DE2918711A1

DE2918711A1 - Macrolid-antibiotika, verfahren zu ihrer gewinnung und diese antibiotika enthaltende pharmazeutische praeparate

Info

Publication number: DE2918711A1
Application number: DE19792918711
Authority: DE
Inventors: Tadashiro Fujii; Mitsuo Hayashi; Seiji Katsumata; Naoki Muto; Masaru Ono; Masaru Otani; Tetsu Saito; Shuzo Satoi
Original assignee: Toyo Jozo KK
Current assignee: Asahi Kasei Corp
Priority date: 1978-05-10
Filing date: 1979-05-09
Publication date: 1979-11-22
Also published as: GB2020647B; FR2425444A1; GB2020647A; DE2954218C2; US4291021A; IT7922536A0; CA1125203A; NL192621B; FR2425444B1; ES480405A1; NL7903601A; DE2918711C2; IT1113372B; NL192621C

Description

ELISABETH JUNG dr. phil., dipl-chem. JÜRGEN SCHIRDEWAHN dr.rer.nat.,dipl.-püys. GERHARD S C H M ITT-N I LS O N dr.-ing. GERHARD B. HAGEN or.phil. _

PETER HIRSCH dipl-ing. ⁺

PATENTANWÄLTE

büuü MljNüHF.N ^O₁
k O. POX A'J U 68
CLtMENSoTRASSE 30
TELEFON: (089) 34 50 67

TELEGRAMM/CABLEilNVENJ MÖNCHEN TELEX: 5-29 686 2518/1 1

u.Z.: Q 094 C (vdB/we) Case 1516

9. Mai I979

TOYO JOZO COMPANY, LIMITED Ohitocho-Mifuku, Tagata-gun, Shizuoka, Japan

¹¹ Macrolid-Antibiotika, Verfahren zu ihrer Gewinnung und diese Antibiotika enthaltende pharmazeutische Präparate "

Beanspruchte Prioritäten:

10. Mai 1978, Japan, Nr. 51373/78,

2. März 1979, Japan, Nr. 2^788/79, und

16. März 1979, Japan, Nr. 31316/79-

Die Erfindung betrifft neue Macrolid-Antibiotika, die eine ausgezeichnete antibakterielle und antimycoplasmale Wirkung gegen Mikroorganismen, wie Staphylococcus oder Mycoplasma, zeigen, ferner Verfahren zur Gewinnung dieser Antibiotika und diese Antibiotika enthaltende pharmazeutische Präparate.

Aus Bodenprobf-n auf einer Kartoffelf'arm in Unaauki-cho,

909S47/869S

Shimoshinkawa-gun (Distrikt), Präfektur Toyama (Japan) wurde ein zur Gattung der Micromonospora gehörender Actinomyceten-Stamm gefunden, der als "Micromonospora species A 11725" bezeichnet worden ist. Dieser Stamm ist beim Institute of Fermentation Research, Agency of Industry and Technology, Japan, hinterlegt worden und hat die Bezeichnung "FERM-P Nr. 4488" erhalten. Des weiteren ist dieser Stamm am 21. März 1979 bei NRRL unter der Nr. 11452 hinterlegt worden.

Es wurde gefunden, daß dieser Mikroorganismen-Stamm Macrolid-Antibiotika zu erzeugen vermag.

Gegenstand vorliegender Erfindung sind demzufolge Macrolid-Antibiotika mit einem aldehydgruppenfreien, 16-gliedrigen Lactonring, Desosamin als Aminozucker und 6-Desoxy-2,3~di-(O-methyl)-hexose oder 6-Desoxy-(2 oder 3)~0-methyl-hexose als Neutralzucker und der folgenden Teilstruktur I im Lactonring:

(D

-0-CH₂ «l

in der R₁ ein Wasserstoffatom oder die Hydroxylgruppe ist und die gestrichelte Linie eine Doppelbindung oder die Epoxygruppe bedeutet, und deren pharmakologisch verträgliche Salze.

909847/6698

CH₂-OH₃

Aus dem beim Züchten des Micromonospora species A II725 erhaltenen Medium hat man die Macrolid-Antibiotika A 11725 I, A II725 II, A II725 III, A II725 Ia und A 11725 Ha beim fraktionierten Auftrennen erhalten.

In der Zeichnung sind die Infrarot-, Ultraviolett- und kern- . magnetischenResonanz-Spektren der vorgenannten Verbindungen dargestellt. Es zeigen:

Fig. 1 und Fig. 2 die IR-Spektren der Macrolid-Antibiotika A II725 I und II;

Fig. 3 und Fig. 4 die UV-Spektren der Macrolid-Antibiotika A II725 I und IIj

Fig. 5 und Fig. 6 die NMR-Spektren der Macrolid-Antibiotika A II725 I und II; .

Fig. 7 das UV-Spektrum des Macrolid-Antibiotikums A 11725 III;

Fig. 8 das IR-Spektrum des Macrolid-Antibiotikums A II725 III;

Fig. 9 das NMR-Spektrum des Macrolid-Antibiotikums A II725 III;

Fig. 10 das UV-Spektrum des Macrolid-Antibiotikums A 11725 Ia;

Fig. 11 das IR-Spektrum des Macrolid-Antibiotikums A 11725 Ia;'

Fig. 12 das NMR-Spektrum des Macrolid-Antibiotikums A 11725 Ia;

9038Α7/Θ696

-κ-

Fig. 13 das UV-Spektrum des Macrolid-Antibiotikums A 11725 Ha;

Fig. lH das IR-Spektrum des Macrolid-Antibiotikums A 11725

Fig. 15 das NMR-Spektrum des Macrolid-Antibiotikums A 11725 Ha.

Die· physikalisch-chemischen Eigenschaften dieser Macrolid-Antibiotika sind in der nachstehenden Tabelle I angegeben.

Aus den verschiedenen Eigenschaften wird geschlossen, daß die Antibiotika zur Gruppe von basischen Macrolid-Antibiotika gehören, die noch nicht bekannt gewesen sind.

Obwohl die Strukturformeln dieser Substanzen noch nicht gesichert sind, konnten doch einige spezifische Merkmale dieser Substanzen aus den Analysendaten bestimmt und mit bekannten Substanzen verglichen werden. Bei allen neuen Verbindungen handelt es sich um 16-gliedrige cyclische Substanzen vom Macrolid-Typ, die als Aminozuckerrest den Desosaminrest und als Neutralzuckerrest den Rest der 6-Desoxy-2,3~ di-(0-methyl)-hexose bzw. im Falle der Substanz A 11725 HI den Rest der 6-Desoxy-(2 oder 3)-0-methyl-hexose aufweisen. Des weiteren ist festgestellt worden, daß alle Verbindungen keine Aldehydgruppe aufweisen. Darüber hinaus ist festgestellt worden, daß die Antibiotika A 11725 I und II die nachstehende Teilstruktur II im Lactonring aufweisen:

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AA

-0-CH₂

(ID

CH₂-CH₃

in der R₁ ein Wasserstoffatom beim Antibiotikum A 11725 I oder die Hydroxylgruppe beim Antibiotikum A 11725 II ist. Die Antibiotika A 11725 III, Ia und Ha besitzen die nachstehende Teilstruktur III im Lactonring:

(III)

in der R„ ein Wasserstoffatom bei den Antibiotika A 11725 III und Ia und die Hydroxylgruppe beim Antibiotikum A 11725 Ha sind.

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Tabelle I

	C	:	C	A 11725	Molekularge	711	A 11725	•	727	A 11725	A 11725	A 11725
	H	I	wicht auf grund des		II		III	Ia	Ha
Aus	N	weißes	Massen		weißes		weißes	weiße	weiße
sehen:	C	Pulver		Pulver	Pulver	Kristalle	Kristalle
Summeη- formel:	H	37^H61^NO12	spektrums i	C₃₇H₆₁NO₁₃^	^₃₆H₅₉NO₁	C₃₇H₆₁NO₁₁ 1	C₃₇H₆₁NO₁₂
Analyse	N
berech	62,43	61,05	63,41	63,86	62,43
net:	8,64	8,44	8,72	8,84	8,64
	1,97	1,92	2,05	2,01	1,97
gefun	62,34	60,57	63,25	64,05	62,21
den:	9,25	8,95	9,01	9,10	8,82
	1,96	1,96	2,10	2,04	1,94

	681	695	711

Schmelzpunkt oder 103-107⁰C 102-106⁰C 99-102⁰C 174-176⁰C 148-15O°C Zersetzungspunkt i

[a]. -IJO₁O⁰ -31,0° -2,3° +2,7° +18,7°

^D" (C=I, ■ (C=I, (C=I,0, (C=I,0, (C=l,0,

'Methanol) Methanol) Methanol) Methanol) Methanol)

UV- Fig. 3 Fig. 4 Fig. 7 Fig. 10 Fig. 13

Spektrum: (25y/mJl, (25γ/πιϋ, (28γ/πι£,, (23γ/πι£, (20,42y/nU,

, in in in in in

Methanol) Methanol) Methanol) Methanol) Methanol)

Xmax217nm Xmax217nm Xmax2l6iim Xmax215nm Xmax215nm

=326,1) =323,2)

Xmax240nm Xmax240nm Xmax283nm Xmax283nm Xmax280nm

(Sch, 180) (Sch, 180) _(F1% »_10U£H /rl^

^lcm"-^{3 M} lern ^Vfclcm

=333,9) =323,2)

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Tabelle

(Fortsetzung)

.IR- Pig, 1 Fig. 2 Fig. 8 Fig. 11 Fig. 14 Spektrum (mit Ab- (mit Ab- (mit Ab- (mit Ab- (mit Absorptions-sorptions-sorptions-sorptions-sorptionsbanden bei banden bei banden bei banden bei banden bei Wellenlän-Vfellenlän- Wellenlän- Wellenüän- Wellenlängen von gen von gen von gen von gen von etwa: etwa: etwa: etwa: etwa:

3440,	NMR-	296O	3460	,2960	. 6	3600	,2970	.9	3600	,2970	. 12	3550,	2970
2920,	Spektrum: Fig.	2875	2930	,2880		2930	₃2880		2930	,2880		2930,	2880
2845,	(CDCÄ.3,	2780	2830	,2780		1710	,1675		2830	,2780		2830,	2780
1715,	lOOMHz,	1685	1715	,1690		1645	,1590		1720	,1710		1720,	1710
1650,	TMS)	1645	1645	,1620		1460	,1380		1678	,1645		1670,	1640
1620,	Dünnschicht	1460	1455	,1375		1350	,1320		I625	,1596		1590,	1450
1375,	chromatographie	1355	1350	,1325		1275	,1230		1460	,1380		1375,	1345
• 1325,	an Silicagel	1275	1270	,1255		1170	,1070		1350	,1322		1320,	1270
1255,	(Merck	1230	1230	,1165		1050	,980		1275	,1258		1250,	1230
1170,	Co.,Nr. 5714):	1110	1110	,1075	0,40	960,	930	0,40	1230	,1165		1-160,	1120
1080,	CHCü0: Methanol 0,	1045	1040	,980		835,			1105	,1072		1100,	IO7O
980,	(5:1)	955	955,	930		750cm"-¹-)		1045	,980		1040,	98O
930,	CHC£3:	885	885,	855				960,	930		955,	925
855, 830cm	Methanol:	-¹)	830cm"¹)	0,56		_	882, 858 830Cm"¹)	-	880, 830,	85O 740
	7 ^Ammonia 0,								710cm	Γ¹)
(40:12:20,
niedrigere	5	Fig		Fig		Fig		Fig.	15
Schicht			_		0,31		—
Methanol:






48



72

Benzol:

Aceton

(1:1)

n-Butanol-Essigsäure
Wasser
(3:1:1)

Tabelle I (Portsetzung)

0,05

0,59

Farbreaktion:

Entfärbung
wäßriger
KMnO,- + Lösung

Ninhydrin-

Reaktion,

Sakagushi's

Reaktion,

Eisen(III)-

chlorid-

Reaktion:

saure oder basisch basische

Natur:

Löslich- löslich !/-οι i-.an · .« « αησο —

basisch basisch basisch basisch

keiten:

in angesäuertem Wasser

wie

A 11725

_und
organischen Lösungsmitteln, wie Methanol Aceton , Äthylacetat , Benzol;

schwer löslich in alkalisch eingestelltem Wasser löslich in angesäuertem Wasser, Methanol, Aceton , Äthylacetat und

Bsnzol; schwer löslich in alkalisch eingestelltem Wasser; unlöslich in Hexan.

wie

A 11725

III

.wie

A 11725

III

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Die Macrolid-Antibiotika vorliegender Erfindung zeigen antibakterielle und antimycoplasmale Spektren, wie aus der nachstehenden Tabelle II ersichtlich, wobei die Agarverdünnungsmethode angewandt worden ist.

Demzufolge bilden einen weiteren Gegenstand vorliegender Erfindung pharmazeutische Präparate, die durch einen Gehalt an mindestens einem Macrolid-Antibiotikum A 11725 oder dessen Salz gekennzeichnet sind.

Die Salze lassen sich üblicherweise mit Mineralsäuren oder organischen Säuren, beispielsweise mit Weinsäure, Citronensäure, Bernsteinsäure oder dergleichen, herstellen.

Die Macrolid-Antibiotika vorliegender Erfindung können oral in Form von Tabletten oder Pulvern oder auch mittels einer intravenösen Injektion verabreicht werden. Als Tagesdosis bei Erwachsenen werden etwa ¹JOO bis 2000 mg Antibiotikum als wirksam gegen Infektionen der Atemwege angesehen, die durch grampositive Mikroorganismen, wie Staphylokokken, verursacht worden sind. Bei Toxizitätsmessungen hat man bei Mäusen einen LD^Q-Wert von 2000 mg oderhöher bei oraler Verabreichung gefunden. Demzufolge lassen sich die erfindungsgemäßen Macrolid-Antibiotika als Putterzusatzmittel und zur Therapie von Tieren verwenden.

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Ak

Untersuchte Mikro- ίο Organismen ,χΐ

1.	Staphylococcus
	aureus
	(ATCC 6538 P)
2.	¹¹ (MS 353)
3.	¹¹ (MS 353 C36)
4.	Staphylococcus
	aureus
	(MS 353 AO)
5.	¹¹ (0116)
6..	¹¹ (0119)
7.	" (0126)
8.·	¹¹ (0127)
9.	Staphylococcus
	epidermidis
	(s.p.-al-l)
10.	Streptococcus
	pyogenes
	(N.Y.5)
11.	¹¹ (1022)
12.	Streptococcus
	faecalis
	(1501)
13.	Streptococcus
	agalactiae
	(1020)
14.	Sarcina lutea
	(ATCC 9341)
15.	Micrococcus
	flavus
	(ATCC 10240)
16.	Corynebacterium
	diphtheriae
	(P.W.8)

Tabelle II

Mindesthemmkonzentration mcg/ml

A 11725 A 11725 A 11725 A 11725 A 11725 I II III Ia IIa

0,2 0,2 0,2 0,1 0>4

0,2 0,2 0,2 0_rl 0,4

<0,05 0,1 0,2 <0,05 0,2

>100 >100 >100

>100 >100 100

>1OO >100 >100

>100 >100 >100

0,1 0,1 0,1 <0,05 0,2

<0,05 <0,05 0,1 <0,025 |0,0 >100 >100 >100 >50 >100

>50	>100
>50	MOO
>50	>100
0,8	0,8
>50	>100

>100 >100 >100

>50 >100

12,5 6.3

25

<0,05 <0,05 <0,05 <0,025 <0,05 <0,05 0,2 <0,05 0,1

0,1

0,4 0,4 3,1 1,6 3,1

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17· Bacillus

	subtilis (ATCC 6633)	0,4	0,4	1,6	0,4	1,6
18.	Escherichia
	coil (NIHJ-JC2)	>100	>100	>100	>50	>100
19.	" (B)	100	25	>100	>50	>100
20.	Klebsiella
	pneumoniae (ATCC 10031)	■25	25	100	>50	50
21.	Salmonella
	typhosa (E 901)	>100	>100	>100	>50	>100
22.	Salmonella
	enteritidis
	gertner	>100	>100	>100	>50 ■	>100
23.	Shigella flexneri
	type 3a	100	50	>100	>50	>100
24.	Shigella sonney (E 33)	>100	>100	>100	>50	>100
• 25.	Proteus
	vulgaris (0X19)	100	50	100	>50	>ioo -
26.	Serratla
	marcescence	>100	>100	>100	>50	>100
27.	Pseudomonas
	aeruginosa (IAM 1095) ■	>100	>100	>100	>50	>100
28.	Mycoplasma gallisepticum	0,006	0,03		0,03	0,03
29.	Mycoplasma synoviae	0,03	0,8		0,8	0,8

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Die Macrolid-Antibiotika nach vorliegender Erfindung lassen sich auf biologischem Wege durch Züchten des Micromonospora species A 11725 gewinnen. Dieser Mikroorganismus hat die nachstehenden mikrobiologischen Eigenschaften.

I. Morphologische Eigenschaften

Das Mycelsubstrat wächst in die Länge, verläuft wellenförmig, ist einfach verzeigt und weist einen Durchmesser von 0,6 bis 0,8,um auf. Es wird keine Zerteilung des Mycels beobachtet. Es bildet sich eine Spore an der Spitze eines jeden kurzen Sporenträgers, der aus dem Mycelsubstrat wächst. Diese Spore ist kugelförmig bis oval mit einer Größe von 1,0 bis 1,5,um hat dornartige Vorsprünge, was den Sporen ein konfettiartiges Aussehen verleiht. Auf einem Agärmedium kann manchmal je nach dessen Zusammensetzung ein nicht ausgewachsenes Luftmycel gebildet werden, oder es kann sich auch eine schwarze Sporenschicht auf der Oberfläche der Kolonie bilden.

II. Wachstum auf verschiedenen Medium

Aus der nachstehenden Tabelle III sind die Ergebnisse von Beobachtungen ersichtlich, die nach einer 20-tägigen Züchtung bei 30⁰C auf verschiedenen Medien bei den gezüchteten Produkten gemacht worden sind. Die Angabe der Farben erfolgt nach der Farbklassifikation gemäß dem "Color Harmony Manual", 4. Auflage, 1958, Container Corporation of America.

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Tabelle III

Wachstum auf verschiedenen Medien

Medium

Wachsturn

Farbe des

Mycel-

Substrats

nicht ausgewachsen

Sporen- nes Luft- lösliches schicht mycel pigment

Sucrose-

N.itrat

Agar

gut

Glucose- Spuren
Asparagin bis
Agar wenig
(Waksman
Nr. 2)*

zedernfarr big .(.6Ze) bis ziegelrot (6ng)

fleischfarbig gelbbraun (agc)

keine

stumpfes koralwenig; lenrot fleisch- (6gc) bis rotrosa holzfarbig (5ca), (6ie) stumpfpfirsichfarbig(5ec)

kein kein

Glycerin- Spuren fleischfar- keine Asparagin-Agar

Stärke- mäßig
anorgani- bis
sehe Salze- gut
Agar

big gelbbraun (4gc) bis krebsrot (4ec)

ziegel- . rot C5ng)

Tyrosin-Agar

Spuren krebsrot (3ec)bis .beige (3gc)

mäßig; lampenschwarz (P)

Spuren; lampenschwarz (P)

kein

	gut	ziegel	gut;	kein	kupfer-
Hafermehl-	bis	rot (5ng)	lampen		geIbraun
Agar	mäßig	bis kupfer-	schwarz		Cbie;_ _um
		.braun (5pi)	(P)		die Kolo
		hell-	"Spuren;	kein	nie gebildet
Hefe-	gut	rosa-	lampen-		zedernfar
MaIz-		braun	schwarz		big (6le)
Agar		(7Ag)	(P)		(schwach aus
		bis rosa			gebildet)
		braun
		(7ni)
	mäßig	-·. · kakao	wenig bis	Spuren·
Glucose-		braun	Spuren;	muschel-	kein
He fe-		(5&g)	lampen	fextögrosa
extrakt		bis dunkel	schwarz	(5ba)
Agar		rotholzfar-·	(p)
(Waksman		ben(6ß,g)
Nr. 29)*

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- art -

Tabelle III (Fortsetzung)

	mäßig	zedernfar-	*(Sh*
Glucose-	bis	biK «	ng)
Nitrat-	wenig	^S(6i .	farblos
A gar		Ae) bis	bis hell-
(Waksman		ziegel
Nr. I)*		rot

	Spuren
Nähr-
agar

keine

kein

Spuren; lampengelbbraun schwarz - -.(3gc) (p)

kein

Emerson's Agar (Waksman Nr. 28)*	gut, runz	zedern farbig - (6Ae- 6* Ie)	keine	kein	kein
Bennett¹s Agar (Waksman Nr. 30)*	mäßig bis gut	hell- rosa braun (7Ag) bis rosa braun (7ni)	mäßig; lampen schwarz (P)	kein	hellrosa- braun (7Ag) bis rosa braun (7ni) (um die Kolonie gebildet)
Hickey- Tresner's Agar (Waksman Nr. 32)*	gut	kakao braun (5Ag)	keine	wenig; krebsrot	zedernfarbig (6£g) (um die Kolonie ge bildet)
Stärke-NZ Amin - Hefe extrakt As;ar (ATCC Nr. 172)**	gut "	dunkel weinrot (8pi)bis lilawein- rot (8ni)	gut; lampen schwarz (P)	kein	altweinrot (8ng)
Glucose-NZ Amin -Agar (1% Glucose, 3% NZ-A.min- Typ A, Iv5£ Agar)	mäßig bis wenig	zedern farbig (6£e) bis rostbraun (5Ce)	keine	kein	kein

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ORIGINAL INSPECTED

	Tab	eile	Wachstum	dunkel-	III (Fortsetzung)	alt- weinrotf (7ng)
Glucose- Pepton-	mäßig	rosa braun	bis -_■-	rosa	mäßig kein bis
A gar		(7ni)	Spuren	braun	wenig;
			gut,	(7pn)	lampen-
			runzlig		s'chwarz(p)
Kartoffel	kein			hell-
scheiben		gelb
(Waksman		braun
Np. ¹IO)*	Spuren	Ogc)		dunkel-
Kartoffel	bis	mäßig; kein	rosabraun
scheiben	wenig	lampen	(7pn)
CaCO₀ 3		schwarz	(schwach aus
		(P)	gebildet)
Pepton-			kein
Hefe-	Spur; kein
Eisen-	lampen
Agar	schwarz
(P)

S.A. Waksman "The Actinomycetes" Bd. 2, I96I, S. 327-33M, Wiliams & Wilkins Co.

American Type Culture Collection, "Catalogue of Strains", 18. Auflage, 1968, S. 142. ^;

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III. Physiologische Eigenschaften

1) Assimilierbarkeit von Kohlenstoffquellen:

assimilierbar:

schwach assimilierbar:

nicht assimilierbar: D-Arabinose, D-Glucose, D-Fructose, D-Mannose, Sucrose, Trehalose, Stärke;

L-Arabinose, D-Cellobiose, D-Ribosej

D-Galactose, ß-Lactose, tf-Melibiose, D-Melezitose, L-Rhamnose, Rafflnose, L-Sorbose, D-Xylose, Glycerin, Salicin, Dulcit, Inosit, D-Mannit, D-Sorbit, Cellulose.

(Da die genannten Mikroorganismen nur schlecht auf einem Pridham-Gottlied-Agar-Medium mit einem Gehalt an D-Glucose gezüchtet werden können, wird ein Medium mit einem Gehalt von 0,5 % Hefeextrakt und 1»5 % Agar als Grundmedium verwendet.)

2) Wachstumstemperatur:

3) Gelatineverflüssigung:

4) Stärkehydrolyse:

5) Magermilch:

6) Erzeugung von Melanoid-Pigmenten:

15 bis 45°C;

Verflüssigung im Glucose-Pepton-Gelatine-Medium;

Hydrolyse auf Stärke-anorganisches-Salz-Agar-Mediüm;

peptonisiert und coaguliert;

nicht erzeugt auf Tyrosin-Agar und Pepton-Hefe-Eisen-Agarj

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7) Salzbeständigkeit (nach der Methode gemäß Inter29187i 1 J. System. Bacteriol. 2jL, 240-247, 1971):

NaCl-Konz., % Wachstum

0 gut

1,5 mäßig bis gut

.3*0 oder

höher kein Wachstum;

8) Zersetzung von Cellulose: nicht zersetzt;

9) Erzeugung von Nitrit (unter Verwendung eines organischen Mediums gemäß Inter. J. System. Bacteriol. 21, 240-247, 1971):

nicht erzeugt.

Wie aus dem Vorstehenden hervorgeht, weist der Stamm A 11725 Sporen auf, die jeweils an der Spitze des Sporenträgers ein^ zein wachsen, der aus dem verzeigten Mycelsubstrat erzeugt wird. Der Stamm erzeugt praktisch' kein Luftmycel und ist ein bei mittlerer Temperatur wachsender Mikroorganismus. Aus diesem Grunde gehört dieser Mikroorganismus zur Gattung Micromonospbra.

Die antibiotisch wirkenden Substanzen A 11725 I bis III können durch Züchten des vorgenannten Stammes , der als Micromonospora species A 117.25 bezeichnet worden ist, in einem Medium gewonnen werden, das die üblicherweise zur Züchtung von Mikroorganismen unter aeroben Bedingungen verwendeten Bestandteile enthält. Demzufolge ist ein weiterer Gegenstand vorliegender Erfindung ein Verfahren zur Gewinnung der Macrolid-Antibiotika, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen Mikroorganismus,

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der mindestens eines der Macrolid-Antibiotika A II725 T_t A II725 II oder A 11725 III erzeugt, unter aeroben Bedingungen in einem Medium mit mindestens einer assimilierbaren Kohlenstoffquelle und mindestens einer assimilierbaren Stickstoffquelle unter Bildung der vorgenannten Macrolid-Antibiotika züchtet, die entstandenen Macrolid-Antibiotika aus dem Züchtungsmedium isoliert und gegebenenfalls auftrennt und/oder in die gewünschten Derivate und/oder Salze umwandelt.

So lassen sich die Macrolid-Antibiotika A 11725 Ia und Ha durch ein chemisches Modifizieren aus den Macrolid-Antibiotika A II725 I und II in Gegenwart eines geeigneten chemischen Reagens herstellen.

Als Züchtungsmedium kann man entweder ein festes oder ein flüssiges Medium verwenden. Zur Gewinnung im großen Maßstab, wie in der Industrie, wird ein flüssiges Medium, insbesondere ein wäßriges Medium, bevorzugt. In diesen Medien lassen sich als Kohlenstoffquelle Glucose, Stärke, Glycerin, Sucrose, Melassen, Dextrin u.dgl., verwenden. Als Stickstoffquelle sind Pepton, Fleischextrakt, Sojabohnenpulver und hydrolisiertes Casein geeignet. Jedoch können auch Baumwollsaatrückstände, Maisquellwasser, Nitrate und Ammoniumsalze verwendet werden. Des weiteren kann man auch andere anorganische Verbindungen mit verwenden, die als Kationen beispielsweise Natrium, Kalium, Magnesium, Calcium, Kobalt, Mangan oder Eisen, und/oder als Anionen beispielsweise Chlorid, Sulfat, Phosphat oder Acetat enthalten. Des weiteren kann zur Beschleunigung des Wachs-

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rs

turns der Mikroorganismen getrocknete Hefe oder Hefeextrakt verwendet werden. Zur Einstellung des pH-Wertes des Mediums kann Calciumcarbonat zugegeben werden. Um ein Schäumen während des Züchtehs zu unterdrücken, kann man außerdem eine geeignete Menge eines Schaumunterdrückungsmittels, wie Silicone, tierische oder pflanzliche öle u.dgl., zusetzen. Ein besonders bevorzugtes Medium nach vorliegender Erfindung enthält Glucose, Dextrin, entfettetes Sojabohnenpulver, Calciumcarbonat und Kobaltchlorid.

Die Züchtung kann unter den für die Gewinnung von antibiotisehen Substanzen üblicherweise angewendeten Bedingungen' durchgeführt werden. Die Züchtungstemperatur kann im Bereich von 20 bis 37°C, vorzugsweise von 26 bis 30°C, liegen. Je nach den Züchtun-gsbedingungen variiert die Dauer der Züchtung, die im allgemeinen H bis 5 Tage beträgt.

Obwohl man erfindungsgemäß übliche,bekannte Züchtungsverfahren anwenden kann, ist es jedoch vom Standpunkt einer großtechnischen Gewinnung zweckmäßig, die Züchtung unter Belüftung mittels eines Rührers in einem Gärtank durchzuführen.

Das am meisten geeignete Verfahren zur Abtrennung und Sammlung der antibiotischen Substanzen A 11725 I» II und III aus dem Züchtungsmedium besteht darin, zuerst die Mikroorganismenzellen und andere Festsubstanzen durch Filtrieren oder Zentrifugieren zu entfernen und dann das Filtrat unter Verwendung eines organischen Lösungsmittels einer Extraktion

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zu unterwerfen. Als organische Lösungsmittel für die Extraktion können chlorierte Kohlenwasserstoffe, wie Chloroform, Dichloräthylen, Trichloräthylen u.dgl., oder aliphatische Säureester, wie Äthylacetat, Butylacetat, Amylacetat u.dgl., verwendet werden. Man kann auch andere organische Lösungsmittel einsetzen, die die Substanzen A 11725 I> II und III gut lösen und mit Wasser kaum mischbar sind.

Der organische Lösungsmittelextrakt mit einem Gehalt an den Substanzen A 11725 I, II und III kann durch Eindampfen unter vermindertem Druck auf ein Hundertstel bis auf ein Zweihundertstel seines ursprünglichen Volumens eingeengt werden. Das Konzentrat wird dann wieder mittels einer Säure, wie Chlorwasserstoff säure, Schwefelsäure oder Essigsäure, auf einen pH-Wert von 1,0 bis 3»0 eingestellt. Dann wird die wäßrige Schicht abgetrennt, mittels einer alkalischen Lösung, wie Natriumhydroxid-, Kaliumhydroxid- oder Ammoniaklösung, auf einen pH-Wert von 7,8 bis 9»0 eingestellt und dann erneut einer Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel unterworfen. Durch Konzentrieren dieses Extrakts durch Abdampfen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck bis zur Trockne erhält man ein Rohprodukt, das die Substanzen A 11725 I, II und IHenthält. Das Rohprodukt wird mittels Säulenchromatographie unter Verwendung von Silicagel oder mittels Gegen-.stromverteilung fraktioniert. Jede Fraktion wird der pünnschichtchromatographie an Silicagel unterworfen, um die darin enthaltenen Substanzen zu bestimmen. Die Fraktionen mit einem Gehalt an reinem A 11725 I» II und III werden gesammelt

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OQ10 7 und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. TSan¹ ° ' ' erhält weiße Pulver der jeweiligen Verbindungen.

Zur Herstellung der Substanzen A 11725 Ia oder Ha werden die Substanzen A 11725 I oder II, die nach dem vorbeschriebenen Verfahren gewonnen worden sind, in einer niedermolekularen aliphatischen Säure, wie Eisessig oder Propionsäure, gelöst. Dann wird zur Lösung unter Kühlen Chrom(II)-Chlorid zugegeben und die Reaktion 3 bis 20 Std. bei Raumtemperatur ablaufen gelassen. Chrom(II)-Chlorid kann in einer Menge von 2 Mol oder mehr je Mol der Substanzen A 11725 I oder II verwendet werden. Das Reaktionsprodukt wird dann in Wasser oder Eiswasser gegossen. Die erhaltene Lösung wird mit einer basischen Verbindung, wie Natriumcarbonat, schwachbasisch auf etwa pH 8,5 eingestellt, bevor sie mit einem Lösungsmittel, wie Äthylacetat oder Benzol, extrahiert wird. Der Extrakt wird gewaschen, getrocknet und zum Entfernen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck eingedampft. Man erhält rohe Pulver, die chromatographisch an Silicalgel unter Verwendung eines Lösungsmittels aus Chloroform-Methanol-28prozentigem Ammoniak im Verhältnis 400:10:1 gereinigt werden. Man erhält die Substanzen A II725 Ia bzw. Ha. Bei den derart erhaltenen Substanzen A II725 Ia und Ha bilden sich Doppelbindungen im Mole-kül aus, die sich durch Umwandeln der Epoxygruppen in den Molekülen der Substanzen A 11725 I bzw. II bilden.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

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Gewinnung der Macrolid-Antibiotika A 11725 I, II und III

In einen 500 ml fassenden Erlenmeyer-Kolben werden 100 ml eines Mediums vom pH 7»0 gegeben, das 1 % Dextrin, 1 % Glucose, 0,5 % hydrolisiertes Casein, 0,5 % Hefeextrakt und 0,1 % Calciumcarbonat enthält. Dann wird das Medium durch 20-minütiges Erhitzen auf 120⁰C sterilisiert. Auf jede der zehn Ampullen mit diesem Medium wird eine Platinöse voll Züchtungsbouillon von Micromonospora species A 11725 überimpft, der auf einem Schrägagar gezüchtet worden ist. Die Züchtungsmedien werden 120 Stunden bei 30⁰C geschüttelt. Dann werden die Impfkulturen, in ein Gärgefäß mit einem Gehalt von 20 Litern eines

heißsterilisierten Mediums der.gleichen Zusammensetzung übererfolgt _o führt und die ZüchtungV 72 Stunden bei 30 C unter aseptischer Belüftung von 20 Litern je Minute und unter Rühren trri.t300 UpM. Anschließend werden 10 Liter der erhaltenen Züchtungslösung in einen 250 Liter-Gärtank überführt, der 200 Liter eines hitzesterilisierten Mediums vom pH 7,2 mit einem Gehalt von 5 % Dextrin, 0,5 % Glucose, 3 % entfetteten Sojabohnenpulvers und 0,2 % Calciumcarbonat enthält. Die Züchtung wird 120 Stun-

_o mit 250 UpM
den bei 30 C unter Rühren /and unter aseptischer Belüftung von 100 Litern je Minute durchgeführt. Man erhält I90 Liter Produktlösung.

Die vorgenannten I90 Liter Produktlösung werden filtriert, um Mikroorganismenzellen und andere Feststoffe zu entfernen. Man erhält 160 Liter Filtrat, das mit der gleichen Menge Äthylacetat extrahiert wird, wobei man I60 Liter°Äthylacetatlösung

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COpy

mit einem Gehalt der gewünschten Verbindungen erhält. Diese Lösung wird auf 50 Liter unter vermindertem Druck eingeengt, die dann wieder mit 20 Litern wäßriger Chlprwasserstoffsäure vom pH 2,5 vermischt wird. Dadurch werden die Substanzen in die wäßrige Schicht überführt. Anschließend wird die wäßrige Chlorwasserstofflösung mit konzentriertem Ammoniak auf pH 8,5 eingestellt und einer Extraktion von 20 Litern Chloroform unterworfen. Die Chloroformschicht wird zur Trockne eingedampft. Man erhält 8,5 g Rohprodukt.

8,5 g Rohprodukt werden in 50 ml Chloroform gelöst. Die erhaltene Lösung wird an einer Silicalgelsäule (3 cm χ 55· cm) .adsorbiert, die zuvor mit Chloroform gefüllt worden ist. Anschließend wird mit einem Lösungsmittelgemisch aus Chloroform, Methanol und 28-prozentigem Ammoniak im Verhältnis 20:1:0', 1 entwickelt und dabei 15 ml-Fraktionen aufgefangen. Die in jeder Fraktion enthaltene Verbindung wird durch ihre antibakterielle Wirkung unter Verwendung von Bacillus subtilis und durch Dünnschichtchromatographie unter Verwendung eines Gemisches aus Chloroform, Methanol und 7-prozentigem Ammoniak im Verhältnis 40:12:20 als Entwicklungsmittel (untere Schicht) nachgewiesen. Die Fraktionen mit der jeweils . gleichen Verbindung werden gesammelt.

Die Fraktionen von Nr. 61 bis Nr. 78 enthalten nur die als Macrolid-Antibiotikum A 11725 I identifizierte Substanz. Diese Fraktionen werden zur Trockne eingedampft. Man erhält 1,2 g des Macrolid-Antibiotikums Ä 11725 I.

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Die Fraktionen Nr. 126 bis 160 enthalten nur die als Macrolid-Antibiotikum A 11725 II identifizierte Substanz. Diese Fraktionen werden ebenfalls zur Trockne eingedampft, und man erhält 1,7 g des Macrolid-Antibiotikums A 11725 II.

Die Fraktionen Nr. 2¹Il bis 3 20 enthalten nur die als Macrolid-Antibiotikum A 11725 III identifizierte Substanz. Diese Fraktionen werden ebenfalls zur Trockne eingedampft, und man erhält 0,2 g des Macrolid-Antibiotikums A 11725 III.

Beispiel 2 Herstellung des Macrolid-Antibiotikums A 11725 Ia

Ein Gramm des Macrolid-Antibiotikums A 11725 I> das in der, gleichen Weise wie in Beispiel 1 gewonnen worden ist, wird in 30 ml Eisessig gelöst. Die Lösung wird mit 1,0 g Chrom(II)-chlorid versetzt. Die erhaltene Lösung wird gekühlt. Die Reaktion wird durch l6-stündiges Rühren bei Raumtemperatur durchgeführt. Anschließend gießt man das Reaktionsgemisch in 700 ml Eiswasser. Anschließend wird die Lösung mit wäßriger Natriumcarbonatlösung auf pH 8,5 eingestellt und dreimal mit je MOO ml. Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatschichten werden vereinigt, mit Wasser gewaschen und dann über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Die getrocknete Lösung wird anschließend unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft, und man erhält etwa 800 mg Rohprodukt mit einem Gehalt des Macrolid-Antibiotikums A 11725 Ia, das an einer Silicagelsäule (2,h cm χ 55 cm) unter Verwendung eines Gemisches aus Chloroform, Methanol und 28 £-igem Ammoniak im Verhältnis ^00:10:1 als Eluierungs-

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ORIGINAL INSPECTED

mittel gereinigt wird. Man fängt 15 ml-Fraktionen auf. Die Fraktionen Nr. I30 bis Nr. 210 werden vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Man erhält, 605 ml des gereinigten Macrolid-Antibiotikums A 11725 Ia.

Beispiel 3 Herstellung des Macrolid-Antibiotikums A 11725 Ha

Das Verfahren des Beispiels 2 wird mit der Maßgabe wiederholt, daß anstelle der Substanz A II725 I jetzt die Substanz A 11725 II, die wie in Beispiel 1 hergestellt worden ist, verwendet wird. Aus der Chromatographie an Silicagel erhält man die Fraktionen Nr. 150 bis 220, aus denen man 612 mg gereinigtes Macrolid-Antibiotikum A 11725 Ha erhält.

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Leerseite

Claims

Patentansprüche

1. Macrolid-Antibiotikum mit einem aldehydgruppenfreien, 16-gliedrigen Lactonring,. Desosamin als Aminozucker und S-Desoxy-2,3-di-(0-methyl)-hexose oder 6-Desoxy-(2 oder 3)-0-methyl-hexose als Neutralzucker und der folgenden Teilstruktur I im Lactonring

(D

in der R., ein Wasserstoffatom oder die Hydroxylgruppe ist und die gestrichelte Linie eine Doppelbindung oder die Epoxygruppe bedeutet, und deren pharmakologisch verträgliche Salze.

2. Macrolid-Antibiotikum A 11725 I oder dessen pharmakologisch verträgliche Salze und mit den folgenden Eigenschaften:

Aussehen: weißes Pulver; Summenformel: ^C37^H6l^NOl2^;
Molekulargewicht: 711J

Schmelzpunkt: 103 bis 107°C; M-q' - 40,0° (C=I, Methanol);

Ultraviolett-Absorptionsspektrum: wie in Fig. 3j Infrarot-Absorptionsspektrum: wie in Pig. I;

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-Vt-

kernmagnetisches Resonanzspektrum: wie in Fig. 5; Farbreaktion:

Entfärbung einer wäßrigen Kaliumpermanganatlösung ist positiv;

Ninhydrin-Reaktion, Sakaguchi's-Reaktion und Eisen(III)-chlorid-Reaktion sind negativ;

säure oder basische Natur: basisch;

• Löslichkeit: löslich in angesäuertem Wasser, Methanol, Aceton, Äthylacetat und Benzol,

schwerlöslich in alkalisch eingestelltem Wasser.

3. . Macrolid-Antibiotikum A 11725 II oder dessen pharmakologisch verträgliche Salze und mit den folgenden Eigenschaften:

Aussehen: weißes Pulver;

Summenformel: ^C37^H6l^NOlV

Molekulargewicht: 727;

Schmelzpunkt: 102 bis 106°C;

£*J_O: - 31,0° (C=I, Methanol);

Ultraviolett-Absorptionsspektrum: wie in Fig. ¹I; Infrarot-Absorptionsspektrum: wie in Fig. 2; kernmagnetisches Resonanzspektrum: wie in Fig. 6;

Farbreaktion:

Entfärbung einer wäßrigen Kaliumpermanganatlösung ist positiv;

Ninhydrin-Reaktion, Sakaguchi's-Reaktion und Eisen(III)-chlorid-Reaktion sind negativ;

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saure oder basische Natur: basisch;

Löslichkeit: löslich in angesäuertem Wasser, Methanol, Aceton, Äthylacetat und Benzol,

schwerlöslich in alkalisch eingestelltem Wasser.

k. Macrolid-Antibiotikum A II725 III oder dessen pharmakologisch verträgliche Salze und den folgenden Eigenschaften:

Aussehen: weißes Pulver; Summenformel: C,/-H,-_nN(v ;

3d 59 11

Molekulargewicht: 681;

Schmelzpunkt: 99 bis 102°C;

/^7_D: - 2,3° (C=I,0, Methanol);

Ultraviolett-Absorptionsspektrum: wie in Fig. 7; Infrarot-Absorptionsspektrum: wie in Fig. 8; kernmagnetisches Resonanzspektrum: wie in Fig. 9;

Farbreaktion:

Entfärbung einer wäßrigen Kaliumpermanganatlösung ist positiv;

Ninhydrin-Reaktion, Sakaguchi's-Reaktion und

Eisen(III)-chlorid-Reaktion sind negativ; saure oder basische Natur: basisch;

Löslichkeit: löslich in angesäuertem Wasser, Methanol, Aceton, Äthylacetat und Benzol,

schwerlöslich in alkalisch eingestelltem Wasser und unlöslich in Hexan.

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5· Macrolid-Antibiotikum A 11725 Ia und dessen pharmakologisch verträgliche Salze und den folgenden Eigenschaften:

Aussehen: weiße Kristalle; Summen forme 1: ^7^61^11»

Molekulargewicht: 695;

Schmelzpunkt: 174 bis 176°C;

/Ö7_D: + 2,7° (C=I,0, Methanol);

Ultraviolett-Absorptionsspektrum: wie in Fig. 10; Infrarot-Absorptionsspektrum: wie in Fig. 11; kernmagnetisches Resonanzspektrum: wie in Fig. 12; Farbreaktion:

Entfärbung einer wäßrigen Kaliumpermanganatlösung ist positiv;

Ninhydrin-Reaktion, Sakaguchi¹s-Reaktion und Eisen(III)-chlorid-Reaktion sind negativ;

saure oder basische Natur: basisch;

Löslichkeit: löslich in angesäuertem Wasser, Methanol, Aceton, Kthylacetat und Benzol,

schwerlöslich in alkalisch eingestelltem Wasser und unlöslich in Hexan.

6. Macrolid-Antibiotikum A 11725 Ha und dessen pharmakologisch verträgliche Salze mit den folgenden Eigenschaften:

Aussehen: weiße Kristalle; Summenformel: ^C37^H6l^NOl2^;
Molekulargewicht: 711;

Schmelzpunkt: 148 bis 150°C;

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_D: . + 18,7° (C=I,O, Methanol); Ültraviolett-Absorptionsspektrum: wie in Fig. 13; Infrarot-Absorptionsspektrum: wie in Pig. I¹J; kernmagnetisches Resonanzspektrum: wie in Fig. 15; Farbreaktion:

Entfärbung von wäßriger Kaliumperraanganatlösung ist positiv;

Ninhydrin-Reaktion, Sakaguchi's-Reaktion und Eisen(III)-chlorid-Reaktion sind negativ;

saure oder basische Natur: basisch; Löslichkeit: löslich in angesäuertem V/asser, Methanol,

Aceton, Äthylacetat und Benzol,

schwerlöslich in alkalisch eingestelltem

Wasser und

unlöslich in Hexan.

7. Verfahren zur Gewinnung der Macrolid-Antibiotika nach den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet , daß man einen Mikroorganismus, der mindestens eines der Macrolid-Antibiotika A 11725 I, A II725 II oder A 11725 III erzeugt, unter aeroben Bedingungen in einem Medium mit mindestens einer assimilierbaren Kohlenstoffquelle und mindestens einer assimilierbaren Stickstoffquelle unter Bildung der vorgenannten Macrolid-Antibiotika züchtet, die entstandenen Macrolid-Antibiotika aus dem Züchtungsmedium isoliert und gegebenenfalls auftrennt und/oder in die gewünschten Derivate und/oder Salze umwandelt.

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8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Micromonospora sp. A 11725 (PERM-P Nr. 4488; NRRL 11452) verwendet.

9. Verfahren nach den Ansprüchen 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß man die erzeugte Macrolid-Antibiotika A 11725 Ii II und III fraktioniert auftrennt.

10. Verfahren nach Anspruch 9» dadurch gekennzeichnet, daß man bei den Macrolid-Antibiotika A 11725 I oder A 11725 II mit einem chemischen Mittel die Epoxygruppen in Doppelbindungen umwandelt.

11. . Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man als chemisches Mittel Chrom(II)-Chlorid verwendet.

12. Pharmazeutische Präparate, gekennzeichnet durch einen Gehalt an mindestens einem Macrolid-Antibiotikum oder dessen Salz nach den Ansprüchen 1 bis 11.