NRRL 3143 und NRRL 3144. Ihre morphologischen und physiologischen Eigenschaften sind im einzelnen in der US-PS 33 61742 beschrieben. Es handelt sich um thermophile Bakterien, deren Temperaturoptimum bei 35 bis 55° C liegt Bei Temperaturen um 28° C oder darunter erfolgt praktisch kein Wachstum.

Damgegenüber ist dar arfmdungsgemäß verwendete Stamm Streptomyces spadicogriseus KOMATSU nachstehend kurz als Stamm FERM P-3275 bezeichnet ein mesophiles Bakterium, das bei Temperaturen von 18 bis 39°C und mit einem Temperaturoptimum bei 25 bis

2) 35⁰Cwächst

Nachstehend sinii die bakteriologischen Eigenschaften des Stammes FERM P-3275 zusammengefaßt:

(1) Morphologische Eigenschaften

jo Luftmycel und Substratmycel sind gut entwickelt verzweigte und reife Hyphen haben einen Durchmesser von etwa 1 Mikron. Die Sporophoren an den Enden der reifen Hyphen bilden Haken oder sind wirtelig oder spiralig (Rectinaculum apertum). In reifem Zustand sind

j-, die Sporen in Ketten von mehr als 10 angeordnet Unter dem Elektronenmikroskop zeigen die Sporen eine Oberfläche und eine ovale Gestalt mit den Abmessungen 1,51 bis 1,58x0,9 bis 1,1 Mikron,

(2) Wachstum auf Nährböden

Die Wachstumseigenschaften des erfindungsgemäß verwendeten Stammes auf verschiedenen Nährböden nach 21tägiger Bebrütung bei 28° C sind in Tabelle I zusammengefaßt Die Bezeichnung der Farben erfolgt π nach Nippon Shikisai Kenkyojo, »Standards of Color«, Nippon Shikisai Co, 1954.

Nährboden	Vcgetatives Mycel (Wachstum 'ind	Luftmyccl	Lösliches Pigment
	Farbe der Kolonieunterseite)
Czapek-Agar	dünn und spärlich, Unterseite	hellbraun-grau	keines
	hellbraun-grau
Glucose-Czapek-Agar	reichlich und gut; mattes gelb,	pulverig; hellbraun-grau	hellgelb
	umschlagend nach hellbraun
	grau
Glycerin-Czapek-Agar	reichlich und sehr gut; anfäng	hellbraun-grau, nach gelb	hellgelb-braun
	lich rotbraun, mit fortschreiten	braun umschlagend
	dem Wachstum nach gelbbraun
	umschlagend
Glycerin-Asparagin-Agar	dünn und spärlich: hellgelb.	braunweiß, umschlagend	keines
(ISP Nr. 5)	umschlagend nach dunkelgelb	nach hellgelb-braun
Ilefeextrakt-Malz-	reichlich und sehr gut; gniu-	pulvrig; hellbraun-grau	hellgelb-grau

extrakt Agar
(ISPNr. 2)

stichig braun

Fortsetzung

Nährboden

Vegetatives Mycel (Wachstum und Luftmyce Farbe der Kolonieunterseite) Lösliches Pigment

Stärke - synthetischer

(ISP Nr. 4)

Hafermehl-Agar
(ISP Nr. 3)

Tyrosin-Agar
(ISP Nr. 7)

Fleischextrakt-Agar
(ISP Nr. 8)

Glucose-Fleischextrakt-Agar

Nährbouillon

Glucose-Nährbouillon

Kartoffel

Karotten

reichlich und gut; hellgelbbraun, umschlagend nach hellbraun-grau

dünn, aber gut; hellbraun-grau

dünn und befriedigend; hellbraun-grau

dünn und spärlich; hellgelb

reichlich und sehr gut; hellbraun

Absetzen auf dem Boden; spärlich; gelbstirhig-weiß, umschlagend nach hellgelb

Absetzen auf dem Boden; auf der Nährbodenoberfläche gewachsene Zellen gerunzelt, mattgelb

sehr gut, gerunzelt, hellolivfarben

sehr gut; gerunzelt; olivfarben, umschlagend nach gelbbraun hellgelb-braun, umschlagend keines
nach graustichig-gelbbraun

Trypton-Hefeextrakt	gut; hellbraun-grau	pH-Wert 6,0 bis ⁷,5
(ISPNr. 1)		Temperatur 18 bis
Pepton-Hefeextrakt-	gut; hellbraun-grau	aerob.
Eisen-Agar (ISP Nr. 6)		pseudopositiv
(3) Physiologische Eigenschaften	positiv
Wachstumsbedingungen:	negativ

	positiv
Gelatineverflüssigung:	negativ
Stärkehyorolyse:
Tyrosinasebildung:	negativ
Peptonisierung von	negativ
Milch:	negativ.
Gerinnung von Milch:
Bildung von melanoidem
Pigmeni:
Reduktion von Nitrat:
Zersetzung von Cellulose:

39° C;

hO

(4) Verwertung von Kohlenstoffquellen

Der erfindjngsgemäß verwendete Stamm verwertet folgende Kohlenstoffquellen:

(1) D-Glucose, D-Xylose, L-Arabinose, D-Fructose, D-Galactose, D-Mannit;

(2) Verwertung zweifelhaft: Salicin

(3) keine Verwertung von: D-Rhamnose, Raffinose und Sucrose.

Zusammenfassung

Der erfindungsgemäß verwendete Stamm gehört zur Familie der Actinomycj.en und er bildet 5,10,11,1 Ia-Te-

trahydro-^ll-dihydroxy-e-methyl-S-oxo-lH-pyrrolo[2,l-c][l,4]benzodiazepin-2-acrylamid, nachstehend pulverig; hellbraun

etwas pulverig;
hellbraun-grau

gelbstichig-weiß
hellbraun-grau

gelbstichig-weiß, umschlagend nach hellgelb

gelbstichig-weiß

pulverig; gelbstichiggrau

pulverig, hellgelb-braun

hellbraun-grau

keines
keines
keines
hellgelb

hci/gelb, später
ausbleichend

hellolivfarben

hellolivfarben, umschlagend nach
olivgrau

keines
keines
keines

kurz mit PBA bezeichnet; das Wachstum ist im al^:^emeinen gut Die Unterseite des Substratmycels ist im allgemeinen braun-grau, machmal hellgelblich gefärbt. Das Luftmycel ist ebenfalls im allgemeinen grau-braun, machmal gelblich gefärbt Sofern sich ein lösliches Pigment bildet, ist es von fiellgelb-brauner, hellgelber hellolivgrüner Farbe. Der Stamm hydrolysiert Stärke und peptonisiert Milch. Die Verflüssigung von Gelatine ist pseudopositiv.

Aus Tabelle II ist ersichtlich, daß der erfindungsgemäß verwendete Stamm FERM P-3275 sich von den bekannten Stämmen Streptomyces refuineus van thermotolerans NRRL 3143 und 3144 hinsichtlich des Tenmeraturoptimums eindeutig unterscheidet. Der erfindungsgemäß verwendete Stamm ist mesophil, während die bekannten Stämme thermophil sind. Aus Tabelle III ist ersichtlich, daß der erfindungsgemäS verwendete Stamm sich auch morphologisch von den bekannten Stämmen unterscheidet.

Tabelle II

Stamm Temperaturoptimum

FERM P-3275 (ATCC 31179) 25-38

Streptomyces refuineus var. thermo- 35-55

toleransNRRL 3143,3144

Tabelle III

ligenschaften

Stamm

FRRM P-3275 (ATCC 31179»

Durchmesser des Luftmyeels

Morphologie da .Sporophoren

Ketten

0.9-1.3μ

Streplomyces refuineu¹; var. thermotolerans NRRL 314.1. 3144

Oberfläche Gestalt

0.5 -0.7 μ

wirtelig. Ilaken.

primitive Spiralen

haarig \

oval (kleiner

Durchmesser

0.9-1.4 μ:

großer

Durchmesser

1.5-l.Su)

Spulen

oval (kleiner Durchmesser 0.5-1.2 μ: großer

Durchmesser 1.0 -2.3 -i.) Stamm

ICKM l'-3275
ι \I( ( 3ΙΓ')>

Streptomtco iiluincus \ar Ihermotolerans NRRI 3143. 3144

Morphologie der
Sporophoren
Zahl der >]()

Sporen

Nach der Nomenklatur von Bergeys Manual of Determinative Bacteriology, 8. Auflage, 1974, wird der erfindungsgemäß verwendete Stamm taxonomiidi folgendermaßen beschrieben:

Farbe des Luftmyeels: grau

Bildung von melanoidem Pigment: negativ Sporenkette: offen, imperfekt

spiralig (RA^ Sporenoberfläche: haarig

Dementsprechend gehört der Stamm zur Gruppe 17; 42i.

Dv Verwertung von Kohlenstoffquellen und die Art der erzeugten Antibiotika durch den erfindungsgemäß verwendeten Stamm ;ind die bekannten Stämme sind in 1 abeile IV zusammengefaßt.

Tabelle IV

Name des Stammes Streptomycc,

Kohlenstoffquc

l'ermen-

tations-

procluk.

calvus

cyanoalbus finlay:

flaveolus

geysiriensis herbiferis

pactum

spadicogriseus KOMATSU keine Beschreibune

Nuclcodicin

Moenomycin

Pactamycin PBA

Zum Vergleich sind die Wachstumseigenschaften der vorstehend aufgeführten Stämme unter Bezugnahme auf die nachstehend angegebenen Veröffentlichungen in Tabelle V zusammengefaßt

(1) Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, Auflage, 1974

(2) Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 7. Auflage, 1957

(3) K. H. W a 11 h a u s e r u. Mitarb, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1965, S. 734—736

(4) B. K. Bhuyan u. Mitarb, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1961, S. 184-190.

Tabelle V

Wachstumseigenschaften Literaturzitat Nr.

FERM P-3275 (ATCC 31179)

Streptomyces calvus

Die Farbe des Substratmycels ist im allgemeinen hellbraungrau, auf einigen Nährböden gelbstichig-weiß oder hellgelb

gutes Wachstum auf Czapek-Nährboden: auf den meisten Nährböden nur spärliche Bildung von Luftmycel

(D

I orNel/unj!
Stamm

Streproniy;es cyanualbus
Streptomyces finlayi
Streplomyccs llavcolus

Streptomyces geysiricnsis
Stfptomyces hcrbiferis
Streptomyces pactum

Wachstumseigenschaften l.ileratur-/ital Nr.

(I)

Farbe des Substrafmvcels blau oder auf einigen Nährböden grün

Farbe des Substralmyceis schlägt bei einigen Nährböden von grün auf gelbgrün um

Unterseite des Substratmycels schlägt von gelb nach dunkclgelb (2) um; das Luftmycel ist hell-jirünstichiggrau gefärM; auf synthetischen Agar ist die Unterseite des Substratmycels weiß, auf Kartoffelnahrboden hellgelb gefärbt.

Ks wurde keine Beschreibung der Farbe des Substratmycels und des Luftmvcels gefunden

Farbe des Substratmycels auf einigen Nährböden dunkelgelb-grün

Farbe des Substratmycels auf den meisten Nährböden grau bis graustichig olivgrün und auf einigen Nährböden gelb oder hellgelb

(I)

(4)

Aufgrund der vorstehend mitgeteilten Befunde wird der Stamm FERM P-3275 (ATCC 31179) als neue Art angesehen und ihr der Name Streptomyces spadicogriseus KGMATSU verliehen.

Nachstehend wird das Verfahren zur Züchtung des erfindungsgemäß verwendeten Stammes und die Isolierung von PBA aus der Kulturbrühe erläutert.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird in Gegenwart von Kohlenstoff- und Stickstoffquellen unter aeroben Bedingungen durchgeführt. Beispiele für verwendbare Kohlenstoffquellen sind Glucose, Xylose, Mannit, Lactose, Stärke, Dextrin und Melasse. Beispiele für verwendbare Stickstoffquellen sind Pepton, Sojabohnenmehl, Maisquellwasser, Fleischextrakt, Trockenhefe, Baumwollsamenmehl, Ammoniumsulfat und Natriumnitrat. Das Nährmedium kann etwa 0,05 bis 1,0 Gewichtsprozent pro Volumen anorganische Salze, beispielsweise Natrium-, Kalium-, Calcium-, Magnesium-, Eisen-, Kupfer-, Zink- und Magnesiumsalze, enthalten. Die Konzentration der Kohlenstoffquellen im Nährmedium beträgt etwa 2 bis 10 Gewichtsprozent pro Volumen und die der Stickstoffquelle etwa 0,1 bis 2 Gewichtsprozent pro Volumen. Der Ausdruck »Gewichtsprozent pro Volumen« bedeuet die Menge von 1 g gelöstem Stoff in 100 ml Lösung. Der pH-Wert des Nährmediums liegt im Bereich von etwa 6 bis 8, vorzugsweise bei 6,5 bis 7,5. Zur Erhöhung der Bildung von PBA kann dem Nährmedium ein Zusatzstoff einverleibt werden. Beispiele für derartige Zusatzstoffe sind organische und anorganische Verbindungen, wie Aminosäure, beispielsweise Cystein, Vitamine und Phosphate.

Die Züchtung wird wie bereits ausgeführt, unter aeroben Bedingungen bei 25 bis 35° C, vorzugsweise 30 bis 35° C, vorzugsweise nach dem Submersverfahren und vorzugsweise unter Schütteln oder Rühren und Belüften durchgeführt Die Züchtung kann auch durch Plattenkultur erfolgen. Die Züchtungsdauer beträgt gewöhnlich 2 bis 5 Tage. Bei der Züchtung unter Schütteln oder Rühren und Belüften kann die maximale Ausbeute an PBA innerhalb etwa 3 bis 5 Tagen erhalten werden. Da sich der pH-Wert der Kulturbrühe während

b0 der Fermentation ändert, wird er vorzugsweise durch Zusatz einer Base oder einer Säure, wie Natriumhydroxid oder Salzsäure, auf einen Wert im Bereich von 6,0 bis 8,0, vorzugsweise 7, eingestellt.

Nach beendeter Züchtung wird die Kulturbrühe filtriert und aus dem Filtrat das PBA isoliert. Die Isolierung kann durch Extraktion mit einem Lösungsmittel oder durch Adsorption an einem Adsorptionsmittel oder durch eine Kombination dieser Verfahren erfolgen. Beispiele für verwendbare Adsorptionsmittel zur selektiven Adsorption von PBA aus seiner wäßrigen Lösung sind Aktivkohle und Kieselgel. Die erfindungsgemäß hergestellte Verbindung wird am Adsorptionsmittel gut adsorbiert und kann mit einem mit Wasser zumindest teilweise mischbaren Alkohol oder Keton, wie Methanol, Äthanol, Butanol, Aceton oder Methylethylketon oder deren Gemischen mit Wasser oder mit einem halogenierten aliphatischen Kohlenwasserstoff, wie Methyjenchlorid, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff oder Äthylenchlorid, eluiert werden. Beispiele für Lösungsmittel, die zur Extraktion von PBA aus seiner wäßrigen Lösung verwendet werden können, sind mit kaltem Wasser schlecht mischbare Lösungsmittel, insberondere aliphatische einwertige Alkohole mit 4 bis 6 Kohlenstoffatomen, wie Butanol, Pentanol oder Hexanol, halogenierte aliphatische Kohlenwasserstoffe, wie Methylenchlorid, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff und Äthylenchlorid, sowie deren Gemische. Diese Lösungsmittel können zur Extraktion sowohl der Kulturbrühe als auch einer bei den Reinigungsstufen von PBA anfallenden wäßrigen Lösung verwendet werden.

Das Eluat oder der Extrakt wird durch Eindampfen konzentriert oder zur Trockene eingedampft. Die konzentrierte Lösung wird chromatographisch gereinigt Die produkthaltigen Fraktionen bei der Chromatographie werden anhand ihres UV-Absorptionsspektrums erkannt Das PBA zeigt ein Absorptionsrnaximurn bei 330 bis 335 nm. Die produkthaltigen Fraktionen werden vereinigt, eingedampft und aus einem Gemisch von Aceton und Äthylacetat oder wasserhaltigem Aceton umkristallisiert

ίο

Im nachstehenden Reaktionsschema ist die Umwandlung des erfindungsgemäß hergestellten PBA in den PBA-methyläther (II) und das Anhydro-PBA (III) erläutert.

H₁C

OH

'ON H,

on

H.Γ

OCH,

OH

,CONH,

H.f

N —n/N/V CONH₂

(Π)

Die Die durch die Pfeile in dem Reaktionsschema angegebenen Reaktionen entsprechen folgenden Behandlungen:

(a) Umkristallisation aus einem heißen Gemisch von Methanol und Wasser

(b) Umkristallisation aus siedendem Aceton

(c) Umkristallisation aus wasserhaltigem Aceton bei Raumtemperatur

(d) Erhitzen unter Rückfluß in Acetonitril und in Gegenwart einer katalytischen Menge eines Kationenharzaustauschers (Amberlite IRC-50) oder Erhitzen unter Rückfluß in Isopropenylacetat; vgl. J. Am. ehem. Soc, Bd. 87 (1965), S. 5791 bis 5793.

Das erfindungsgemäß hergestellte PBA und seine Derivate haben die gleichen physikalischen und

Tabelle VI

(Hl)

chemischen Eigenschaften, wie sie für die Verbindungen in der US-PS 33 61742 und in J. Am. Chem. Soc, Bd. 87 (1965), S. 5791 bis 5793 angegeben sind. Die physikalischen und chemischen Eigenschaften sind in Tabelle VI zusammengefaßt.

PBA:5,10,l 1,1 la-Tetrahydro-9,11-dihydroxy-8-methyl-5-oxo-1 H-pyrrolo[2,l -c] [1,4]benzodiazepin-2-acrylamid

Anhydro-PBA: 1,1 la-Dihydro-g-hydroxy-e-methyl-5-oxo-5H-pyrrolo[2,i-c][2,4]benzodiazepin-2-acryIamid

PBA-methyläther: 5,10,11,11 a-Tetrahydro-

g-hydroxy-ll-methoxy-e-methyl-lH-pyrrolo-[2,l-c][l,4]benzodiazepin-2-acrylamid

ΡΒΛ

Anhydro-PBA

PBA-methyläther

Smp.	188-194 C"	315	gef.:	203-206 C	297	gef.:	—	H999	gef.:
Spezifischer	M »+930		61,07	\a] ² _n ⁵+ 1793		64,44	[_a]² _n ^}-\	, DMSO)	61,72
Dreh wert	(c=l, DMF)		5,32		5,19	(C=I	,,NjO₄	6,18
	C₁₆H₁₇N₃O₄		13,13		14,10	C₁₇H		12,60
Elementaranalyse:	ber.:			(c= 1, Ν,Ν-dimethyIacetamid)		ber.:
C	60,92	C₁₆H₁₅N₃O₃	61,81
Il	5,44	ber.:	6,06
N	13,33	64,62	12,73	330
Mgw.	5,09
14,14

Die Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1

Der Stamm FERM P-3275 (ATCC Nr. 3Π79) wird in 88 Liter eines Nährrnediums vom pH 7,0 überimpft, das 2 Gewichtsprozent/Volumen Glucose, 0,5 Gewichtsprozent/Volumen Fleischextrakt, 0,5 Gewichtsprozent/Volumen Pepton und 0,5 Gewichtsprozent/Volumen Kochsalz enthält Das beimpfte Nährmedium wird 48 Stunden bei 32 bis 34° C in einem 120 Liter fassenden Fermenter unter Rühren und Belüftung inkubiert Sodann wird die erhaltene Kulturbrühe Filtriert Es werden 60 Liter Filtrat erhalten. Das Filtrat wird mit 03 kg Aktivkohle versetzt Nach der Adsorption wird die Aktivkohle abfiitriert und in 3 Liter 80prozentigem wäßrigem Aceton suspendiert Das Gemisch wird etwa 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt Hierauf wird die Aktivkohle abfiltriert Das Filtrat wird unter verminder-

tem Druck »if etwa Vs seines ursprünglichen Volumens eingedampft. Das erhaltene Konzentrat wird mit 600 ml Butanol versetzt und verrührt. Danach wird die Butanolschicht abgetrennt und zu einem Sirup eingedampft. Der Sirup wird in einem Gemisch von Methanol > und Chloroform (1 :9) gelöst und die erhaltene Lösung auf eine mit Kieselgel gefüllte Säule gegeben und Chromatographien. Jede Fraktion des Eluats wird durch Messung des UV-Absorptionispektrums auf Produkt untersucht. Die aktiven Fraktionen mit einem Absorp- m tionsmaximum bei 330 bis 335 nm werden vereinigt und unter vermindertem Druck eingedampft. Das erhaltene Rohprodukt wird in einem Gemisch von Aceton und Äthylacetat (1 :1) in der Hitze gelöst. Die gesättigte Lösung wird abgekühlt. Hierbei fallen 2,52 g gereinigtes ι > PBA mit den in Tabelle VI angegebenen Eigenschaften

Beispiel 2

Beispiel 1 wird wiederholt. Es werden 65 Liter :n filtrierte Kulturbrühe erhalten. Die filtrierte Kulturbrühe wird auf etwa Vs ihres ursprünglichen Volumens mittels eines Flashverdampfers eingedampft. Das Konzentrat wird mit 10 Liter Butanol versetzt und verrührt. Danach wird die Butanolschicht abgetrennt. Die wäßrige Lösung wird nochmals mit 5 Liter Butanol verrührt. Die Butanolschicht wird erneut abgetrennt. Die Butanolschichten werden vereinigt und bis zu einem Sirup eingedampft Das Konzentrat wird in einem Gemisch von Methanol und Chloroform (2 :8) gelöst und die Lösung auf eine mit Kieselgel gefüllte Säule gegeben und Chromatographien. Jede Fraktion wird durch UV-Spektroskopie auf Produkt untersucht. Die Fraktionen mit einem Absorptionsmaximum bei 330 bis 335 nm werden vereinigt und unter vermindertem Druck eingedampft. Es hinterbleibt als gelbes Pulver lohes PBA. Das rohe PBA wird in 50prozentigem wäßrigem Aceton heiß gelöst. Die erhaltene gesättigte Lösung wird abgekühlt und filtriert. Ausbeute 2,12 g gereinigtes PBA mit den in Tabelle VI angegebenen Eigenschaften.

Beispiel 3

10 g des gemäß Beispiel 1 erhaltenen rohen PBA werden in 1 Liter Methanol suspendiert. Die erhaltene Suspension wird 1 Stunde auf 50°C erhitzt, sodann mit einer geringen Menge Aktivkohle versetzt und filtriert. Das Filtrat wird unter vermindertem Druck bis zur beginnenden Kristallisation eingedampft und sodann bei -10°C stehengelassen. Es wird der PBA-methyläther mit den in Tabelle Vl angegebenen Eigenschaften erhalten.

Beispiel 4

10 g des gemäß Beispiel 1 hergestellten rohen PBA werden in 1 Liter wasserfreiem Aceton suspendiert. Die erhaltene Suspension wird 2 Stunden auf 45°C erwärmt. Danach wird die erhaltene Lösung eingedampft. Die entstandene Fällung wird in 2 Liter Acetonitril gelöst, bis zur beginnenden Kristallisation eingedampft und sodann bei -10°C stehengelassen. Es wird das Δ nhv/rlt-rt.PR Δ ffjt ¹^An JP ToKojl*» V/I antrpnphfnpn Eigenschaften erhalten.

Vergleichsversuch

Beispiel 1 wird mit dem Stamm ATCC 31179 wiederholt. Die Stämme Streptomyces refuineus var. thermotolerans NRRL 3143 und 3144 werden gemäß Beispiel 1 der US-PS 33 61 742 gezüchtet. Die in den Kulturbrühen vorhandene Menge an PBA wird nach der Methode von V. Stefanovich und M. Q. C e ρ r i η i, J. Pharm. Sei, Bd. 60 (1971), S. 781 bis 783, spektrophotometrisch bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle VII zusammengefaßt. Aus der Tabelle ist ersichtlich, daß das Verfahren der Erfindung wesentlich höhere Ausbeuten an PBA liefert.

Tabelle VIl

Stumm	31179	Absorption,	48 h	berechnet nach	96 h	Menge an
	3143	Std. Ziirhtu!	2,14		8,30	PBA nach
	3144		0,32		4,31	96 Std.
		0,05		0,95	Züchtung
	24 h	72 h	)/ml
ATCC	0,25	5,62	112,2
NRRL	0,02	1,64	58,2
NRRL	0,02	0,42	12,8

Hier/u 2 Blatl Zeichnungen

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von 5,10,11,1 la-Tetrahydro-9,1 l-dihydroxy-8-methyl-5-oxo-1 H-pyrrolo[2,l -c] [1,4]benzodiazepin-2-acrylamid durch aerobes Züchten von Mikroorganismen eines Stammes der Gattung Streptomyces in einem verwertbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und anorganische Salze enthaltenden Nährmedium und Isolieren der Verbindung aus der Kulturbrühe, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Züchtung Mikroorganismen des Stammes Streptomyces spadicogriseus KOMATSU, FERM P-3275 (ATCC Nr. 31179) einsetzt