DE2034799A1

DE2034799A1 - Neues Antibiotikum, seine Herstellung und Verwendung

Info

Publication number: DE2034799A1
Application number: DE19702034799
Authority: DE
Inventors: Robert Bourg la Reine Robert Alexandre Ablon Grandpierre, (Frankreich) C07c
Original assignee: Albert Rolland S A , Paris
Priority date: 1969-07-19
Filing date: 1970-07-14
Publication date: 1971-02-04
Also published as: FI46629B; AT296505B; NL7010736A; FI46629C; FR2059533A1; LU61361A1; IL34909A; NO131941B; OA03642A; DK127194B; CA922251A; RO56893A; ES381751A1; JPS5034638B1; ZA704837B; IL34909A0; GB1314019A; SE382074B; NO131941C; BE753101A

Description

DR.-ING. VON KREISLER DR.-!NG. SCHÖNWALD DR.-ING. TH. MEYER DR. FUES DIPL-CHEM. ALEK VON KREISLER DIPL-CHEM. CAROLA KELLER DR.-ING. KLUPSCH

KÖLN 1, DEICHMANNHAUS

Köln, den 11»?*197O Kl/Ax

A L B ERT R OLLAN D S.A./ k, Rue Piaton,, Paris 15e (Frankreich).

Neues Antibiotikum, seine Herstellung und Verwendung

Die Erfindung betrifft ein neues Antibiotikum, das das Wachstum gewisser pathogener Keime zu hemmen vermag. Diese antibiotische Substanz wurde von der Änmelderin aus Mikroorganismen extrahiert, die von dem unter dem. Hamen "Barfegines¹¹ bekannten Schlamm stammen».der im Etablissement Thermal de Luchon (Prankreich) gewonnen wird.

Durch direkte Entnahme von den "Baregines" isolierte die Anmelderin einen Stamm eines Mikroorganimua, den sie nach den Identifizierungsmerkmalen in "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology" identifizierte. Mit Hilfe der nachstehend beschriebenen Versuche konnte nachgewiesen werden, daß der neue Stamm als neue Spezies in die Ordnung I, Pseudomonadales, Familie IV, Pseudomonadacae, Gattung I, Pseudomonas, einzustufen ist.

Der Vergleich der Gesamtheit der Eigenschaften des neuen Stammes mit denen, die den 149 in Bergey's Manual beschriebenen. Spezies von Pseudomonas zugeschrieben werden, ermöglichte die Feststellung, daß der neue Stamm mit Pseudomonas Fairmontenais verglichen werden muß, mit dem

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er die meisten Eigenschaften gemeinsam hat. Wie jedoch nachstehend ausgeführt, unterscheidet sich der Stamm gemäß der Erfindung von Pseudomonaa Fairmontensis und noch mehr von den anderen Spezies von Pseudomonas durch gewisse Eigenschaften, so daß er als völlig neu anzusehen ist.

Von der Anmelderin wurde der neue Stamm gemäß der Erfindung als "Pseudomonas Rollandi" bezeichnet. Dieser neue Stamm wurde beim Centraal Bureau voor Schimmelculturea, Baarn (Holland), hinterlegt, wo er die Rinterlegunganunimer 368.68 erhielt.

Die Identifizierung des neuen Stamms basiert auf den folgenden Beobachtungenι Der neue Stamm wächst zufriedenstellend auf gewöhnlichen Kulturmedien, z.B. auf Nährbouillon» Nähragar und auch auf gewissen besonderen Spezialmedien, z.B. auf schwefelhaltigen Uedien, Peptonwasser und analogen Medien. Er wächst innerhalb sehr weiter*Temperaturgrenzen von etwa 12 bis 42⁰C.

Auf Nähragar bildet der Stamm weiße Kolonien, die glänzend und durchscheinend aussehen und in einigen Tagen geschlossen zusammenfließen. Die Ränder der Kolonien sind regelmäßig und leicht gewölbt. In einer Nährbouillon beobachtet man gelegentlich die Bildung eines grünen fluoreszierenden Pigments, das in Wasser löslich und in Chloroform unlöslich ist.

Bei der Untersuchung unter dem Mikroskop wurde beobachtet, daß diese Kolonien aus kurzen, an den Enden abgerundeten, sehr beweglichen Stäbchen bestehen. Die Färbung der Zilien nach der Leifson-Methode zeigt, daß der neue Stamm eine endständige Geißel hat (monotriche polaire).

Die Kultureigenschaften und morphologischen Eigenschaften des neuen Stammes sind nachstehend in Tabelle I genannt.

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Tabelle I

2034793

Färbung nach Gram: Beweglichkeit: Morphologie: Kolonien:

Nähragar: Nährbouillon:

Peptonwasser:

Lackmusmilch:

Lackmusmol Ice:

(Petit lait tournesole) Agar-Stichkultur: (Gelose profonde VF) Kartoffeln: Harnstoff-Indol:

Lactose-Glucosegramnegativ
sehr beweglich kleine Stäbchen

weiß, glänzend,regelmäßige Ränder

unterschiedliche Fluoreszens

grün, gleichmäßiger trüber Schleier, Fällung

Schleier an der Oberfläche, trübe,Fällung Salkowsky-Reaktion: Indol

Koaguliert in 24 Std., digeriert in 3 Tagen, angesäuert auf p_H 5,0 Nach 18 Stunden, alkalisch

Btreng aerobes Wachstum

beigefarbene Kolonien

Nach 2 Std. Bebrütungsdauer Umschlag nach rot-violett: + Urease: +

Untersuchung auf Tryptophandesaminase Indolessigsäure: +

Schwarze Kolonien auf der Schrägkultur (48 Stunden)
Gas

Glucose Lactose Lysin Decarboxylase -

Agar-baslsches Bleiacetat:	SH₂ + SH₂+.
Citrat:	+ - ■■'.-.
Nitrat-Nitrite:	- -
Clark und Lubs:	. - ■
Gelatine:	Zylindrische Verflüs sigung

009886/2235

- 4 - :■ :. ■"■■:■■■" ν

Fermentation von Kohlehydraten

Starkes -

Arabinoae: ±

Galactose: ±

Glucose: +

lactose: -

Lävulose: +
Maltose:

Mannit: -

Saccharose! Xylose:

Die oben genannten Vergleichsversuche zeigen, daß der neue Stamm sich von Pseudomonas aeruginosa (oder Pseudomonas Pyocyanea oder B. pyocyaneus) durch seine Kulturen auf der Kartoffel (beigefarbene Kolonien auf hellem Grund, während die Spezies Pyoeeanea dunkelbraune Kolonien mit grüner Farbe der Kartoffel ergibt) und durch Ansäuerung von Milch unterscheidet (Aeruginosa macht die Milch alkalisch). Die Spezies Pyoceanea ist fakultativ aerob, während der neue Stamm streng aerob ist* Pyoeyanea fermentiert Glucose nicht, während der neue Stamm Glucose fermentiert, Pseudomonas Fairmontensis wächst nicht mehr bei 35⁰C, und Pseudomonas Boeropolis wächst nicht mehr bei 35 bis 37⁰C, während der neue Stamm noch bei 42⁰C wächst, Pseudomonas Fairmontensis ist fakultativ aerob, während der neue Stamm streng aerob ist. Pseudomonas Effusa macht ebenfalls I/ackmusmilct alkalisch und ist fakultativ aerob. Die anderen bekannten Spezies von Pseudomonas unterscheiden sich sämtlich noch stärker vom neuen Stamm gemäß der Erfindung«

Der neue Stamm gemäß der Erfindung wurde außerdem nach dem taxonomischen System von Stanier, Palleroni und Doudoroff identifiziert. Die charakteristischen und^.■morphologischen Eigenschaften des neuen Stamms sind nachstehend in Tabelle II ,genannt.

ι 009886/2235.

2Q34793

Tabelle II

Bestimmung des Stammes nach dem Klassifizierungssystem von Stanier. Palleroni und Doudoroff - , -

Optisches Mikroskop Morphologie Beweglichkeit Färbung nach Gram Geißeln

Kultur

Nährbouillon

Nähragar

King-Medium 15

Agar-»Stichkultur (Gelose profonde)

Anaerobe Bouillon, ohne Nitratquelle

Anaerobe Bouillon» mit Nitratquelle

Succinat p-Hydroxybenzoat Snikimate Adipat

Tryptophan

Leucin

C-C-Muconat Vergleichsversuch (ohne Kohlenstoffquelle) Fueose Maleat Threonin Catechin Phenol m-Hydroxybenzoat kleine Stäbchen sehr beweglich gramnegativ endständige Geißel (Monotriche polaire)

grün, Schleier, gleichmäßig trübe, Fällung

grün, Fluoreszenz (Pyoverdine) dunkelblau nach 24 Stunden bei 37 0 CPyözyanin)

streng aerob wächst nickt

wächst, Gasbildung, streng aerob, denitriert Wachstum ++ · Wachstum + Wachstum + Wachstum + Wachstum + Wachstum + Mutanten

kein Wachstum θ kein Wachstum Q kein Wachstum θ kein Wachstum θ kein Wachstum θ kein Wachstum θ kein Wachstum Q

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Aus sämtlichen vorstehenden Eigenschaften ist 2U folgern, daß bei diesem Klassifizierungssystem der neue Stammzur Gattung Pseudomonas, Spezies Aeruginosa gehört·

Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung des neuen Antibiotikums. Dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man

a) den Stamm Pseudomonas Rolland! Nr.CBS 368.68 aerob bei 12 bis 42⁰C, vorzugsweise bei 28 bis 57⁰Ci in; einem klassischen Kulturmedium, z.B. Näbrbouillön> während der Zeit kultiviert, die zum Erreichen der stationären Wachstumsphase des Mikroorganismus notwendig ist, anschließend den gebildeten Mikroorganismus vorzugsweise durch Zentrifugierimg oder Feinfiltration abtrennt,

b) die Zellen des Mikroorganismus vorzugsweise mit Ultras sehall zerreißt, das hierbei erhaltene Mahlgut vorzugsweise durch Gefriertrocknung dehydrätisiert, abscnliessend die wasserfreien Zellen mit Methanol extrahiert und den Extrakt zur Trockene eindampft, wobei der Methanolextrakt der zerrissenen Zellen von Pseudomonas Rollandi erhalten wird, der das rohe Antibiotikum darstellt, das gegebenenfalls gereinigt^ wird·

Die Reinigung des Methanolextraktes wird wie folgt vorgenommen:

a) Man extrahiert mit einem chlorierten lösungsmittel, insbesondere Trichiormethan, Methylenchlorid oder Trichloressigsäure, nachdem man oder bevor man zur Entfernung der Lipide mit Hexan oder Heptan behandelt hat, wobei das Antibiotikum im halbreinen Zustand erhalten wird.

b) Man extrahiert gegebenenfalls das halbreine Antibiotikum mit Äthanol, wobei das Antibiotikum im reinen Zustand erhalten wird.

0098867 22 3 5

Beispiel 1 i Kultivierung yon Pseudomo^as Rollahäi

I) Gewinnung von Pseudomonas Rollandi dttreh stationäre - Kultivierung - . -'.-V-' ■'■■:: / ■■>.;;■;:;-" in 1 I-Roux-Kolben werden steril Je 250 ml gegeben. Zu diesem Zweck wird NährbOiiillondes Pasteur·* . Instituts verwendet. Man impft diese Bouillon mit Hilfe einer Pasteur-Pipette mit eifter 12 ^tunden-lCultiir von . , Pseudomonas Rollandi in iiähriiouilltin· ßifi Roux*-K9lbeti ' werden flach in den Wärmesctorank gesteilt> ttfli einte gro3e Berührungsfläche zwischen der Luft und der Buoilloh z\x erhalten. Die Bebrütung dieser Kulturen erfolgt eine Woche bei 37⁰C. ■■■■.' I

Nach der Bebrütungszeit wird der größte Teil der gebildeten Mikroorganismen durch Zentrifugierung abgetrennt. Der Rest der Mikroorganismen wird durch Feinfiltration mit der Millipore-Membran mit einem mittleren Porendurchmesser von 0,45 mu gewonnen*

II) Gewinnung von fsgudomonas Rollandi in bewegter Kultur 1 1 Kulturmedium, das aus 8 g Difco-Bakteriennährbrühe, 2.0 5 g Difco-Hefeextrakt und der an 1000 ml fehlenden Wassermenge besteht, wird mit einer Suspension von Pseudomonas Rollandi geimpft, die aus einer 12 Stunden-Kultur bei 28°C auf Pasteur-Nähragar stammt« Bas Medium wird eine ä Macht bei 28⁰C gerührt. ;:

Am folgenden Morgen werden 10 1 Kulturmedium mit der Yorkultur in einer Menge von 100 ml Yorkültur pro Flasche,-■' die 1 1 Medium enthält, geimpft* Me ^lasöhen werden im ■ Wärmeschrank bei 28°C 7 stunden gerührt* Biese Zeit ist _; notwendig, damit die Kultur die stationäre Wachstumaphase erreicht»

Bie vereinigten Kulturen werden mit einer gekühlten Sharples-Zentrifuge bei 35000 UpM zentrifugiert. Der abgetrennte Feststoff wird in einem 0,02-molaren Phosphatpuffer gewaschen und dann kalt 20 Min.mit 15000 UpK zentrifugiert.

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BADORIQINAL

Zur quantitativen Bewertung der Ausbeute ist in der graphischen Darstellung von Fig.1 als Abszisse das Trockengewicht (in mg/1) von Pseudomonas Rollandi, das im Kulturmedium enthalten ist, und als Ordinate die Trübung (ausge-? drückt als optische Dichte) des Mediums, abgelesen am Spektrophotometer bei einer Wellenlänge von 600 nm, aufgetragen. Beispielsweise zeigt die graphische Darstellung für den verwendeten Stamm und die oben genannten Versuchsbedingungen, daß 1 1 Kultur einer optischen Dichte von 0,5 etwa 3'25 mg Bakterien (Trockengewicht) enthält.

In der graphischen Darstellung von Pig.2 ist die Wachstumskurve von Pseudomonas Rollandi dargestellt, wobei die Zeit in Stunden als Abszisse und der Logarithmus der optischen Dichte als Ordinate aufgetragen sind. Die Phase des exponentiellen Wachstums ist durch eine Gerade ausgedrückt.

Die Generationszeit ist die Zeit, die zur Verdoppelung der optischen Dichte im geradlinigen Teil (Exponentialzeit der Wachstumskurve) notwendig ist. Unter den oben genannten Versuchsbedingungen beträgt die Generationszeit 60 Minuten.

Fig.2 zeigt ferner, daß das Wachstum der Bakterien in der bewegten Kultur (Kurve II) deutlich schneller ist als in der stationären Kultur (Kurve I). Dies stimmt mit der aeroben Natur von Pseudomonas Rollandi überein.

Beispiel 2
A. Extraktion des neuen Antibiotikums

Der durch Zentrifugieren oder F_einfiltration auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise abgetrennte Mikroorganismus wird anschließend mit Ultraschall gemahlen« Die nach der. Ultraschallbehandlung erhaltene homogene Flüssigkeit wird gefriergetrocknet und das Lyophilisat in einem Mörser pulverisiert, gewogen und aufbewahrt» 140 g äea auf diese Weise erhaltenen Mikrobienpulvers werden ia Gellulosebülsen gegeben und in eine Soxblet-Apparatur eingesetzt» Das Pulver wird 1 Stunde mit 5 1 Methanol unter Rückfluß extra-

009886/223S

hiert. Der Extrakt wird zur Trockene eingedampft, wobei 63 g methanolischer Extrakt erhalten werden, der den gesaraten aktiven Bestandteil des eingesetzten Mikrobienpulvers enthält» Der inaktive Rückstand wird verworfen. Dieser Methanolextrakt stellt die rohe antibiotische Substanz dar.

B. Reinigung des Methanolextraktes durch fraktionierende Fällung _; -:

Der Methanolextrakt wird dreimal mit je 300 ml siedendem Trichlormethan 5 Minuten behandelt. Der T_richlorraethanextrakt, der das aktive Material enthält, wird zur Trockene ,-eingedampft und dann zur Entfernung der Lipide mit sie- dendem Hexan behandelt. Der Rückstand (3,4 g), der das aktive Material enthält, stellt den Extrakt (I) dar (halbreines Antibiotikum).

Dieser Extrakt I wird anschließend mit Aceton behandelt, wobei eine Fraktion I₁, die aus dem aktiven Rückstand (1,1 g) besteht, und eine Fraktion Ig, die aus dem aktiven Extrakt (1,9 g) besteht, erhalten Werden.

Die Fraktion I- ergibt nach Extraktion mit wasserfreiem Äthanol einen inaktiven Rückstand (0,7 g) und einen sehr aktiven Extrakt, der zur Trockene eingedampft wird, wobei die Fraktion I₁₁ (0,35 g) erhalten wird. . 4(

Die zur Trockene eingedampfte Fraktion I₂ wird mit wasserfreiem Äthanol extrahiert, wobei ein inaktiver Rückstand (0,15 g) und ein sehr aktiver Extrakt erhalten werden. Dieser Extrakt wird zur Trockene eingedampft, wobei die Fraktion I₂₂ (1,7 g) erhalten wird. Die Fraktionen I₁₁ und I₂₂ stellen das Antibiotikum im gereinigten Zustand dar.

Zur Bestimmung der Konstitution des gereinigten Antibiotikums wird die Fraktion I₂₂ mit Trichlormethan extrahiert, wobei ein inaktiver Rückstand und ein sehr aktiver Extrakt, der zur Trockene eingedampft wird (1,3 g), erhalten werden.

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Aus einer Lösung dieses Extraktes in 10 ml Äthylacetat werden Kristalle ausgefällt, die abgenutscht werden, wobei eine kristallisierte Fraktion I* (0,13 g) erhalten wird. Die Mutterlauge wird zur Trockene eingedampft, der Rücfcstand in Äthylacetat aufgenommen und der lösliche Teil mit wässrigem 0,5n-Natriumfaydroxyd behandelt. Die organische Phase wird abgetrennt und mit 5#iger Essigsäure behandelt. Diese Säure überführt basische Substanzen in die wässrige Phase. Diese wässrige Phase wird abgetrennt und eingedampft, wobei eine halbkristalline Fällung erhalten wird, die die Fraktion I» darstellt.

Ci ⁴

Das gereinigte Antibiotikum enthält somit zwei Komponenten in kristallisierter Form (Fraktionen I, und I.). Die Kennzahlen dieser kristallisierten Fraktionen sind nachstehend angegeben.

Fraktion I,

Physikalische Kennzahlen: leicht beigefarbene Kristalle; Schmelzpunkt 155—156⁰C; Drehvermögen <xD = -46°.

Spektralanalyse: Infrarotspektrum (Fig.3): charakteristisehe Banden der Gruppen und Bindungen:

OH, NH, -CO-O- und -CO-NH-

1$ Chromatographie:

• Aminosäuren: Im Hydrolysat werden durch zweidimensionale Chromatographie 4 Flecken gefunden,"von denen zwei identifiziert wurden: Glycin und Threonin. Die beiden anderen Flecken haben auf Cellulose und mit einem Lösungsmittelgemisch aus Butanol, Essigsäure und Wasser im Verhältnis von 12:3:5 und aus Äthylacetat, Pyridin und Essigsäure im Verhältnis von 5:5:1,3 Rf-Werte von 0,26 und 0,29 in einem Fall und von 0,32 und 0,33 im anderen Fall.

Polare Säuren: Hydroxysäuren, Hydroxylgruppen enthaltende Dicarbonsäuren mit einer Kohlenstoffkette von 4 bis 6 C-Atomen*

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R Weinsäure =0,75 (auf Cellulose mit dem Lösungsmittelsystem Butanol-Essigsäure-Wasser 12:3s5) und eine nicht identifizierte polare Säure, die mit Ninhydrin nicht reagiert.

Die Fraktion I-* ist somit ein Peptidester oder Depsi-?eptid von niedrigem Molekulargewicht. Dieses Produkt ist bei einer Temperatur von 280 bis 30Q⁰C flüchtig ohne Zersetzung.

Fraktion I.ϊ

Halbkristalline Substanz, Ninhydrin-positiv, . fl

löslich in verdünnter Essigsäure.

Der Rf-Wert auf Cellulose mit dem gleichen Lösungsmittelsystem Butanol-Essigsäure-Wasser (12:3:5) beträgt 0,35.

Aminosäuren: (identifiziert durch zweidimensionale Chromatographie): Leucin, Isoleucin, Valin, Prolin, Serin, Glycin, Asparaginsäure, Arginin, Lysin und drei nicht identifizierte Säuren^

Die Fraktion I, ist ein Gemisch öder ein Komplex von Dipeptid- und teilweise Depsi-peptidcharakter, da Peptidbindungen und Esterbindungen abwechseln.

Gemeinsame Eigenschaften der Fraktionen I-» und I.t %

Löslich in Äthanol und Methanol, unlöslich in Hexan, geringe Löslichkeit in Chloroform. Es handelt sich um Gemische von Oligopeptiden, Depsipeptiden und Cyclopeptiden.

Wirkung des aus Pseudomonas Rollandi extrahierten Anti-

biotikums -»___^

Die Aktivität des neuen Antibiotikums wurde durch seine Fähigkeit nachgewiesen, das Wachstum eines Stamms von Staphylococcus aureus, der aus der Sammlung des Pasteur-Instituts stammt, zu hemmen. Die Wachstumshemmungstests an dem pathogenen Stamm wurden wie folgt durchgeführt:

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BADORfQiNAL

Nähragar in zwei gleichen Fetrischaien wird auf der gesamten Oberfläche mit einer Suspension von Staphylokokken; geimpft, die durch Überführen einer ösenmenge einer 18 Stunden-Kulturbouillon in 10 ml steriles Wasser erhalten worden ist. Eine der Fetrischaien dient als Kontrolle· Auf die andere werden die zu testenden Fraktionen gelegt, mit denen sterile Papierscheiben getränkt sind. Nach einer Bebrütungsdauer von etwa 16 bis 18 Stunden im Wärmeschrank bei 37⁰C werden gut getrennte Kolonien erhalten, die die gesamte Oberfläche der Kontrollschale bedecken. Bei diesem Test gilt eine antibiotische Substanz als sehr aktiv, wenn die Hemmungszone, in der sich keine pathogenen Mikrobien befinden, um die Filterpapierscheibe größer ist als 5 mm. Sie gilt als aktiv, wenn die Hemnmngszone um die Filterpapierscheibe 5 mm beträgt, und als schwach aktiv, wenn diese Hemntungszone kleiner ist als 5 nm· Die Ergebnisse dieser Versuche sind nachstehend in Tabelle III genannt·

Tabelle III

Getestetes Produkt Aktivität

Methanolextrakt +*^a*

Hallfereinigter Extrakt I
Fraktion I* +

Fraktion I₂ +

Fraktion I^ HM-

Fraktion I₂₂

(β) aktiv, He&mungszone 5 mm

(b) sehr aktiv, Hemsnungszone breiter als 5 wm

Die folgende Tabelle IV zeigt das antibiotische Spektrum der wirksamen Fraktionen, ermittelt an Keimen, die teilweise grampositiv und teilweise gramnegativ sind« Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, daß die gereinigten Fraktionen des neuen Antibiotikums gegen zahlreiche,Keime wirksam sind. Die aktiven Dosen variieren zwischen 0*5

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-13 -

0,06 rag.

w Jl^t* W U, .JU JL. ΙΛ, *J WJ «4 UV^ A'MiW. . - - I I — js

Tabelle IV	Bezeichnung des	Gram	¹II.	^I22	-
	Mikroorganismus	+	+	+
Aktive Fraktionen	Bacillus anthracis	■ -		-	-
Bruceila abortus	-	-	+	Mi
Bacillus brevis		-	+ '	-
Bacillus megatherium. .	+	-	+
Bacillus subtii-ia". ."-'.	+	+	-
Corynebacteriura diphferiae				- -
¹¹. pseudo	+	±	-	Λ.
^H diphteriae	+	ί	+	-
" xerose		mm .	+	- -
Diplococcus pneumoniae	- -	-	+
Klebsiella pneumoniae	+	++
Mycobacterium tuberculosis	-	+	+	-
Neisseria catarhalis.	-	+	±	■ +
Proteus vulgaris			+
Salmonella enteriditis	-	±	+	+
Salmonella paratyphi	—		++
Salmonella typhi	-	+	-	—
Shigella paradysent.	+	+		-
Staphylococcus aureus	+		+
Streptococcus faecalis	+		+
Streptococcus pyogenes

Die akute Toxizität wurde mit dem Methanolextrakt ermittelt, der das rohe Antibiotikum darstellt. Gruppen von je 10 Mäusen mit einem Gewicht von etwa 15 g wurde der Methanolextrakt in abgestuften Dosen von 0,005 bis 4 g/kg intraperitoneal injiziert. Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle V angegeben. Bis zu einer Dosis von 2g/kg ist die Mortalität Null. Die LD₅₀ beträgt 2,8 g/kg.

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	*	10	Nr. der Gruppe von Versuchs tieren	Tabelle	V	Bemerkungen
			1	Injizierte Dosis, ß/kg	Mortalität in
			2	0,005	0
		3	0,05	0
	15	'4	0,10 - - ■ '	0
		Lv. 5	0,25	0
		6 7	0,5	0
		8	0,75 1,00	0 0
		9	1,25	0
	10	1,5	0
	11	2,0	0
	12	2,5	9
	13	2,75	40
	14	3	70	LD
	4	100


5

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Claims

Pat en tan Sprüche

1) Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibiotikums« dadurch gekennzeichnet, daß man

a) den Stamm Pseudomonas Rollandi Nr. CBS 368,68 aerob bei 12 bis 42⁰C, vorzugsweise bei 28 bis 37⁰C, in einem klassischen Kulturmedium, z.B. Nährbouillon, während der Zeit kultiviert, die zum Erreichen der stationären Wachstumsphase des Mikroorganismus notwendig ist, anschließend den gebildeten Mikroorganismus vorzugsweise durch Zentrifugierung oder F_einfiltration abtrennt,

b) die Zellen des. Mikroorganismus vorzugsweise mit m Ultraschall zerreißt, das hierbei erhaltene Mahlgut vorzugsweise durch Gefriertrocknung dehydratisiert, abschließend die wasserfreien Zellen mit Methanol extrahiert und den Extrakt zur Trockene eindampft, wobei der Methanolextrakt der zerrissenen Zellen von Pseudomonas Rollandi erbalten wird, der das rohe Antibiotikum darstellt, das gegebenenfalls gereinigt wird.

2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß nan den Methanolextrakt reinigt, indem man

a) vor oder nach einer zur Entfernung der Lipide vor- *

genommenen Behandlung mit Hexan oder Heptan eine m

Extraktion mit einen chlorierten Lösungsmittel, insbesondere T_richlormethan, Kethylenchlorid oder Triehloressigsäure, vornimmt und hierbei das Antibiotikum im halbreinen Zustand erhält und

b)gegebenenfalls das halbreine Antibiotikum mit Ithanol extrahiert und hierbei einen Trockenextrakt erhält, der das Antibiotikum im gereinigten Zustand darstellt·

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3) Neues Antibiotikum, bestehend aus dem gemäß Anspruch erhaltenen Methanolextrakt des Mikroorganismus-Stammes Pseudomonas Rollandi Nr. CBS 368.68.

4) Neues Antibiotikum, bestehend aus dem halbgereinigten Extrakt, der gemäß Anspruch 2 durch Behandlung des Methanolextraktes mit einem chlorierten Lösungsmittel und mit Hexan oder Heptan erhalten worden ist.

5) Neues Antibiotikum, bestehend aus dem gereinigten Extrakt, der durch Extraktion des halbreinen Extraktes mit Äthanol gemäß Anspruch 2 erhalten worden ist.

/6) Durch Extraktion von Mikroorganismen des Stammes Pseudomonas Rollandi Nr.CBS 638»68 erhaltenes neues Antibiotikum, enthaltend

a) eine aus einem Peptidester oder Depsipeptid von niedrigem Molekulargewicht bestehende Komponente, die in Form von leicht beigefarbenen Kristallen isoliert werden kann, die einen Schmelzpunkt von

155 bis 156⁰C und ein Drehvermögen ccD von -46° haben, und deren Infrarotspektrum die charakteristischen Absorptionsbanden von Gruppen der Formel OH, NH, -CO-O- und -CO-NH- aufweisen, und

b) eine zweite Komponente, die ein Gemisch oder ein Komplex von Dipeptid- und teilweise Depsipeptidcharakter ist, das in halbkristalliner Form isoliert werden kann, Ninhydrin-positiv, in verdünnter Essigsäure löslich ist und auf einer Celluloseplatte mit dem Lösungsmittelsystem Butanol-Essigsäure-Wasser im Verhältnis von 12s3s5 einen Rf-Wert von 0,35 hat,

7) Verwendung des neuen Antibiotikums nach Anspruch 3 bis β als Wirkstoff in pharmazeutischen Zubereitungen in Verbindung mit einem pharmazeutisch ungiftigen Träger«,

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