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Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibiotikums Dievorliegende Erfindung betrifft ein neues Antibiotikum, das im folgenden mit"Echanomycin"be- zeichnet wird, seine Derivate und Spaltprodukte sowie pharmazeutische Präparate, welche diese Verbindungen enthalten, und Verfahren zur Herstellung dieser Substanzen und Substanzgemische.
Das Antibiotikum Echanomycin entsteht bei der Kultur einer neuen Aktinomyceten-Art der Gattung Streptomyces, die mit keiner der in Bergey's "Manual of Determinative Bacteriology", 6. Auf. oder in"Actinomycetes and their Antibiotics" von Waksman und Lechevalier 1953 aufgeführten Arten identisch ist und im folgenden als Streptomyces echinatus nov. sp. beschrieben wird. Sie wurde aus einer in Angola gesammelten Bodenprobe isoliert und wird in unseren Laboratorien und in der Eidg. Technischen Hochschule, Institut für spezielle Botanik, Zürich, unter der Bezeichnung A 8331 aufbewahrt.
Streptomyces echinatus bildet ein aschgraues Luftmycel. Es trägt Konidienketten, die ein typisches Merkmal der Gattung Streptomyces sind. Die Sporen sind elliptisch bis oval. Ihre Oberfläche ist mit lan-
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abhängig von der Temperatur, sowohl bei 180 als auch bei 400 entwickelt sich der Pilz gut, doch liegt das Optimum zwischen 25 und 320.
Zur weiteren Charakterisierung wird im folgenden dasWachstum vonStreptomyces echinatus auf verschiedenen Nährmedien beschrieben. Die Nährmedien 1-8 und 12 wurden nach W. Lindenbein, Arch. Mikrobiol. 17, [ 1952]. S. 361, hergestellt.
1. Synthetischer Agar : Wachstum dünn, schleierartig, grünlichgelb oder zitronengelb bis lauchgrün ;
Luftmycel sammetig, schneeweiss nach 4 Tagen, zitronengelb nach 7 Tagen ; Pigment grünlich- gelb bis grasgrün nach 14 Tagen.
2. Synthetische Lösung : Wachstum spärlich, feine Trübung.
3. Glucosebrühe : Flottierendes Wachstum, punktförmig, hellbraun ; kein Pigment.
4. Glucose-Agar : Substratmycel runzlig, dottergelb ; Luftmycel sammetig, schneeweiss im Zentrum, bräunlichgelb am Rand nach 4 Tagen, wollig, grauweiss bis aschgrau nach 7 Tagen ; Pigmentsatt- gelb bis goldgelb.
5. Glucose-Asparagin-Agar : Substratmycel dünn, glatt, goldgelb bis grünlichgelb, nach 7 Tagen auch grünlichgrau ; Luftmycel sammetig, von oben nach unten im Reagenzglas aschgrau, rötlich-violett, weissgrau nach 4 Tagen, auf die ganze Länge des Schrägagars aschgrau nach 7 Tagen ; kein deut- liches Pigment.
6. Calciummalat-Agar:. Wachstum dünn, schleierartig, blassgelb nach 4 Tagen, grünlichgelb nach 7 Ta - gen ; Luftmycel staubig milchweiss bis blassgelb ; kein Pigment.
7. Gelatinestich 180C : Wachstum oberflächlich, dünn, dunkelbraun ; Luftmycel sammetig grünlich- grau nach 14 Tagen ; Pigment dunkelbraun ; keine Verflüssigung nach 31 Tagen.
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:oder höchstens Spuren nach 5 Tagen.
9 : Nähragar : Wachstum punktförmig, hellgelb ; kein Luftmycel ; kein Pigment.
10. Kartoffeln : Substratmycel flechtenartig, grünlich-bis rabenschwarz ; Luftmycel spärlich, staubig, weissgrau nach 4 Tagen, graublau nach 7 Tagen ; Substrat bräunlich-pechschwarz gefärbt.
11. Karotten : Wachstum dann, hellgelbe Luftmycel staubig, weissgrau nach 4 Tagen, grünlichgrau nach
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<tb>
<tb>
;L-Xylose <SEP> + <SEP> Inulin
<tb> L-Arabinose <SEP> + <SEP> D-Mannit <SEP> + <SEP>
<tb> L-Rhammose <SEP> + <SEP> D-Sorbit <SEP>
<tb> D-Fmktose <SEP> + <SEP> Dulcit
<tb> D-Galaktose <SEP> + <SEP> Mesoinosit <SEP> +
<tb> Saccharose-Salicin
<tb> Maltose <SEP> + <SEP> Natriumacetat <SEP> +
<tb> Lactose <SEP> + <SEP> Natriumcitrat
<tb> Raffinose <SEP> + <SEP> Natriumsuccinat <SEP> +
<tb>
Dabei bedeutet.
+ gutes Wachstum, sichere Verwendung der betreffenden Kohlenstoffquelle (+) schwaches Wachstum, Verwendung der betreffenden Kohlenstoffquelle fraglich sehr schwaches Wachstum, Verwendung der betreffenden Kohlenstoffquelle unwahrscheinlich kein Wachstum, keine Verwendung der betreffenden Kohlenstoffquelle
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mit Sjlaveolus (Waksman) Waksmanment und gibt totale Gelatineverflüssigung sowie mittlere Stärkehydrolyse.
Die vorliegende Erfindung ist, was die Herstellung des Antibiotikums Echanomycin anbelangt, nicht auf die Verwendung des Streptomyces echinatus oder anderer der Beschreibung entsprechender Stämme be- schränkt, sondern betrifft auch die Verwendung von Varianten dieser Organismen, wie sie z. B. durch Selektionierung oder Mutation, insbesondere unter der Einwirkung von Ultraviolett-oder Röntgenstrahlen oder von Stickstoff-Senfölen gewonnen werden.
Zur Erzeugung des Antibiotikums Echanomycin wird ein die Eigenschaften von Streptomyces echinatus* j aufweisender Streptomyceten-Stamm, z.B. in wässeriger, anorganische Salze, stickstoffhaltige Verbindungen und gegebenenfalls Kohlehydrate enthaltender Nährlösung aerob gezüchtet, bis diese eine wesentliche antibakterielle Wirkung zeigt, und das Antibiotikum Echanomycin hierauf isoliert.
Die Nährlösung enthält als anorganische Salze beispielsweise Chloride, Nitrate, Carbonate, Sulfate von Alkalien, Erdalkalien, Magnesium, Eisen, Zink, Mangan. Als stickstoffhaltige Verbindungen und gegebenenfalls zuzusetzende Kohlehydrate und wachstumfördernde Stoffe seien z. B. genannt : Aminosäuren und ihre Gemische, Peptide und Proteine sowie ihre Hydrolysate, wie Pepton oder Trypton, Fleischextrakte, wasserlösliche Anteile von Getreidekörnern, wie Mais und Weizen, von Destillationsrückstän-- den bei der Alkoholherstellung, von Hefe, Bohnen, insbesondere der Sojapflanze, von Samen, beispielsweise der Baumwollpflanze, ferner Glukose, Saccharose, Lactose, Stärke usw.
'""Die Züchtung erfolgt aerob, also beispielsweise in ruhender Oberflächenkultur oder vorzugsweise submers unter Schütteln oder Rühren mit Luft oder Sauerstoff in Schüttelflaschen oder den bekannten Fermentern. Als Temperatur eignet sich eine solche zwischen. 18 und 400. Eine wesentliche antibakterielle Wirkung zeigt die Nährlösung dabei im allgemeinen nach 1 1/2-5 Tagen.
Zur Isolierung des Antibiotikums können z. B. folgende Verfahren dienen : Man trennt das Mycel vom Kulturfiltrat ab, wonachcdie Hauptmenge des Antibiotikums im Kulturfimat gefunden wird. Es bleiben aber trotzdem namhafte Mengen des Antibiotikums am Mycel adsorbiert. Es ist daher vorteilhaft, letzteres gut auszuwaschen. Dazu eignen sich besonders organische, mindestens teilweise wasserlösliche Lösungsmittel, wie Alkohole, z. B. Methanol, Äthanol und Butanole, oder Ketone, z. B.
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Wasser nicht mischbaren, organischen Lösungsmittel, wie Estern niederer Fettsäuren, beispielsweise Äthylacetat oder Amylacetat, Kohlenwasserstoffen, z. B. Benzol, chlorierten Kohlenwasserstoffen, z. B. Äthylenchlorid, Methylenchlorid oder Chloroform, Ketonen, z.B.
Methylpropylketon, Me- thylamylketon oder Diisobutylketon, Alkoholen, wie Butylalknhplen cdsst Amylalkoho-
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len, Äthem, z. B. Äthyläther, Diisopropyläther, Dibutyläthern oder Glykoläthem u. dgl. An Stelle einer Lösungsmittel-Extraktion der Kulturen, oder in Kombination mit einer solchen als weitere Reinigungsoperation, kann man das Antibiotikum auch durch Adsorption gewinnen, beispielsweise an Aktivkohle oder an aktivierten Erden, wie Fullererde oder Floridin, und anschliessende Extraktion des Adsorbates z. B. mit einem in Wasser wenigstens teilweise löslichen organischen Lösungsmittel, wie Aceton, Butanol oder Methyläthylketon.
Man kann auch die Kulturen direkt, ohne vorgängige Abtrennung des Mycels, in der angegebenen Art und Weise extrahieren.
Eine weitere Anreicherung lässt sich dadurch erzielen, dass man die antibiotikumhaltigen organischen Extrakte zuerst mit einer sauren wässerigen Lösung mit einem PH unter 5 und dann mit einer alkalischen wässerigen Lösung mit einem PH über 8 wiederholt auszieht, wobei die Hauptmenge der antibiotischen aktiven Substanz in der organischen Phase bleibt, aus der das Echanomycin isoliert wird. Eine geringere Menge aktiver Substanz findet sich in den alkalischen wässerigen Auszügen, aus denen mittels Extraktion mit den oben genannten organischen Lösungsmitteln bei einem PH unter 5 eine antibiotisch aktive organische Säure gewonnen werden kann.
Als saure wässerige Lösungen eignen sich verdünnte Säuren, wie Essigsäure, Salzsäure oder Schwefelsäure, oder Pufferlösungen, wie Citrat-oder Phosphatpuffer, und als alkalische wässerige Lösungen verdünnte Alkalien, wie Natronlauge oder Kalilauge, oder Pufferlösungen, wie Phosphatpuffer u. dgl.
Ein gutes Reinigungsverfahren für das neue Antibiotikum stellt die Verteilung zwischen einer alkoholischen wässerigen Lösung und einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel dar. Zweckmässig erfolgt die Verteilung nach dem Gegenstromverfahren in entsprechenden Apparaten. Auch Chromatographie
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Gemischen, Aceton-Äther-Gemischen oder Aceton-Petroläther-Gemischen. Zum Umkristallisieren dienen dieselben Lösungsmittel oder auch wässerig-organische Lösungen, wie verdünnte Alkohole, verdünntes Aceton usw.
Das Antibiotikum erhält man als farbloses, mikrokristallines Pulver. F. 217-2180, [a]D = -310 .
Die Elementaranalyse liefert folgende Werte : C = 55,79% H = 5, 74%, N = 15, 20%, S = 5, 24%,
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CH32, 02). Im Infrarot-Spektrum sind Banden u. a. bei folgenden Wellenlängen sichtbars 5, 74u, 6, 00 u, 6,81 , 7,06 , 7,22 , 7,85-8,00 (sehr breite Bande), 8, 75u, 9, 06u, 12, 78uund 13, 16u. Echanomycin besitzt keine basischen Eigenschaften und keine leicht acylierbaren Hydroxylgruppen.
Bei der sauren Hydrolyse von Echanomycin entstehen die Aminosäuren D-Serin und L-Alanin, sowie weitere Spaltprodukte, die, eine positive Farbreaktion mit Ninhydrin geben. Anderseits wird bei milder
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isolieren lässt. Nach diesen Untersuchungen ist Echanomycin offenbar eine peptidartig gebaute Verbindung, in der neben L-Alanin, D-Serin, Chinoxalin-2-carbonsäure und wahrscheinlich amidartig ge- bundenem Ammoniak noch ein dreiwertiger Rest C H OgNgS vorliegt.
Das Antibiotikum Echanomycin besitzt eine sehr hohe antibiotische Wirksamkeit gegenüber verschiedenen Testorganismen. Verwendet man als Testmethode in vitro Verdünnungsreihen (Zehnerpotenzen) in Glukosebouillon, die während 24 Stunden bei 37 bebrütet werden, so ergeben sich folgende noch hemmende Konzentrationen :
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<tb>
<tb> Testorganismen <SEP> Hemmende <SEP> Konzentration
<tb> Jlgfcm3
<tb> Micrococcus <SEP> pyrogenes, <SEP> var.aureus <SEP> 0,1
<tb> Micrococcus <SEP> pyogenes, <SEP> var. <SEP> aureus <SEP> Penicillin-resistent <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP>
<tb> Streptococcus <SEP> pyogenes <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP>
<tb> Streptococcus <SEP> viridans <SEP> 0, <SEP> 1
<tb> Streptococcus <SEP> faecalis <SEP> 1 <SEP>
<tb> Corynebacterium <SEP> diphtheriae <SEP> 0,
<SEP> 1
<tb> Vibrio <SEP> cholerae <SEP> el <SEP> Tor <SEP> 100
<tb> Bacillus <SEP> Megatherium <SEP> 10
<tb> Candida <SEP> vulgaris <SEP> 100
<tb> Mycobacterium <SEP> tuberculosis <SEP> # <SEP> 100
<tb> Enta <SEP> moeba <SEP> histolytica <SEP> ## <SEP> 1000
<tb> Trichomonas <SEP> foetus <SEP> ### <SEP> 1 <SEP> < <SEP> 4
<tb>
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KirchLeitungswasser ; PH vor der Sterilisation 7, 5. d) 20 g Glycerin, 10 g Soyamehl, 5 g Natriumchlorid, 1 g Natriumnitrat, 10 g Calciumcarbonat und
11 Leitungswasser ; PH vor der Sterilisation 7, 5.
Beispiel 3: Der Filterrückstand eines gemäss Beispiel 1 oder 2 erhaltenen 150 1-Ansatzes wird mit 25 1 Aceton ausgerührt und erneut filtriert. Dies wird zweimal wiederholt, worauf man die antibiotikumhaltigen Acetonlösungen vereinigt im Vakuum auf 5 l einengt und mit dem Kulturfiltrat vereinigt. Diese Lösung wird mit 70 1 Äthylacetat im Westfalia-Extraktor ausgezogen, wobei die gesamte antibakteriell aktive Substanz in die organische Phase übergeht. Der Extrakt wird mit Wasser gewaschen, im Vakuum auf 5 1 eingeengt und dann mehrere Male mit 0, 5-n. Essigsäure und mit 2-n@ Natronlauge ausgeschüttelt.
Schliesslich trocknet man die Äthylacetatlösung über Natriumsulfat und dampft sie im Vakuum ein, wobei ein öliger Rückstand erhalten wird. Durch Behandlung mit Petroläther gewinnt man daraus das rohe Antibiotikum Echanomycin in Form von gelblichen Flocken.
Die oben erwähnten Natronlauge-Auszüge besitzen eine schwache antibiotische Wirksamkeit. Sie werden auf PH 3 gebracht und mit Äthylacetat extrahiert. Die Extrakte wäscht man mit Wasser, trocknet sie und dampft sie im Vakuum ein. Der gelbe amorphe Rückstand ist antibiotisch wirksam.
Beispiel 4 : 5, 7 g des gemäss Beispiel 3 erhaltenen rohen Antibiotikums Echanomycin werden einer 82-stufigen Gegenstromverteilung unterworfen, wobei man das folgende Lösungsmittelgemisch verwendet : 2,63 Vol. -Teile Tetrachlorkohlenstoff, 0,37 Vol.-Teile Chloroform, 2,4 Vol.-Teile Methanol und 0. 6 Vol. -Teile Wasser. Nach dem Eindampfen des Inhaltes der einzelnen Verteilungsgefässe im Vakuum bei 300 findet man die Hauptmenge der Substanz und der Aktivität bei Stufe 35. Die Fraktionen 30-40 werden vereinigt und man erhält 20 gpapierchromatographisch einheitliches Echanomycin. Es wird aus Methanol
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Säule aus 150 gAluminiumoxyd (Aktivität III) nach der Durchlaufmethode chromatographiert, wobei mit Benzol, Chloroform, Chloroform-Methanol-Gemischen und Methanol eluiert wird.
Die einzelnen Fraktionen (je 400 cm3) werden im Vakuum-eingedampft und auf ihre antibiotische Aktivität untersucht. Die Benzol-und Chloroform-Fraktionen enthalten nur unwirksame Begleitsubstanzen, während die mit Chloroform-Methanol (99 : 1) -Gemischen eluierten Anteile hochwirksam sind. Sie werden vereinigt und aus Methanol kristallisiert. Man erhält 900 mg Echanomycin, F. 217-218 , [ x] D ==-310 (in Chloroform).
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Verwendung finden : a) 1%ige Lösung in Wasser-N-Methyl-pyrrolidon-Gemisch (80:20 Vol.-Teile), b) 1%ige Lösung in Rizinusöl, c) 0, 1%ige Lösung in Arachidöl.
Beispiel 6 : Man erhitzt eine Lösung von 20 mg Echanomycin in 5 ems 20% iger Salzs äure im zugeschmolzenen Rohr 16 Stunden lang auf 1000 und dampft sie darauf im Vakuum bei 35 zur Trockne ein. Der Rückstand wird papierchromatographisch untersucht, wobei, neben andem Ninhydrin-positiven Substanzen, Serin und Alanin nachgewiesen werden können.
Beispiel 7 : Man versetzt eine Lösung von 250 mg Echanomycin in 20 ems Äthanol mit einer Lö- sung von 1 g Kaliumhydroxyd in 30 cm3 Äthanol und lässt das Gemisch 14 Stunden bei 200 stehen. Dann gibt man Wasser zu und extrahiert die Lösung mehrmals mit Äthylacetat. Die Extrakte werden mit Wasser gewaschen, getrocknet und eingedampft, wobei 3 mg Ausgangsmaterial erhalten werden. Die alkalische wässerige Phase säuert man durch Zugabe von verdünnter Salzsäure an und extrahiert sie erneut mit Äthylacetat. Nach Waschen mit Wasser und Trocknen werden die Extrakte im Vakuum eingedampft. Man er-
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20 mg Echanomycinsäure werden wie in Beispiel 6 beschrieben mit 5 cm3 20%iger Salzsäure hydrolysiert.
Im Hydrolysat kann man bei der papierchromatographischen Untersuchung, neben ändern Ninhydrin-positiven Substanzen, Alanin. nachweisen.
Beispiel 8 : 500 mg Echanomycin werden in einem Gemisch von 5 cm ? konz. Salzsäure und 5 cm3 Wasser im Einschlussrohr z Stunden auf 1000 erwärmt. Man verdünnt die schwarz-grün gefärbte Reaktionslösung mit Wasser und gibt etwas Aktivkohle zu. Nach dem Filtrieren wird die Lösung im Vakuum bei 400 eingedampft, wobei ein brauner Rückstand erhalten wird. Dieser wird wieder in 15 cm3 Wasser aufgenommen. Man gibt zu dieser Lösung zuerst 500 mg Natriumhydrogencarbonat und dann eine Lösung
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wird die Lösung im Vakuum auf ein Viertel eingeengt und danach mit Äther extrahiert.
Die resultierende wässerige Phase wird hierauf angesäuert und nochmals mit Äther ausgezogen, Aus diesen Extrakten erhält man nach Waschen, Trocknen und Eindampfen ein zähflüssiges Öl, das gemäss papierchromatogra-hischer Auswertung die 2, 4-Dinitrophenyl-Derivate von Serin und Alanin enthält. Es kann durch Verteilungschromatographie aufgetrennt werden. Zu diesem Zweck bereitet man eine Säule aus 40 g Kieselsäure,
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Säulenitrophenyl-D-serin. Die das 2,4-Dinitrophenyl-alanin enthaltende Fraktion wird durch Gegenstromverteilung zwischen Äther und Mac ILvaine-Puffer (PH 4, 9) weiter gereinigt. Bei einer Verteilung über 62 Stufen findet sich das Substanz-Maximum in Stufe 26. Man vereinigt die Stufen 20-32, säuert sie an und extrahiert sie mit Äther.
Nach dem Waschen, Trocknen und Eindampfen der Extrakte erhält man einen
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f < x] p =-15, 5 l, 07 in Aceton). Es handelt sich also um das 2, 4-Dinitrophenyl-L-alanin.
B e i s p i e l 9:2 g Echanomycin werden mit einer Lösung von 4g Natriumhydroxyd in 35 cm3 Wasser in einem Destillationskolben langsam erwärmt und dann zum Sieden erhitzt, wobei man nach dem Abdestillieren von zirka 30 cm ? Destillat nochmals 30 cm ? Wasser in den Kolben gibt und diese Menge nochmals abdestilliert. Das Destillat wird in 50 cm3 0, 1-n. Salzsäure aufgefangen. Die übergehenden flüchtigen Anteile enthalten 1, 2 Mol Ammoniak, was durch Rücktitration der Vorlage und durch Isolierung von Ammoniumchlorid festgestellt werden kann.
Der alkalische Destillationsrückstand wird in 30 cm3 Wasser aufgenommen, mit Salzsäure angesäuert und viermal mit Essigester ausgezogen. Man wäscht die Extrakte mit Wasser, trocknet sie und dampft sie im Vakuum ein. Durch Umlösen aus Essigester erhält man aus dem Extraktionsrückstand 410 mg Chinoxalincarbonsäure- (2) in kristalliner Form. Zur weiteren Reinigung wird sie im Hochvakuum sublimiert.
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(2) gebildete Methylester1.
Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibiotikums durch aerobe Züchtung neuer StreptomycesStämme in einer wässerigen Nährlösung, die anorganische Salze, Stickstoff- und Kohlenstoffverbindungen und gegebenenfalls Wachstumfördernde Stoffe enthält, und darauffolgende Abtrennung der antibiotisch wirksamen Substanz aus dem Kulturfiltrat und allfälliger weiterer Reinigung, dadurch gekennzeichnet, dass man den Streptomyces-Stamm A 8331 (Zürich) (oder seine Varianten oder Mutanten) aerob züchtet,
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Nährlösung einewesentliche antibakterielle Wirkung zeigt, u. zw. vorzugsweise submers undnigt.