DE2855949C2

DE2855949C2 -

Info

Publication number: DE2855949C2
Application number: DE2855949A
Authority: DE
Inventors: Akira Nishinomiya Hyogo Jp Imada; Kazuaki Sakai Osaka Jp Kitano; Mitsuko Takatsuki Osaka Jp Asai
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1977-12-30
Filing date: 1978-12-23
Publication date: 1987-06-04
Also published as: JPS6046955B2; CS208768B2; ES476480A1; SU1003761A3; BE873217A; FR2413399A1; AU521534B2; US4229436A; SE433229B; DK147452C; GB2011380A; SE7813384L; CA1113873A; GB2011380B; CH644593A5; PH15534A; FR2413399B1; IT7831423A0; AU4230778A; JPS54163501A

Description

Die Erfindung betrifft ein neues Antibiotikum mit der Bezeichnung G-6302, seine Salze und ein Verfahren zu ihrer Herstellung.

Mit dem Ziel, neue Antibiotika zu finden, isolierte die Anmelderin eine große Zahl von Mikroorganismen aus Bodenproben und untersuchte die von diesen Mikroorganismen gebildeten Antibiotika. Die Untersuchung ergab, daß einige dieser Mikroorganismen ein neues Antibiotikum bilden, daß diese Mikroorganismen zur Gattung Pseudomonas gehören und daß diese Mikroorganismen bei Kultivierung in einem geeigneten Nährmedium ein Antibiotikum anhäufen, das eine hemmende Wirkung auf grampositive und gramnegative Bakterien ausübt. Die Anmelderin isolierte dieses Antibiotikum und stellte auf Grund seiner physikalisch-chemischen und biologischen Eigenschaften fest, daß dieses Antibiotikum neu ist. Es wurde "Antibiotikum G-6302" bezeichnet.

Die Bedingungen für die Herstellung von Antibiotikum G-6302 wurden ebenfalls untersucht. Hierbei wurde festgestellt, daß die Bildung des Antibiotikums G-6302 bedeutend gesteigert werden kann, wenn die in Frage kommenden Mikroorganismen in einem Nährmedium, das mit einer Schwefelverbindung ergänzt ist, die die Mikroorganismen zu verwerten vermögen, kultiviert werden.

In der vorliegenden Beschreibung und in den Ansprüchen wird das Antibiotikum G-6302 zuweilen kurz als G-6302 bezeichnet.

Die Erfindung umfaßt daher

1) das Antibiotikum G-6302 und seine Salze entsprechend Anspruch 1 und
2) die Herstellung des Antibiotikums G-6302 nach Anspruch 2. Der Anspruch 3 nennt eine Ausgestaltung der Maßnahmen nach Anspruch 2.

Der erfindungsgemäß eingesetzte Stamm Pseudomonas G-6302 (nachstehend zuweilen als Stamm G-6302 bezeichnet) wurde von der Anmelderin von Bodenproben, die in Ashigara-Shimo-Gun, Präfektur Kanagawa, Japan, entnommen wurden, isoliert.

Die bakteriologischen Eigenschaften von Pseudomonas Stamm G-6302 sind nachstehend genannt.

a) Morphologie

Nach 2 Tagen auf Schrägagar bei 28°C sind die Zellen stabförmig mit 0,7 bis 1,0 µm Durchmesser und 0,7 bis 3,5 µm Länge. Ohne Polymorphismus sind die Bakterien mit einer oder mehreren polaren Geißeln beweglich. Keine Sporulation; keine Anreicherung von Poly-β-hydroxybuttersäure als intrazelluläre Kohlenstoffreserve (R. Y. Stanier und Mitarbeiter, Journal of General Microbiology 43 (1966) 159. Gramnegativ, nicht säurefest.

b) Kulturmerkmale auf verschiedenen Medien:

Bei 28°C kultiviert und 1 bis 14 Tage beobachtet.

1) Nähragarplatte: Kreisrunde, erhabene Kolonien von 1 bis 3 mm Durchmesser mit ganzem Rand werden nach 3 Tagen gebildet. Glatt, undurchsichtig, weiß, kein diffundierbares Pigment gebildet.
2) Schrägagar: mäßiges Wachstum, fadenförmig, opak und cremefarben.
3) Nährbrühe: trübes Wachstum, im wesentlichen ohne Sedimentation. Ein Pellikel erscheint nach 14-tägiger Kultivierung.
4) Stichkultur in Nährgelatine: Oberflächenwachstum ohne Verflüssigung.
5) Lackmusmilch: keine Veränderung

c) Physiologische Eigenschaften

1) Reduktion von Nitraten: negativ
2) Denitrifikation: negativ
3) MR-Test (Methylrottest): negativ
4) VP(Voges-Prospkauer)-Test: negativ
5) Bildung von Indol: negativ
6) Bildung von Schwefelwasserstoff: positiv (schwach)
7) Hydrolyse von Stärke: negativ
8) Verwertung von Citrat: positiv
9) Verwertung von anorganischen Stickstoffquellen
- I) Kaliumnitrat: negativ bis schwach-positiv
- II) Ammoniumsulfat: positiv
10) Bildung von Pigmenten: nein
11) Urease: positiv
12) Oxidase: negativ
13) Katalase: positiv
14) Wachstumsbereich
- I) pH: Wachstum bei pH 4 bis 8, optimal pH 4,5 bis 6,0
- II) Temperatur: Wachstum bei 2 bis 37°C, optimal 25 bis 30°C.
15) Sauerstoffbedarf: aerob
16) O-F-Test (oxydativ-fermentativ) (Hugh-Leifson- Methode): oxydativ.
17) Bildung von Säure und Gas aus Zuckern: schwache Säurebildung, aber keine Gasbildung wird in Pepton- Wasser festgestellt, das 1% (Gew./Vol.) D-Glucose, D-Mannose, D-Galactose, Maltose, Saccarose, Trehalose, D-Sorbit, D-Mannit, Inosit oder Glycerin enthält.
18) Assimilierung von Kohlenstoffquellen: Die Ergebnisse der Kultivierung in anorganische Salze enthaltenden Medien (Gew./Vol.: 0,7% Dikaliumhydrogenphosphat, 0,3% Monokaliumdihydrogenphosphat, 0,1% Ammoniumsulfat, 0,1% Natriumchlorid, 0,01% Magnesiumsulfat · 7 H₂O), die verschiedene Kohlenstoffquellen enthalten, für 14 Tage sind nachstehend in Tabelle 1 genannt.
Tabelle 1

Verwertung von Kohlenstoffquellen
19) Andere Eigenschaften
- I) Verwertung von Malonat: negativ
- II) Desaminierung von Phenylalanin: negativ
- III) Decarboxylase-Aktivität
  - a) Argenin: negativ
  - b) Lysin: negativ
  - c) Ornithin: negativ
- IV) Hydrolyse von Esculin: positiv
- V) Hydrolyse von "Tween 80": positiv
- VI) GC-Gehalt (Guanin-Cytosin) von DNA: 59,5 Mol.-%

Ein Vergleich der vorstehend genannten bakteriologischen Eigenschaften des Stamms G-6302 mit der Beschreibung in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, Auflage 7 und 8, ergibt, daß der Stamm G-6302 angesichts der Tatsache, daß er ein gramnegatives stabförmiges Bakterium, streng aerob, mit einer oder mehreren polaren Geißeln beweglich und Katalase-positiv ist, offensichtlich zur Familie Pseudomonadaceae gehört. Die Tatsache, daß er keinen Nährstoffbedarf und einen GC-Gehalt von 59,5 Mol.-% hat, läßt erkennen, daß der Stamm zur Gattung Pseudomonas gehört. Da Pseudomonas- Bakterien hinsichtlich der vorstehend genannten Eigenschaften mit dem Stamm G-6302 verwandt sind, sind Pseudomonas syringae und Pseudomonas maltophilia zu nennen, die negativ für Cytochromoxydase sind. P. maltophilia ist jedoch vom Stamm G-6302 offensichtlich insofern verschieden, als P. maltophilia Methionin benötigt und bei 4°C kein Wachstum zeigt. Während Pseudomonas syringae eine Spezies ist, die eine große Anzahl von Nomenspezies enthält, ergibt sich eindeutig aus Tabelle 2, daß das gemeinsame Merkmale dieser Stämme, d. h. die Unfähigkeit, gewisse Kohlenstoffquellen zu verwerten, beim Stamm G-6302 nicht zu finden ist.

Tabelle 2

Vergleich der Verwertbarkeit verschiedener Kohlenstoffquellen

Ferner ist der optimale pH-Wert für das Wachstum des Stamms G-6302 sehr niedrig, nämlich 4,5 bis 6,0, wobei selbst bei pH 4,0 Wachstum stattfindet. Diese Unterschiede schalten die Möglichkeit aus, den Stamm G-6302 als einen Stamm von Pseudomonas syringae anzusehen. G-6302 ist daher als neue Spezies der Gattung Pseudomonas zu betrachten. Angesichts der Tatsache, daß sein niedriger optimaler pH-Wert für das Wachstum 4,5 bis 6,0 beträgt, der für Bakterien der Gattung Pseudomonas im allgemeinen niedrig ist, wurde der Stamm G-6302 als Pseudomonas acidophila G-6302 bezeichnet.

Proben dieses Stammes G-6302 wurden beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science of Technology (FERM), Chiba, Japan, unter der Zugangsnummer FERM p-4344, beim Institute for Fermentation, Osaka (IFO), Japan, unter der Zugangsnummer IFO 13 774 hinterlegt.

Für die Kultivierung des Stamms G-6302 können Kohlenstoffquellen wie Glucose, Saccharose, Maltose, ausgebrauchte Melasse, Glycerin, Öle und Fette (z. B. Sojabohnenöl und Olivenöl), organische Säuren (z. B. Citronensäuren, Bernsteinsäure und Gluconsäure) und andere verwertbare Kohlenstoffquellen verwendet werden. Als Stickstoffquellen eignen sich organische und anorganische stickstoffhaltige Verbindungen und Materialien, beispielsweise Sojabohnenmehl, Baumwollsaatmehl, Maisquellwasser, Trockenhefe, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Pepton, Harnstoff, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumchlorid und Ammoniumphosphat. Ferner können die für die Kultivierung von Bakterien normalerweise erforderlichen anorganischen Salze, z. B. Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumcarbonat, Magnesiumsulfat, Monokaliumdihydrogenphosphat und Dinatriummonohydrogenphosphat, allein oder in geeigneter Kombination verwendet werden. Es wurde gefunden, daß die Ausbeute an gewünschtem Antibiotikum gesteigert werden kann, wenn das Nährmedium durch eine Schwefelverbindung, die der G-6302 bildende Stamm zu verwerten vermag, nämlich anorganische Schwefelverbindungen, z. B. Sulfate (Natriumsulfat), Thiosulfate (z. B. Natriumthiosulfat) oder organische Schwefelverbindungen, beispielsweise schwefelhaltige Aminosäuren (z. B. Cystin, Cystein und Methionin), ergänzt wird. Für diesen Zweck wird Natriumthiosulfat besonders bevorzugt. Die Konzentration dieser Schwefelverbindungen im Nährmedium beträgt 0,01 bis 1,0% (Gew./Vol.), vorzugsweise 0,02 bis 0,5%. Der Zusatz einer solchen Schwefelverbindung zum Nährmedium hat erhöhte Bildung von G-6302 zur Folge, so daß er kommerziell von erheblichem Wert ist.

Ferner können Salze von Schwermetallen, z. B. Eisen(II)- sulfat und Kupfersulfat, Vitamine, z. B. Vitamin B₁ und Biotin, und andere Zusatzstoffe nach Bedarf zugesetzt werden. Schaumverhütungsmittel und oberflächenaktive Mittel, z. B. Siliconöl und Polyalkylenglykoläther, können ebenfalls zugesetzt werden. Natürlich können auch andere organische oder anorganische Stoffe, die das Wachstum des Mikroorganismus fördern und die Bildung von G-6302 steigern, in geeigneten Mengen zugegeben werden.

Die Kultivierung des Stamms G-6302 kann nach ähnlichen Verfahren, wie sie für die Erzeugung von Antibiotika im allgemeinen angewandt werden, unter Verwendung eines festen Kulturmediums oder in einem flüssigen Kulturmedium erfolgen. Die Flüssigkultur kann stationär, unter Rühren, Schütteln oder aerob durchgeführt werden, wobei die aerobe Kultur unter Rühren besonders zweckmäßig ist. Die bevorzugte Kultivierungstemperatur liegt im Bereich von etwa 15 bis 35°C, während der pH-Wert des Nährmediums zwischen etwa 4 und 8 liegen kann. Die Kultivierung wird etwa 8 bis 168 Stunden, vorzugsweise 24 bis 144 Stunden durchgeführt. Da das gebildete Antibiotikum G-6302 zum größten Teil in der flüssigen Phase des Kulturmediums vorliegt, ist es zweckmäßig, das Kulturmedium zu zentrifugieren oder filtrieren, um den flüssigen Überstand oder das Filtrat von der Zellmasse zu entfernen, und das Antibiotikum G-6302 im flüssigen Überstand oder im Filtrat zu reinigen. Gegebenenfalls kann auch eine direkte Reinigung aus dem Kulturmedium vorgenommen werden.

Die Testung der Aktivität des in dieser Weise hergestellten Produkts kann gegen Proteus mirabilis IFO 3849 als Testmikroorganismus unter Verwendung von G-6302 als Standard nach der Zylindermethode oder der Papierblättchenmethode unter Verwendung von TSA (Trypticase-Soja- Agar) erfolgen.

Das Antibiotikum G-6302 kann mit Hilfe der verschiedenen Verfahren, die üblicherweise für die Isolierung von Metaboliten-Mikroorganismen angewandt werden, isoliert werden. Beispielsweise werden die Zellen durch Zentrifugieren entfernt, worauf das aktive Produkt nach üblichen Methoden vom flüssigen Überstand abgetrennt und gereinigt wird. Beispielsweise können das Verfahren, bei dem die Löslichkeit oder der Löslichkeitsunterschied in einem geeigneten Lösungsmittel ausgenutzt wird, das Verfahren, bei dem die Fällung oder der Unterschied in der Fällungsgeschwindigkeit des Antibiotikums aus einer Lösung ausgenutzt wird, das Verfahren, bei dem seine charakeristische Adsorptionsaffinität zu verschiedenen Adsorptionsmitteln ausgenutzt wird, die Ionenaustauschchromatographie an Ionenaustauschern, Konzentrierung unter vermindertem Druck, Gefriertrocknung, Kristallisation, Umkristallisation, Trocknung usw. entweder allein oder in geeigneter Kombination und Reihenfolge und/oder in Wiederholung angewandt werden.

Ein typisches Verfahren wird nachstehend beschrieben. Nach beendeter Kultivierung wird das Kulturmedium filtriert, das erhaltene Filtrat durch eine Aktivkohlesäule geleitet und das adsorbierte G-6302 mit einem hydrophilen organischen Lösungsmittel eluiert. Als hydrophile organische Lösungsmittel eignen sich beispielsweise niedere Ketone (z. B. Aceton, Metyläthylketon und Methylisobutylketon) und niedere Alkohole (z. B. Methanol, Äthanol, Isopropanol, Propanol und Butanol). Diese Lösungsmittel können allein oder als Gemisch in Kombination mit Wasser verwendet werden. Auf Grund der sauren Natur von G-6302 können Anionenaustauschharze, z. B. Harze der Cl-Form (Amberlite IRA-400 und 402, Dowex-1, Diaion SA-21A) vorteilhaft verwendet werden. Das adsorbierte aktive Produkt wird beispielsweise mit einer wäßrigen Natriumchloridlösung eluiert. Um das Eluat zu entsalzen, wird die Säulenchromatographie erneut mit Aktivkohle durchgeführt. Das erhaltene Eluat wird dann eingeengt und beispielsweise mit Aceton versetzt. Die hierbei gebildete Fällung wird abfiltriert, mit Aceton und Diäthyläther gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet, wobei ein hellbraunes Pulver gewonnen wird. Zur Reinigung des Antibiotikums G-6302 im Pulver kann die Säulenchromatographie an DEAE-Sephadex vorteilhaft angewandt werden. Beispielsweise wird eine Säule des Produkts DEAE-Sephadex A-25 mit 0,01-molarem Phosphatpuffer (pH 6,6) gewaschen und eine wäßrige Lösung des Pulvers durch die Säule geleitet, an der das Antibiotikum adsorbiert wird. Die Säule wird mit der vorstehend genannten Pufferlösung gewaschen, worauf mit dem Puffer, der 0,5% (Gew./Vol.) Natriumchlorid enthält, eluiert wird. Die aktiven Fraktionen werden zusammengegossen, auf pH 3,0 eingestellt und erneut durch eine Aktivkohlesäule geleitet. Die Säule wird mit Wasser und anschließend mit 20%igem wäßrigem Methanol gewaschen. Die Elution wird dann mit wäßrigem Aceton durchgeführt. Die aktiven Fraktionen werden zusammengegossen und unter vermindertem Druck getrocknet. Dem Konzentrat wird Aceton zugesetzt, wobei G-6302 erhalten wird. G-6302 bildet Metallsalze und das Ammoniumsalz. Als Beispiele von Metallsalzen sind das Natriumsalz, Kaliumsalz und Lithiumsalz zu nennen.

Die physikalisch-chemischen Eigenschaften des gemäß Beispiel 1 hergestellten Antibiotikums G-6302 sind nachstehend genannt.

1) Schmelzpunkt 120°C (Sinterung), 130°C (Zers.)
2) Aussehen: weißes Pulver
3) Elementaranalyse (nach Trocknung unter vermindertem Druck über Phosphorpentoxyd bei 40°C für 6 Stunden) (%): C34,83 35,45 (34,99 ± 0,5) H 5,41 5,24 (5,58 ± 0,5) N13,22 13,73 (13,60 ± 0,5) S 7,65 7,75 (7,70 ± 0,5) O (38,13 ± 0,5)
4) Molekulargewicht durch Titrometrie: 400 ± 20 Bruttoformel (auf der Grundlage der vorstehenden Kennzahlen) C₁₂H₂₀N₄SO₉ · H₂OBerechnet: C 34,78; H 5,35; N 13,52; S 7,74
5) UV-Absorptionsspektrum: nur Endabsorptionen (über 210 nm keine charakteristischen Absorptionen)
6) Infrarotabsorptionsspektrum (siehe Fig. 1), Hauptpeaks (KBR) (cm^-1)
3440(s), 2920(m), 2850(m), 2600(w), 1770(s), 1650(s), 1530(s), 1458(m), 1390(w), 1340(w), 1280(sh), 1240(s), 1210(sh), 1180(m), 1118(w), 1043(s), 792(w), 632(s)
(s = stark; m = mittel; w = schwach; sh = Schulter)
7) Spezifische Drehung: [α] + 94° ± 10° (c = 0,35, H₂O)
8) Kernmagnetisches Resonanzspektrum (in Dimethylsulfoxyd, 100 MHz) δ 3,31 ppm (s, chemische Verschiebung, die O-CH₃ zuzuschreiben ist).
9) Löslichkeit in Lösungsmitteln:
Unlöslich in Petroläther, Hexan, Diäthyläther, Benzol, Äthylacetat und Chloroform; schwerlöslich in Äthanol, Pyridin und Aceton; löslich in Methanol und Dimethylsulfoxyd; leichtlöslich in Wasser.
10) Farbreaktionen:
Positiv: Ninhydrin- und Kaliumpermanganatreaktion;
negativ: Eisen(III)-chlorid-Kaliumferricyanid-, Sakaguchi- und Molisch-Reaktionen;
unsichere positive Reaktionen: Ehrlich-Reaktion.
11) Stabilität: in wäßriger Lösung im Bereich von pH 3 bis 7 bei 60°C 10 Minuten stabil; über pH 8,5 instabil.
12) Basisch, neutral oder sauer: sauer.

Die physikalisch-chemischen Eigenschaften des Natriumsalzes des gemäß Beispiel 3 hergestellten Antibiotikums G-6302 sind nachstehend genannt.

1) Schmelzpunkt: kein scharfer Schmelzpunkt (Bräunung bei 170°C)
2) Aussehen: weißes Pulver
3) Elementaranalyse (nach Trocknung unter vermindertem Druck über Phosphorpentoxyd bei 40°C für 6 Stunden) (%): C33,08 33,32 H 5,07 4,97 N12,73 13,27 S 7,33 7,43 Na 5,19 5,31
4) Molekulargewicht: 438 ± 5 unter der Annahme, daß jedes Molekül 1 Mol Na enthält.

Bruttoformel (auf der Grundlage der vorstehenden Daten)

C₁₂H₁₉H₄SO₉Na · H₂O

Berechnet C 33,03; H 4,85; N 12,84; S 7,35; Na 5,27

5) UV-Absorptionsspektrum: Nur Endabsorptionen.
6) Infrarotabsorptionsspektrum (Fig. 2), Hauptpeaks (KBr) (cm^-1): 3430 (stark), 3250 (Schulter), 3000 (mittel), 1770 (stark), 1640 (stark), 1530 (stark), 1450 (schwach), 1405 (schwach), 1343 (schwach), 1280 (Schulter), 1245 (stark), 1180 (schwach), 1118 (schwach), 1050 (stark), 820 (schwach), 785 (schwach), 632 (stark).
7) Spezifische Drehung: [α] + 85° ± 10° (c = 0,37, H₂O).
8) Löslichkeit in Lösungsmitteln: Unlöslich in Petroläther, Hexan, Diäthyläther, Benzol, Äthylacetat, Chloroform und Aceton; schwerlöslich in Methanol, Äthanol und Pyridin; löslich in Dimethylsulfoxyd; leichtlöslich in Wasser.
9) Farbreaktionen:
Positiv: Ninhydrin- und Kaliumpermanganatreaktionen;
negativ: Eisen(III)-chlorid-Kaliumferricyanid-, Sakaguchi- und Molisch-Reaktionen; unsichere positive Reaktionen: Ehrlich-Reaktion.
10) Stabilität: In wäßriger Lösung im Bereich von pH 3 bis 7 bei 60°C für 10 Minuten stabil; über pH 8,5 instabil.

Die Umwandlung von G-6302 in Form der freien Säure in ein Salz, beispielsweise das Natriumsalz, kann durch Zusatz eines molaren Äquivalents Natriumhydroxyd zu einer wäßrigen Lösung der freien Säure und anschließende Gefriertrocknung des Systems erfolgen.

Das Salz von G-6302 kann in die freie Säure beispielsweise durch Zusatz von 1n-Salzsäure zu einer wäßrigen Lösung beispielsweise des Natriumsalzes von G-6302 zur Einstellung auf pH 3,0 und Entsalzen der Lösung mit Hilfe von Aktivkohle umgewandelt werden.

Die biologischen Merkmale von G-6302 sind nachstehend genannt. Das antibiotische Spektrum von G-6302 und seinem Natriumsalz gegen verschiedene Mikroorganismen ist in Tabelle 3 angegeben (Agarplatten-Verdünnungsmethode). Die Ergebnisse zeigen, daß das Antibiotikum G-6302 hauptsächlich gegen gramnegative Bakterien, jedoch auch gegen einige grampositive Bakterien wirksam ist.

Die akute Toxizität des Natriumsalzes von Antibiotikum G-6302 ist gering. Wenn das Salz in eine Dosis von 500 mg/kg Mäusen intravenös verabreicht wurde, starb kein Tier.

Ferner wurde gefunden, daß G-6302 bei einer subkutanen Dosis von 10 mg/kg oder bei einer oralen Dosis von 100 mg/kg eine Schutzwirkung auf Mäuse ausübt, die mit Escherichia coli oder Klebsiella pneumoniae infiziert worden sind.

Tabelle 3

Antimikrobielles Spektrum von G-6302 und seinem Natriumsalz

Wie das vorstehende antibiotische Spektrum zeigt, übt das Antibiotikum G-6302 gemäß der Erfindung eine hemmende Wirkung auf gramnegative und grampositive Bakterien aus. Es kann daher zur Behandlung von Infektionen mit den genannten Bakterien bei Säugetieren (z. B. Maus, Ratte, Hund und Mensch) und Geflügel (z. B. Huhn und Ente) verwendet werden. Für die Verwendung als Mittel gegen Infektionen mit Escherichia coli wird G-6302 beispielsweise in physiologischer Kochsalzlösung gelöst und parenteral, beispielsweise subkutan oder intramuskulär, in einer Tagesdosis von 5 bis 30 mg/kg Körpergewicht verabreicht. Für die orale Verwendung wird das Antibiotikum G-6302 beispielsweise mit Lactose gemischt, in Kapseln gefüllt und in einer Dosis von 20 bis 200 mg (als G-6302)/kg Körpergewicht täglich verabreicht.

G-6302 kann auch als keimtötendes Mittel oder Desinfektionsmittel verwendet werden. Beispielsweise wird G-6302 zur Herstellung einer Lösung, die 0,1 bis 1,0% (Gew./Vol.) G-6302 enthält, in destilliertem Wasser gelöst oder mit einer Salbengrundlage, z. B. Vaseline oder Lanolin, zur Herstellung einer Salbe formuliert, die 5 bis 20 mg G-6302/g enthält. Die Lösung bzw. Salbe wird auf Pfoten, Beine, Augen, Ohren oder andere Teile der vorstehend genannten Tiere als Desinfektionsmittel aufgebracht.

G-6302 ist insofern eine sehr aussichtsreiche Verbindung, als sie als Zwischenprodukt für die Synthese neuer Medikamente wertvoll ist.

Ein Vergleich von Antibiotikum G-6302 mit den bekannten Antibiotika hatte die folgenden Ergebnisse: Als Antibiotika, die wasserlöslich und sauer sind und Schwefel enthalten, sind Penicillin und die Cephalosporine zu nennen. G-6302 unterscheidet sich jedoch von den Cephalosporinen darin, daß es im UV-Bereich des Spektrums nicht absorbiert. Die Tatsache, daß das kernmagnetische Resonanzspektrum eine chemische Verschiebung zeigt, die O-Methylprotonen zuzuschreiben ist, und die Tatsache, daß G-6302 bei saurer Hydrolyse Glutaminsäure bildet, stellen Beweise dar, daß G-6302 von allen natürlich vorkommenden Penicillinen und Cephalosporinen verschieden ist.

Es gibt zwar zahlreiche bekannte Antibiotika, die von Bakterien der Gattung Pseudomonas gebildet werden, aber keines dieser Antibiotika ist in Wasser löslich und sauer und enthält Schwefel. Ferner unterscheidet sich G-6302 von allen bekannten Antibiotika, die von anderen Mikroorganismen als Pseudomonas-Stämmen gebildet werden, durch seine einmaligen physikalisch- chemischen und biologischen Eigenschaften. G-6302 ist daher als neue Verbindung anzusehen.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert. In diesen Beispielen verstehen sich die Teile als Gewichtsteile, falls nicht anders angegeben. Gewichtsteile verhalten sich zu Raumteilen wie Gramm zu Kubikzentimeter, und die Prozentsätze basieren auf "Gew./Vol.", falls nicht anders angegeben.

Beispiel 1

Die Zellen von Pseudomonas acidophila G-6302 IFO 13 774, die auf Schrägagar gezüchtet worden waren, wurden zum Beimpfen von zwei Sakaguchi-Kolben verwendet, die ein Fassungsvermögen von 2000 Raumteilen hatten und je 500 Raumteile eines Mediums aus 1% Glucose, 0,5% Polypepton, 0,5% Fleischextrakt und 0,5% Natriumchlorid enthielten (pH 7,0). Jeder Kolben wurde auf einer hin- und hergehenden Schüttelvorrichtung 48 Stunden bei 28°C bebrütet. Die hierbei erhaltene Kultur wurde als Impfkultur verwendet.

In einen als Fermenter dienenden Tank aus nichtrostendem Stahl mit einem Fassungsvermögen von 200 000 Raumteilen wurden 120 000 Raumteile eines Mediums gegeben, das 3% Glycerin, 0,1% Glucose, 0,5% Polypepton, 0,5% Fleischextrakt und 0,5% NaCl enthielt und nach Einstellung auf pH 7,0 mit 30%igem wäßrigem Natriumhydroxyd 20 Minuten mit Wasserdampf bei 120°C sterilisiert worden war. Der sterilisierte Tank wurde dann mit der vorstehend genannten Impfkultur beimpft und bei einer Temperatur von 28°C unter Belüftung mit einer Rate von 120 000 Raumteilen/Minute und einer Geschwindigkeit des Rührers von 180 UpM 78 Stunden bebrütet. Das erhaltene Kulturmedium wurde mit einem Sharples-Zentrifugalabscheider zur Entfernung der Zellen zentrifugiert, wobei 110 000 Raumteile eines flüssigen Überstandes zurückblieben. Die Flüssigkeit wurde auf pH 4,2 eingestellt und durch eine Säule aus 150 000 Raumteilen Aktivkohle (chromatographische Qualität) geleitet, wobei die aktive Substanz an der Aktivkohle adsorbiert wurde. Die Säule wurde mit 45 000 Raumteilen Wasser gespült und dann mit 45 000 Raumteilen 50%igem wäßrigem Aceton eluiert. Das Eluat wurde in Fraktionen von je 10 000 Raumteilen aufgefangen. Die Fraktionen wurden gegen Proteus mirabilis IFO 3849 getestet. Die Fraktionen Nr. 2 und 3 wurden zusammengegossen und mit 20 000 Raumteilen Wasser versetzt. Das Gemisch wurde durch eine Kolonne geleitet, die mit 10 000 Raumteilen des Harzes "Dowex-1" (Cl-Form) gefüllt war. Die Säule wurde mit 25 000 Raumteilen Wasser gespült und dann mit 50 000 Raumteilen einer 5%igen wäßrigen Natriumchloridlösung eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden zusammengegossen, auf pH 4,0 eingestellt und erneut durch eine Aktivkohlesäure (8000 Raumteile) geleitet. Die Säule wurde mit 24 000 Raumteilen Wasser gewaschen und mit 20%igem wäßrigem Methanol eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden zusammengegossen und unter vermindertem Druck auf 50 Raumteile eingeengt. Dann wurden 200 Raumteile Aceton zugesetzt. Die hierbei gebildete Fällung wurde abfiltriert, mit 50 Raumteilen Aceton und 100 Raumteilen Diäthyläther gewaschen und dann unter vermindertem Druck getrocknet. Hierbei wurden 12 Teile rohes Produkt erhalten.

In 500 Raumteilen M/100-Phosphatpuffer (pH 6,6) wurden 10 Teile des vorstehend genannten rohen Produkts gelöst. Die Lösung wurde durch eine Säule von 200 Raumteilen DEAE-Sephadex A-25 geleitet, das vorher mit der vorstehend genannten Pufferlösung gepuffert worden war. Die Säule wurde mit 400 Raumteilen der gleichen Pufferlösung gewaschen und dann mit dem gleichen Puffer, dem 0,5% Natriumchlorid zugesetzt worden waren, eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden zusammengegossen, mit 1n-HCl auf pH 3,2 eingestellt und durch eine Säule von 60 Raumteilen Aktivkohle geleitet. Die Säule wurde mit 200 Raumteilen Wasser und 100 Raumteilen 20%igem wäßrigem Methanol gewaschen und anschließend mit 50%igem wäßrigem Aceton eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden zusammengegossen, unter vermindertem Druck eingeengt und in 5 Raumteilen Methanol gelöst. Nach Zugabe von 100 Raumteilen Aceton wurde die Lösung in der Kälte stehen gelassen. Die hierbei gebildete Fällung wurde abfiltriert, mit Diäthyläther gewaschen und 6 Stunden unter vermindertem Druck bei 40°C über Phosphorpentoxyd getrocknet. Hierbei wurden 3,8 Teile eines Pulvers erhalten. Das Infrarot-Absorptionsspektrum dieses Produkts ist in Fig. 1 dargestellt.
Elementaranalyse: C 34,83; H 5,41; N 13,22; S 7,65 (Gew.-%).

Beispiel 2

In einen als Fermenter dienenden Tank aus nichtrostendem Stahl mit einem Fassungsvermögen von 50 000 Raumteilen wurden 35 000 Raumteile eines Mediums gegeben, das aus 3% Glycerin, 0,1% Glucose, 0,5% Polypepton, 0,5% Fleischextrakt und 0,5% Natriumchlorid bestand. Nach Einstellung des Mediums auf pH 7,0 mit 30%igem wäßrigem Natriumhydroxyd wurde 20 Minuten mit Wasserdampf bei 120°C sterilisiert. Der sterilisierte Tank wurde mit dem gleichen Mikroorganismus-Stamm, der bei dem in Beispiel 1 beschreibenen Versuch verwendet wurde, beimpft und zur Herstellung einer sekundären Impfkultur 48 Stunden bei 28°C unter Belüftung mit einer Rate von 35 000 Raumteilen/Minute und einer Geschwindigkeit des Rührers von 180 UpM bebrütet.

In einen als Fermenter dienenden Tank aus nichtrostendem Stahl mit einem Fassungsvermögen von 2 000 000 Raumteilen wurden 1 200 000 Raumteile eines Mediums gegeben, das aus 3% Glycerin, 0,1% Glucose, 0,5% Polypepton, 0,5% Fleischextrakt, 0,5% Natriumchlorid und 0,1% Natriumthiosulfat bestand. Nach Einstellung auf pH 7,0 mit 30%iger Natriumhydroxydlösung wurde 20 Minuten mit Wasserdampf bei 120°C sterilisiert. Der sterilisierte Tank wurde mit der vorstehend genannten sekundären Impfkultur beimpft.

Das beimpfte Medium im Tank wurde 90 Stunden bei 28°C unter Belüftung mit einer Rate von 1 200 000 Raumteilen/Minute bei einer Geschwindigkeit des Rührers von 180 UpM bebrütet, wobei 1 150 000 Raumteile Kulturmedium erhalten wurden. Diesem Kulturmedium wurden 40 000 Teile des Filterhilfsmittels "Hyflo-Super-Cel" zugesetzt, worauf es mit einer Filterpresse filtriert wurde. Das Filtrat wurde mit 4n-Schwefelsäure auf pH 4,2 eingestellt und durch eine Säule über 120 000 Raumteile Aktivkohle geleitet. Die Säule wurde mit 300 000 Raumteilen Wasser gewaschen und mit 50%igem wäßrigem Aceton eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden zusammengegossen und zur Entfernung des Acetons unter vermindertem Druck eingeengt. Das hierbei erhaltene wäßrige Konzentrat wurde mit Wasser auf 200 000 Raumteile verdünnt und durch eine Säule von 50 000 Raumteilen des Ionenaustauscherharzes "Diaion SA-21A" (Cl-Form) geleitet. Die Säule wurde dann mit 150 000 Raumteilen Wasser gespült und mit 1%igem wäßrigem Natriumchlorid eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden zusammengegossen und unter vermindertem Druck auf 100 Raumteile eingeengt. Dann wurden 2000 Raumteile Methanol zugesetzt. Das ausgefällte Natriumchlorid wurde abfiltriert. Das Filtrat wurde unter vermindertem Druck weiter auf 200 Raumteile eingeengt, worauf 2000 Raumteile Aceton zugesetzt wurden. Die Fällung wurde abfiltriert und getrocknet. Hierbei wurden 757 Teile rohes Produkt erhalten. Dieses rohe Produkt (500 Teile) wurde in 5000 Raumteilen Wasser gelöst, auf pH 4,0 eingestellt und an einer Aktivkohlesäule (5000 Raumteile) adsorbiert. Das aktive Ingrediens wurde nach der Gradienten-Elutionsmethode, bei der das Laufmittel von 10 000 Raumteilen Wasser bis zu 10 000 Raumteilen 70%igem wäßrigem Methanol verändert wurde, eluiert. Das Eluat wurde in Fraktionen von je 1000 Raumteilen aufgefangen. Die aktiven Fraktionen wurden zusammengegossen, zur Entfernung des Methanols unter vermindertem Druck eingeengt und mit M/100-Phosphatpuffer (pH 6,0) auf 6000 Raumteile aufgefüllt. Diese Probelösung wurde an einer Säule von 3000 Raumteilen des Adsorptionsmittels "DEAE-Sephadex A-25", das auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise vorbehandelt worden war, adsorbiert. Die Säule wurde mit 6000 Raumteilen des gleichen Puffers gewaschen und dann mit dem gleichen Puffer, der mit 0,5% Natriumchlorid ergänzt war, eluiert. Das Eluat wurde in Fraktionen von je 500 Raumteilen aufgefangen. Die aktiven Fraktionen wurden zusammengegossen, mit 1n-HCl auf pH 3 eingestellt und durch eine Säule von 500 Raumteilen Aktivkohle geleitet. Die Säule wurde mit 2000 Raumteilen Wasser bis 2000 Raumteilen 20%igem wäßrigem Methanol gewaschen, worauf mit 50%igem wäßrigem Aceton eluiert wurde. Das Eluat wurde in Fraktionen von je 200 Raumteilen aufgefangen. Die aktiven Fraktionen wurden zusammengegossen, unter vermindertem Druck eingeengt und durch Zusatz von 300 Raumteilen Methanol gelöst. Nach Zugabe von 3000 Raumteilen Aceton und 4000 Raumteilen Diäthyläther wurde die Lösung in der Kälte stehen gelassen. Das hierbei ausgefällte G-6302 wurde abfiltriert, mit Diäthyläther gewaschen und unter vermindertem Druck über Phosphorpentoxyd getrocknet. Ausbeute 72 Teile.
Elementaranalyse: C 35,45; H 5,24; N 13,73; S 7,75 (Gew.-%).

Beispiel 3

In 90 Raumteilen Wasser wurden 4,0 Teile der gemäß Beispiel 1 und 2 hergestellten freien Form von G-6302 gelöst. Unter Kühlen wurden etwa 9,0 Raumteile wäßriges 1n-Natriumhydroxyd zugesetzt. Anschließend wurde eine weitere Menge 1n-Natriumhydroxyd zugesetzt, wobei der pH-Wert der Lösung überwacht wurde, bis er 6,5 erreichte. Die Lösung wurde gefriergetrocknet, wobei 4,2 Teile G-6302-Mononatriumsalz als weißes Pulver erhalten wurden. Das Infrarot-Absorptionsspektrum dieses Produkts nach dem Trocknen unter vermindertem Druck für 6 Stunden bei 40°C ist in Fig. 2 dargestellt.
Elementaranalyse: C 33,08; H 5,07; N 12,73; S 7,33; Na 5,19 (Gew.-%).

Beispiel 4

Mit den Zellen von auf Schrägagar gezüchtetem Pseudomonas acidophila G-6302 (IFO 13 774) wurde ein Kolben geimpft, der ein Fassungsvermögen von 200 Raumteilen hatte und 40 Raumteile eines Mediums aus 1% Glucose, 0,5% Polypepton, 0,5% Fleischextrakt und 0,5% Natriumchlorid enthielt (pH 7,0). Der geimpfte Kolben wurde zur Herstellung einer Impfkultur auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung 48 Stunden bei 28°C bebrütet.

Dann wurden in Kolben mit einem Fassungsvermögen von 200 Raumteilen je 40 Raumteile eines Mediums, das 3% Glycerin, 1% Glucose, 0,5% Polypepton, 0,5% Fleischextrakt und 0,5% Natriumchlorid enthielt (pH 7,0), gegeben, worauf 0,02 bis 0,5% verschiedener Schwefelverbindungen dem Kolben zugesetzt wurden. Jeder Kolben wurde dann mit 1 Raumteil der vorstehend genannten Impfkultur beimpft und 96 Stunden auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung bei 28°C bebrütet. Wie die folgende Tabelle zeigt, wurde die Bildung von G-6302 durch den Zusatz der Schwefelverbindungen erheblich gesteigert.

Beispiel 5

In 7,5 Raumteilen kaltem Wasser wurde 1 Teil der gemäß Beispiel 1 oder 2 hergestellten freien Form von G-6302 gelöst. Der Lösung wurden 17,5 Raumteile kaltes Methanol zugesetzt.

Das erhaltene Gemisch wurde 24 Stunden in der Kälte stehen gelassen, wobei pulverförmiges G-6302 zu farblosen Kristallen kristallisierte. Die Kristalle wurden isoliert, mit einer geringen Menge kaltem wäßrigem 80%igem Methanol, kaltem Methanol und Äther in dieser Reihenfolge gewaschen und unter vermindertem Druck 6 Stunden bei 60°C über Phosphorpentoxyd getrocknet, wobei 0,930 Teile kristallines G-6302 erhalten wurden. Die physikalisch-chemischen Eigenschaften der erhaltenen Kristalle sind nachstehend genannt.

1) Schmelzpunkt 168 bis 170°C
2) Elementaranalyse (Gew.-%) Gefunden
C35,51 35,56 H 5,61 5,61 N12,93 12,98 S 7,45 7,59Berechnet für C₁₂H₂₀N₄SO₉ · CH₃OH ·½ H₂O
C35,69 H 5,76 N12,81 S 7,33
3) Spezifische Drehung: [α] + 82° ± 5° (c = 1,0, in H₂O)
4) IR-Absorptionsspektrum (Fig. 3), Hauptpeaks (Kbr) (cm^-1):
3440, 3355, 3000, 1780, 1660, 1650, 1538, 1265, 1245, 1220, 1038, 625
5) Kernmagnetisches Resonanzspektrum (in Dimethylsulfoxyd, 100 MHz)
δ 3,31 ppm (s, 3H) (auf O-CH₃ von G-6302 zurückzuführende chemische Verschiebung)
δ 3,20 ppm (s, 3H) (chemische Verschiebung, die auf das O-CH₃ des in den Kristallen enthaltenen Methanols zurückzuführen ist).

Die übrigen physikalisch-chemischen Eigenschaften, d. h. UV-Absorptionsspektrum, Löslichkeit in Lösungsmitteln, Farbreaktionen, Stabilität, Basizität, Neutralität oder Acidität, sind die gleichen wie bei dem gemäß Beispiel 1 hergestellten Produkt.

Wie aus der Veröffentlichung in "Nature", Vol. 289 vom 12. Februar 1981, Seiten 590 und 591 hervorgeht, wurde mittlerweise die Struktur des in der vorliegenden Anmeldung beanspruchten Antibiotikums G-6302 festgestellt; dieses Antibiotikum wurde als Sulfazecin bezeichnet und weist die folgende Struktur auf

Claims

1. Antibiotikum G-6302 und seine Salze, wobei das Antibiotikum G-6302 gekennzeichnet ist durch folgende Eigenschaften:

1) Schmelzpunkt 120°C (Sinterung), 130°C (Zers.)
2) Aussehen: weißes Pulver
3) Elementaranalyse (%) C34,99 ± 0,5 H 5,58 ± 0,5 N13,30 ± 0,5 O38,13 ± 0,5 S 7,70 ± 0,5(nach 6-stündiger Trocknung über Phosphorpentoxyd unter vermindertem Druck bei 40°C).
4) Ultraviolettabsorptionsspektrum: keine charakteristischen Absorptionen über 210 nm
5) Infrarotabsorptionsspektrum (KBr, Hauptabsorptionen (Wellenzahlen in cm^-1)): 1770, 1650, 1530, 1240, 1043
6) Spezifische Drehung: [α] + 94° ± 10° (c = 0,35, H₂O)
7) Löslichkeit: unlöslich in Petroläther, Hexan, Diäthyläther, Benzol, Äthylacetat und Chloroform; schwerlöslich in Äthanol, Pyridin und Aceton; löslich in Methanol und Dimethylsulfoxyd; leicht löslich in Wasser;
8) sauer;
9) Molekulargewicht 400 ± 20 (durch Titrometrie)
10) Farbreaktionen: Ninhydrin- und Kaliumpermanganatreaktionen positiv; Eisen(III)-chlorid-Kaliumferricyanat-Reaktion, Sakaguchi- und Molisch-Reaktion negativ; Ehrlich-Reaktion: unsicher positiv.

2. Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums G-6302 des Anspruchs 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Pseudomonas acidophila IFO 13 774 in einem Nährmedium kultiviert und das Antibiotikum aus dem flüssigen Überstand gewinnt durch ein Verfahren, bei dem die Löslichkeit oder der Löslichkeitsunterschied in einem geeigneten Lösungsmittel ausgenutzt wird, ein Verfahren, bei dem die Fällung oder der Unterschied in der Fällungsgeschwindigkeit aus einer Lösung ausgenutzt wird, ein Verfahren, bei dem seine charakteristische Adsorptionsaffinität zu verschiedenen Adsorptionsmitteln ausgenutzt wird, die Ionenaustauschchromatographie an Ionenaustauschern, Konzentrierung unter vermindertem Druck, Gefriertrocknung, Kristallisation, Umkristallisation, Trocknung entweder allein oder in geeigneter Kombination und Reihenfolge und/oder in Wiederholung.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Kulturmedium einsetzt, das zusätzlich 0,01 bis 1,0% (Gew./Vol.), vorzugsweise 0,02 bis 0,5% (Gew./Vol.), Natriumthiosulfat, Natriumsulfat, Cystin, Cystein oder Methionin enthält.