DE2516615A1 - Neues antibiotikum bn-130 und verfahren zur herstellung desselben - Google Patents

Description

(Die Priorität aus der japanischen Patentanmeldung No. 42267/74 vom 17. April 1974 wird in Anspruch genommen)

Die Erfindung betrifft das neue Antibiotikum BN-130, welches eine starke wachstumshemmende Wirkung auf gram-positive und gram-negative Bakterien sowie auf säurebeständige Bakterien ausübt. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung des neuen Antibiotikums BN-130 durch Züchtung eines Stammes der Gattung Pseudomonas. Zum Gegenstand der Erfindung gehört weiterhin die Abtrennung und Reinigung des neuen Antibiotikums und dessen Verwendung für pharmazeutische Zwecke.

Es sind bereits viele Antibiotika, die für therapeutische Zwecke verwendbar sind, bekannt. Bei dem Versuch, weitere neue und wertvolle Antibiotika zu finden, die gegenüber verschiedenen Arten von Bakterien eine hohe antibakterielle Wirkung haben, wurden verschiedene Bodenproben genommen, aus den Bodenproben Mikro-Organismen isoliert und die Stoff-

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Eingesandte Modelle werden nach 2 Monaten, falls nicht zurückgefordert, vernichtet. Mündlich» Abreden, Insbesondere durch Fernsprecher, bedürfen schriftlicher Bestätigung. — Die in Rechnung gestellten Kosten sind mit Rechnungsdatum ohne Abzug tüllig. — Bei verspäteter Zahlung werden Bankzinsen berechnet

Wechselprodukte untersucht, die bei der Züchtung der isolierten Mikro-Organismen erzeugt werden. Bei diesen Arbeiten konnte ein neuer Mikro-Organismus aus einer Bodenprobe isoliert werden, die bei Nima-machi, Shimane-Prefecture, Japan, aufgenommen worden ist; der neue Mikro-Organismus hat die Bezeichnung "Stamm BN-13O" erhalten. Es konnte bestätigt werden, dass der Stamm BN-13O zur Gattung Pseudomonas gehört.

Wie jetzt gezeigt werden konnte, bildet sich in der Gärbrühe des Stammes BN-13O ein neues Antibiotikum, welches eine stark hemmende Wirkung auf das Wachtstum von gram-positiven und gram-negativen Bakterien sowie auf das vötn säurebeständigen Bakterien besitzt. Es ist jetzt gelungen, dieses neue Antibiotikum aus der Gärbrühe zu isolieren; die isolierte Substanz hat die Bezeichnung "Antibiotikum BN-13O" erhalten.

Gegenstand der Erfindung ist demzufolge die Gewinnung des Antibiotikums BN-13O als reines Produkt oder als Rohprodukt durch Züchtung des Stammes BN-130.

Das Antibiotikum BN-130 weist, wie bereits erwähnt, eine starke antibakterielle Wirkung gegenüber gram-negativen und gram-positiven Bakterien sowie gegenüber säurebeständigen Bakterien auf. Das Antibiotikum ist ein farbloses oder schwach gelb gefärbtes Öl, welches keinen definierten Schmelzpunkt besitzt, in der Nähe von 0° Celsius eine eisähnliche Beschaffenheit annimmt und bei etwa 40° Celsius als Öl vorliegt; das Antibiotikum ist eine saure Substanz und enthält Carboxylgruppen. Das Antibiotikum ist löslich in Methanol, Äthanol, n-Butanol, Aceton, Äthylacetat und Methylisobutylketon sowie schwach löslich in Benzol und Chloroform; unlöslich ist die Substanz in Wasser. Das Antibiotikum zeigt in einprozentiger methanolischer Lösung eine optische

Drehung von t-wl 25 . ,. ,o Das Antibiotikum zeigt eine LOvJ η minus 19.2 .

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positive Reaktion gegenüber Kaliumpermanganat und Jod, jedoch eine nagative Reaktion gegenüber Ninhydrin, Silbernitrat, Sakaguchi-Reagenz und Ferrichlorid. Die Elementar-Analyse zeigt folgende Werte: C = 65,24%; H = 8,79%; N = 4,85% und 0 = 21,12% (Rest). Das molekulare Gewicht des Antibiotikums liegt nach dem Ergebnis der Titrationsmethode bei 520 und nach der Berechnung aus den Dampfdruckwerten des Methylesters der Substanz bei .550. Das Ultraviolettabsorptionsspektrum des Antibiotikums ist in Fig. 1 dargestellt; das Infrarotabsorptionspektrum des Antibiotikums, aufgenommen in einer Kaliumbromidtablette ist in Fig. 2 dargestellt. Bei der Dünnschichtchromatographie an Silikagel unter Verwendung von Äthylacetat-Methanol (Volumenverhältnis 20 : 1) erhält man einen R^-Wert von 0,45; wird dieselbe Dünnschichtchromatographie an Silikagel mit Chloroform-Isopropanol (Volumenverhältnis 9:1) durchgeführt, so erhält man einen R_-Wert von 0,23. Das Antibiotikum BN-130 bildet pharmazeutisch akzeptable Salze.

Das Antibiotikum BN-130 kann in ein Alkalimetallsalz, beispielsweise das NafcLum-, das Kalium- oder das Ammoniumsalz sowie in ein Erdalkalimetallsalz, beispielsweise das Calcium- oder Magnesiumsalz umgewandelt werden, indem man es mit einem Alkalimetallhydroxid oder einem Erdalkolimetallhydroxid neutralisiert.

Das Antibiotikum BN-130 kann durch Umsetzung mit einem Alkanol mit 1-4 Kohlenstoffatomen, zum Beispiel Methanol, Äthanol, Propanol, in der bei der Veresterung von Carbonsäuren üblichen Weise verestert werden. Der Methylester des Antibiotikums BN-130, der durch Umsetzung des Antibiotikums in Form der freien Säure mit Methanol in Gegenwart eines Kondensationskatalysators die konzentrierte

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Schwefelsaure erhalten werdeti kann, kann weiter acetyliert werden, indem man ihn mit Essigsäureanhydrid ansetzt. Der so gewonnene acetylierte Methylester des Antibiotikums BN-130 liegt in Form eines farblosen oder schwach gelb gefärbten kristallinen Pulvers vor.

In den beiliegenden Zeichnungen haben die einzelnen Figuren folgende Bedeutung:

Fig. 1 Kurven der Ultraviolettabsorptionsspektren

von Proben des Antibiotikums BN-130 (in Form der freien Säure), gelöst in Methanol, in 0,1 η HCl-Methanol und in 0,1 η KOH-Methanol;

Fig. 2 den Verlauf des Infrarotabsorptionsspektrums einer Probe des Antibiotikums BN-130 (in Form der freien Säure), tablettiert in Kaliumbromid;

Fig. 3 eine Kurve des Ultraviolettabsorptionsspektrums einer Probe des acetylierten Methylesters des Antibiotikums BN-130, gelöst in Methanol;

Fig. 4 eine Kurve des Infrarotabsorptionsspektrums

einer Probe des acetylierten Methylesters des Antibiotikums BN-130, tablettiert in Kaliumbromid.

Die physikalischen und chemischen Eigenschaften des Antibiotikums BN-130 (in Form der freien Säure) und des acelylierten Methylesters des Antibiotikums BN-130 sind nachfolgend beschrieben.

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(I) Eigenschaften des Antibiotikums BN-130 (in Form der freien Säure)

(1) Aussehen: farbloses oder schwach gelb gefärbtes

Öl.

(2) Elementaranalyse: C = 65,24%; H - 8,79%

N = 4,85%; 0 = 21,12%

(Rest)

Andere Elemente ausser Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff und Sauerstoff konnten bei der Elmentaranalyse nicht festgestellt werden.

(3) Molekulargewicht: Das Antibiotikum BN-130 weist ein Molekulargewicht von 520 auf, wenn die Bestimmung mit Hilfe der Titrationsmethode erfolgt, jedoch ein Molekulargewicht von 550, wenn man dasselbe aus der Dampfdruckbestimmung des Methylesters des Antibiotikums BN-130 berechnet. .

(4) Schmelzpunkt: Das Antibiotikum besitzt keinen definierten Schmelzpunkt. Das Antibiotikum BN-130 wird beim Abkühlen bei etwa 0 Celsius eisähnlich; bei etwa 40° Celsius liegt es als Öl vor.

(5) Spezifische optische Drehung: fdj j:⁵ -19,2°

(c=l, Methanol)

(6) Ultraviolettabsorptionsspektrum: Die Spektren des Antibiotikums BN-130 in Lösung in Methanol, in 0,1 η HCl-Mehtanol sowie in 0,1 η KOH-Methanol sind in Fig. 1 dargestellt. Das Antibiotikum liegt in den Lösungsmitteln jeweils in einer Konzentration von 10 mcg/ml vor. Die Spektren sind charakterisiert

1% durchAbsorptionsmaxima bei 22 7 π\μ (E₁ 860) in Methanol lösung; bei 227 πιμ (E^ _cm 800) in 0,1 η HCl-Methanollösung; und bei 233 mu (E^ 680) in 0,1 η KOH-Methanollösung.

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(7) Infrarotabsorptionsspektrum: Das Spektrum des Antibiotikums BN-130, tablettiert in Kaliumbromid, ist in Fig. 2 dargestellt; das Spektrum ist charakterisiert durch Absorptionspeaks bei 3380, 2940, 1700, 1640, 1550, 1450, 1400, 1380, 1330, 1230, 1150, 1100, 1060, 990, 890 and 780.

(8) Löslichkeit in Lösungsmitteln: Leicht löslich in Methanol, Äthanol, n-Butanöl, Aceton, Äthylacetat und Methylisobutylketon; schwach löslich in Benzol und Chloroform; unlöslich in Wasser.

(9) Farbreaktionen: Positiv gegenüber Kaliumpermanganat und Jod, negativ gegenüber Ninhydrin, Silbernitrat, Sakaguchi-Reagenz und Ferrichlorid.

(10) Filterpapier-Elektrophorese: Das Antibiotikum BN-130 wandert nicht unter sauren Bedingungen (pH 1,9 bei 3000 Volt; Elektrophoresedauer 10 Minuten), es wandert jedoch um 1,8 cm auf die Anode zu unter alkalischen Bedingungen (pH 8,1 bei 300 Volt, Elektrophoresedauer 2 Stunden), was anzeigt, dass das Antibiotikum BN-130 eine saure Substanz ist.

(11) R -Wert bei der Silikagel-Dünnschichtchromatographie: Es ergibt sich ein R_-Wert von 0,45, wenn mit Äthylacetat-Methanol (Volumenverhältnis 20:1) entwickelt wird, und ein R--Wert von 0,23, wenn mit Chloroform-Isopropanol (Volumenverhältnis 9:1) entwickelt wird.

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(II) Eigenschaften des acelylierten Methylesters des Antibiotikums BN-130

(1) Aussehen: farbloses bis schwach gelb gefärbtes kristallines Pulver.

(2) Elementaranalyse: C= 64,43%; H = 8,40%;

N = 4,40%; 0 = 22,77% (Rest)

(3) Molekulargewicht: Der acetylierte Methylester des Antibiotikums BN-130 weist ein Molekulargewicht von 600 bei Bestimmung nach der Dampfdruckmethode auf.

(4) Schmelzpunkt: 85 - 87° Celsius.

(5) Spezifische optische Drehung: M^⁵ -16,2°

(c=l, Mehtanol)

(6) Ultraviolettabsorptionsspektrum: das Spektrum des acetylierten Mehtylesters des Antibiotikums BN-130 in Lösung in Methanol ist in Fig. 3 dargestellt. Die Substanz liegt in der Lösung in einer Konzentration von 10 mcg/ml vor. Das Spektrum ist charakterisiert

-ic/

durch ein Absorptionsmaximum bei 22 7 mu (Ε.Γ 790).

^{c r} l cm

(7) Infrarotabsorptionsspektrum: Das Spektrum des acetylierten Mehtylesters des Antibiotikums BN-130, tablettiert in Kaliumbromid ist in Fig. 4 dargestellt; das Spektrum weist charakterische Absorptionspeaks bei 3450, 3340, 2980, 2940, 1730, 1700, 1640, 1610, 1570, 1450, 1400, 1330, 1260, 1250, 1160, 1130, 1090, 1070, 1040, 990, 890 und 790 cm"¹ auf.

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(8) Löslichkeit in Lösungsmitteln: Leicht löslich in Methanol, Äthanol, n-Butanol, Aceton, Äthylacetat und Methylisobutylketon; löslich in Chloroform, schwach löslich in Benzol und unlöslich in Petroläther und Wasser.

(9) Farbreaktionen: positive Reaktion gegenüber Kaliumpermanganat und Jod; negative Reaktion gegenüber Ninhydrin, Silbernitrat, Sakaguchi-Reagenz und Ferrichlorid.

(10) Filterpapier-Elektrophorese: Der acetylierte Methylester bewegt sich weder unter alkalischen Bedingungen (pH 8,1 bei 300 Volt, Elektrophoresedauer 2 Stunden) noch unter sauren Bedingungen (pH 5,1 bei 300 Volt, Elektrophoresedauer 2 Stunden) von dem Ursprungsfleck weg.

(11) R_f-Wert bei der Silikagel-Dünnschichtchromatographie: Der R--Wert liegt bei 0,68, wenn mit Äthylacetat-Methanol (Volumenverhältnis 20:1) entwickelt wird und bei 0,41, wenn mit Chloroform-Isopropanol (Volumenverhältnis 9:1) entwickelt wird.

Das Antibiotikum BN-130 gemäss vorliegender Erfindung weist eine starke antibakterielle Wirkung auf, wie deutlich aus dem antibakteriellen Wirkungsspektrum der Substanz hervorgeht, welches in der folgenden Tabelle 1 dargestellt ist. Die Mindesthemmkonzentration des Antibiotikums BN-130 gegenüber verschiedenen Bakterien wurde in verschiedenen Züchtungsmedien bestimmt, die in Tabelle 1 angegeben sind; die Bebrütung erfolgte jeweils für 16 Stunden bei einer Temperatur von 37° Celsius.

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Mindesthemmkonzentration

Testorqanismen

Bacillus subtilis ATCC 6633 Sarcina lutea
Staphylococcus aureus 2O9P

Staphylococcus aureus 52-34 resistent gegen Erythromycintetracyclin

Escherichia coli
Pseudomonas aeruginosa Klebsiella pneumonia Proteus vulgaris
Mycobacterium smegmatis 607 Candida albicans

BN-130	Bebrütunqsmedien
>100	1
>100	1
1.5	1
0.025	1
3.1	1
>100	1
12.5	1
0.3	1
6.25	2
>100	3

Bemerkungen zur vorstehenden Tabelle:

(1) Das Medium 1 ist ein Bouillon-Medium; Medium 2 . ist ein Glycerin-Bouillon-Medium; Medium 3 ist ein Glucose-Pepton-Medium.

(2) Die Werte der Mindesthemmkonzentration wurden nach der Standard-Brühenverdünnungsmethode bestimmt,

Es konnte beobachtet werden, dass das Natriumsalz des Antibiotikums BN-130 eine antibakterielle Wirkung zeigt, die praktisch genauso hoch ist wie die des Antibiotikums BN-130 in Form der freien "Säure.

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Das Antibiotikum BN-130 gemäss vorliegender Erfindung zeigt eine hohe antibakterielle Wirkung gegenüber verschiedenen Bakterien und insbesondere gegenüber Staphylococcus aureus, wie dies aus der vorstehenden Tabelle hervorgeht; das erfindungsgemässe neue Antibiotikum besitzt nur eine geringe Toxizität, was sich aus der Tatsache ergibt, dass alle Mäuse überleben konnten, nachdem ihnen eine Dosis von 400 mg Antibiotikum BN-130 (in Form der freien Säure) pro kg Körpergewicht intraperitoneal verabreicht worden war; die Mäuse überlebten auch, wenn ihnen oral Mengen bis zu 1000 mg Antibiotikum BN-130 pro kg Körpergewicht verabreicht wurden, um die akute Toxizität des Antibiotikums BN-130 zu bestimmen. Das Antibiotikum BN-130 gemäss vorliegender Erfindung ist infolgedessen ein wertvollen therapeutisches Mittel zur Behandlung verschiedener, durch Bakterien hervorgerufener Infektionen; es ist ausserdem für die Sterilisierung chirurgischer Instrumente und Materialien in Verbindung mit einer mechanischen Reinigung derselben brauchbar.

Zur therapeutischen Behandlung bakterieller Infektionen kann das erfindungsgemässe Antibiotikum BN-130 oral oder parenteral, beispielsweise durch intraperitoneale, intravenöse, subkutane oder intramuskuläre Injektion, verabreicht werden. Für die parenterale Verabreichung kann das erfindungsgemässe Antibiotikum in üblichen Dosierungsformen verwendet werden, beispielsweise in Form einer sterilisierten Lösung in einem pharmazeutisch akzeptablen organischen Lösungsmittel wie Äthanol. Eine sterile wässrige Lösung des Natriumsalzes des Antibiotikums BN-130 kann für die parenterale Verabreichung verwendet werden. Für die orale Verabreichung kann das erfindungsgemässe Antibiotikum ebenfalls in üblichen Dosieruhgsformen

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bekannter Art verwendet werden, beispielsweise in Form von Pulvern, Kapseln, Tabletten, Suppositorien, Salben, Sirupen etc., und zwar auch zusammen mit bekannten pharmazeutisch akzeptablen Trägermaterialien. Die Höhe der im Eilzelfall anzuwendenden Dosis des erfindungsgemässen Antibiotikums hängt von der Art der bakteriellen Infektionen, die behandelt werden soll, ab und kann experimentell vom Fachmann in bekannter Weise bestimmt werden, so wie dies bei bekannten Antibiotika wie Streptomycin, Kanamycinen u.a. durchgeführt wird. Der weiter vorn erwähnte acetylierte Methylester des Antibiotikums BN-13O weist praktisch keine antibakterielle Wirkung auf.

Gemäss einer ihrer Ausführungsformen betrifft die vorliegende Erfindung auch ein pharmazeutisches Mittel, welches zur Behandlung bakterieller Infektionen bei lebenden Tieren geeignet ist und welches aus einer therapeutisch wirksamen Menge des Antibiotikums BN-13O und/oder einem pharmazeutisch akzeptablen Salz dieses Antibiotikums in Kombination mit einem pharmezeutisch akzepteblem Trägermaterial besteht. Zur Behandlung bakterieller Infektionen bei lebenden Tieren wird dieses Mittel in ausreichender Menge verabreicht.

Wie weiter vorn bereits angedeutet, wird das Antibiotikum BN-13O gemäss vorliegender Erfindung in der Gärbrühe eines neuen Mikroorganismus gebildet und angereichert, der als Stamm BN-13O bezeichnet worden ist und der zur Gattung Pseudomonas gehört. In einer ihrer weiteren Ausführungsformen betrifft die vorliegende Erfindung auch dieses Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums BN-13O. Dieses Verfahren besteht in der Züchtung eines, das Antibiotikum BN-13O produzierenden Stammes der Gattung

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Pseudomonas in einem geeigneten Kulturmedium, welches assimilierbaren Kohlenstoff und Stickstoff enthält. Die Züchtung erfolgt unter aeroben Bedingungen über einen Zeitraum hinweg, dass sich eine ausreichende Menge des Antibiotikums BN-130 in dem Kulturmedium bilden und ansammeln kann; anschliessend wird das Antibiotikum BN-130 aus der Brühe isoliert. Zur Herstellung des erfindungsgemässen Antibiotikums BN-130 kann jeder beliebige Stamm der Gattung Pseudomonas verwendet werden, vorausgesetzt dass dieser Stamm die Fähigkeit besitzt, das Antibiotikum BN-130 zu bilden. Ein geeignetes Beispiel für einen das Antibiotikum BN-130 bildenden Stamm der Gattung Pseudomonas, welcher für das erfindungsgemässe Verfahren verwendet werden kann, ist der weiter vorn erwähnte Stamm BN-130 der Gattung Pseudomonas. Dieser Stamm BN-130 wurde am 17. Januar 1974 bei der autorisierten japanischen Hinterlegungsstelle "Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology", Inage, Chiba-City, Japan, unter der Nummer FERM-P 2443 hinterlegt. Der Stamm BN-130 wurde auch bei der "American Type Culture Collection", Washington D.C, U.S.A., hinterlegt und erhielt die ATCC-Nummer % 4 1 h )■ ■

Die Kultureigenschaften und die taxonomischen Eigenschaften des Stammes BN-130 werden im folgenden beschrieben.

(I) Morphologische Eigenschaften

Stäbchen, 0,6 bis 0,8 χ 1,5 bis 3,0 Mikron auf Nähragar. Beweglich mit polarer einfädiger Geißel. Sporen werden nicht gebildet. Gram-negativ.

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(II) Züchtungseigenschaften

(1) Nähragar-Kolonien (bebrütet bei 28°Celsius):

Die Kolinien frisch isolierter Stämme sind hellbraun und rauh, faltig, trocken und zusammenhängend. Diffundierende Pigmente werden nicht gebildet. In Glucose-Medien wächst der Stamm kräftig. Die Kultur riecht faulig.

(2) Nährbrühe (bebrütet bei 28° Celsius):

Es wird ein dünnes und flexibles Oberflächenwachstum beobachtet.

(3) Nähr-Gelatine (bebrütet bei 23° Celsius): Das Medium wird verflüssigt.

(III) Physiologische Eigenschaften

(1) Reduktion von Nitrat: Positiv nach dreitägigem Bebrüten bei 28° Celsius (eine Nitrat-Konzentration in der Grössenordnung von 0,2% ist für die Reduktion des Nitratesjgeeignet).

(2) Denitrifizierung: Positiv nach dreitägigem Bebrüten bei 28 Celsius (eine Nitrat-Konzentration in der Grössenordnung von 0,2% ist für die Denitrifizierung geeignet).

(3) Methylrot-Test: Negativ bei drei- oder fünftägigem Bebrüten bei 28° Delsius.

(4) Voges-Proskauer-Test: Negativ bei drei- oder fünftägigem Bebrüten bei 28° Celsius.

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(5) Bildung von Indol: Negativ bei drei- oder fünftägigem Bebrüten bei 28 Celsius,

(6) Bildung von Schefelwasserstoff: Negativ bei Prüfung mit Hilfe der Bleiacetatpapier-Methode.

(7) Hydrolyse von Stärke: Positiv bei dreitägigem Bebrüten bei 28° Celsius.

(8) Bildung von Pigment: Nicht beobachtet auf King-Medium.

(9) Oxidase-Test: Positiv bei zweitägigem Inkubieren bei 28 Celsius.

(10) Catalase-Test: Positiv.

(11) Wachstumstemperaturen: Bei 20 bis 37° Celsius kommt es zu einer Reproduktion der Zellen des Stammes BN-130, jedoch fehlt diese Zellreproduktion sowohl bei 5° Celsius als auch bei 42° Celsius.

(12) Oxidations-Fermentations-Test (nach der Huhg-Leifson-Methode): Der Stamm BN-130 kann unter anaeroben Bedingungen nicht wachsen, bildet jedoch saure Substanzen aus Glucose unter aeroben Bedingungen.

(13) Ausnutzung von Kohlenstoffquellen für das Wachstum: Der Stamm kann Glucose, Maltose, Stärke oder Cellobiose als alleinige Kohlenstoffquellen für sein Wachstum verwenden, kann jedoch nicht Galactose, L-Arabinose, 2-Ketogluconsäure, Glycolat,

Propylenglycol, p-HydrOXybenzaesäure, β-Alanin oder L-Histidin ausnutzen.

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(14) Empfindlichkeit gegenüber Antibiotika: Empfindlich gegenüber Tetracyclin, Nalidixinsäure, Colistin und Polymixin. Massig empfindlich gegenüber Chloramphenicol, Streptomycin und Kanamycin. Resistent gegenüber Penicillin, Aminobenzylpenicillin und Cephaloridin.

Vergleicht man den Stamm BN-13O mit den vorstehend aufgeführten mikrobiologischen Eigenschaften mit bekannten Stämmen mit ähnlichen Eigenschaften, so kommt man zu folgendem Schluss:

(1) Es darf angenommen werden, dass der Stamm BN-130 zur Gattung Pseudomonas gehört, und zwar im Hinblick auf die Tatsache, dass es sich um gram-negative Stäbchen handelt und dass er morphologisch dadurch charakterisiert ist, dass er keine Sporen bildet, sich jedoch mit polarer Geißel bewegt sowie im Hinblick auf die Tatasche, dass kein Energiestoffwechsel vom Gärtyp erfolgt.

(2) Der Stamm BN-130 muss der Gruppe Pseudomonas stutzeri zugerechnet werden, und zwar im Hinblick auf die Tatsache, dass er faltige Kolonien bildet und dass er eine Denitrifizierung von Nitratverbindungen sowie eine Hydrolyse von Stärke hervorruft.

(3) Es erscheint sinnvoll, den Stamm BN-130 des Spezies Pseudomonas stutzeri zuzurechnen, weil der Stamm BN-130 in vielen Punkten dem bekannten idealen^Phänotyp von Pseudomonas stutzeri gleicht, der mit Bezug auf seine polare einfädige Geißel, seine Fähigkeit zur Denitrifizierung sowie die Ausnutzung von 11 Kohlenstoffverbindungen

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definiert worden ist,und zwar in der Klassifizierung der Gattung Pseudomonas von Stanier et al.in dem Werk "Journal of General Microbiology" Bd. 43, Seite 159 (1966) sowie in der Klassifizierung der Pseudomonas stutzeri-Gruppe durch Palleroni et al. in "Journal of General Microbiology" Bd. 60, Seite 215 (1970); jedoch unterscheidet sich der Stamm BN-130 ein wenig von dem bekannten idealen Phänotyp P. stutzeri hinsichtlich der Ausnutzung von Cellobiose, Propylenglycol und Glycolat. Es erscheint infolge dessen unrealistisch, den Stamm BN-130 einer anderen Spezies als P. stutzeri zuzuordnen.

(4) Die Empfindlichkeit gegenüber Antibiotika des Stammes BN-130 stimmt mit der von P. stutzeri überein, wenn man den Bericht von Yabu-uchi et al in "Media Circle" Bd. 16, Seite 6 (1971) heranzieht.

Aufgrund des vorstehenden Vergleiches kann gesagt werden, dass der Stamm BN-130 ein neuer Stamm der bekannten Spezies Pseudomonas stutzeri ist und von den anderen Stämmen dieser Spezies zu unterscheiden ist. Der Stamm BN-130 ist infolge dessen als Pseudomonas stutzeri BN-130 bezeichnet worden.

Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums BN-130, welches darin besteht, dass man einem das Antibiotikum BN-130 erzeugenden Stamm von Pseudomonas stutzeri oder insbesondere Pseudomonas stutzeri BN-130, idenfiziert als FERM-P 2443, in einem geeigneten Kulturmedium, welches assimilierbaren Kohlenstoff und Stickstoff enthält, unter aeroben Bedingungen züchtet, bis sich das Antibiotikum BN-130 in der Kulturbrühe gebildet und angesammelt hat, so dass es aus dieser abgetrennt werden kann.

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Für die Bildung des Antibiotikums BN-130 kann ein dieses Antibiotikum bildender Stamm der Gattung Pseudomonas, insbesondere der Stamm BN-130 (identifiziert als FERM-P 2443) in bekannter Weiee unter aeroben Bedingungen in einem geeigneten Kulturmedium, welches Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, die als Nährstoffe für übliche Mikroorganismen bei der Züchtung verwertbar sind, gezüchtet werden. Glucose, Stärke,Stärkesirup, Melasse u.a. sind beispielsweise brauchbare Kohlenstoffquellen. Sojabohnenmehl, lösliches Pflanzeneiweiß, Maisweichwasser, Pepton, Fleischextrakt und andere geeignete organische Stickstoffverbindungen sowie anorganische Stickstoffverbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Natriumnitrat u.a. können als Stickstoffquellen herangezogen werden. Falls erforderlich, können dem Kulturmedium auch anorganische Salze wie Magnesiumsulfat, Calciumcarbonat etc. zugefügt werden. Weiterhin können dem Kulturmedium Vitamine und/oder bekannte schaumverhütende oberflächenaktive Mittel zugesetzt werden, falls dies erforderlich erscheint. Die Züchtung des Stammes BN-130 kann mit Hilfe jeder beliebigen, in Flüssigkeit ablaufenden Methode durchgeführt werden. Die Schüttelzüchtung und insbesondere die Kultivierung in der Flüssigkeit unterjsubmersen aeroben Bedingungen eignen sich besonders gut genau wie bei der Herstellung bekannter Antibiotika. Die Züchtung bzw. Kultivierung des Stammes BN-130 wird vorzugsweise bei einer Temperatur von 25 und 35 Celsius über einen Zeitraum von 40 bis Stunden durchgeführt. Das Antibiotikum BN-130 wird hauptsächlich in der flüssigen Phase der Kulturbrühe gebildet und angesammelt.

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Zur Prüfung des Antibiotikums BN-130 kann folgende Methode angewandt werden: Als Basis für den Versuch wurde ein Kulturmedium verwendet, welches 1,0% Pepton, 0,5% Fleischextrakt, 0,25% NaCl und 2% Agar enthielt (bei dem Agar handelte es sich um "Penassay Agar", das ist ein Handelsprodukt, welches von der Firma Kyo-ei Seiyaku Co., Japan, vertrieben wird.) Als Mikroorganismus wurde bei dem Versuch die bekannte Spezies Staphylococcus aureus 2O9P eingesetzt. Bei dieser Versuchs- bzw. Prüfmethode kann bei einer Konzentration des Antibiotikums BN-130 von 5 mcg/ml bis 1.000 mcg/ml das Verhältnis zwischen Logarithmus der Konzentration und Durchmesser der Hemmzone linear aufgetragen werden, so dass sich die Hemmzone mit einem Durchmesser von 20 bis 36 mm darstellt (bestimmt nach der PapierScheibenmethode).

Das Antibiotikum BN-130, welches bei der Züchtung des Stammes BN-130 erhalten wird, liegt vorwiegend in der flüssigen Phase der Kulturbrühe vor und kann aus dieser abgetrennt werden, indem man sich die vorstehend aufgeführten physikalischen und chemischen Eigenschaften desselben zunutze macht. Die folgende Methode eignet sich zur Abtrennung des Antibiotikums BN-130 aus der Kultur. Zunächst wird die Kulturbrühe, die als aktive Antibiotikum BN-130 enthält, von den festen Bestandteilen durch Filtrieren oder Zentrifugieren befreit; das so erhaltene Brühenfiltrat wird durch Zugabe von Chlorwasserstoffsäure oder Schwefelsäure angesäuert. Das angesäuerte Brühenfiltrat wird mit einem mit Wasser nicht mischbarem organischen Lösungsmittel wie Äthylacetat, Butylacetat, n-Butanol oder Methylisobutylketon extrahiert; der organische Extrakt wird unter vermindertem Druck eingedampft, wobei man das Antibiotikum BN-130 als Rohprodukt erhält. Es ist auch möglich, die Kulturbrühe direkt durch Zugabe von

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Chlorwasserstoffsäure oder Schwefelsäure anzusäuern, so dass sich ein Niederschlag bildet, der das gewünschte aktive Antibiotikum BN-130 enthält. Der Niederschlag wird abfiltriert und anschliessend mit einem organischen Lösungsmittel wie Aceton oder Methanol extrahiert. Der so gewonnene Extrakt wird unter vermindertem Druck eingedampft, wobei man wiederum das Antibiotikum BN-130 als Rohprodukt erhält. Dieses Rohprodukt kann weiter gereinigt werden, indem man es über Silikagel oder Sephadex LH-20 (Handelsprodukt der Firma Pharmacia Co., Schweden) oder Aktivkohle chromatographiert und/oder einem Gegenstrom-Verteilungsverfahren mit Äthylacetat und Benzol unterwirft. Auf diese Weise erhält man das Antibiotikum BN-130 als farbloses Öl. Prüft man dieses farblose Öl mit Hilfe der Dünnschichtchromatographie an Silikagel unter Verwendung verschiedener Lösungsmittelsysteme, so zeigt sich, dass das farblose Öl einen Einzelfleck bei der Entwicklung mit allen Lösungsmittelsystemen ergibt, was beweist, dass das farblose Öl das reine authentische Antibiotikum BN-130 ist.

Um das erfindungsgemässe Antibiotikum BN-130 klar von bekannten Antibiotika, die von verschiedenen Pseudomonas-

Arten erzeugt werden, zu unterscheiden, wurden die antibakterielle Wirkung und die chemischen Eigenschaften des Antibiotikums BN-130 mit denen von bekannten Antibiotika verglichen. Dabei wurde festgestellt, dass Pseudomonsäure und mit dieser verwandte Verbindungen (vergleiche die vorveröffentlichte japanische Patentanmeldung No. 8992/73) dem erfindungsgemässen Antibiotikum BN-130 ähnlich sind. Es konnte dabei aber auch festgestellt werden, dass Pseudominsäure und die mit dieser verwandten Verbindungen keinen Stickstoff im Molekül enthalten und damit von dem Antibiotikum BN-130 deutlich verschieden sind, welches

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Stickstoff im Molekül enthält. Es konnte weiterhin festgestellt werden, dass das erfindungsgemässe Antibiotikum BN-130 mit keinem der bekannten Antibiotika übereinstimmt, die von Bakterien und durch Actinomyceten gebildet werden. Infolgedessen muss das Antibiotikum BN-130 als ein neues Antibiotikum angesehen werden.

Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.

Beispiel 1

20 Sakaguchi-Kolben mit einem Fassungsvermögen von 500 ml wurden jeweils mit 100 ml eines flüssigen Kulturmediums beschickt, welches aus 2% Glucose und 2% gepulverter Bouillon bestand; die Kolben wurden mit Baumwollstopfen verschlossen; der Inhalt der Flaschen wurde dann durch 10 Minuten dauerndes Erhitzen auf 120° Celsius unter Druck sterilisiert. Anschliessend wurde in jedem Kolben das sterilisierte Kulturmedium mit der in einer Schlinge enthaltenen Menge einer Schrägbodenkultur von Pseudomonas stitzeri BN-130 (identifiziert als PERM-P 2443) geimpft. Das geimpfte Medium wurde bei 32° Celsius 3 Tage unter Schütteln bebrütet, wodurch man 1,8 1 einer Kulturbrühe erhielt, die 50 mcg/ml Antibiotikum BN-130 enthielt.

Die Kulturbrühe wurde sterilisiert, indem man 10 Minuten auf 100 Celsius erhitzte; anschliessend wurde durch Zugabe von Chlorwasserstoffsäure auf pH 2 eingestellt. Die angesäuerte Brühe wurde mit 500 ml Äthylacetat extrahiert; der Äthylacetat-Extrakt wurde danach unter vermindertem Druck eingeengt. Die so gewonnene konzentrierte Lösung wurde durch eine Kolonne mit einem Fassungsvermögen von 80 ml, die mit Silikagel gefüllt war, geleitet; das Silikagel war mit Äthylacetat imprägniert worden. Die

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Kolonne wurde anschliessend mit Äthylacetat eluiert und das Eluat wurde in 10 ml-Fraktionen aufgefangen. Die aktiven Fraktionen 12 bis 23 wurden vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft, wobei 80 mg eines gelb gefärbten Öles erhalten wurden. Die 80 mg des Öles wurden in 1 ml Äthylacetat aufgenommen und die gewonneneLösung wurde durch eine Kolonne geleitet, die ein Fassungsvermögen von 50 ml hatte und mit "Sephadex LH-20" gefüllt war (das ist ein Handelsprodukt für die Gel-Filtration, welches von der Firma Pharmacia Co., Schweden, vertrieben wird und aus Dextran besteht); die Kolonnenfüllung war imprägniert und gequollen mit Äthylacetat. Die Kolonne wurde mit Äthylacetat eluiert und das Eluat wurde in 7 ml-Fraktionen aufgefangen. Die aktiven Fraktionen 13 bis 19 wurden vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft; auf diese Weise erhielt man 38 mg des Antibiotikums BN-130 (in Form der freien Säure) als farbloses Öl.jjd]^⁵ -19,2° (c=l, Methanol).

Beispiel 2

Ein Kulturmedium (15 1), welches 0,5% Glucose, 2% lösliche Stärke, 1% Pepton, 0,7% Fleischextrakt, 0,1% MgSO₄.7HpO und 0,03% Silikonöl als Antischaummittel enthielt, wurde in einem 30 1-Tank als Gärbehälter gegeben und durch 10 Minuten dauerndes Erhitzen auf 120° Celsius sterilisiert und anschliessend auf Umgebungstemperatur abgekühlt. Das sterilisierte Medium wurde mit einer Impfkultur (200 ml) des Stammes BN-130 geimpft, welcher 2 Tage in 2 Sakaguchi-Kolben -mit einem Kulturmedium der vorstehend angegebenen Zusammensetzung bebrütet worden war. Das geimpfte Medium wurde bei 30° Celsius 2 Tage unter Schütteln und Belüftung bebrütet (die Schüttelgeschwindigkeit betrug 240 Umdrehungen pro Minute und die Belüftungsgeschwindigkeit lag bei 15 1 pro Minute).

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Man erhielt auf diese Weise 13 1 einer Kulturbrühe, welche 100 mcg/ml des Antibiotikums BN-130 enthielt.

Die Kulturbrühe wurde sterilisiert, indem man 10 Minuten auf 100 Celsius erhitzte; anschliessend wurde die Brühe durch Filtrieren von festen Materialien befreit. Das so gewonnene Brühenfiltrat wurde durch Zugabe von Chlorwasserstoffsäure auf pH 1,5 eingestellt und anschliessend mit 5 1 Methylisobutylketon unter Rühren vermischt, um die aktive Substanz BN-130 zu extrahieren. Die Methylisobutylketon-Schicht (der Extrakt) wurde von der wässrigen Schicht abgetrennt und mit 5 1 alkalisch gemachtem Wasser, welches durch Zugabe von wässrigem Natriumhydroxid auf pH 10 eingestellt worden war, geschüttelt, so dass die aktive Substanz BN-130 in wässrige Schicht übergeführt wurde. Die wässrige Schicht wurde anschliessend von der organischen Schicht abgetrennt, durch Zugabe von Chlorwasserstoffsäure auf pH 1,5 eingestellt und danach erneut mit 2 1 Methylisobutylketon unter Schütteln extrahiert. Die Methylisobutylketon-Schicht (der Extrakt), der so erhalten worden war, wurde von der wässrigen Schicht abgetrennt und durch eine Kolonne mit 50 g permiger Chromatographier-Aktivkohle, die zuvor mit Methylisobutylketon imprägniert worden war, geleitet. Die Kohlekolonne wurde zunächst mit Methylisobutylketon und dann mit Aceton gewaschen und anschliessend mit 0,1 η Ammonial-70%igem wässrigem n-Propanol (das heisst einer Mischung aus 70 Volumenprozent n-Propanol und 30 Volumenprozent Wasser, welches 0,1 η Ammoniak enthielt) eluiert, so dass die aktive Substanz BN-130 von der Kohle desorbiert wurde. Das Eluat wurde in 100 ml-Fraktionen aufgefangen und die aktiven Fraktionen 2 bis 6 wurden vereinigt; diese ergaben ein Gesamtvolumen von 500 ml, welches durch Einengen unter vermindertem Druck auf 50 ml verringert wurde. Die konzentrierte Lösung wurde

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durch Zugabe von Chlorwasserstoffsäure auf pH 1,5 eingestellt und anschliessend mit 30 ml Äthylacetat extrahiert, um die aktive Substanz, d.h. das Antibiotikum BN-130 zu isolieren. Die Äthylacetat-Phase (der entstandene Extrakt) wurde unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt, wobei man 800 mg des Antibiotikums BN-130 als teilweise gereinigtes Produkt in Form eines schwach gelben Öles erhielt. Dieses Öl wurde in 3 ml eines Lösungsmittelgemisches aus Benzol und Aceton (Volumenverhältnis 5:2) gelöst und die so gewonnene Lösung wurde durch eine Kolonne mit einem Fassungsvermögen von 80 ml, die mit Silikagel gefüllt war, welches mit einer weiteren Menge desselben Lösungsmittelgemisches imprägniert worden war, geleitet. Die Silikagel-Kolonne wurde mit dem genannten Lösungsmittelgemisch gewaschen und dann der graduellen Chromatographie unterworfen, wobei die Konzentration des Acetons in dem als Entwicklungslösungsmittel benutzten Lösungsmittelgemisch stufenweise erhöht wurde. Das Eluat wurde in 15 ml-Fraktionen aufgefangen. Die aktiven Fraktionen 55 bis 62, die das Antibiotikum BN-130 enthielten, wurden vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt; man erhielt auf diese Weise 320 mg des reinen Antibiotikums BN-130 als farbloses Öl.[cQ^⁵ -19,2° (c=l, Methanol).

Beispiel 3

Ein Kulturmedium (300 1), welches aus 0,5% Glucose, 2% löslicher Stärke, 2 % entfettetem Sojabohnenmehl, 1% Maisweichwasser, 0,1% MgSO₄-TH₃O und 0,01% Siliconöl als Antischaummittel bestand, wurde in einen 570 1 Tank als Bebrütungsgefäss gegeben und in diesem durch Erhitzen auf 120 Celsius für 30 Minuten sterilisiert und schliesslich auf Umgebungstemperatur abgekühlt. Das sterilisierte Medium wurde mit einer Impfkultür (15 1) des Stammes BN-130

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geimpft, die gewonnen worden war, indem man zuvor eine Ansatzkultur des Stammes BN-13O in derselben Menge Kulturmedium wie in Beispiel 2 einen Tag lang bebrütet hatte. Das geimpfte Medium wurde 2 Tage bei 28 Celsius unter Belüftung und unter Schütteln bebrütet (die Belüftungsgeschwindigkeit betrug 300 1 pro Minute und die Schüttelgeschwindigkeit lag bei 180 Umdrehungen pro Minute); man erhielt auf diese Weise 280 1 einer sehr viskosen Kulturbrühe, die das Antibiotikum BN-130 in einer Menge von 150 mcg/ml enthielt.

Die Kulturbrühe wurde sterilisiert, indem man bei 100°Celsius 10 Minuten erhitzte; anschliessend wurde abgekühlt und mit 90 1 Wasser versetzt. Die verdünnte Kulturbrühe wurde durch Zugabe von Chlorwasserstoffsäure auf pH 1,5 eingestellt und mit 30 kg eines Filtrierhilfsmitteis unter Rühren versetzt. Die Mischung wurde dann filtriert, wobei man 70 kg eines feuchten Filterkuchens erhielt. Dieser Kuchen wurde mit 60 1 Methanol versetzt. Die Mischung wurde durch Zugabe von wässrigem Natriumhydroxid auf pH 7 eingestellt. Durch zweistündiges Rühren ging die aktive Substanz aus der Mischung in die Methanol-Schicht über. Die Mischung wurde filtriert, wobei man zuerst den methanolischen Extrakt als Filtrat erhielt. Der so gewonnene Filterkuchen wurde erneut mit 60 1 Methanol unter Rühren vermischt und die Mischung wurde durch Zugabe von Natriumhydroxid auf pH 7 eingestellt und wiederum 2 Stunden gerührt. Die Mischung wurde anschliessend filtriert, so dass man einen zweiten methanolischen Extrakt als Filtrat erhielt. Der erste und der zweite methanolische Extrakt wurden vereinigt und auf ein Volumen von 1,5 1 eingeengt, indem man das Lösungsmittel unter vermindertem Druck verdampfte. Die so gewonnene konzentrierte Lösung wurde durch Zugabe von

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Chlorwasserstoffsäure auf pH 1,5 eingestellt und mit 1 1 Methylisobutylketon extrahiert, um das Antibiotikum BN-130 zu isolieren. Die Methylisobutylketon-Schicht wurde von der Methanol-Schicht abgetrennt und zweimal mit je 500 ml Wasser, welches durch Zugabe von Natriumhydroxid bis auf pH 10 alkalisch gemacht worden war, extrahiert; auf diese Weise wurde das Antibiotikum BN-130 in die wässrige Schicht überführt. Die vereinigten wässrigen Extrakte wurden durch Zugabe von Chlorwasserstoffsäure auf pH 1,5 eingestellt und danach erneut mit 1 1 Methylisobutylketon extrahiert. Der Methylisobutylketon-Extrakt wurde unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt; man erhielt auf diese Weise 120 g eines gelblich braunen Öles. Das Öl wurde in 100 ml Äthylacetat aufgenommen und die Äthylacetatlösung wurde durch eine Kolonne geleitet, die ein Fassungsvermögen von 1,5 1 hatte und mit Silikagel beschickt war, welches mit Äthylacetat imprägniert worden war. Die Silikagel-Kolonne wurde mit Äthylacetat entwickelt und das Eluat der Kolonne wurde in 500 ml-Fraktionen aufgefangen. Die aktiven Fraktionen 3 bis 10, die das gewünschte Antibiotikum BN-130 enthielten, wurden vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt; man erhielt auf diese Weise 40 g eines gelb gefärbten Öles. Dieses Öl wurde in 50 ml Äthylacetat aufgenommen. Die entstandene Lösung wurde durch eine Kolonne geleitet, die ein Fassungsvermögen von 1 1 hatte und mit "Sephadex LH-20" beschickt war, welches mit Äthylacetat imprägniert worden war. Die Kolonne wurde mit Äthylacetat entwickelt. Das Eluat von der Kolonne wurde in 50 ml-Fraktionen aufgefangen. Die aktiven Fraktionen 35 bis 62, die das gewünschte Antibiotikum enthielten, wurden vereinigt und unter vermindertem Druck eingeengt; auf diese Weise erhielt man 13 g des Antibiotikums BN-130 in Form der freien Säure als farbloses Öl. ρ⁵ -19,2° (c=l, Methanol).

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Beispiel 4

100 mg des Antibiotikums BN-130 in Form der freien Säure wurden in 5 ml Methanol gelöst. Die entstandene Lösung wurde mit einer weiterai Lösung von Diazomethan (CH-N») in Äthyläther versetzt. Die Mischung wurde 30 Minuten
unter Kühlung Lmit Eis abgestellt und dann unter vermindertem Druck eingeengt, wobei 9 3 mg eines Öles zurückblieben, die den Methylester des Antibiotikums BN-130 darstellten. Dieses Öl (90 mg) wurde in einer Mischung aus 3 ml
Pyridin und 1,5 ml Essigsäureanhydrid gelöst. Die entstandene Lösung wurde drei Tage bei 5 Celsius unter
Kühlung mit Eis abgestellt. Danach wurde die Lösung auf etwa ein Viertel des ursprünglichen Volumens eingeengt und anschliessend mit Eisstückchen versetzt. Der sich
bildende Niederschlag wurde abfiltriert und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Auf diese Weise erhielt man 110 mg des acetylierten Methylesters des Antibiotikums BN-130 als kristallines Pulver. F. 85-87° Celsius.

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Claims (7)

1. Patentansprüche

   Neues Antibiotikum BN-13O, dadurch gekennzeichnet, dass dasselbe

   eine antibakterialle Wirkung sowohl gegenüber gramnegativen und gram-positiven Bakterien als auch gegenüber säurebeständigen Bakterien aufweist, in Form eines schwach gelb gefärbten Öles ohne definierten Schmelzpunkt vorliegt,

   bei Temperaturen um 0° Celsius eisähnlich wird und bei Temperaturen um 40 Celsius als Öl vorliegt, saurer Natur ist und Carboxylgruppen enthält, löslich ist in Methanol, Äthanol, n-Butanol, Aceton, Äthylacetat und Methylisobutylketon, massig löslich ist in Benzol und Chloroform und unlöslich ist in Wasser,

   eine optische Drehung von fcO_D minus 19,2° in einprozentiger methanolischer Lösung aufweist, positiv gegenüber Kaliumpermanganat und Jod sowie negativ gegenüber Ninhydrin, Silbernitrat,Sakaguchi-Reagenz und Ferrichlorid reagiert, in der Elementaranalyse die Werte C=65,24%," H=8,79%, N=4,85% und 0=21,12% (Rest) aufweist, ein Molekulargewicht von 520 bei Bestimmung nach der Titrationsmethode und von 550 bei Berechnung aus dem Dampfdruck seines Methylesters aufweist, Ultraviolettabsorptionsspektren wie in Fig. 1 dargestellt und ein Infrarotabsorptionsspektrum (tablettiert in Kaliumbromid) wie in Fig. 2 dargestellt, aufweist, bei der Dünnschichtchromatographie an Silikagel beim Entwickeln mit Äthylacetat-Methanol (Volumenverhältnis 2O:l) einen R_f-Wert von 0,45 und beim Entwickeln mit Chloroform-Isopropanol (Volumenverhältnis 9:1) einen R_f-Wert von 0,2 3 ergibt,

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   einschliesslich der pharmazeutisch akzeptablen Salze des neuen Antibiotikums BN-13O.
2. 2. Das Natriumsalz des Antibiotikums BN-13O gemäss

   Anspruch 1.
3. 3. Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums BN-130 gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man einen das Antibiotikum BN-130 produzierenden Stamm der Gattung Pseudomonas in einem geeigneten Kulturmedium, welches assimilierbaren Kohlenstoff und Stickstoff enthält, unter aeroben Bedingungen solange züchtet, bis sich eine ausreichende Menge des Antibiotikums BN-130 in dem Kulturmedium gebildet und angereichert hat, und dass man das Antibiotikum BN-130 aus dem Kulturmedium isoliert.
4. 4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass man als Antibiotikum BN-130 erzeugenden Stamm einen der Gattung Pseudomonas stutzeri verwendet.
5. 5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der das Antibiotikum BN-130 erzeugende Stamm Pseudomonas stutzeri BN-130 (identifiziert als FERM-P2443) ist.
6. 6. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Stamm Pseudomonas stutzeri BN-130 bei Temperaturen zwischen 25 und 35° Celsius in 40 bis Stunden gezüchtet wird.

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7. 7. Pharmazeutisches Präparat zur Behandlung bakterieller Infektionen bei lebenden Tieren, dadurch gekennzeichnet, dass in demselben eine therapeutisch wirksame Menge des Antibiotikums BN-13O und/oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes des Antibiotikums BN-13O in Kombination mit einem pharmazeutisch akzeptablen Trägermaterial vorliegt.

   Für den Anmelder:

   Meissner & Bolte Patentanwälte

   Bremen, den 14. April 1975
   Anmelder:

   MEIJI SEIKA KAISHA, LTD.
   No. 8, 2-chome,
   Kyobashi, Chuo-ku
   Tokyo, Japan

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